NL8304327A

NL8304327A - Werkwijze voor het zuiveren van anthracyclinon-glycosiden door een selectieve absorptie aan harsen.

Info

Publication number: NL8304327A
Application number: NL8304327A
Authority: NL
Original assignee: Erba Farmitalia
Priority date: 1982-12-23
Filing date: 1983-12-15
Publication date: 1984-07-16
Also published as: HU197917B; SE8307134D0; GR79135B; FI834650A; KR840007438A; ES8504758A1; US4861870A; DK594083D0; IL70500A; DK594083A; ES528226A0; CH657623A5; NZ206605A; NO834765L; GB8333511D0; CA1204738A; DE3345445A1; SU1575943A3; SG34587G; CS980283A2

Description

-1- * - * * VO 5303

Werkwijze voor het zuiveren, van anthracyclinon-glycosiden door een selectieve absorptie aan harsen.

De uitvinding betreft een werkwijze voor het zuiveren van anthracyclinon-glycosiden door een selectieve adsorptie aan harsen.

Er bestaat behoefte aan een zeer specifieke methode voor het verkrijgen van dit soort glycosiden in een zuivere vorm, omdat zowel 5 bij de fermentatie als bij de synthetische bereiding vrij grote hoeveelheden organische en anorganische onzuiverheden in het produkt I

optreden met een gemiddelde van 12 tot 25 %. I

De tot dusver gebruikte conventionele methoden, waarbij het I

ruwe produkt met gechloreerde oplosmiddelen werd geëxtraheerd en ver- I

10 volgens met buffers werd gewassen, leiden tot een eindprodukt, waar- I

van het percentage onzuiverheden weliswaar sterk is verminderd, maar I

nog altijd ligt in een traject tussen 4,5 en 5,0 %. — I

Hoewel dit cijfer vaak aanvaardbaar wordt geacht, moet gezien I

de specifieke gevoeligheid voor bepaalde handelingen en chemische j

15 stoffen van het glycoside-molecuul toch naar een verbeterde zuiverings- I

methode worden gestreefd die het mogelijk maakt een nagenoeg zuiver I

produkt te verkrijgen. Gezien het specifieke gebruik van anthracyclinon- I

glycosiden in de klinische praktijk als anti-tumor middelen en de neven- I

problemen betreffende dosering en giftigheid is een optimale ellmine- I

20 ring van onzuiverheden, die gewoonlijk zeer giftig zijn, van groot be- I

lang te achten. |

De uitvinding, die het mogelijk maakt een eindprodukt te ver- j

krijgen met een onzuiverheidsgehalte van maximaal 2 %, is in essentie I

gebaseerd op een werkwijze waarbij het ruwe produkt een adsorptie-be-25 handeling ondergaat op diverse typen harsen en wel in een zuur milieu I

(pH = 3-5) gevolgd door een eluering met water of mengsels van water I

met een polair oplosmiddel. Meer in het bijzonder betreft de uitvin- I

ding een eerste fase, waarbij een zwak zure waterfase met de in water 1 opgeloste stof op de hars in de vorm van deeltjes als korrels of bol- | 30 letjes wordt geadsorbeerd, en een volgende trap waarbij de geadsorbeerde stof weer wordt gedesorbeerd.

De adsorberende hau:s kan aanwezig zijn in een passende houder of vat, dat over het algemeen de vorm heeft van een toren of een kolom, die op passende wijze gevuld is met harsdeeltjes. Afhankelijk van het 35 type onzuiverheden in het ruwe produkt kan het eluaat verkregen door 8304327 ί. __ Γ -2- desorptie van de hars , desgewenst opnieuw op een hars van een ander type worden geadsorbeerd, waarvan het volgens een bekende methode weer kan worden geëlueerd.

Bij de onderhavige chromatografische zuiverings-methode werd 5 gebruik gemaakt van adsorberende harsen van het polymere-en ionenui twisselende type of van het carboxymethylcellulose type: een juiste selectie, een passende volgorde in het gebruik, van de diverse typen harsen naar gelang van het te zuiveren ruwe produkt,. en het zwakzure milieu tijdens de.adsorptie maken het mogelijk een bijzonder zuiver 10 eindprodukt te verkrijgen, waardoor kan worden af gezien van het gebruik van gechloreerde organische oplosmiddelen en toch een voortreffelijke opbrengst na zuivering kan worden verkregen.

