NL8400979A - Werkwijze voor het zuiveren van tylosine. - Google Patents

Description

*

843012/vdV/AD

Korte aanduiding: Werkwijze voor het zuiveren van tylosine

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het zuiveren van tylosine door selectieve adsorptie aan polymere harsen. Zoals beschreven in de wetenschappelijke- en octrooiliteratuur, wordt de tylo-sinebase geëxtraheerd uit de fermentatiebouillon die vooraf gebracht 5 is op een pH van 8,5 met behulp van gechloreerde organische oplosmiddelen, zoals dichloormethaan of chloroform^of niet-gechloreerde oplosmiddelen .zoals methyl-isobutylketon.

De samengevoegde organische extracten worden daarna in vacuo geconcentreerd en, na ontkleuren met actieve kool, slaat de tylosinebase 10 neer door toevoegen van n-hexaan.

Tylosinebase kan ook uit het organisch extract overgebracht worden in een waterige fase in de vorm van een oplosbaar zout door neutraliseren met een geschikt organisch- of anorganisch zuur (wijnsteenzuur of fosforzuur). De waterige oplossing die de oplosbare zouten van 15 tylosine bevat wordt vervolgens in vacuo gedroogd (sproeidrogen) voor het verkrijgen van een anti-bioticum in de vorm van het zout van het gebruikte zuur.

Volgens de bovengenoemde werkwijze is het in bepaalde gevallen niet mogelijk om een volledige verwijdering van de aanwezige onzuiver-20 heden te bereiken, in het bijzonder bij grote hoeveelheden onzuiverheden in de fermentatiebouillon, zodat de kwaliteit van het eindprodukt afhankelijk van het type van deze onzuiverheden (kleurstoffen of fermentatie nevenprodukten) vaak onbevredigend is zowel wat de titer als de analytische en organoleptische eigenschappen betreft.

25 De onderhavige uitvinding beoogt nu de bovengenoemde nadelen te ondervangen en een nieuwe werkwijze te verschaffen voor het zuiveren van tylosine die zeer eenvoudig is en de mogelijkheid biedt om een produkt te verkrijgen met eigenschappen overeenkomstig de eisen.

De werkwijze voor de zuivering volgens de uitvinding bestaat 30 uit een selectieve adsorptie van tylosine in de fermentatiebouillon (R) op een adsorberende hars ER-180 ' (Rohm en Haas) of andere typen poly mere harsen zoals amberliet^ (XAD^: XAD, - Rohm en Haas); type Daion^ (XAD2: XAD4 - Rohm en Haas); type Daion(R* (HP 20; HP 21; HP 30; HP 40; HP 50 - Mitsubishi); type Duoliet^ (S 861; S 862; S 863; S 866 - (R) (R) 35 Diamond Shamrock); type Kastel' ‘ (S 112 - Montedison); Lewatite' (OC 1031 - Bayer A.G.).

8400979 9+ ~ l

843012/vdV/AD

2

Het is derhalve voor de deskundige duidelijk dat het bijzondere onderwerp van de zuiveringswerkwijze volgens de uitvinding in de eerste plaats gelegen is in het vinden van de adsorptie-omstandig-heden, de geschikte oplosmiddelen en mengsels van oplosmiddelen 5 die gebruikt worden bij de desadsorptiereactie en, het juiste pH gebied, en de opeenvolgende bewerkingen die het mogelijk maken om een eindprodukt te verkrijgen in overeenstemming met de vereiste specificaties.

De nieuwe zuiveringswerkwijze, die hierna in het kort en meer 10 in bijzonderheden in de voorbeelden beschreven zal worden, bestaat uit het filtreren van de fermentatiebouillon en het brengen van het tylosine bevattende filtraat op pH 7,5 - 10 door toevoegen van een waterige natriumhydroxide oplossing gevolgd door adsorptie op de poly-mere hars.

15 Bij de genoemde pH waarden wordt de grootste hoeveelheid van de in de bouillon aanwezige gekleurde onzuiverheden verwijderd met het effluent terwijl de tylosinebase op de hars geadsorbeerd wordt. Gewezen dient te worden op een ander belangrijk voordeel van de werkwijze volgens de uitvinding door het zeer hoge adsorptievermogen van de hars 20 ten opzichte van het produkt (40 - 50 g/1) en de mogelijkheid om de hars opnieuw voor een volgende reactie te gebruiken na het uitvoeren van de desadsorptie met een waterige alcoholische- of waterige aceton-oplossing.

