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Verfahren zur Abscheidung von ungesättigten Diketonen der Cyclopentanopolyhydrophenanthren- reihe aus Sterin-Oxydationsgemischen.
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worden ; dabei wurde naeh der Oxydation und nach der Wiederherstellung einer Doppelbindung in dem Oxydationsprodukt bisher das Cholestenon gewonnen. In ähnlicher Weise hat man aus Sitosterin das Sitostenon dargestellt.
Ferner ist es aus den französischen Patentschriften Nr. 806468 und 8064. 69 bekannt, gesättigte oder ungesättigte Sterine, gegebenenfalls unter vorübergehendem Schutz der Ringdoppelbindung und der Hydroxylgruppe in 3-Stellung, mit die Seitenkette der Sterine abspaltenden Oxydationsmitteln, wie z. B. Chromtrioxyd, Kaliumpermanganat, zu oxydieren. Aus den hiebei erhaltenen Oxydationsgemischen können nach Abtrennung der sauren Anteile die entstandenen gesättigten oder ungesättigten Oxyketone z. B. mittels Ketonreagenzien abgeschieden und in die einzelnen Bestandteile zerlegt werden.
Es wurde nun gefunden, dass aus Oxydationsgemisehen, welche in bekannter Weise durch Oxydation von freien Hydroxylgruppen und eine Ringdoppelbindung enthaltenden Sterine oder deren Derivaten erhalten wurden und die in ihrer Konstitution mit dem Cholesterin, Allocholesterin oder Epicholesterin bis zum Kohlenstoffatom 22 übereinstimmen, ungesättigte Diketone der Cyclope- tanopolyhydrophenanthrenreihe erhalten werden können, wenn man die nach Wiederherstellung der Ringdoppelbindung erhaltenen Oxydationsgemische oder zweckmässiger nur die neutralen Anteile derselben der chromatographischen Trennung unterwirft.
Die neutralen Teile des Oxydationsgemisches können unmittelbar der chromatographischen Trennung unterworfen werden ; da sie jedoch bedeutende Mengen an solchen Produkten enthalten, welche zu ihrer Abtrennung ein so fein differenzierendes Mittel, wie das Chromatographieren, nicht erfordern, ist es zweckmässiger, diese Anteile des Oxydationsgemisehes vorerst durch andere Massnahmen, wie Kristallisieren oder Verteilen zwischen zwei Lösungsmitteln, abzutrennen und erst die in ihrer Menge schon bedeutend verminderten und zu ihrer weiteren Trennung schon ein feiner differenzi reides
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Als Adsorbens können verschiedene, für solche Zwecke übliche Stoffe, wie Aluminiumoxyd, Bauxit, Kaolin, Hydrosilikate, ErdalkaJihydroxyde,-earbonate,-oxyde od. dgl., verwendet werden.
Zweckmässig geht man von neutralen Anteilen solcher Oxydationsgemische aus, welche in bekannter Weise durch oxydativen Abbau von Cholesterindibromid mittels Chromtrioxyd oder Chromaten in Gegenwart von Schwefelsäure und durch Wiederherstellung der Doppelbindung erhalten wurden.
Aus dem Oxydationsgemisch wird nach Entfernung des sauren Anteiles und nach der üblichen Wiederherstellung der Doppelbindung das nur am Kohlenstoffatom in 3-Stellung oxydierte Ausgangsmaterial, z. B. im Falle des Cholesterindibromids das Cholestenon, durch Kristallisation aus acetonischer Lösung abgetrennt. Die Abtrennung kann auch auf anderem Wege, z. B. durch Verteilung zwischen mit Wasser mischbaren und mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln, wie wässrigem Methylalkohol und Petroläther, bewirkt werden, wobei sich das Cholestenon in der Petrolätherphase anreichert.
Die in der wässrigen Schicht zurückgebliebenen Anteile des Oxydationsgemisches werden nun entweder unmittelbar oder nach Abtrennung der in Methylalkohol schwer löslichen Teile derselben der chromatgraphischen Trennung unterworfen, z. B. in benzolischer Lösung bei Verwendung von Aluminiumoxyd als Adsorbens, in welchem Falle die Diketone in dem durch die Säule gehenden Filtrat verbleiben.
