DE2840670A1 - Verfahren zur isolierung von mutterkornalkaloiden aus kultursuspensionen - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die industrielle Gewinnung von Mutterkornakaloiden, insbesondere für therapeutische Zwecke, aus Submers- und Emerskulturen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist ein wesentliches Charakteristikum saprophytischer Mutterkornkulturen, dass sich die gebildeten Alkaloide (wasserlösliche Alkaloide vom Ergometrintyp, Clavine, z. T. auch Beptidalkaloide) mehr oder minder ausgeprägt auf Zellmasse und Flüssiganteile der Kultursuspension verteilen. Die bekannten technischen Lösungen zur Isolierung von Mutterkornalkaloiden tragen diesem Sachverhalt dadurch Rechnung, dass sie nach Trennung von Biomasse und Kulturfiltrat gesonderte Aufarbeitungsverfahren für beide oder eines der beiden Medien vorsehen (HU-PS 150 632, HU-PS 161 654, Zusatz p.z.HU-PS 150 631, DL-PS 41 967, OE-PS 259 770), die den speziellen Löslichkeitseigenschaften der jeweils gebildeten Alkaloide angepasst sind. So wird zur Isolierung des wasserlöslichen Ergometrins der Zusatz z. T. erheblicher Salzmengen empfohlen (Ung. Anm. R I-440); die in der HU-PS 142 407 vorgeschlagene Adsorption an Bentonit mit nachfolgender Extraktion des Adsorbats mittels wässrigen Alkohols erwies sich wegen der hohen Verluste durch Isomerisierung als ungünstig (siehe dazu HU-PS 142 406).

Es hat deshalb nicht an Versuchen gefehlt, den Isolierungsprozeß durch eine Einstrang-Aufarbeitung der Kultursuspension technisch und ökonomisch günstiger zu gestalten; so wird im DDR-Patent C 12d/165 516 die direkte Extraktion der Suspension beschrieben, doch mindern Emulsionsbildung und Isomerisierungsneigung in Abhängigkeit vom Verarbeitungsrhythmus den praktischen Wert dieses Verfahrens.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung war die Entwicklung eines ökonomisch günstigen Aufarbeitungsverfahrens, das die Nachteile der bekannten Verfahren unter konsequenter Durchsetzung des Einstrangprinzips überwindet und universell auf alle Typen von Mutterkornalkaloiden in saprophytischer Kultur anwendbar ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Es wurde nun überraschend gefunden, dass speziell die quellfähigen Tonerden wie Bentonit, Bleicherde, Fullererde oder Walkerde beim natürlichen pH-Wert der Kultursuspension ein außerordentlich hohes Adsorptionsvermögen nicht nur für Ergometrin, sondern auch alle untersuchten Mutterkornalkaloide der unterschiedlichsten Struktur aufweisen.

Es wurde weiter gefunden, dass so hergestelte Mycel-Adsorbens-Gemische durch Filtration oder andere Trennverfahren mechanisch gut abtrennbar sind.

Weiterhin wurde überraschend gefunden, dass sich die nach mechanischer Abtrennung erhaltenden alkaloidhaltigen Mycel-Adsorbensgemische ohne Isomerisierung oder Zersetzung der Alkaloide bei an sich unüblich hohen Temperaturen von 80 - 90° C durch Wirbelschichttrocknung unter Einhaltung bestimmter physikalischer Bedingungen in hervorragender Weise konservieren lassen. Die erhaltene, beliebig lagerfähige Trockenmycel-Adsorbens-Masse lässt sich nach Anquellen mit wenig schwachalkalischer wässriger Lösung mittels organischer, aprotischer Lösungsmittel schonend und vollständig extrahieren.

In weiteren Versuchen wurde festgestellt, dass sich das genannte Trocknungsverfahren auch auf solche Kulturen übertragen lässt, die alle gebildeten Alkaloide in der Biomasse enthalten, den Zusatz von Adsorbentien also nicht erforderlich machen. Auch hier wird nach mechanischer Abtrennung und Trocknung in der Wirbelschicht ein lagerfähiges Trockenmycel erhalten, dessen Aufarbeitung unabhängig vom Erntetermin vorgenommen werden kann.

