DE2846118A1

DE2846118A1 - Verfahren zum gewinnen von moranolin und n-methylmoranolin

Info

Publication number: DE2846118A1
Application number: DE19782846118
Authority: DE
Inventors: Yoshiaki Aoyagi; Hiroshi Enomoto; Yoji Ezure; Shingo Matsumura; Masahiro Yagi; Yoshiaki Yoshikuni
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1977-11-10
Filing date: 1978-10-23
Publication date: 1979-05-17
Also published as: CH637936A5; FR2409986B1; SE7811582L; GB2009152A; ATA792378A; DE2846118C3; US4339585A; FR2414042A1; FR2409986A1; NL175819C; FR2414042B1; IT1111075B; NL175819B; NL8304395A; NL7811106A; SE439630B; GB2009152B; AT366032B; IT7851847A0; DE2846118B2

Description

Verfahren zum Gewinnen von Moranolin und N-Methylmoranolin

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gewinnen von Moranolin

HO

.011

(D

und N-Methylmoranolin

-OfI

CII₂OH

(III)

sowie von deren Salzen.

Eine Substanz der Formel (I) ist bereits aus Morus-Pilanzen und einem chinesischen Arzneikraut "Soh-hakuhi" (der WürzeL-rinde von Maulbeerpflanzen) als Naturstoff erstmals isoliert und als "Moranolin" bezeichnet worden (Yagi et al., Journal of the Agricultural Chemical Society, Japan, Band 50, Seite (1976)). Es wurde gefunden, daß Moranolin ein sehr nützliches Arzneimittel darstellt, indem es den Blutzuckerspiegel von zuckerbeladenen Lebewesen senkt. Darauf waren die Forschungen darauf gerichtet, ein Verfahren zur wirtschaftlichen Erzeugung

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dieser Substanz zu finden, was zu der vorliegenden Erfindung geführt hat, die ein sehr vorteilhaftes Gewinnungsverfahren für Moranolin angibt.

Außer dieser genannten Methode des Extrahierens von Moranolin aus Moruspflanzen und anderen ist als Gewinnungsverfahren für Moranolin nur eine Methode bekannt, nach der Nojirimycin

OH

A ,.0H

(II), j ι
HO-

II

ein durch eine bestimmte Actinomycetes-Art erzeugtes Antibiotikum, mittels eines Platinkatalysators oder mittels Natriumborohydrid reduziert wird (Inoue et al., Tetrahedron, .23, 2125 (1968)).

Das Verfahren zur Gewinnung von Nojirimycin durch Fermentierung und das Verfahren zum Reinigen desselben sind in den japanischen Patentanmeldungen No. 760/1968 und No. 5033/1970 beschrieben. Aus diesen Literaturstellen ist bekannt, daß Nojirimycin eine außerordentlich instabile Substanz ist und sich sogar schon unter neutralen Bedingungen zersetzt. Unter sauren Bedingungen zersetzt es sich sehr leicht. Deshalb ist es höchst schwierig, Nojirimycin aus seiner Kulturlösung zu isolieren. In den beiden vorstehend genannten Druckschriften ist auch festgestellt, daß zahlreiche mühevolle Arbeitsgänge notwendig sind, zu denen vor allem die Ionenaustausch-Säulenchromatographie gehört, und größte Umsicht hierfür erforderlich ist. Und. selbst dann, wenn ein Reinigungsverfahren mittels Anlagerung von schwefliger Säure, das als vorteilhaft erkannt worden ist, angewendet wird, gibt es bei der Reinigung 50 % und mehr Verlust. Was außerdem die Ableitung von Moranolin (I) aus dem

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erhaltenen gereinigten Nojirimycin angeht, so beträgt die Ausbeute nur 50 % oder weniger selbst dann, wenn ein teurer Platinkatalysator eingesetzt wird. Wenn man diese Faktoren zusammennimmt, so sind beim Gewinnen von Moranolin (I) aus Nojirimycin (II) in der Kulturlösung viele mühevolle Arbeitsgänge und Stufen erforderlich, und nichtsdestoweniger beträgt die Ausbeute nur 15 bis 20 %, so daß eine solche Methode in keiner Weise als wirtschaftlich angesehen werden kann.