Eine weitere Anreicherung erzielt man dadurch, dass man den Rückstand dieses Filtrats in petrol- ätherischer Lösung mit 10-30% Wasser enthaltendem Methylalkohol auszieht, wobei sich die Diketone in der methylalkoholischen Schicht anreichern.
Zur Darstellung der kristallisierten Diketone kann man nach einer andern Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens in der Weise vorgehen, dass man das durch die Aluminiumoxydsäule durchgelaufene Benzolfiltrat vom Lösungsmittel befreit, den Rückstand in Petroläther löst und allenfalls nach Zugabe eines die Lage der Diketone anzeigenden Farbstoffindikators, z. B. Sudan-III, zweckmässig unter Anwendung von Aluminiumoxyd chromatographiert. In diesem Falle verbleiben die Diketone in der Aluminiumoxydsäule adsorbiert. Die Verteilung der zwei Ketogruppen enthaltenden Produkte in der Säule kann an den durch den Farbstoffindikator entstandenen Farberscheinungen festgestellt werden.
Das Androsten- (4)-dion- (3. 17) findet sich hauptsächlich in der oberen Zone, das Pregnen- (4)-dion- (3. 20) [Corpus-luteum-Hormon], hauptsächlich in der mittleren Zone, allerdings von Androsten- (4)-dion- (3. 17) begleitet. Aus den einzelnen Schichten der entsprechend aufgeteilten Chromatogrammsäule werden die Diketone bzw. das Diketongemisch durch Extraktion mit Äther, Methylalkohol oder Alkohol entfernt. Eine weitere Reinigung kann erreicht werden, wenn die ätherischen bzw. alkoholischen Lösungen eingedampft und der so gewonnene Rückstand wiederholt zwischen wässrigem Methylalkohol und Petroläther verteilt wird, wobei der Wassergehalt des Methylalkohol allmählich gesteigert wird und die oben erwähnten zwei Hormone sich in der Methylalkoholphase anreichern.
Diese Verfahren, wie Verteilung zwischen Lösungsmitteln und Chromatographie, gestatten, allenfalls nach öfterer Wiederholung, solche Produkte zu gewinnen, welche die Diketone praktisch voneinander getrennt enthalten ; ihre Reindarstellung in kristallisierter Form wird dadurch, gegebenenfalls nach Einschaltung einer Hochvakuumdestillation, möglich. Man kann z.
B. die nach Ausführung des Petroläther-Chromatogramms aus den oberen und mittleren Schichten gewonnenen und vom verwendeten Farbstoff befreiten Produkte-allenfalls nach einer Reinigung mit der vorher angegebenen Verteilungsmethode-einer neuerlichen chromatographischen Aufteilung unterwerfen ; dabei wird zweckmässig in petrolätherisch-benzolischer Lösung unter Verwendung von Aluminiumoxyd gearbeitet ; aus den ersten Anteilen der durch die Säule gelaufenen Lösung wird das Pregnen- (4)-dion- (3. 20), aus den späteren Anteilen sowie aus der Säule selbst Androsten- (4)-dion- (3. 17) gewonnen.
Die nach den angeführten Trennungsverfahren gewonnenen Fraktionen, welche die Diketone enthalten, können auch mit Ketonreagenzien, z. B. mit Semiearbazid, zur Reaktion gebracht werden. Die gewonnenen Ketonderivate werden durch fraktionierte Kristallisation, z. B. im Falle des Semi- carbazons durch wiederholte Kristallisation aus Alkohol, in einzelne Fraktionen zerlegt, welche die
Verbindungen der Diketone in angereicherter Form und voneinander weitergehend getrennt enthalten.
Aus den so erhaltenen Ketonderivaten werden die Diketone wieder abgeschieden und gegebenenfalls noch im Hochvakuum destilliert.