Das Wesen der Erfindung besteht somit darin, dass man die geerntete, ein beliebiges Spektrum an Mutterkornalkaloiden wie Ergokryptin/Ergotamin/Ergo
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/Ergocornin/Ergometrin/Lysergsäure/Agroclavin/Ergo
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andere enthaltende Kultursuspensionen bei Anwesenheit wasserlöslicher Anteile im Spektrum zunächst mit 4 bis 5 Gew.-% (bezogen auf Erntevolumen) einer quellfähigen Tonerde ca. 30 mil verrührt, die festen und flüssigen Anteile mechanisch, z. B. durch Filtration trennt, das erhaltende Feuchtmycel bzw. Feuchtmycel-Adsorbens-Gemisch in der Wirbelschicht bei 80 - 90° C während 20 bis 40 min bis zu einer Ablufttemperatur von 50 bis 70° C und einer Restfeuchte von maximal 15 % trocknet, das Trockenmycel bzw. Trockenmycel-Adsorbens-Gemisch bei Bedarf nach Anteigen mit einer wässrigen, schwach alkalischen Lösung, z. B. 15 %igen Ammonikakwasser, der Extraktion mit einem aprotischen organischen Lösungsmittel, z.B. einem niederen Alkylcarbonsäureester, Aceton oder einem halogenierten Kohlenwasserstoff unterzieht, den erhaltenden Extrakt gegebenenfalls zur Entfernung nichtbasischer Ballaststoffe der flüssig-flüssig-Extraktion mit einer wässrig-sauren Phase im Volumenverhältnis 2 : 1 bis 1 : 1 zuführt und die wässrige, die Gesamtalkaloide enthaltende Lösung nach Alkalisierung bis zu einem pH-Wert im Bereich 8 bis 9,5 mit einem organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, vorzugsweise Äthylacetat, im Verhältnis 1 : 1 bis 3 : 1 reextrahiert.

Die weitere Verarbeitung des vorgereinigten Extraktes erfolgt in an sich bekannter Weise unter Berücksichtigung der chemischen und physikalischen Eigenschaften der betreffenden Alkaloide.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

200 l Kultursuspension des Stammes Claviceps purpurea (Fr.) Tul IMET PA 130 (hinterlegt beim Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena) wird mit 8 kg Bentonit 30 min verrührt und anschließend über ein Vakuumdrehzellenfilter mit 10 mm Schicht aus Calziumsulfat-Dihydrat filtriert. Das praktisch alkaloidfreie Filtrat wird verworfen; das abgenommene Feuchtmycel-Bentonit-Gemisch trocknet man in der Wirbelschicht bei einer Zulufttemperatur von 90° C, bis eine Ablufttemperatur von 60° erreicht wird (Dauer ca. 30 min). Man erhält 20 bis 24 kg Trockenmycel-Bentonit-Gemisch mit einer Restfeuchte von 3 - 5 %, das 95 - 100 % des in der Kultursuspension bestimmten Ergotoxins und 92 - 96 % des Ergometrins enthält.

Beispiel 2

100 l Kultursuspension des unter Beispiel 1 bezeichneten Claviceps-purpurea-Stammes wird mit 5 kg Bleicherde 1 Stunde verrührt, filtriert und das Feuchtmycel-Bleicherde-Gemisch in der Wirbelschicht während 15 min bei 80 - 90° C bis zu einer Ablufttemperatur von 50 ° getrocknet. Man erhält 12 kg Trockenmycel-Bleicherde-Gemisch mit einer Restfeuchte von 10 - 12 % und einem Alkaloidgehalt von 92 - 100 % bezogen auf Kultursuspension.

Beispiel 3

10 kg eines gemäß Beispiel 1 oder 2 hergestellten Trockenmycel-Adsorbens-Gemisches werden mit 1,5 l 1 : 2 verdünntem Ammoniakwasser angeteigt, nach einer Quellzeit von 5 - 10 min mit 40 l Äthylacetat in 2 Portionen jeweils 15 min mit dem Ultra-Turrax verrührt und abgesaugt; den Gesamtextrakt gibt man mit 20 l 3%iger wässriger Phosphorsäure durch den Separator. Die schwere Phase wird mit 8 l Äthylacetat überschichtet, unter Rühren durch Zugabe von konzentriertem Ammonikakwasser auf pH 8,5 bis 9,0 eingestellt und 10 min gerührt. Nach Phasentrennung wird die Extraktion mit 6 bis 8 l Äthylacetat noch zweimal wiederholt. Der Gesamtextrakt wird im Vakuum-Umlauf-Verdampfer, Fallstromverdampfer oder einem anderen schonenden Eindampfverfahren auf 0,3 bis 0,6 l konzentriert, mit dem doppelten Volumen Chloroform versetzt und das Ergometrin in Form des schwerlöslichen Chloroform-Adduktes abgetrennt. Aus dem Filtrat gewinnt man nach adsorptionschromatographischer Reinigung im Säulen- oder Batchverfahren das Ergotoxin als Benzol- oder Toluoladdukt.

Beide Addukte sind dünnschichtchromatographisch rein und haben einen Akaloidgehalt von 96 bis 103 % ber. als Bimaleinat. Die Ausbeute beträgt 58,6 g Ergotoxin-Toluoladdukt = 72 % bezogen auf Kultursuspension und 40,5 g Ergometrin-Chloroformaddukt = 82 % bezogen auf Kultursuspension.

Beispiel 4

60 kg eines gemäß Beispiel 1 oder
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mycel-Adsorbens-Gemisches werden mit 7,5 l 1 : 1 verdünntem Ammoniakwasser verknetet, im Rührextrakter mit 150 l Chloroform oder Methylenchlorid über 45 min extrahiert, der Extrakt unter Druck filtriert und die Extraktion mit dem gleichen Volumen des Lösungsmittels über 30 min wiederholt.

