NL193108C - Werkwijze voor het zuiveren van een anthracyclinon-glycoside. - Google Patents

Description

1 193108

Werkwijze voor het zuiveren van een anthracyclinon-glycoside

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het zuiveren van een anthracyclinon-glycoside.

Een dergelijke werkwijze is bekend uit het Franse octrooischrift 1.593.235. Dit document beschrijft een 5 werkwijze voor de bereiding van het anthracyclinon-glycoside daunorubicine. Tevens wordt beschreven hoe daunorubicine kan worden gezuiverd. Volgens de beschreven zuivering worden extractiestappen uitgevoerd met bijvoorbeeld chloroform, eventueel voorafgegaan door een adsorptie aan een hars. Ter verkrijging van zeer zuiver daunorubicine wordt gesuggereerd om bijv. chromatografie of vloeistofextractie toe te passen.

De uitvinding beoogt nu een werkwijze te verschaffen voor een ander anthracyclinon-glycoside, namelijk 10 4-demethoxydaunorubicine. Er bestaat behoefte aan een industrieel toepasbare methode voor het verkrijgen van 4-demethoxydaunorubicine in een zuivere vorm, omdat zowel bij de fermentatie als bij de synthetische bereiding vrij grote hoeveelheden organische en anorganische onzuiverheden in het product optreden met een gemiddelde van 12 tot 25%. Voor een beschrijving een bekende bereidingswijze van anthracyclinon-glycosiden kan worden verwezen naar het Britse octrooischrift 1.467.383.

15 De tot dusver gebruikte methoden (zoals te herleiden uit het Britse octrooischrift 1.467.383), waarbij het ruwe product met gechloreerde oplosmiddelen werd geëxtraheerd en vervolgens met buffers werd gewassen, leiden tot een eindproduct waarvan het percentage onzuiverheden weliswaar sterk is verminderd, maar nog altijd ligt in een traject tussen 4,5 en 5,0%.

Hoewel dit gehalte aan onzuiverheden vaak aanvaardbaar wordt geacht, moet gezien de specifieke 20 gevoeligheid voor bepaalde handelingen en chemische stoffen van het glycoside-molecuul toch naar een verbeterde zuiveringsmethode worden gestreefd die het mogelijk maakt een nagenoeg zuiver product te verkrijgen. Gezien het specifieke gebruik van 4-demethoxydaunorubicine in de klinische praktijk als anti-tumormiddel en de nevenproblemen betreffende dosering en giftigheid, is een optimale eliminatie van onzuiverheden, die gewoonlijk zeer giftig zijn, van groot belang te achten.

25 De uitvinding voorziet nu in een werkwijze van de in de aanhef genoemde aard die industrieel toepasbaar is, welke werkwijze wordt gezuiverd ter verkrijging van een eindproduct met een onzuiverheidsgehalte van niet meer dan 3%, waarbij een waterige oplossing van 4-demethoxydaunorubicine, gebufferd bij een pH-waarde van 4,7, wordt geadsorbeerd aan een hydrofobe, niet-ionogene, op polystyreen gebaseerde hars met een porositeitsvolume 42%, een werkelijke (nat) dichtheid 1,02 g/ml, een specifiek oppervlakte 330 30 m2/g, een gemiddelde poriëndiameter 9 μιη en met een deeltjesgrootte van 0,3-0,9 mm, waarbij de verhouding van de hars en het ruwe 4-demethoxydaunorubicine 27:1 (vol./vol.) is, het geadsorbeerde product eerst wordt geëlueerd met een 5:1 (vol./vol.) mengsel van water en methanol en vervolgens met een 1:1 (vol./vol.) mengsel van water en methanol, het tweede gedeelte van genoemd eluaat, dat gedeeltelijk gezuiverd 4-demethoxydaunorubicine bevat, wordt geconcentreerd en op een pH-waarde van 4,0 35 gebracht, deze oplossing wordt gereadsorbeerd op een macroporeuze ionenuitwisselingshars op basis van een verknoopte agarosegel waaraan carboxymethylgroepen zijn gebonden in de natriumvorm, met een capaciteit van 100-140 μιηοΙ/ml, en met een deeltjesgrootte van 45-165 μηπ, het geadsorbeerde product wordt geëlueerd met 0,03 gew.% zoutzuur, het eluaat-gedeelte dat gezuiverd 4-demethoxydaunorubicine bevat, wordt afgescheiden en geconcentreerd en het gezuiverde product wordt geïsoleerd uit het genoemde 40 geconcentreerde eluaat door precipitatie.