Die vorhergehend angeführten Reinigungsmassnahmen können sowohl in anderer Reihenfolge als auch in den einzelnen Stufen wiederholt angewendet und kombiniert werden, wodurch die Diketone im Verlauf der Anreicherung entweder in Form von angereicherten Fraktionen oder auch in reinem, kristallisiertem Zustande gewonnen werden.
Die während des Anreicherungsverfahrens gewonnenen Nebenfraktionen, welche von Diketonen noch nicht völlig befreit sind, können auch in eine frühere Stufe des Anreicherungsverfahrens zurück- geführt werden.
Zur näheren Beschreibung des Verfahrens dienen folgende Beispiele :
Beispiel l : Ein durch Oxydation von Cholesterindibromid in bekannter Weise mittels Chrom- trioxyd und Schwefelsäure erhaltenes Oxydationsprodukt wird nach Wiederherstellung der Ring- doppelbindung von den sauren Anteilen befreit und nach dem Abdampfen des Lösungsmittels bei
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1 mm Druck und 700 getrocknet. Zum Zwecke der Abtrennung des Cholestenons wird der Rückstand aus der gleichen Gewichtsmenge Aceton umkristallisiert. Die Mutterlauge des ausgeschiedenen Cholestenons wird im Vakuum vom Lösungsmittel befreit und der Rückstand, ungefähr 200 g, in der gleichen Gewichtsmenge Methylalkohol unter Erwärmen gelöst und unter Ruhren auf-12 abgekühlt.
Es bilden sich zwei Schichten ; die obere wird abdekantiert und die untere noch drei-bis viermal auf dieselbe Weise mit Methylalkohol ausgezogen. Die vereinigten, abdekantierten methylalkoholisehen Lösungen werden im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz eingedampft ; das Gewicht des Rückstandes beträgt ungefähr 100 g. Dieses Produkt zeigt im Corpus-luteum-Test starke Wirkung.
100 g des so erhaltenen Produktes werden in Benzol gelöst, durch ein mit 1 kg Aluminiumoxyd (Brockmann) gefülltes Rohr durchgeschickt und die Säule mit Benzol gewaschen. Die vereinigten Benzollösungen werden eingedampft, der Rückstand in Petroläther. aufgenommen und an Aluminiumoxyd chromatographiert ; die Diketone verbleiben in diesem Falle in der Säule. Wenn zur Petrolätherlösung wenig Sudan-III zugesetzt wird, so kann die Säule nach der Entwicklung des Chromatogramms leicht aufgeteilt werden.
Die Rohrfüllung wird von ihrem Beginn an bis zu einer durch das untere Ende eines gut sichtbaren, dunkelroten Farbringes angezeigten Tiefe weiter verarbeitet, wobei sich das An- drosten- (4)-dion- (3. 17) im oberen Drittel dieses Säulenteiles, praktisch frei von Corpus-luteum-Hormon, letzteres hingegen in den unteren zwei Dritteln, von Androsten- (4)-dion- (3. 17) begleitet, befindet.
Die in diesen beiden Säulenteilen adsorbierten Produkte werden durch mehrmaliges Auskochen mit Methylalkohol (Alkohol oder Äther) eluiert. Die Eluatlösungen werden auf ein kleines Volumen eingedampft, der Farbstoff mit Aktivkohle entfernt und durch Abkühlen auf niedrige Temperatur und allenfalls nach Impfung Cholestandion abgeschieden, wobei die physiologisch wirksamen Diketone aus den eingedampften Mutterlaugen gewonnen werden. Die so gewonnenen Fraktionen enthalten das Pregnen- (4)-dion- (3. 20) bzw. das Androsten- (4)-dion- (3. 17) in stark angereichertem Masse und sind für therapeutische Zwecke sehr gut verwendbar.
Beispiel 2 : Ein in bekannter Weise durch Oxydation von Cholesterindibromid mit Kaliumpermanganat in schwefelsaurer Lösung erhaltenes Oxydationsgemisch wird nach Abtrennung der sauren Anteile und nach Wiederherstellung der Doppelbindung zur Entfernung von Cholestenon beiläufig in der fünffachen Menge Petroläther gelöst und sechs-bis siebenmal mit der gleichen Menge 90% igem Methylalkohol ausgeschüttelt ; aus der Petrolätherschicht gewinnt man das Cholestenon.