Den Gesamtextrakt gibt man mit 5%iger wässriger
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säure im Verhältnis 1 : 1 durch den Separator, stellt die Wasserphase kontinuierlich auf pH 9 ein und separiert ein zweites Mal mit dem gleichen Lösungsmittel oder mit Äthylacetat im Verhältnis 2 : 1. Nach Eindampfung, Ergometrin-Abtrennung und Ergotoxin-Fällung erhält man die Andukte in der im Beispiel 3 genannten Ausbeute und Qualität.

Beispiel 5

60 l Kulturlösung des ergosinbildenden
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Clavicepa purpurea IMET PA 134 werden beim natürlichen pH-Wert (5-6) 30 min mit 1,2 kg Bentonit verrührt, über eine Schicht aus Calziumsulfat-Dihydrat abgesaugt und das Filtrat verworfen. Die Trocknung des Feuchtmycel-Bentonit-Gemisches gemäß Beispiel 1 liefert 2,8 kg lagerfähiges Trockenmycel-Bentonit-Gemisch, das die in der Kultursuspension analytisch bestimmten Alkaloide (Ergosin/Ergosinin/Spuren Chanoclavin) zu praktisch 100 % enthält.

Der Extraktionseffekt bei der Rührextraktion mit der 10- bis 12-fachen Menge Äthylacetat beträgt i. D. 90 % bezogen auf den Gehalt des Trockenmycel-Bentonit-Gemisches.

Beispiel 6

20 l Kultursuspension des im Beispiel 5 genannten Stammes werden ohne Zusatz eines Adsorptionsmittels über eine 20 mm Schicht aus Calziumsulfat-Dihydrat filtriert; das Filtrat, das nur Spuren Ergosin und einen Teil der Begleitalkaloide enthält, wird verworfen. Das isolierte Feuchtmycel wird sofort in der Wirbelschicht bei 90° bis zur Ablufttemperatur von 60° getrocknet (Dauer ca. 40 min). Man erhält 0,8 bis 1,0 kg eines lagerfähigen Trockenmycels, das 96 - 100 % des in der Kultursuspension bestimmten Ergosins sowie Spuren der Begleitalkaloide enthält.

Zur Gewinnung des Alkaloids wird das Trockenmycel nach Anteigen mit 150 ml 10%igem Ammoniakwasser unter Rühren mit 8 l Chloroform in 2 Portionen extrahiert und nach Überführung in die wässrig-saure Phase, Reextraktion und Eindampfung aus dem erhaltenden Konzentrat mit Weinsäure als Rohtartrat gefällt.

Claims (6)

1. Verfahren zur Isolierung von Mutterkornalkaloiden aus Kultursuspensionen, dadurch gekennzeichnet, dass man die geerntete Kultursuspension im natürlichen Zustand oder - bei Anwesenheit wasserlöslicher Alkaloidanteile - nach Verrühren mit einer quellfähigen Tonerde mechanisch, z.B. durch Filtration, trennt, das abgenommene Feuchtmycel bzw. Feuchtmycel-Adsorbens-Gemisch in der Wirbelschicht trocknet, bei Bedarf mit organischen, aprotischen Lösungsmitteln extrahiert, den erhaltenen Extrakt gegebenenfalls mit verdünnten wässrigen Säuren extrahiert, den wässrigen Extrakt nach Alkalisierung mit organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln reextrahiert und den so vorgereinigten Extrakt in bekannter Weise zu den Reinalkaloiden weiterverarbeitet.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, dass als quellfähige Tonerde 4 bis 5 Gewichtsprozent Bleicherde, Fullererde, Walkerde oder Bentonit verwendet werden und die Kultursuspension vor der mechanischen Trennung 30 min mit dem Adsorbens gerührt wird.

3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirbelschichttrocknung des Feuchtmycels bzw. Feuchtmycel-Adsorbensgemisches bei 80 - 90° C während 20 bis 40 min bis zu einer Ablufttemperatur von 50 bis 70° und einer Restfeuchte von maximal 15 % durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die fest-flüssig Extraktion mit niederen Alkylcarbonsäureestern, vorzugsweise Äthylacetat, Aceton oder halogenierten Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise Chloroform oder Methylenchlorid vornimmt und das Trockenmycel bzw. Trockenmycel-Adsorbensgemisch vor der Extraktion mit 10 bis 20 Gew.% eines wässrigen Alkalis, vorzugsweise Ammoniakwasser, anquillt.

5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den erhaltenen Rohextrakt zur Entfernung nicht basischer Ballaststoffe im Verhältnis 2 : 2 bis 1 : 1 mit wässrigen Säuren, vorzugsweise 3 bis 5%iger Phosphorsäure oder Weinsäure, extrahiert.

6. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die erhaltene wäßrig-saure Phase nach Einstellen eines pH-Wertes von 8,0 bis 9,5 im Verhältnis 1 : 1 bis 3 : 1 mit einem niederen Alkylcarbonsäureester, vorzugsweise Äthylacetat oder einem halogenierten Kohlenwasserstoff, vorzugweise Chloroform oder Methylenchlorid, reextrahiert.