Erfindungsgemäß wurden nun ernste Anstrengungen unternommen, ein wirtschaftliches Verfahren zum Gewinnen von Moranolin(I) zu finden, das ein nützliches Arzneimittel ist, wobei festgestellt wurde, daß durch katalytisches Reduzieren einer Lösung von Nojirimycin (II) enthaltender Actinomycetes-Kultur, so wie sie ist, mittels verschiedener Katalysatoren, wie Raney-Nickel, und anschließendes Behandeln der erhaltenen reduzierten Kulturlösung mit einem Ionenaustauschharz es überraschenderweise möglich ist, Moranolin (I) in nahezu quantitativer Ausbeute zu gewinnen. Außerdem sind als Metallkatalysatoren Mangan, Zink, Kobalt, Kupfer usw. und vor allem Raney-Nickel anwendbar. Diese Methode hat das höchst spezifische Merkmal, daß hierbei die Gesamtausbeute an Moranolin (I) aus Nojirimycin (II), das in dem Medium enthalten ist, nicht nur verbessert, d.h. auf einen Schlag um das fünffache oder mehr erhöht werden kann, verglichen mit dem konventionellen Verfahren, sondern es werden auch eine Reihe von mühevollen Stufen zum Extrahieren und Isolieren von Nojirimycin (II) im Verfahrensablauf überflüssig, und trotzdem ist es möglich, die Arbeitsgänge des Extrahierens und Reinigens des Endproduktes in hohem Maße zu vereinfachen. Beim Extrahieren von Nojirimycin (II) aus der Kulturlösung, wie bei der konventionellen Methode, behindern nämlich die in dem Medium enthaltenen Nährstoffsubstanzen und Metaboliten oder Zersetzungsprodukte von Nojirimycin das Extrahieren des gewünschten Nojirimycins (II), indem sich diese Substanzen mit dem Extrakt vermischen und so das Isolieren und Reinigen von Nojirimycin (II) erschweren;

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dazu kommt als Erschwernis noch die Instabilität von Nojirimycin (II) selbst. Dagegen wurde höchst überraschend festgestellt, da§i diese behindernden Substanzen durch den Reduktionsprozeß nach der Erfindung eine Denaturierung verursachen, und wenn das Extrahieren und Isolieren von Moranolin (I) aus der reduzierten Kulturlösung durch eine Ionenaustauschbeiiandlun^ vorgenommen wird, vermischen sich diese Substanzen kaum mit
dem erhaltenen Extrakt. Selbst wenn eine extrem kleine !,!enge an unreinen, behindernden Substanzen sich darin vermischen
sollte, ist es möglich, durch Salzbildung mit einer üblichen Mineralsäure oder einer geeigneten organischen Säure auf
übliche Weise leicht zu reinigen. Durch das Auffinden dieser Tatsachen konnte ein nicht zu erwartendes hohes Ausmaß an
Arbeitserleichterung erreicht werden, und kombiniert mil" der Tatsache, daß eine quantitative Ausbeute an der gewünschten
Substanz (I) erreicht werden kann, ist das Gewinnungsverfahren von Moranolin gemäß der Erfindung wirtschaftlich von höchstem Wert.

Im Zusammenhang damit wird auf die beigefügte Zeichnung hingewiesen. In dieser zeigt

Fig. 1 ein Dünnschichtchromatogramm von Kohmoranolin (I),
erhalten durch Ionenaustauschbehandlung gemäß der
Methode des nachfolgenden Beispiels 1 und

Fig. 2 ein Dünnschichtchromatogramm von Roh-Nojirimycin (II), erhalten durch Extraktion aus der gleichen Kulturlösung gemäß der Methode, wie sie in der japanischen Patentanmeldung 7G0/1968 beschrieben ist.

In beiden Fällen waren die Bedingungen wie folgt:
Adsorbent: Kieselsäuregel;

Entwicklungsmittel: Äthanol-Wasser-Chloroform (4:2:1);
Versuch mit Wasserstoff-Flammisonisierungsdetektor
(Synchrograph, hergestellt von Yatoron (phonetisch)).

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Wie aus Fig. 2 hervorgeht, liegt das Nojirimycin (II), das ein Vorläufer zu der Reduktion von Moranolin (I) ist, im Geraisch mit einer Vielzahl"und großen Mengen von Verunreinigungen und seine Extraktion behindernden Stoffen vor. Dagegen enthält das durch Reduktion und Extraktion gemäß der Erfindung erhaltene Moranolin (I) nahezu keine Verunreinigungen, wie Fig. 1 zeigt.

