DE3881819T2

DE3881819T2 - Extraktion von Alkaloiden.

Info

Publication number: DE3881819T2
Application number: DE88903929T
Authority: DE
Inventors: Anne Elizabeth Goodbody; Masanaru Misawa; Colin Derek Watson
Original assignee: Mitsui Petrochemical Industries Ltd
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1987-05-01
Filing date: 1988-04-27
Publication date: 1994-02-03
Anticipated expiration: 2008-04-28
Also published as: JPH01503236A; KR890701596A; US4831133A; FI886053A; CA1262443A; EP0312609A1; EP0312609B1; KR950013574B1; WO1988008425A1; DE3881819D1; FI91639C; FI91639B; JP2550405B2

Description

Die Erfindung betrifft Alkaloide, die gebildet worden sind von der Catharanthus roseus Pflanze.

Hintergrund

Die geringen Mengen in denen Vinblastin und Vincristin natürlich von Catharanthus roseus gebildet werden, hat Forscher dazu veranlaßt, die Durchführbarkeit der Anwendung von in vitro Verfahren zur Bildung dieser pharmazeutisch aktiven Verbindungen zu untersuchen.
Als Ergebnis von Untersuchungen in verschiedenen Bereichen ist es jetzt allgemein anerkannt, daß die monomeren Alkaloide Catharanthin und Vindolin, die Komponenten sind, die in vivo kuppeln unter Bildung einer Zwischenverbindung 3',4'-Anhydovinblastin, die schließlich zu Vinblastin umgewandelt wird. Andererseits wird Vincristin aus Vinblastin gebildet. Das Gesamtreaktionsschema kann so wie folgt angegeben werden:
Vindolin + Catharanthin -> 3',4'-Anhydrovinblastin
Vinblastin -> Vincristin
Um eine wirtschaftliche in vitro Bildung von Vinblastin und Vincristin zu ermöglichen, ist eine wirksame Bildung von 3',4'-Anhydrovinblastin (im Folgenden als AVLB bezeichnet) notwendig. Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Gewinnung von AVLB zur Verwendung insbesondere bei der Anwendung von in vitro Verfahren zur Herstellung der wertvolleren dimeren Alkaloide Vinblastin und Vincristin.
Die am 27.01.1981 veröffentlichte CA-PS 1 094 552 beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von Vindolin, Catharanthin und AVLB, das das Extrahieren getrockneter Blätter mit organischem Lösungsmittel wie Methanol oder Toluol oder einem Gemisch davon und einer wäßrigen sauren Lösung, Reinigen des Auszugs unter Anwendung eines Phasenumkehrverfahrens und anschließendes Ausfällen durch Zugabe von Sulfat, umfaßt. Anschließend werden die einzelnen Alkaloide oder Gruppen davon aus der Mutterlauge durch Chromatographie, Lösungsmittel-Gradienten und/oder pH Unterschiede isoliert.
In Physiol. Vég, 1985, 23(4), 381-388 beschreibt Renaudin ein Alkaloid-Extraktionsverfahren, bei dem Suspensionszellen von Catharanthus roseus extrahiert werden mit 0,01%iger Essigsäure und in organischen Lösungsmittelfraktionen gesammelt werden unter Anwendung einer Phasenumkehrkartusche nachdem der pH-Wert des sauren Auszugs durch Zugabe von NaOH auf 7,3 bis 7,5 erhöht worden ist. Dieses spezielle Extraktions- Verfahren ist besonders geeignet zur Bestimmung des Alkaloid- Gehaltes unter Anwendung von HPLC und fluorimetrischem Nachweis.
