DE1467986A1

DE1467986A1 - Verfahren zur Isolierung des Antibiotikums Fusidinsaeure durch selektive Adsorption

Info

Publication number: DE1467986A1
Application number: DE19611467986
Authority: DE
Inventors: Lorck Henning Otto Bojsen; Sverre Jahnsen; Godtfredsen Wagn Ole
Original assignee: Leo Pharmaceutical Products Ltd AS
Current assignee: Leo Pharma AS
Priority date: 1960-09-21
Filing date: 1961-09-21
Publication date: 1969-03-13
Also published as: FR1651M; DK114682B; DE1468178A1; SE334435B; SE334436B; ES270607A1; DK114542B; CH458624A

Description

Beschreibung Verfahren zur Isolierung des Antibiotikums Fusidinsäure durch selektive Adsorption.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung einer bisher unbekannten antibiotisch wirksamen Substanz, genannt Pusidinsäure (die auch als Antibiotikum ZN-6 bezeichnet wird) aus einem, ie substanz enthaltenden, Kulturmedium. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung des Antibiotikums durch selektive desorption, wodurch das Extraktionsverfahren vereinfacht und verbilligt wird. und insbesondere einfachere Vorrichtungen für die Isolierung verwendet werden können.
Das Antibiotikum wird erzeugt, indem man einen Mikroorganismus unter geregelten Bedingunen in einem geeigneten Kulturmedium wachsen läßt. Die bekannten Pilze dephalosporium lammelaecola und Fusidium coccineum Fuck K.Tubaki erzeugen diese Substanz unter geeigneten Kulturbedingungen in, für die industrielle Produktion zufriedenstellenden, Mengen.
Bei bakteriologischen Untersuchungen erwies sich das Antibiotikum Pusidinsäure gegen eine Anzahl pathogener Mikroorganismen wirksam, insbesondere gegen Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae , und deren penicillinresi-stente Stämme, ferner gegen Neisseria meningitides, Nycobacterium tuberculosis, und die streptomycin-, isonikotinsäurehydrazid- oder p-amino-salyzilsäure-reBistenten Stämme dieser Organismen und gegen Corynebacterium diphteriae.
Das Antibiotikum Fusidinsäure ist eine schwache Säure, die mit verschiedenen anorganischen und organischen Basen Salze und außerdem sogenannte Solvate, das sind Molekülverbindungen mit gewissen Lösungsmitteln, bilden kann.
Die elektrometrische Titration des Antibiotikums mit 80%-igem wässrigem Äthanol lieferte einen pKa-Wert, der einem pKa-ifert von ungefähr 5,3 in Wasser entspricht. Perner zeigt die Titration ein Äquivalenzgewicht der Substanz von 516 an.
Untersuchungen über die chemische Struktur und analytische Daten für diese Substanz deuten auf die Formel C31H48O6 hin. Die Verbindung scheint ein Cyclopentenopolyhydrophenanthren-Ringsystem, das durch 2 Hydroxylgruppen, eine Acetoxygruppe und 4 lVrethylgruppen substituiert ist und in 17-Stellung über eine Doppelbindung mit dem α-Kohlenstoffatom von 5-Methyl-4,5-heptensäure verbunden ist, zu enthalten, Die Struktur des Antibiotikums Fusidinsäure wurde bisher nicht endgültig aufgeklçrt, jedoch wird angenommen, daß die Verbindung nachstehende Formel (I) besitzt, in welcher die wellenförmigen Linien anzeigen, daß uie Konfiguration an den betreifenden Kohlenstoffatomen ungewiss ist und die unterbrochenen Linien, daß sich uer oetreffende Rest in α-Stellung befindet: Das ntibiotikum Fusidinsäure ist in Wasser und Hexan schwer löslich und leicht löslich in Äthanol, Azeton , Methylbutylketon, Amylacetat, Chloroform und ahnlichen Lösungsmitteln.
Das Antibiotikum kann Molekülverbindungen, sogenannte Solvate, mit einigen organischen Lösungsmitteln, insbesondere Benzol und Methanol, bilden, Diese Solvate sind gut kristallisierbare Substanzen.
Deshalb kann man sich der Bildung von SolVaten bei der Extraktion und Reinigung der Verbindung bedienen.
Das Fermentationsverfahren selbst fällt nicht in den Umfang der Erfindung. Das Ausgangsmaterial des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein, das Antibiotikum enthaltendes, Substrat und das eHinaungsgemäße Verfahren ist aaaurch gekennzeichnet, daß man ein, das Antibiotikum Fusidinsäure enthaltendes, Kulturmedium mit einem für das Antibiotikum geeigneten Adsorptionsmittel behanaelt, worauf man das Adsorptionsmittel isoliert und aus aiesem uas Antibiotikum als solches oder in Form eines Solvats oder eines seiner Salze durch Eluieren gewinnt.
Vorzugsvfeise wird die Adsorption nach Entfernung der Feststoffe, z.B. der verwendeten Mikroorganismen oder von Bestandteilen der verwendeten Nährstoffe, durch Filtration oder Zentrifugieren, aus dem Kulturmedium aurchgeffihrt.
Die auswahl des Adsorptionsmittels erfolgt insbesondere it Rücksicht auf die sauren eigenschaften aes Antibiotikums. Doch kann man auch ein Mittel anwenden, dessen Adsorptionsfähigkeit auf seinen physikalischen Eigenschaften Derunt.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsart ird die Adsorption mittels eines Anionenaustauschers, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7,0 oder mehr, durchgeführt, worauf man aas Harz von dem Kulturmedium abtrennt und das Antibiotikum durch eluieren Qes Ausorptionsmittels mit einem organischen Lösungsmittel für das antibiotikum, in Gegenwart einer Saure, oder mit einem Gemisch eines organischen Lösungsmittels und wassers, in Gegenwart einer Säure, isoliert.
Jedoch kann der Anionenaustauscher auch mit der wässrigen Lösung eines Salzes eluiert werden, dessen Anion das antibiotikum von dem Adsorptionsmittel verdrängen kann. Besonders verwendbare Elutionsmittel sinG wässrige Lösungen von Natriumsulfat oder Natriumzitrat, deren pH-Wert vorzugsweise auf ungefähr 7,0 eingestellt ist.
Letztere Ausführungsart hat aen Vorteil, daß der größere Teil des Antibiotikums in der Kulturflüssigkeit extrahiert wird, insbesondere, wenn eine mehrstufige Gegenstrom-Adsorption angewendet wira. ner Ionenaustauscher wird leicht regeneriert, so daß er erneut verwendet werden kann.
In einer anderen Austührungsart des ertindungsgemaßen Verfahrens wird aktivkonle als Adsorptionsmittel verwendet. Die Aktivkonle hat gleichzeitig entfärbende Wirkung und durch Extraktion des Antibiotikums aus aer abtiltrierten Kohle wird die Suostanz einem vorteilhaften Reinheitsgrad gewonnen. Die Extraktion wird vorzugsweise bei erhohter Temperatur mit einem solvatbilaenden Lösungsmittel, z.b. Methanol, durchgeführt, so daß beim Abkühlen der warmen Extraktionsflüssigkeit das Antibiotikum in Form eines Solvats kristallisiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren wira durch folgende Beispiele naher erläutert: Beispiel 1 20u ml des Ionenaustauscherharzes Amberlite IRA 401 s (OH) wurden mit drei Portionen von je zwei Litern einer geklärten Kulturflüssigkeit 2 Stunden geruht. Diese Kulturflussigkeit enthielt 110/u g Antibiotikum Busidinsaure je ml. Der pH-ifert wurde durch Zugabe von 2 n wässrigem Natriumhydroxyd unter Rühren auf 9,5 gehalten.
Analysen des Filtrats zeigten, daß 85 % des Antibiotikums an das Harz adsorbiert worden waren. Nach der Filtration wurde das Harz dreimal mit je 1,5 1 Wasser gewaschen und nierauf in 500 ml Azeton dispergiert.
Der pH-Wert wurde im Verlaufe von Stunden-durch Zusatz von 6 n Chlorwasserstoffsäure unter Rühren auf 3,6 herabgesetzt und hierauf das Harz abfiltriert und zweimal mit je 100 ml Azeton gewaschen.
Die Filtrate und Wasschflüssigkeiten wurden vereinigt.
Sie enthielten 375 mg Antibiotikum Pusidinsäure, entsprechend 57 s der in der Kulturflüssigkeit anwesenden enge.
Beispiel 2: 1 1 einer geklärten, das Antibiotikum Fusidinsäure enthaltenden, Kulturflüssigkeit wurde eine Stunde mit 5 g Entfärbungskohle (S.E.C.A. III) gerührt und filtriert. Im Filtrat wurde ein Gehalt von weniger als 25 mg Antibiotikum Fusidinsäure festgestellt.
Der Filterkuchen wurde mit siasser gewaschen und hierauf unter Rückfluß mit 100 ml Methanol 2 Stunden gekocht, abgekühlt und abfiltriert. Das Filtrat enthielt ungefähr 150 mg des Antibiotikums Fusidinsäure.
Patentansprüche