Erfindungsgemäß kann als Nickelkatalysator jeder beliebige aktivierte Nickelkatalysator mit Vorteil verwendet werden, jedoch sind im allgemeinen die handelsüblichen, technischen Raney-Nickel-Katalysatoren ausreichend«.

Dieser Aspekt der Erfindung wird nachfolgend anhand eines Beispiels im einzelnen erläutert.

Beispiel 1

Eine Nojirimycin produzierende Actinomycetes-Kultur (gehörend zu Streptomyces) wird in 5 1 eines flüssigen Mediums geimpft, das aus 2 % Stärke, 1 % Sojabohnenpulver, 0,05 % KCl, 0,u5 % MgSO₄-? H₂O, 0,5 % NaCl und 0,35 % CaCO₃ besteht, und bei 27 C wird 3 Stunden lang unter Belüftung die SchiittelinkuDacion vorgenommen. Nach Beendigung der Inkubation werden boü <j liigh-Flow-Super-Cell zugefügt. Danach wird filtriert, wodurch 4,4 1 Filtrat erhalten werden. Der Gehalt an Nojirimycin in diesem Filtrat betrug 500 yug/ml, wie durch biologischen Nachweise unter Anwendung von ß-Glukosidase (Niwa et al., Agr. Biol. Chem. , 34, 9t5ö (1970)) festgestellt wurde.

ml dieser Kulturlösung werden mit etwa Io ml handelsüblichem technischem Raney-Nickel versetzt, wonach in einem Wasserstoffstrom bei Normaltemperatur und unter Atmosphärendruck gerührt wird. Innerhalb von 6 Stunden werden etwa 200 ml gasförmiger Wasserstoff adsorbiert, wonach abgebrochen wird. Der Katalysator wird abfiltriert, und das erhaltene Filtrat wird durch eine Säule geschickt, die 300 ml Dowex 1x2 (OiI)

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enthält. Der erhaltene Auslauf wird weiterhin durch eine 200 ml Dowex 5OW χ 4 (H) enthaltende Säule geschickt. Die Säule wird mit 2 1 Wasser gewaschen, wonach die adsorbierten Substanzen mit 0,5 %igem wässrigem Ammoniak eluiert werden. Das erhaltene Eluat wird unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt, wobei blaßgelblich-braune Kristalle erhalten werden. Ausbeute: 280 mg. Das Dünnschichtchromatografie dieses Produktes ist in Fig. 1 dargestellt. Umkristallisieren aus Methanol ergibt 218 mg gereinigtes Moranolin (I). Fp. 203-205° C, [d] ^⁴ = 44,6° (Wasser). Ausbeute: 87 %.

Nachfolgend wird das Verfahren zum Gewinnen von N-Methylmoranolin (III) nach der Erfindung erläutert.

Es ist schon bekannt, daß die Verbindung (III) ein sehr nützliches Arzneimittel darstellt, indem sie den Blutzuckerspiegel von zuckerbeladenen Lebewesen senkt. Darüber hinaus konnte j>tzt im liahmen der Erfindung ein Herstellungsverfahren für diese Verbindung (III) gefunden werden.

(III)

ClI₀OH

Zur synthetischen Gewinnung der Verbindung (III) ist es bekannt, eine Verbindung (I) der vorstehend angegebenen Formel, d.h. das in Pflanzen vorkommende Moranolin (Yagi et al., Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan, Band 50, Seite 571 (1976)), der N-Methylierung zu unterziehen. Die der Erfindung zugrunde liegenden Studien waren jedoch darauf gerichtet, zur Herstellung der Verbindung (III) von einer Verbindung (II) der ebenfalls vorstehend angegebenen Formel auszugehen, die durch Fermentierung gewinnbar ist, d.h. von Nojirimycin (japanische Patentanmeldung No. 760/1963 und No. 5033/1970).

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Dabei wurde überraschenderweise gefunden, daß durch Anwendung einer höchst einfachen Arbeitsweise mit nur einer Stufe durch Zusetzen von Formaldehyd zu einer Nojirimycin enthaltenden Lösung und Reduzieren derselben es möglich ist, die Verbindung (III) in quantitativer Ausbeute zu gewinnen. Darüber hinaus ist es erfindungsgemäß möglich, als Nojirimycin (II) enthaltende Lösung außer einer Lösung von reinem Nojirimycin (II) sogar eine Lösung von Nojirimycin produzierender Actinomycetes-Kultur, so wie sie ist, einzusetzen. So ist das Verfahren nach der Erfindung von höchstem wirtschaftlichem Wert.