Denjenigen, die mit Alkaloid-Extraktions-Verfahren vertraut sind, ist es klar, daß Extraktions-Verfahren variieren in Abhängigkeit von der chemischen Art der zu extrahierenden Verbindung. In diesem Zusammenhang erfordert AVLB spezielle Berücksichtigung seiner Neigung zur Oxidation zu weniger wichtigen oder weniger wertvollen Alkaloiden wie Leurosin. Die Verwendung von getrockneten Blättern bei einem Extraktionsverfahren, wie es z.B. in der oben erwähnten CA-PS angegeben ist, ist ungünstig, wenn AVLB gewonnen werden soll, da das Trockungsverfahren oxidativ ist und das wertvolle AVLB in dem Ausgangsgewebe verringert werden könnte.
Im gleichen Sinne kann die pH Erhöhung eines rohen AVLB-Auszugs, wie sie von Renaudin angegeben ist, z.B. durch Zugabe von Natriumhydroxid auch zu einer AVLB-Oxidation beitragen und daher das zur Gewinnung verfügbare AVLB verringern.
Die Oxidation von AVLB bei bekannten Verfahren zeigt sich möglicherweise in der sehr mäßigen Ausbeute an AVLB, das durch das in der CA-PS angegebene Verfahren extrahiert wird (0,145 g aus 1 kg getrockneten Blättern). Es ist folglich ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zu entwickeln, das geeignet ist zum Extrahieren von AVLB aus Catharanthus roseus Gewebe.
Die vorliegende Erfindung liefert daher ein Verfahren zum Extrahieren eines Alkaloids aus der löslichen Komponente eines sauren, wäßrigen Auszugs von Catharanthus roseus Gewebe, das entweder frisch oder gefroren ist, umfassend die Behandlung der löslichen Komponente mit einem Reduktionsmittel und Extrahieren der behandelten löslichen Komponente mit einem organischen Lösungsmittel. Als Anfangsextraktionsmittel verwendet die vorliegende Erfindung ein wäßriges Medium mit saurem pH-Wert. Die Verwendung eines wäßrigen sauren Mediums statt eines organischen Lösungsmittels bei dem anfänglichen Extraktionsverfahren führt zu verschiedenen Vorteilen. In erster Linie ist das wäßrige Medium selektiv in dem Sinne, daß AVLB und andere basische Alkaloide in der Anfangsstufe gesammelt werden, und nicht mit einer großen Anzahl von Pflanzenprodukten in einem organischen Lösungsmittel. Außerdem können Zelltrümmer einschließlich Chloroplasten, die in dem wäßrigen Medium enthalten sind, durch einfaches Zentrifugieren entfernt werden, wodurch Chlorophyl entfernt wird, das sonst zu einer Oxidation von AVLB führen und das Reinigungsverfahren stören könnte. Die Entfernung von Chlorophyl aus organischem Lösungsmittel erfordert ein komplizierteres Verfahren.
Nach der Abtrennung von Zelltrümmern von den löslichen Bestandteilen, wie durch Zentrifugieren, wird die lösliche Komponente mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Reduktionsmittel, vorzugsweise Natriumborhydrid, zu der löslichen Komponente zugesetzt vor der Extraktion mit dem organischen Lösungsmittel. Die Zugabe eines Reduktionsmittel in dieser Stufe des Extraktions-Verfahrens führt zu einer erhöhten AVLB-Ausbeute, möglicherweise durch Kompensation von oxidativen Mitteln oder durch Umwandlung von oxidierten AVLB- Derivaten zu AVLB, d.h. das Iminium-Produkt der Catharanthin- und Vindolin-Kupplung wird durch Natriumborhydrid zu AVLB reduziert.
Wenn es einmal mit organischem Lösungsmittel extrahiert ist, kann AVLB nach Standard-Verfahren gereinigt werden, z.B. chromatographisch, unter Anwendung selektiver Kristallisation usw.
Gemäß einer bevorzugt Ausführungsform der Erfindung wird das Catharanthus roseus Gewebe mit Enzym abgebaut, um Zellwände zu zerstören und Alkaloide so weit wie möglich freizusetzen.