Die wässrigen methylalkoholischen Lösungen werden bis zur Ausscheidung eines Harzes verdampft, dann mit Benzol dreimal ausgezogen und dieses zum Zwecke der Entfernung der letzten Reste Methylalkohol mit Wasser ausgewaschen. Nach dem Eindampfen der benzolischen Lösung werden ungefähr 100 g Rückstand mit starker Corpus-luteum-Hormon-Wirksamkeit gewonnen, welcher auf ehromatographischem Wege noch weiter angereichert wird. Zu diesem Zwecke wird der Rückstand in der fünffachen Menge Benzol gelöst, durch ein mit der ungefähr 15fachen Menge Aluminiumoxyd (Brockmann) gefülltes Rohr durchgesehiekt und hierauf die Säule mit Benzol ausgewaschen.
Nach dem Eindampfen der vereinigten Benzollösungen verbleiben ungefähr 60 g eines lichtgelben Harzes, welches zur allfälligen weiteren Anreicherung in 300 cm3 Petroläther und 90 cm3 Methylalkohol gelöst und unter Schütteln mit 10 cm3 Wasser versetzt wird. Den abgeschiedenen petrolätherischen Anteil schüttelt man noch viermal mit je 100 cm3 90% igem wässrigem Methylalkohol aus. Die methylalkoholischen Fraktionen werden nach ihrer Vereinigung vom Methylalkohol befreit ; der Rückstand wird in Benzol aufgenommen und dann die benzolische Lösung zur restlosen Entfernung des Methylalkohols mit Wasser gewaschen und schliesslich abgedampft. Ausbeute 10 g lichtgelb gefärbtes Harz, welches im physiologischen Versuch sehr starke Corpus-luteum-Hormon-Wirksamkeit zeigt.
Dieses Produkt ist ein ausgezeichnetes Ausgangsmaterial zur Abscheidung der kristallisierten Diketone.
Beispiel 3 : Die im Beispiel 1 beschriebene Aufarbeitung erfolgt bis zur Gewinnung des im Methylalkohol leicht löslichen Anteils. Die weitere Reinigung wird auf folgendem Wege vorgenommen :
100 g des in Methylalkohol leicht löslichen Produktes werden in 500 cm3 Petroläther und 90 em3 Methanol gelöst und mit 10 cm3 Wasser geschüttelt, wobei sich zwei Schichten bilden. Die abgetrennte Petrolätherschicht wird nun noch sechsmal mit je 100 cm3 90% gem Methylalkohol ausgezogen.
Nach dem Eindampfen der vereinigten Methylalkoholauszüge werden ungefähr 60 glichtgelbes Harz gewonnen, welches auf chromatographischem Wege in folgender Art aufgearbeitet wird :
Die benzolische Lösung wird durch ein ungefähr 1 kg Aluminiumoxyd (Brockmann) enthaltendes Rohr durchgeschickt und die Säule mit Benzol nachgewaschen. Die Benzollösung wird auf ein kleineres Volumen eingedampft und neuerdings in einem mit Aluminiumoxyd gefüllten Rohr ehromatographiert, wonach man aus der nunmehr erhaltenen Benzollösung beim Eindampfen 20 g Rückstand gewinnt.
Dieser Rückstand wird in 100 cm3 Petroläther gelöst, mit 0-25 g Sudan-III versetzt, durch ein mit 400 g Aluminiumoxyd (Brockmann) gefülltes Rohr durchgeschickt und die Säule mit Petroläther gewaschen. Nach der Entwicklung des Chromatogramms wird die Säule nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren aufgeteilt. Der mittlere Anteil wird mit Methylalkohol mehrmals extrahiert und der Extrakt eingedampft ; es verbleiben 6. 5 g Trockenrückstand, welcher im physiologischen Versuch starke Corpus-luteum-Hormon-Wirksamkeit zeigt, während das aus dem oberen Drittel extrahierte Produkt starke Aktivität im Vesicular-Test aufweist.