Het volgende voorbeeld licht de uitvinding nader toe:

Amberlite XAD: (Rohm en Haas) is beschreven in Fluka, Produkt Informatie, blz. 80 (1995), CM Sepharose C1 6B (Pharmacia) is beschreven in ”lon Exchange Chromatography: Principles and Methods”; 3e editie (1991), door Pharmacia LKB Biotechnology.

45

Voorbeeld 15.0 gram 4-demethoxydaunorubicine in ruwe vorm met een titer van 70,2% en een gehalte aan onzuiverheden van 18% werd opgelost in 3,6 liter van een oplossing van 0,5% natriumacetaat. Deze oplossing werd met azijnzuur op pH 4,7 gebracht en geadsorbeerd op 400 m3 Amberlite XAD2 (Rohm en Haas) in een 50 kolom met een diameter van 2,5 cm. Het product werd gewassen met 1000 cm3 water en vervolgens geëlueerd met een mengsel van water/methanol (5:1 volumina). Als een eerste eluaat werd 2000 cm3 oplossing met agluconen en diverse onzuiverheden opgevangen.

Bij verder elueren met een mengsel van water/methanol (1:1) werd een fractie van 4500 cm3 opgevangen: dit eluaat bevatte in oplossing het 4-demethoxydaunorubicine tezamen met 10% onzuiverheden.

55 Dit eluaat werd met zoutzuur op pH 2,8 gebracht en vervolgens in vacuo geconcentreerd tot een volume van 1500 cm3. Door een toevoeging van natriumacetaat aan de geconcentreerde oplossing, werd de pH op 4.0 gebracht en deze zwakzure oplossing geadsorbeerd op 150 cm3 CM Sepharose C1 6B (Pharmacia) in

Claims (1)

193108 2 een kolom met een diameter van 2,5 cm waarbij een stroomsnelheid van 150 cm3/uur werd aangehouden. Nadat alles was geadsorbeerd, werd de kolom eerst uitgewassen met 450 cm3 water en daarna geëlueerd met 0,03% zoutzuur. De eerste 800 cm3 eluaat met 18% onzuiverheden werden door een toevoeging van natriumacetaat op 5 pH 4,7 gebracht en gerecirculeerd naar de oplossing van het ruwe 4-demethoxydaunorubicine, bestemd voor adsorptie op de Amberlite XAD 2 harsen voor de eerste zuiveringstrap. Het volgende eluaat (3500 cm3) met zuiver 4-demethoxydaunorubicine werd in een vacuüm geconcentreerd tot een volume van 50 cm3, waarna 250 cm3 aceton werd toegevoegd, het verkregen neerslag afgefiltreerd, met aceton gewassen en gedroogd. Met een opbrengst van 52%, berekend op het ruwe 10 uitgangsproduct, werd een 4-demethoxydaunorubicine verkregen met een titer van 97% en een gehalte aan onzuiverheden van minder dan 3%. 15 Werkwijze voor het zuiveren van een anthracyclinon-glycoside, met het kenmerk, dat 4-demethoxydaunorubicine wordt gezuiverd ter verkrijging van een eindproduct met een onzuiverheids-gehalte van niet meer dan 3 gew.%, waarbij een waterige oplossing van 4-demethoxydaunorubicine, gebufferd bij een pH-waarde van 4,7, wordt geadsorbeerd aan een hydrofobe, niet-ionogene, op polystyreen 20 gebaseerde hars met een porositeitsvolume 42%, een werkelijke (nat) dichtheid 1,02 g/ml, een specifiek oppervlakte 330 m2/g, een gemiddelde poriëndiameter 9 μηη en met een deeltjesgrootte van 0,3-0,9 mm, waarbij de verhouding van de hars en het ruwe 4-demethoxydaunorubicine 27:1 (vol./vol.) is, het geadsorbeerde product eerst wordt geëlueerd met een 5:1 (vol./vol.) mengsel van water en methanol en vervolgens met een 1:1 (vol./vol.) mengsel van water en methanol, het tweede gedeelte van genoemd eluaat, dat 25 gedeeltelijk gezuiverd 4-demethoxydaunorubicine bevat, wordt geconcentreerd en op een pH-waarde van 4,0 gebracht, deze oplossing wordt gereadsorbeerd op een macroporeuze kationenuitwisselingshars op basis van een verknoopte agarosegel waaraan carboxymethylgroepen zijn gebonden met een capaciteit van 100-140 jUmol/ml, in de natrium vorm met een deeltjesgrootte van 45-165 μιη, het geadsorbeerde product wordt geëlueerd met 0,03 gew.% zoutzuur, het eluaatgedeelte dat gezuiverd 4-demethoxydaunorubicine 30 bevat, wordt afgescheiden en geconcentreerd en het gezuiverde product wordt geïsoleerd uit het genoemde geconcentreerde eluaat door precipitatie.