Na 20 tot 30 bewerkingskringlopen, afhankelijk van het type in 25 de fermentatiebouillon aanwezige onzuiverheden, is het alleen maar noodzakelijk om de hars te regenereren wat gemakkelijk kan plaatsvinden met een mengsel van waterrisopropanol alcohol (70:30) en' 4% natriumhydroxide. De desadsorptie van de tylosinebase van de hars wordt uitgevoerd zoals hierboven vermeld met behulp van een mengsel van water: 30 isopropanol of water:aceton bij voorkeur in een verhouding van 1:1.

Het aldus verkregen eluaat wordb geadsorbeerd op een macro-verknoopte zwatk. anionogene hars van het type IRA 35v (Rohm en Haas) om een volledige ontkleuring te bewerkstelligen.

(R) 35 Andere harsen van het type Lewatite (CA 9 222 - Bayer) of (5)

Kastel (A-105 - Montedison) kunnen ook eventueel gebruikt worden.

84 0 0 979 3

843012/vdV/AD

Na concentreren in vacuo en instellen van de pH slaat de tylosinebase uit het eluaat neer door uitzouten, waarbij de opbrengst ongeveer 80% bedraagt.

Uit de aldus verkregen gezuiverde tylosinebase kan men zijn 5 zouten (tartraat, fosfaat) bereiden door vorming van een zout met een stoechiometrische hoeveelheid zuur in een waterig-alcoholisch medium en het tot droog concentreren van de oplossing na filtreren door ontkleurende kool. Desgewenst kan men ook deze zouten direct verkrijgen door het gezuiverde eluaat om te zetten in een zout en vervolgens de 10 oplossing te onderwerpen aan sproeidrogen.

De volgende voorbeelden lichten de werkwijze volgens de uitvinding toe zonder haar echter te beperken.

Voorbeeld 1.

Zuivering van de tylosinebase.

15 Aan 440 kg fermentatiebouillon werd 3% Dic'aliet toegevoegd en vervolgens gefiltreerd op een roterend filter. De aldus verkregen gefiltreerde bouillon (615 liter) die 94% van de bruikbare uitgangswerk- zaamheid bezat werd op pH 7>5 gebracht door toevoegen van 20% natrium- (R) hydroxide en geadsorbeerd op een hars ER-18CT (Rohm en Haas) in een 20 kolom met een stroomsnelheid van 150/h (volume van het hars TOO 1; diameter van de kolom 22,5 cm). De geëxtraheerde bouillon vertoonde geen werkzaamheid meer bij titreren. De kolom werd vervolgens gewassen met 200 ml water met een snelheid van 150 1/h. Het waswater bevatte evenmin enige werkzaamheid van het antibioticum.

25 Vervolgens werd de kolom geëlueerd met een mengsel van water: isopropanol- of water:aceton in een verhouding van 1:1 en na verwijdering van 50 1 van de een werkzame stof bevattende vloeistof, werd tenslotte 100 1 van het centrale eluaat met 90% van de uitgangswerkzaamheid verzameld.

30 Dit eluaat werd geconcentreerd en vervolgens geadsorbeerd op (R) IRA 35 hars (Rohm en Haas) in een kolom die vooraf omgezet is in een zout met een snelheid van 20 1/h.

Het aldus verkregen ontkleurde eluaat werd gebracht op +10°C en op een pH van ongeveer 8,5 door toevoegen van een waterige natrium-35 hydroxide oplossing, terwijl 4,5 kg natrium-chloride toegevoegd werd.

Na 2 uren roeren bij 35°C werd de neergeslagen tylosinebase 8400979 U(V .. Λ*

843012/vdV/AD

4 afgefiltreerd door een Buchner-filter en gewassen met 8 1 water met een pH van 8,5 en een temperatuur van 45°C. Het gewassenprodukt werd in vacuüm gedroogd bij 45°C gedurende 8 uren en vervolgens gedurende 6 uren in een hoog vacuüm.

5 De opbrengst, berekend op de bruikbare beginwerkzaamheid, bedraagt nog ongeveer 80% van de tylosinebase overeenkomstig de normale specificaties.

Voorbeeld 2.

Bereiding van (neutraal) tylosine tartraat.

10 1 kg gezuiverde tylosinebase, verkregen volgens voorbeeld 1, werd gesuspendeerd in 3,0 1 methylalcohol en 9>066 kg wijnsteenzuur en 0,05 kg actieve kool toegevoegd. Na 30 minuten roeren bij kamertemperatuur werd het mengsel gefiltreerd op Dicaliet (0,10 kg), en het produkt gewassen met 1,0 1 methanol en het filtraat in vacuo geconcen-15 treerd (tempeatuur van de dampen 20° tot 25°C) tot droog.

Het aldus verkregen droge, breekbare residu, werd verder gedroogd in een oven in vacuo bij 50°C gedurende 3 uren en vervolgens gezeefd. Verkregen werd 911,5 g tylosinetartraat met 98,5% bruikbare werkzaamheid.