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Beispiel 4 : Die im Beispiel l beschriebene Aufarbeitung erfolgt bis zum Petroläther-Chromato- gramm ; die weitere Trennung erfolgt in nachstehender Weise : 18 g des aus der mittleren Zone gewonnenen Produktes werden in 800 cm3 absolutem Alkohol gelöst und mit Semicarbazidacetat, bereitet aus 21. g Semicarbazid-Chlorhydrat und 26 g Natriumacetat, 2 Stunden auf dem Wasserbad erwärmt, wobei gleichzeitig auf ein Volumen von ungefähr 400 cm3 eingeengt wird. Nach 24 Stunden langem Stehen in der Kälte werden die Kristalle abgesaugt.
Das Rohsemicarbazon wird mit heissem Wasser, schliesslich nach dem Trocknen mit Äther digeriert, wodurch 9 g eines Produktes gewonnen werden, das sich bei 21. 5-2190 zersetzt.
7. 4 g dieses Semicarbazons werden aus 300 cm3 kochendem Alkohol umkristallisiert, wobei man 4-7 g einer Substanz vom Zersetzungspunkt 2250 gewinnt. Wird dieses Produkt neuerlich aus 1000 cm3 Alkohol umkristallisiert, so gewinnt man nach längerem Stehen bei 0 1-5 g einer Substanz, welche einen Zersetzungspunkt von über 3000 aufweist. Aus der eingeengten Mutterlauge wird ein Produkt vom Zersetzungspunkt 2210 gewonnen.
Die über 3000 sich zersetzende Substanz wird mit 40 cm3 96%igem Alkohol und 5 cm3 Brenztraubensäure 2 Stunden erwärmt, wobei alsbald Lösung eintritt ; diese Lösung wird in verdünnte Lauge gegossen und mit Äther extrahiert. Die ätherische Lösung wird dreimal mit Natronlauge, verdünnter Schwefelsäure und schliesslich mit Wasser bis zur neutralen Reaktion gewaschen. Man erhält so 1-3 g Substanz, welche im Hochvakuum bei 165-170 Luftbadtemperatur und unter 0. 001 mm Druck destilliert wird. Das aus einem Gemisch von Äther-Petroläther kristallisiert erhaltene Destillat ist Corpus-luteum-Hormon.
Die oben erwähnte, durch Einengen der Mutterlauge erhaltene Semiearbazon-Fraktion vom Zersetzungspunkt 2210 liefert nach der Spaltung des Semicarbazons und nach der Destillation des Spaltproduktes im Hochvakuum kristallisiertes Androsten-(4)-dion-(3. 17).
Beispiel 5 : Das gemäss Beispiel 3 durch Extrahieren des mittleren Anteiles der Chromatogrammsäule mit Methylalkohol gewonnene Produkt kann auf folgendem Wege weiter gereinigt werden :
6-7 g dieses Produktes werden in einem Gemisch von 60 cm3 Methylalkohol und 60 cm3 Petrol- äther gelöst und unter Schütteln in mehreren Anteilen mit 6. 65 cm3 Wasser versetzt. Zu dem abgeschiedenen methylalkoholisehen Teil werden 60 cm3 Petroläther und unter sorgfältigem Schütteln 8. 35 cm Wasser zugegeben. Die abgeschiedene methylalkoholisehe Phase wird nun neuerdings mit
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100 cm3 Petroläther und 90 crn3 Methylalkohol gelöst und unter Schütteln mit 10 crn3 Wasser behandelt wird.