V/ie in den japanischen Patentanmeldungen 760/1968 und 5033/1970 beschrieben ist, ist Nojirimycin (II) eine höchst instabile Substanz, und die Ausbeute beträgt nach Extrahieren und Reinigen und ausgehend von der Kulturlösung und endend mit dem gereinigten Nojirimycin (II) nur etwa 40 %, salbst in dem Fall, wo das bisher als vorteilhaft angesehene Verfahren über/fein Addukt mit schwefliger Säure angewendet wird. Außerdem wird aus diesem Nojirimycin (II) nach einer bekannten Methode die Substanz (I) hergestellt (Inoue et al., Tetrahedron J23, 2155 (1968)), aus der dann die gewünschte Substanz (III) durch N-Methylierung erhalten wird. Bei diesem konventionellen Herstellungsverfahren, das zwei weitere Stufen erfordert und bei dem das mühevolle Extrahieren und Reinigen von Nojirimycin (II) notwendig ist, beträgt die Gesamtausbeute an (III), ausgehend von der Nojirimycin-Kulturlösung, nur 10 bis 15 %.

Dagegen ist es durch das Verfahren nach der Erfindung möglich, die gewünschte Substanz (III) in nahezu quantitativer Ausbeute durch eine einfache einstufige Umsetzung, ausgehend von der Kulturlösung, zu gewinnen, und auch das Extrahieren und Reinigen dieser Substanz (III) aus der reduzierten Kulturlösung ist einfach.

Hinsichtlich des Rohmaterials für die Gewinnung von N-Methylmoranolin (III) nach der Erfindung ist es auch möglich, eine Lösung von Nojirimycin produzierender Actinomycetes-Kultur

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— y —■

zu verwenden und außerdem ein Addukt mit schwefliger ,Säurο, ons ein stabilsiertes Derivat von Nojirimycin ist, ganz abgesehen von gereinigtem Nojirimycin (II).* Als Ueaktionslösungsmi t tel is L ganz allgemein Wasser anwendbar, aber daneben können auch alle cUo Reaktion nicht beeinflussenden Lösungsmittel, die in dor Lap;ο r.ind, das Rohmaterial zu lösen, eingesetzt werden, wie niedei-o, auch wasserhaltige Alkohole. Außerdem ist es möglich, i-Orina i.iehyu i/ewöhn.lich in Form seiner wässrigen Lösungen einzusetzen, aber cianeben sind auch Parafornialdehyd oder Salze der Ameisensäure od. dgl. geeignet. Was die Reduktion angeht, so kann nicht nur katalytisch, sondern auch chemisch unter Verwendung von Nr. Lriumborohyclrid reduziert werden.

Zum Isolieren der gewünschten Substanz aus dem 'leaktionsgeiiiisch ist das Behandeln mit einem Ionenaustauschharz am vortoiihaiiosten und einfachsten, aber selbstverständlich können ganz allgemein auch andere Methoden zum Extrahieren undlsolieren wasserlöslicher Substanzen angewendet werden, wobei die Adsorptionsmethode mit Aktivkohle an erster Stelle steht, ferner durch Verteilungschromatographie, Gegenstroraverteilung, Adsorptionschromatographie mit Polyamid, porösen Harzen od. dgl., Sephadex-Chromatographie oder die derivative Extraktionsmethode über die Veresterung der Hydroxylgruppen.

Dieser Aspekt der Erfindung wird anhand von Beispielen nachfolgend im einzelnen erläutert, die jedoch den Erfindungsbereich in keiner Weise einschränken.

Beispiel 2

179mg Nojirimycin wurden in 2u ml Wasser gelöst, wonach 1 ml Formalin und außerdem 0,5 ml Raney-Niekel-Katalysator (handelsüblich, technisch) zugesetzt und in einem Wasserstoffstrom bei Normaltemperatur und unter Atmosphärendruck 3 Stunden lang gerührt wurde. Nach Beendigung der Umsetzung wurde der Katalysator abfiltriert,· das erhaltene Filtrat wurde durch eine etwa 1.00 ml Dowex 5OW χ 4 (H) enthaltende Säule geschickt. Nach

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-/to -

■.,"(sehen der Säule wurden die erhaltenen adsorbierten üubstanken mit 1 ',tigern wässrigem Ammoniak eluiert. Das erhaltene iiluat wurde unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt, v/ob ei nach Umkristallisieren aus Äthanol N-Methylmoranolin in s-'ord farbloser Kristalle erhalten wurde. Fp. 141-142 C, L^J {-' ⁼ -· 5, ö (Wasser), Ausbeute 3 öl mg (91 %).

