NO834765L - Fremgangsmaate for rensing av antra-cyclinon-glukosider ved adsorpsjon paa harpikser - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for rensing av antracyklinon-glykosider ved selektiv adsorbsjon på harpikser.

Ønsket om å ha en meget spesifik metode for bruk til opp-nåelse av nevnte glykosider i i det vesentlige ren form, kommer hovedsakelig fra de fermentative produksjonsprosesser og de syntetiske fremstillingsprosesser der mengden organiske og uorganiske urenheter i råproduktet er spesielt høyt,

og i middel utgjør fra 12 til 25%.

De konvensjonelle metoder som til nu har vært benyttet i kjente renseteknikker og som har omfattet ekstrahering av råproduktet med klorerte oppløsningsmidler og deretter ut-vasking med buffere, førte imidlertid til et sluttprodukt der urenhetsandelen, selv om den vesentlig grad ble redu-sert, lå innen området mellom 4,5 og 5,0%.

Selv om den generelt har vært ansett som aksepterbar, har nevnte renhetsstandard, tatt i betraktning den spesielle sensivitet ved behandling av kjemiske midler med glykosi-disk molekyl, stimulert interessen for forskning rettet mot en forbedret rensemetode som muliggjør å oppnå et i det vesentlige rent sluttprodukt. Tatt i betraktning den spesielle bruk av antracyklinon-glykosider i klinisk prak-sis som anti-tumulært middel og sideproblemene ved dosering og giftighet, er den optimale eliminering av urenheter, generelt meget giftige sådanne, en evident bekreftelse på foreliggende oppfinnelses anvendelsesmuligheter.

Oppfinnelsen som tillater å oppnå et sluttprodukt som inneholder urenheter i en maksimal mengde på 2%, er generelt basert på en prosess som gjennomfører adsorbsjon av råproduktet på forskjellige typer harpikser i sur omgivelse (pH 3-5), og etterfølgende eluering med vann eller blandinger av vann og et molart oppløsningsmiddel. Mere spesielt medfø-rer fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen en fase hvori lett sure, vandige midler som inneholder vannoppløselige oppløste stoffer adsorberes på harpiksen som dispergert i partiklene, slik som granuler eller kuler, og et etterfølgende trinn med deadsorbsjon av stoffene som er adsorbert i den første fase.

Den adsorberende harpiks kan være inneholdt i en egnet behol-der som i det vesentlige har formen at et tårn eller en kolonne, hensiktsmessig fylt med harpikspartikler. Avhengig av typen urenheter i råproduktet, kan eluatet som oppnås ved deadsorbsjon fra en første type harpiks, hensiktsmessig suksessivt adsorberes på en harpiks av en annen type enn den fra hvilken den elueres ved kjente metoder.

I den foreliggende kromatografiske rensemetode, anvendte man adsorbsjonsharpikser av polymer- og ionebyttetypen, eller av karboksymetylcellulose-typen, det riktige valg,

den egnede sekvens ved bruk av de forskjellige typer harpiks i henhold til råproduktet som skulle renses, den lette sure omgivelse under adsorbsjonen, tillot å oppnå en høy grad av renhet i sluttproduktet, eliminering av anvendelsen av klorerte organiske oppløsningsmidler, og utmerkede utbytter under rensingen.

De følgende eksempler skal kun illustrere oppfinnelsen.

Eksempel 1.

Rensing av 4- demetoksy- daunorubicin.

i 15.0 g 4-demetoksy-daunorbicin i rå tilstand og med en titer på 70,2% og således med et urenhetsinnhold på ca. 18%, opp-løses i 3,6 liter av en oppløsning og 0,5% natriumacetat. Oppløsningen, bragt til en pH-verdi på 4,7 ved tilsetning

av eddiksyre, adsorberes på 400 ml "Amberlite XAD2" fra Rohm og Haas, i en kolonne med en diameter på 2,5 cm. Produktet vaskes med 1000 ml vann og elueres deretter med en blanding av vann og metanol i et vektforhold på 5:1. Som

et første eluat samles 2000 ml oppløsning inneholdende aglukoner og forskjellige urenheter.

Elueringen fortsettes med en blanding av vann-metanol i

et volumforhold på 1:1, og det samles en fraksjon på 4500 ml: i oppløsning inneholder dette eluat nevnte 4-derr.etoksy-daunorubicin samråen med 10% urenheter.

Eluatet bringes til en pH-verdi på 2,8 ved tilsetning av saltsyre og vakuumkonsentreres til et volum på 1500 ml. Ved tilsetning av natriumacetat til den konsentrerte oppløs-ning, bringes pH-verdien til 4,0, og den lett sure oppløsning adsorberes på 150 ml "CM Cepharose Cl 6B" fra Pharmacia, inneholdt i en kolonne med en diameter på 2,5 cm og ved en strømningshastighet på 150 ml pr. time. Etter ferdig adsorbsjon blir kolonnen først vasket med 450 ml vann og deretter eluert med 0,3% saltsyre. Det første 800 ml eluat inneholdende 18% urenheter, bringes til en pH-verdi på 4,7 ved tilsetning av natriumacetat, og oppsamles for tilbake-føring til oppløsningen av uren 4-demetoksy-daunorubicin som skulle adsorberes på "Amberlite XAD2" i det første rense-trinn .