De volgende voorbeelden lichten de uitvinding nader toe.

Voorbeeld I.

15 Zuivering van 4-demethoxy-daunorubicine.

15,0 gram 4-demethoxy-daunorubicine in ruwe vorm met een titer van 70,2 % en een gehalte aan onzuiverheden van 18 % werd opgelost in 3,6 liter van een oplossing van 0,5 % natriumacetaat. Deze oplossing werd met. azijnzuur op pH 4,7 gebracht en geadsorbeerd op 400 cm^ 20 Amberlite -XAD2 (Rohm en Haas) in een kolom met een diameter van 2,5 3 cm. Het produkt werd gewassen met 1000 cm water en vervolgens geëlueerd met een mengsel van water/methanol (5:1 volumina). Als een eerste 3 eluaat werd 2000 cm oplossing met agluconen en diverse onzuiverheden opgevangen.

25 Bij verder., elueren met een mengsel van water/methanol (1 : 1) werd een fractie van 4500 cm opgevangen t dit eluaat bevatte in oplossing het 4-demethoxy-daunorubicine tezamen met 10 % onzuiverheden.

Dit eluaat werd met zoutzuur op pH 2,8 gebracht en vervolgens 3 in vacuo geconcentreerd tot een volume van 1500 cm . Door een toevoeging 30 van natriumacetaat aan de geconcentreerde oplossing, werd de pE op 4,0 3 gebracht en deze zwakzure oplossing geadsorbeerd op 150 cm CM Sepharose

Cl 6B (Pharmacia) in een kolom, met een diameter van 2,5 cm waarbij een stroomsnelheid van 150 cm^/uur werd aangehouden. Nadat alles was ge- • 3 adsorbeerd, werd de kolom eerst uitgewassen met 450 cm water en daarna 35 geëlueerd met 0,03 % zoutzuur.

3

De eerste 800 cm eluaat met 18 % onzuiverheden werden door een toevoeging van natriumacetaat op pH 4,7 gebracht en gerecirculeerd naar 8304327 ♦ -3- de oplossing van het ruwe 4-demethoxy-dauhorubicine, bestemd voor adsorptie op de Amberlite XAD2 harsen voor de eerste zuiveringstrap.

Het volgende eluaat (3500 cm3) met zuiver 4-demethoxy-daunorubi-cine werd in een vacuum geconcentreerd tot een volume van 50 cm3, 5 waarna 250 cm3 aceton werd toegevoegd, het verkregen neerslag af gefiltreerd, met aceton gewassen en gedroogd. Met een opbrengst van 52 %, berekend op het ruwe uitgangsprodukt, werd een 4-demethoxy-daunorubicine verkregen met een titer van 97 % en een gehalte aan onzuiverheden van minder dan 3 %.

Voorbeeld II.

10 Zuivering van daunorubicine.

15,0 gram. gechloreerde daunorubicine met een titer van 74,2 % 3 en een gehalte aan onzuiverheden van 8,5 % werd opgelost in 4500 cm water. Deze oplossing werd met natriumacetaat op pH 5,0 gebracht en gè- 3 adsorbeerd aan 400 cm SI 12 Kas teil hars of op Amber lite ER180 van 15 Rohm en Haas, en wel in een kolom met een diameter van 2,5 cm en bij een stroomsnelheid van 600 cm3/uur.

Het produkt werd hierna gewassen met 1000 cm van een oplossing van 1 % natriumchloride en daarna geëlueerd met een mengsel van water/ ethanol (1:1).

De kopfractie van 400 cm3 met de agluconen in oplossing werd 20 verwijderd daarna verder geëlueerd en 260 cm3 eluaat met zuiver daunorubicine opgevangen. De pH werd op 2,5 ingesteld door een toevoeging van verdund zoutzuur, aceton toegevoegd en men liet het produkt kristalliseren gedurende 6 uren bij een temperatuur van +5°C. Dit produkt werd af gefiltreerd, met aceton gewassen en. 12 uren in vacuo gedroogd. 25 Met een opbrengst van 80 %, berekend op onzuiver uitgangsmateriaal werd een daunorubicine verkregen met de volgende eigenschappen, bepaald via HPLC: titer 97 %, gehalte aan onzuiverheden 2,6 %-Voorbeeld XII.