Beispiel 3

179 mg Nojirimycin wurden in 2Δ ml wässrigem Äthanol (5*1:5·;) gelöst, wonach 1 ml Formalin und 100 mg Palladiumschwaris-Katalysator zugesetzt und bei Normaltemperatur und unter ■Atmosphärendruck katalytisch reduziert wurde. Danach wurde au Γ die in jJeispioj. ''■ beschriebene Weise weiter verfahren, wobei i-ii nuj N-Methylmoranolin erhalten Avurden (Ausbeute '.'Λ '·',).

Ueis])iel 4

¹V⁷O ra^ Nojirimycin wurden in 21) ml Wasser gelöst, wonach 1 ml i'Oriiialin und IUv) mg Platinschwarz-Kacalysator zugesetzt und bei Normalteraperatur und unter Atmosphärendruck katalytisch reduziert wurde. Danach wurde auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise weiter verfahren, wobei 150 mg N-Methylmoranolin erhalten wurden (Ausbeute 85 "?j).

ijoispiel 5

261 mg Nojirimycin-schweflige Säure-Addukt wurden in 3.) ml. Wasser suspendiert, wonach 1 ml Formalin und etwa 2 ml Raney-Nickel-Katalysator zugesetzt und bei Normaltemperatur und Atmosphärendruck U Stunden lang reduziert wurde. Danach wurde auf (iie in Beispiel 2 beschriebene V/eise weiter verfahren, wobei Κ;<ί mg N-Methylmoranolin erhalten wurden (Ausbeute 78 >).

jJoispiel >ϊ

'.i:> ml Pormalin wurden zu 5Oo ml einer Lösung von Nojiriraycin produzierender Actinomycetes-Kul tür zugefügt, die etwa 5ο·< /Lrj/m.l. Nojirimycin enthielt, wonach etwa 10 ml eines handelsüblichen,

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- li -

technischen Raney-Nickel-Käalysators zugesetzt und bei Normaltemperatur und Atmosphärendruck katalytisch reduziert wurde. Nach 6 Stunden waren etwa 1,3 1 Wasserstoffgas absorbiert, und die Gaszufuhr wurde abgebrochen. Der Katalysator wurde abfiltriert, das erhaltene FiItrat durch eine Säule mit etwa 500 ml Dowex 1x2 (OH) geschickt und der erhaltene Auslauf aufeinanderfolgend durch eine 200 ml Dowex 5OW χ 4 (H) enthaltende Säule geschickt. Diese wurde mit 2 1 50 %igem wässrigem Methanol gewaschen, und die adsorbierten Substanzen wurden mit 0,5 %igem wässrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand (280 mg) wurde mit wasserfreier p-Toluolsulfonsäure aufgenommen, mit 10 ml Isopropanol versetzt und erhitzt. Dabei schieden sich Kristalle ab (Ausbeute 344 mg).

Die erhaltene Mutterlauge der Kristalle wurde unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt, der Rückstand mit Wasser aufgenommen und erneut der Säulenbehandlung mit Dowex 1x2 und Dowex 5OW χ 4 unterzogen. Der erhaltene Extrakt wurde mit 50 g wasserfreier p-Toluolsulfonsäui'e versetzt, wobei nochmals 83 mg Kristalle erhalten wurden. Auf diese Weise wurde das p-Toluolsulfonat von N-Methylmoranolin gewonnen (Gesamtausbeute 427 mg (87 %)). Fp. 198-199° C, [«i]J⁴ - 12,2° (Methanol).

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L e e r s e i t e

Claims

Patentansprüche :

jl. Vorfahren zum Gewinnen von Moranolin der allgemeinen Formel

OH

CH₂OH

dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung einer Nojirimycin enthaltenden Actinomycetes-Kultur katalytisch mittels eines Metallkatalysators reduziert und die danach erhaltene Lösung mit einem Ionenaustauschharz behandelt wird.
2. Verfahren zum Gev/innen von N-Methylmoranolin der allgemeinen Formel

(III)

CH_nOH

dadurch gekennzeichnet, daß eine Nojirimycin enthaltende Lösung mit Formaldehyd versetzt und reduziert wird.

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ORIGINAL INSPECTED