Es ist zu bemerken, daß die vorliegende Erfindung die Verwendung von oxidativen Mitteln, wo immer möglich, vermeidet. Folglich ist es ganz besonders bevorzugt, das Extraktions- Verfahren soweit möglich unter einer inerten Atmosphäre durchzuführen, obwohl auch unter üblicher Atmosphäre nennenswerte AVLB-Ausbeuten erzielt werden können.
So liefert die vorliegende Erfindung gemäß einer Ausführungsform ein Verfahren zum Extrahieren von AVLB aus Catharanthus roseus Gewebe, umfassend eine erste Stufe, in der das Gewebe in wäßrigem Medium mit saurem pH-Wert extrahiert wird, und eine zweite Stufe, in der die lösliche Komponente mit organischem Lösungsmittel extrahiert wird.
Das Extraktions-Verfahren kann an frischem, z.B. kürzlich gewachsenem, oder gefrorenem Catharanthus roseus Gewebe durchgeführt werden. Getrocknetes Gewebe wird vorzugsweise vermieden, da angenommen wird, daß das Trocknungsverfahren zur Oxidation von AVLB in dem Gewebe führt und daher die in getrocknetem Gewebe verfügbare Menge an AVLB verringert.
Das frische oder gefrorene Gewebe wird vorzugsweise vor der ersten Extraktionsstufe fein zerkleinert, um das Zellgewebe freizusetzen. Frisches Gewebe kann z.B. in Säure in einem Standardmischer homogenisiert werden. Gefrorenes Gewebe wird günstigerweise in flüssigem Stickstoff verrieben. Da das Catharanthus Gewebe jedoch bei dem Verfahren immer unter nichtoxidativen Bedingungen verarbeitet werden soll, ist es besonders günstig, wenn es unter einer inerten Atmosphäre verrieben bzw. vermahlen wird, um das Gewebe zur Extraktion zu erhalten, unabhängig davon, ob frisches oder gefrorenes Gewebe als Ausgangsmaterial angewandt wird.
Es wird angenommen, daß AVLB mit der Zellwandmatrix assoziiert, möglicherweise im Pflanzengewebe oder wenn die Zellen aufgebrochen werden, und der Inhalt vermischt wird. Es ist daher möglich, daß beim Mahlen des Gewebes eine Fraktion des AVLB in dem Anfangsextraktionsmedium freigesetzt wird, und eine restliche Fraktion des AVLB noch an die Wand gebunden ist und damit einer Extraktion entgeht. Folglich ist es hier bevorzugt, entweder das nicht gemahlene Gewebe oder das gemahlene Gewebe Enzymen auszusetzen, die in der Lage sind, die Zellwandbestandteile abzubauen wie Cellulase, Peptinase, Xylanase und Laminarase, bevor die Extraktion durchgeführt wird. Handelsübliche Zubereitungen, die für diesen Zweck geeignet sind, sind in großer Menge vorhanden und umfassen z.B. Macerozym und Driselase (beides Produkte von Yakult Honsha Co. Ltd., Japan).
Wenn es einmal hergestellt bzw. vorbereitet ist, wird das Gewebe zunächst mit einem wäßrigen Medium mit sauren pH-Wert extrahiert. Wasser als solches kann angewandt werden, z.B. Leitungswasser, destilliertes oder doppelt destilliertes Wasser und dies kann bevorzugt sein, um die Kosten auf einem Minimum zu halten. Versuche haben jedoch gezeigt, daß eine Verringerung des pH-Wertes durch Zugabe von Säure zu dem wäßrigen Medium die AVLB-Extraktion erhöhen kann. Z.B. hat es sich gezeigt, daß die AVLB-Ausbeute, wenn ein wäßriges Medium mit einem pH-Wert von etwa 2 verwendet wird, größer ist als die entsprechende Ausbeute bei pH etwa 6, wenn alle anderen Bedingungen gleich sind. Um den pH-Wert zu verringern, kann eine beliebige Säure verwendet werden, einschließlich organischen Säuren wie Essigsäure und anorganischen Säuren wie Schwefelsäure. Mineralsäuren, wie Salzsäure sind bevorzugt und können mit Wasser vermischt werden, um den gewünschten pH-Wert zu erzielen vor der Extraktion des Gewebes damit. Der pH-Wert des wäßrigen Mediums kann im Bereich von 1,5 bis 7 liegen.