Det deretter følgende eluat på 3500 ml og inneholdende ren

, 4-demetoksy-daunorubicin, konsentreres under vakuum til

et volum på 50 ml. Det tilsettes 250 ml aceton, det opp-nådde precipitat filtreres av, vaskes med aceton og tørkes. Med et utbytte på 52%, beregnet på opprinnelig råprodukt,

4-demetoksy-daunorubicin, oppnåd med en titer på 97% og

I et urenhetsinnhold på mindre enn 3%.

Eksempel 2.

Rensing av daunorubicin.

i

15.0 g klorert daunorubicin med en titer på 74,2% som sådan og et urenhetsinnhold på 8,5%, oppløses i 4500 ml vann.

Oppløsningen bringes til pH 5,0 ved tilsetning av natriumacetat og adsorbert på 400 ml "S112" Kastell harpiks eller på "Amberlite ER180" fra Rohm og Haas, inneholdt i kolonner med en diameter på 2,5 cm. ved en strømningshastighet på

600 ml/time (1,5 b/v).

Produktet vaskes med 1000 ml oppløsning av 1% natriumklorid og elueres deretter med en blanding av vann-etancl i et volumforhold på 1:1.

Tetfraksjonene på 400 ml inneholdende aglukonene i oppløsning fjernes og elueringen fortsettes ved oppsamling igjen av 260 ml eluat inneholdende ren daunorubicin. pH-verdien justeres til 2,5 ved tilsetning av fortynnet saltsyre, aceton tilsettes, og produktet tillates å krystallisere ved en temperatur av +5°C i 6 timer. Produktet filtreres, vaskes med aceton og vakuumtørkes i 12 timer.

Med et utbytte på 80%, beregnet på råproduktet, oppnås det et daunorubicin med de følgende karakteristika, bestemt ved HPLC: titer 97%; urenhetsinnhold 2,6%.

Eksempel 3.

Rensing av 4-demetoksy-doksorubicin.

2000 ml vandig oppløsning inneholdende 10,4 g 4-demetoksy-doksorubicin med et urenhetsinnhold på 14% absorberes på 50 ml "ER180" fra Rohm og Haas, inneholdt i en kolonne med en diameter på 2,5 cm med en strømningshastighet pl 250 ml/time. Eluatet, partielt renset ved selektiv adsorbsjon av urenhetene, adsorberes deretter på 200 ml "CM Sepharose Cl 6B" fra Pharmacia. Produktet elueres med en blanding

av 50 deler metanol, 50 deler vann og 0,015 deler konsentrert saltsyre, kassering av tetfraksjonene (ca. 800 ml) inneholdende aglukoner og andre urenheter. Deretter samles 200 ml eluat inneholdende rent stoff, og i dette konsentreres

til 6 ml under vakuum. Ved omrøring i 3 timer, tilsettes 300 ml aceton. Precipitatet filtreres, vaskes med aceton og tørkes. Med et utbytte på 58,2% av det teoretiske, oppnås 6,5 g ren 4-demetoksy-doksc-rubicin med et urenhetsinnhold på 3%.

Eksempel 4.

Rensing av 4'- desoksy- doksorubicin.

Ved bruk av 15,0 g 4'-desoksy-doksorubicin med en titer

på 69,2% og med et innhold av organiske urenheter på 12% såvel som en urenhet av mineralske salter på 12%, oppløses i 2000 ml vann og adsorberes på 300 ml "CM Cephadex C25" harpiks med en strømningshastighet på 600 ml/time. Etter ferdig adsorbsjon, blir oppløsningen eluert med 0,3% saltsyre og man opp en fraksjon på 6500 ml inneholdende 4'-desoksy-doksorubicin.

Eluatet, bragt til en pH-verdi på 3,8 ved tilsetning av

en oppløsning av natriumhydrat, adsorberes på 200 ml "S112 Kastel" harpiks ved en strømningshastighet på 400 ml/time. Produktet vaskes med 600 ml vann og elueres deretter med metanol, surgjort til pH 2,0 ved hjelp av saltsyre.

600 ml ytterligere eluat oppnås, dette vakuum konsentreres til 60 ml. Under omrøring blir den konsentrerte oppløsning langsomt helt i 600 ml aceton. Precipitatet som dannes filtreres av, vaskes med aceton og tørkes.

Med en utbytte på 61% av det teoretiske, oppnås 4'-desoksy-doksorubicin med en titer på 95,8% og et urenhetsinnhold på 4,2%.