Zuivering van 4-demethoxy-doxorubicine.

30 2000 cm3 van een waterige oplossing met daarin 10,4 gram 4-deme- thoxy-doxorubicine met een gehalte aan onzuiverheden van 14 % werd ge- 3 adsorbeerd op 50 cm ER180 van Rohm en Haas in een kolom met een dia- 3 meter van 2,5 cm bij een stroomsnelheid van 250 cm /uur.

Het eluaat, gedeeltelijk gezuiverd door een selectieve adsorptie 35 van de onzuiverheden, werd vervolgens geadsorbeerd op 200 cm CM Sepha- 8304327 ' -4- * rose cl 6B van Pharmacia. Het produkt werd vervolgens geëlueerd met een mengsel van methanol en water (1 : 1) met daarin 0,015 % geconcentreerd zoutzuur, waarbij de kopfractie van circa 800 cm^ met de aglu-conen en andere onzuiverheden werd weggeworpen. Vervolgens werd 2000 cm^ 5 eluaat opgevangen dat de zuivere stof bevatte, en dit in vacuo geconcentreerd tot 60 cm^. Onder 3 uur roeren werd 300 cm^ aceton toegevoegd, het opgetreden neerslag afgefiltreerd, met aceton gewassen en gedroogd. In een opbrengst van 58,2 % van de theoretische werd 6,5 gram zuiver 4-demethoxy-doxorubicine verkregen met een gehalte aan on-10 zuiverheden van 3 %.

Voorbeeld IV.

Zuivering van 41-desoxy-doxorubicine.

15.0 gram 4’-desoxy-doxorubicine met een titer van 69,2 % en een gehalte aan organische onzuiverheden van 12 % alsmede een gehalte aan 15 . anorganische zouten van eveneens 12 % werd opgelost in 2000 cm^ water en geadsorbeerd op 300 cm^ CM Sephadex C25 en wel met een stroomsnelheid 3 van 600 cm /uur. Nadat alles was geadsorbeerd werd geëlueerd met 0,03 % zoutzuur en een fractie van 6500 cm^ met daarin 4' -desoxy-doxorubicine verkregen.

20 Dit eluaat werd op pH 3,8 gebracht door toevoeging van een oplos sing van natronloog, geadsorbeerd op 200 cm SI 12 Kastel hars met een 3 3 stroomsnelheid van 400 cm /uur en deze hars gewassen met 600 cm water waarna werd geëlueerd met methanol aangezuurd op pH 2,0 met zoutzuur.

600 cm^ kemeluaat werd aldus verkregen, dat in vacuo werd ge- 25 concentreerd tot 60 cm^. Onder roeren werd deze oplossing langzaam 3 uitgegoten in 600 cm aceton. en het daarbij gevormde neerslag afgefiltreerd, met aceton gewassen en gedroogd.

In een opbrengst van 61 % van de theoretische werd 4'-desoxy-doxorubicine verkregen met een titer van 95,8 % en een gehalte aan on-30 zuiverheden van 4,2 %.

Voorbeeld V.

Zuivering van 41-epi-doxorubicine♦ 15.0 gram onzuiver 41-epi-doxorubicine met een titer van 75,9 % en een onzuiverheidsgehalte van 15 %, werd opgelost in 4000 cm^ water.

35 Deze oplossing werd met natriumformiaat op pH 4,8 gebracht en 3 deze oplossing geadsorbeerd op 400 cm Amberlite IRC 724 in een kolom 3 met een diameter van 2,5 cm en bij een stroomsnelheid van 1600 cm /uur .

8304327 W~~ 1 Τ' -5-

De kolom werd uitgewassen met 800 cm* water en vervolgens ge- elueerd met een mengsel van 95 dln methanol op 5 dln water en 0,015 dln geconcentreerd zoutzuur. 4000 cm* van een keraeluaat werd opgevangen met rïaa-r-i n 4' -epi-doxorubicine dat nog altijd 10 % onzuiverheden be- 3 5 vatte , alsmede 1500 cm van een sloteluaat, dat- in hoofdzaak onzuiverheden bevatte.