Der pH-Wert des wäßrigen Mediums wird stärker basisch nachdem das Catharanthus roseus Gewebe darin suspendiert ist. Die durch Zugabe des Gewebes verursachte pH-Erhöhung variiert in Abhängigkeit von der Menge und dem Zustand des Gewebes, obwohl ein Anstieg von 1 bis 2 pH-Einheiten unter typischen Bedingungen erwartet werden kann. Die Ausbeute an AVLB ist jedoch zufriedenstellend, vorausgesetzt, daß der Anfangs pH- Wert des wäßrigen Medium sauer ist. Vorzugsweise bleibt der pH-Wert des Mediums nach der Zugabe des Gewebes sauer, z.B. bei 3,5 bis 6,5, um günstige Ausbeuten zu erzielen. Das kann erreicht werden durch Ansäuern des wäßrigen Mediums bevor es mit dem Gewebe zusammenkommt, um einen Anfangs pH-Wert von etwa 1 bis 2 Einheiten unter dem nach der Gewebeextraktion erwünschten pH-Wert zu erzielen. Wahlweise kann verdünnte Säure direkt zu dem Gewebeextrakt zugegeben werden, wenn dies notwendig ist. Was im Auge behalten werden muß, ist daß die Zugabe von Base zur Einstellung des pH-Wertes vermieden werden sollte, da dies die oxidative (oxidierte) Form von AVLB erhöhen und damit die Ausbeute verringern könnte.
Während die Wirkung der Säure bei dem Extraktions-Verfahren nicht vollständig klar ist, wird angenommen, daß die Säure so wirkt, daß sie AVLB von verschiedenen Makromolekülen, wie Polysacchariden, Proteinen, Polyphenolen usw. abspaltet. Eine ähnliche Wirkung scheint einzutreten, wenn Salz statt Säure anfänglich zu dem wäßrigen Medium zugesetzt wird gemäß einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Obwohl keine Säure zugegeben wird, wird das salzhaltige wäßrige Medium hier noch als ein wäßriges Medium mit saurem pH-Wert angesehen, da die Zugabe von Salz zu Wasser, beispielsweise noch zu einem mittleren pH-Wert von 7 oder darunter führt. Die Salze, die zur Zugabe zu dem Wasser geeignet sind, umfassen stark ionisierbare Salze wie Ammoniumsulfat, Kaliumchlorid und insbesondere Natriumchlorid. Die Salzkonzentration in dem Wasser kann im Bereich von 0,01 bis 5,0 M liegen, obwohl, insbesondere wenn Natriumchlorid verwendet wird, molare Konzentrationen im Bereich von 0,9 bis 3,0 M bevorzugt sind. Das Salz kann direkt zu Wasser (etwa pH 6,0) zugegeben und als Extraktionsmedium verwendet werden, wenn die molare Salzkonzentration wie gewünscht ist.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird Wasserstoffperoxid zu dem wäßrigen sauren Auszug von Catharanthus roseus Gewebe zugegeben, um die AVLB-Ausbeute zu erhöhen. Vorzugsweise beträgt die Menge an zugegebenem Wasserstoffperoxid mehr als 8 mMol, insbesondere 20 mMol.
Wenn das gemahlene und mit Enzym abgebaute Gewebe einmal in dem wäßrigen Medium, sei es Wasser als solche, angesäuertes Wasser oder salzhaltiges Wasser, suspendiert ist, vorzugsweise unter Rühren und gegebenenfalls mit Wasserstoffperoxid vermischt ist, wird die lösliche Komponente, enthaltend die Alkaloide von den Zelltrümmern, d.h. der unlöslichen Komponente abgetrennt, z.B. durch Filtrieren oder besser durch Zentrifugieren. Die wäßrige Extraktion der unlöslichen Bestandteile kann wiederholt werden, um weiteres Alkaloid in einer löslichen Komponente zu gewinnen, das dann mit den vorher gesammelten löslichen Komponenten zusammengegeben werden kann.