Claims

Patentans prüche Verfahren zur Isolierung des Antibiotikums Fusidinsäure aus einem dieses enthaltenden Kulturmedium, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man das Kulturmedium mit einem Adsorptionsmittel für das Antibiotikum behandelt, worauf man das Adsorptionsmittel abtrennt, dieses eluiert und das Antibiotikum als solches oder als Solvat oder als Salz isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man als Adsorptionsmittel Aktivkohle verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man als Adsorptionsmittel ein ionenaustauschendes Mittel verwendet, wobei man die Adsorption vorzugsweise bei einem pE-Wert von 7,0 oder darüber durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t daß man das Antibiotikum aus dem anionenaustauschenden Mittel mit einem organischen Lösungsmittel für das Antibiotikum in Gegenwart einer Säure oder mit einem Gemisch eines organischen Lösungsmittels und Wasser in Gegenwart einer Säure eluiert, worauf man das Antibiotikum aus dem eluat durch Eindampfen und Kühlen oder in einer anderen an sich bekannten Weise zur Kristallisation bringt.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man durch Eluieren des anionenaustauschfenden Mittels mit einer wässrigen Lösung eines Salzes, dessen Anion das Antibiotikum an dem Adsorptionsmittel ersetzen kann, ein Salz des Antibiotikums isoliert.