Die abgeschiedene methylalkoholische Schicht wird mit 100 cm"Petroläther versetzt ; darauf gibt man unter Schütteln 12-5 cm3 Wasser in Anteilen zu. Die abgeschiedene methylalkoholische
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und 30 cm3 Petroläther gelöst ; 60 g Aluminiumoxyd (Brockmann) werden in einem Rohr mit einem Gemisch von Benzol-Petroläther 1 : 3 benetzt ; sodann wird die Lösung durch die Säule geschickt. Das Chromatogramm wird durch Waschen der Säule mit dem Lösungsmittelgemisch entwickelt ; der Trockengehalt der durchgelaufenen Lösung (Konzentration) wird fortlaufend untersucht. Die Konzentration im Filtrat steigt anfänglich, fällt dann rasch und nimmt schliesslich sehr langsam ab.
Von der durchlaufenden Lösung werden neun Fraktionen von je 15 cm3 abgenommen und verdampft.
Die erste Fraktion zeigt nach dem Eindampfen keine Kristallisationstendenz ; der Rückstand der zweiten und dritten Fraktion kristallisiert aus Äther-Petroläther und liefert Pregnen- (4) -dion- (3. 20).
Die vierte Fraktion enthält noch Corpus-luteum-Hormon, es ist aber auch Androsten- (4)-dion- (3. 17) zugegen. Aus der fünften bis neunten Fraktion wird kristallisiertes Androsten-(4)-dion-(3,20) gewonnen.
Die Hauptmenge desselben dagegen bleibt in der Säule zurück, wird aus ihr mit Äther eluiert und durch Kristallisation aus Äther in kristallisierter Form erhalten.
Aus den letzten Anteilen der Elution der Säule mit Äther gewinnt man ein bei 217 schmelzendes Nebenprodukt.
Beispiel 6 : Das nach Beispiel 3 durch Extrahieren des mittleren Anteiles der Chromatogrammsäule mit Methylalkohol gewonnene Produkt kann man auch auf folgendem Wege weiter reinigen :
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6. 5 g dieses Produktes werden in 180 cm3 Alkohol gelöst, mit Semicarbazidacetat (bereitet aus 7. 7 g Semicarbazid-Chlorhydrat und 9-5 y Natriumacetat) 2 Stunden hindurch gekocht, auf 130 cMt eingedampft und über Nacht zur Kristallisation stehen gelassen. Die ausgesehiedenen Kristalle werden abgesaugt, mit Wasser ausgekocht, getrocknet, Gchliesslich mit Äther gewaschen ; man gewinnt
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versetzt, 31/2 Stunden gekocht, wobei das Semicarbazon in Lösung geht.
Das Reaktionsgemiseh wird in 200 cm 10% ige Kaliumcarbonatlösung eingetragen, mit Wasser verdünnt und mit Äther ausgezogen.
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schmelzende Substanz erhalten wird. Durch Vereinigung der Mutterlauge dieses Kristallisates und der durch Elution der Chromatogrammsäule mit Äther gewonnenen Anteile werden 2. 14 ; g eines Produktes erhalten, aus welchem durch neuerliche Chromatographie und Kristallisation das Pregnen- (4)-don-(3. 20) und das Androsten- (4)-dion- (3. 17) abgetrennt werden können.
Die Versuchsbedingungen obiger Beispiele lassen in mancher Hinsicht Variationen zu. So können z. B. an Stelle der aus Cholesterin die aus andern Sterine, die bis zum Kohlenstoffatom 22 in ihrer Konstitution mit dem Cholesterin übereinstimmen, hergestellten Oxydationsgemische aufgearbeitet werden.
PATENT-ANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Abscheidung von ungesättigten Diketonen der Cyclopentanopolyhydrophen- anthrenreihe aus Oxydationsgemischen, welche in bekannter Weise durch Oxydation von freien Hydroxylgruppen und eine Ringdoppelbindung enthaltenden Sterine oder deren Derivaten erhalten wurden und die in ihrer Konstitution bis zum Kohlenstoffatom 22 mit dem Cholesterin, Alloeholesterin oder Epicholesterin übereinstimmen, dadurch gekennzeichnet, dass man die nach Wiederherstellung der Ringdoppelbindung erhaltenen Oxydationsgemische oder zweckmässiger nur die neutralen Anteile derselben der chromatographischen Trennung unterwirft.