Het kemeluaat werd geconcentreerd tot 1500 cm*, met natrium-formiaat op pH 4,8 gebracht en geadsorbeerd op 250 cm* carboxymethyl-cellulose in een kolom met een diameter van 2,5 cm bij een stroom-10 snelheid van 500 cm*/uur. Nadat alles was geadsorbeerd, werd de kolom gewassen met een mengsel van 99,3 % ethanol, 0,7 % water en 0,015 % geconcentreerd zoutzuur, waarna geëlueerd werd met een mengsel van 90 % ethanol, 10 % water en 0,05 % geconcentreerd zoutzuur, waarbij 3200 cm* van een kemeluaat werd opgevangen.

3 15 Dit eluaat werd in vacuo geconcentreerd tot 60 cm en het pro- 3 dukt neergeslagen door een toevoeging van 300 cm aceton.

Aldus werd 6,9 gram 41-epi-doxorubicine verkregen met een titer van 91,2 % en een gehalte aan onzuiverheden van 3 %; De opbrengst bedroeg 55,3 %.

20 Voorbeeld VI.

Zuivering van doxorubicine.

(a) 70 gram doxorubicine werd opgelóst in 28 liter water. De pB werd met een buffer op 3,7 - 4,5 gebracht en deze oplossing geadsorbeerd op 2 liter SI 12 Kastell hars in een kolom met een diameter van 6 cm. Het 25 produkt werd geëlueeerd met een mengsel van 35 liter water en 15 liter methanol.

40 liter eluaat werd in vacuum geconcentreerd, tot 0,5 liter en het produkt gekristalliseerd door een toevoeging van een mengsel van o 1 liter ethanol en 4,5 liter aceton waarbij 3 uren bij +5 C werd ge-30 roerd.

Het produkt werd afgefiltreerd, gewassen met 0,0 liter aceton o en in vacuum gedurende 5 uren bij +40 C gedroogd.

Verkregen werd aldus 56,0 gram halfgezuiverd doxorubicine (I) (b) 80,0 gram halfgezuiverd doxorubicine (I), verkregen volgens (a) 35 werd opgelost in 24 liter water en met een buffer op pH 4,0 gebracht.

Deze oplossing werd geadsorbeerd op een kolom met een diameter van 12 cm en met daarin 1,6 liter carboxymethylcellulose van Wathman.

8304327 --- ί -6-

* * V

Het effluent van de kolom werd verwijderd; vervolgens werd de kolom gewassen met 3,2 liter water en pas hierna het produkt geëlueerd met 55 liter water met pH 2,5, aangezuurd door een toevoeging van zoutzuur.

5 46 liter eluaat werd opgevangen en in vacuum geconcentreerd tot een volume van 0,6 liter waarna men het produkt liet kristalliseren door een voorzichtige toevoeging van een mengsel van isopropanol en aceton (1 : 3).

Het gevormde produkt werd afgefiltreerd, met 1 liter aceton 10 gewassen en 4 uren bij +40°C gedroogd. Aldus werd 65 gram doxorubicine verkregen met een titer van 98,5 % en een gehalte aan onzuiverheden van 1,5 %.

8304327

Claims

1. Werkwijze voor het zuiveren van anthracyclinon-glycosiden, met het kenmerk, dat de zuivering wordt uitgevoerd door een selectieve adsorptie op harsen van een waterige oplossing van het onzuivere pro- I dukt. I

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de oplossing I met het ruwe,, te zuiveren produkt op een pH van 3 tot 5 wordt gebracht, I alvorens dit op de hars wordt geadsorbeerd- I

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de voor de I adsorptie gebruikte harsen zijn gekozen uit de polymere- en de inonen- I 10 uitwisselende adsorptieharsen enerzijds en carboxymethylcellulose I anderzijds. I

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de adsorptie op de hars van de oplossing van het te zuiveren ruwe produkt kan worden I uitgevoerd door slechts een type hars te gebruiken of, afhankelijk van I 15 de aard van de onzuiverheden, verschillende typen hars , in het laatste I geval in een passende volgorde. I

5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de gezuiver- I de verbinding na adsorptie weer van de hars wordt gedesorbeerd. I

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de desorptie I 20 van de gezuiverde verbinding van de hars wordt uitgevoerd door elueren I met zwakzuur reagerend water of een mengsel van water met een polair oplosmiddel. I

7. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de zuivering door een selectieve adsorptie op harsen zowel wordt gebruikt voor I anthracyclinon-glycosiden die verkregen zijn door een fermentatie als I 25 voor verbindingen die synthetisch zijn bereid. I 8304327