20 Voorbeeld 3.

520 kg fermentatiebouillon werden behandeld volgens voorbeeld 1 waarbij men ontkleurd en gezuiverd eluaat verkreeg. Aan het eluaat werd 396 g wijnsteenzuur toegevoegd en de pH gebracht op 6,0 tot 6,4. Vervolgens werden aan het reactiemengsel onder 30 minuten roeren bij 25 kamertemperatuur 300 g actieve kool toegevoegd. Na filtreren op Dicaliet werd de oplossing in vacuo geconcentreerd tot ongeveer 25 1 en vervolgens gesproeidroogd. Verkregen werden 4400 g tylosinetartraat met 98% bruikbare werkzaamheid.

Voorbeeld 4.

30 520 kg fermentatiebouillon werd behandeld als beschreven in voor beeld 1 onder vorming van het centrale eluaat. Vervolgens werd dit eluaat in vacuo geconcentreerd tot 70 1 onder gelijktijdige verwijdering van isopropanol uit de overdestillerende dampen. Toegevoegd werd 35 1 methyleenchloride en de pH op 8,5 gebracht door toevoegen van 20% van 35 een waterige natriumhydroxide oplossing.

Na 15 minuten roeren werd het organische extract afgescheiden, 8400979 »

843012/vdV/AD

5 in vacuo geconcentreerd tot 9,0 1 en 30,0 1 cyclohexaan onder roeren toegevoegd. Het reactiemengsel werd 3 uren geroerd bij 10° tot 15°C en het afgefiltreerde neerslag 4 uren in vacuo bij 40°C gedroogd.

Verkregen werden 4600 g tylosinebase met 95% bruikbare werk-5 zaamheid.

Voorbeeld 5.

490 kg fermentatiebouillon werden behandeld als beschreven (R) in voorbeeld 1 waarbij de adsorptie plaats vond op 100 1 Kastel S 122 hars.

10 Na wassen van de hars met gedeionizeerd water, werd tylosinebase geëlueerd met 300 1 van een mengsel van aceton;water in een verhouding van 2,3:1 met een stroomsnelheid van B/v/h.

100 1 centraal eluaat werd verzameld en omgezet in een zout met een 12% fosforzuur oplossing tot pH 5,5 en vervolgens werd in vacuo 15 geconcentreerd tot 10 1 ter verkrijging van een geconcentreerde oplossing overeenkomende met 5000 g tylosinefosfaat.

8400979

Claims (6)

1. Werkwijze voor het zuiveren van tylosine, met het kenmerk, dat deze zuivering uitgevoerd wordt door een selectieve adsorptie van de in de fermentatiebouillon aanwezige tylosine.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, m e t het kenmerk, 5 dat de te voren gefiltreerde fermentatiebouillon gebracht wordt op pH 7,5 - 10,0· door toevoegen van een waterige natriumhydroxide oplossing, voor de adsorptie op de polymere hars.

3. Werkwijze volgens conclusie 1,met het kenmerk, dat de polymere hars gewassen wordt met water en de geadsorbeerde tylo- . 10 sinebase vervolgens geëlueerd wordt met behulp van een mengsel van water: isopropanol 1:1 (volumedelen), waterraceton 1:1 (volumedelen) of water:aceton 1:2,3 (volumedelen).

4. Werkwijze volgens conclusie 1tot 3,met het ken merk, dat ter verkrijging van een volledige ontkleuring en een 15 maximale verwijdering van onzuiverheden, het eluaat verder gefiltreerd wordt op een macroverknoopte zwak. anionogene hars en het aldus verkregen filtraat'geconcentreerd en op pH 8,5 gebracht wordt, en natrium-chloride toegevoegd wordt om de zuivere tylosinebase neer te slaan.

5.5. Werkwijze volgens conclusie 1 tot 4, met het ken- 20 merk, dat de tylosinebase aanwezig in het filtraat na de adsorptie op de hars geëxtraheerd wordt met organische oplosmiddelen, zoals di-chloor^methaan^en geïsoleerd wordt door toevoegen van n-hexaan en cyclohexaan.

6. Werkwijze volgens conclusie 1 tot 4,met het ken- 25 merk, dat aan het filtraat, verkregen na adsorptie van. he-t waterige alcoholische of waterige-aceton eluaat op de anionogene hars een stoe-chiometrische hoeveelheid wijnsteenzuur of fosforzuur toegevoegd wordt om de tylosinebase om te zetten in de overeenkomstige zouten die geïsoleerd worden in de zuivere vorm door sproeidrogen van de oplossing die 30 deze zouten bevat. 8400979