Eksempel 5.

Rensing av 4'- epidoksorubicin.

15,0 g uren 4<1->epidoksorubicin med en titer på 75,9% og et urenhetsinndhold på 15% oppløses i 4000 ml vann.

Oppløsningen bringes til en pK-verdi på 4,8 ved tilsetning av natriumformeat og absorberes på 400 ml "Amberlite IRC 724" harpiks inneholdt i en kolonne med en diameter på 2,5 cm ved en strømningshastighet på 1600 ml/time (4 b.v.).

Kolonnen vaskes med 800 ml vann og elueres deretter med

en blanding civ 9 5 deler metanol, 5 deler vann og 0,015 deler saltsyre. 4000 ml eluat oppsamles med 4<1->epidoksorubicin fremdeles inneholdende 10% urenheter, samt 1500 ml haleeluat med hovedsakelig urenhetsinnhold.

Kjerneeluatet konsentreres til 1500 ml, bringes til pH 4,8 ved tilsetning av natriumformeat, og absorberes på 250 ml "Carbokxymetylcellulose Wathman" harpiks, inneholdt, i en kolonne med diameter 2,5 cm ved en strømningshastighet på 500 ml/time (2 b.v.).

Ved ferdig absorbsjon, vaskes produktet med en blanding

av 99,3 deler etanol, 0,7 deler vann og 0,015 deler konsentrert saltsyre, og elueres deretter med er. blanding av 90 deler etanol, 10 deler vann og 0,05 deler konsentrert saltsyre, hvorved man oppnås 3200 rr.l kjerneeluat.

Eluatet konsentreres under vakuum ti] 60 ml og produktet felles ut ved tilsetning av 300 ml aceton.

Man oppnår 6,9 g 4'-epidoksorubicin med en titer på 91,2% og et urenhetsinnhold på 3%. Utbytte = 55,3%.

Eksempel 6.

Rensing av doksorubicin.

(a) 70 g doksorubicin oppløses i 28 1 vann, pH-verdien bringes til 3,7-4,5 ved tilsetning av buffer og oppløsningen absorberes på 2 1 "S112 Kastell" harpiks i en kolonne med diameter 6 cm. Produktet elueres med en blanding av 35 liter vann og 15 liter metanol.

Eluatet i en mengde av 40 liter vakuumkonsentreres til 0,5 liter og produktet krystalliseres ved tilsetning av en blanding av 1 liter etanol og 4,5 liter aceton under omrøring ved +5°C i 3 timer.

Produktet filtreres, vaskes med 0,0 1 aceton (?) og vakuum-tørkes ved +40°C i 5 timer.

Man oppnår 56,0 g monorenset doksorubicin. (I).

(b) 80,0 g monorenset doksorubicin (I), oppnådd under (a) ovenfor, oppløses i 24 liter vann og bringes til pH

4,0 ved tilsetning av buffer.

Oppløsningen adsorberes på en kolonne med diameter 12 cm,

og inneholdende 1,6 liter "Carboksymetylcellulose Wathman" harpiks.

Kolonneavløpet fjernes.

Etter vasking med 3,2 liter vann, elueres produktet med

55 liter vann bragt til en pH-verdi på 2,5 ved tilsetning av saltsyre. 46 liter eluat oppsamles og vakuumkonsentrereres til et volum av 0,6 liter, og produktet tillates å krystallisere ved forsiktig tilsetning av en blanding av isopropanol og

aceton i forholdet 1:3.

Produktet filtreres, vaskes med 1 liter aceton og tørkes ved 40°C i 4 timer.

Man oppnår 65 g doksorubicin med en titer på 98,5% og et urenhetsinnhold på 1,5%.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for rensing av antracyklinon-glykosider, karakterisert ved * at rensingen gjennomføres ved selektiv adsorbsjon på harpikser av den vandige oppløsning av råproduktet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at oppløsningen som inneholder råproduktet som skal renses, bringes til en pH-verdi innen området 3-5 før adsorbsjon på harpiksen.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at harpiksen som benyttes for adsorbsjon, velges blant gruppen omfattende polymere og ione-bytte-adsorberende harpikser eller karboksymetylcellulose.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at harpiksadsorbsjonen av oppløs-ningen som inneholder råproduktet som skal renses, utføres ved bruk av kun en type harpiks eller, avhengig av arten av urenheter, på forskjellige typer harpikser som benyttes i en egnet valgt sekvens.

5. Fremgangsmåte ifølge krav ^ karakterisert ved at det rensede stoff deadsorberes fra harpiksen.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at deadsorbsjonen av renset stoff fra harpiksen gjennomføres ved eluering ved hjelp av lett surt vann eller en blanding av vann og et polart oppløsnings-middel.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at rensingen ved selektiv adsorbsjon på harpikser benyttes både for antracyklinon-glykosider oppnådd ved fermentering og for tilsvarende synteseforbindelser.