Vor dem Extrahieren mit organischem Lösungsmittel entspricht es einer bevorzugten Ausführungsform, daß ein Reduktionsmittel zu der löslichen Komponente zugesetzt wird. In diesem Zusammenhang ist Natriumborhydrid besonders geeignet in ausreichenden Mengen, z.B. um eine Konzentration in der löslichen Komponente im Bereich von etwa 0,05 mg/ml bis etwa 4,0 mg/ml, insbesondere im Bereich von 0,1 bis 3,0 mg/ml einzustellen. Es wird angenommen, daß das Reduktionsmittel die AVLB-Extraktion erhöht, entweder durch Reduktion des Iminiumanalogen von AVLB oder durch Hinderung der Oxidation von AVLB in der löslichen Komponente. Die besten Ergebnisse werden erzielt, nach Abtrennen der löslichen Komponente von der unlöslichen Komponente. Die Zugabe von Reduktionsmittel vor dem Abtrennen, d.h. während der Extraktion, scheint den AVLB-Gehalt in dem endgültigen Auszug zu verringern.
Das wäßrige Medium, in das die Alkaloide zunächst extrahiert werden, kann, wenn dies erwünscht ist, gefroren werden, zumindest so lange wie etwa drei Wochen, vor der anschließenden Extraktion mit organischem Lösungsmittel.
Die Extraktion der löslichen wäßrigen Komponente mit organischem Lösungsmittel, die zweite Extraktionsstufe, wird vorzugsweise in einem Zweiphasensystem durchgeführt, unter Verwendung von beispielsweise einem organischen Lösungsmittel, ausgewählt aus Benzol, Toluol und Ethylacetat, wobei die Verwendung von Ethylacetat bevorzugt ist. Wenn dies erwünscht ist, kann eine Reihe von organischen Extraktionen an dem gleichen wäßrigen Auszug vorgenommen werden und die organischen Fraktionen zur weiteren Verarbeitung zusammengegeben werden.
Die Reinigung des in der organischen Fraktion enthaltenen AVLB kann durchgeführt werden unter Anwendung von Verfahren, die üblicher Standard sind, wie Chromatographie, Kristallisation usw. Der Auszug, der bei dem oben angegebenen Extraktions-Verfahren erhalten wird, ist reich an den Monomeren Catharanthin und Vindolin. Nachweisbare Mengen an Vinblastin sind ebenfalls vorhanden. Von besonderer Bedeutung ist hierbei das Vorhandensein eines erhöhten Anteils an AVLB in dem Auszug, der bei den hier bevorzugten Extraktions-Verfahren 0,2 Gew.-% des Trockengewebes betragen kann. Das kann verglichen werden mit den angenommenen Werten von ungefähr 0,0003 Gew.-% für das Trockengewicht der Alkaloide Vinblastin und Vincristin, die hergestellt werden können unter Verwendung von AVLB als Vorläufer.
So werden durch Anwendung eines Verfahrens zur Erhöhung der Ausbeute an extrahiertem AVLB Verfahren, die diesen Vorläufer verwenden, wirtschaftlich attraktiver.
Ausführungsformen der Erfindung sind unten an Hand von Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

Breitspektrumanalyse der Wirkung des pH-Werts

Zu einen Suspensionsmedium, bestehend aus 7,5 ml Wasser (pH 5,9) und 1 g NaCl wurden 2,5 g Frischgewicht von Catharanthus roseus Blattpulver, hergestellt durch Vermahlen der Blätter in flüssigem Stickstoff, zugegeben. Der Anfangs-pH-Wert des NaCl-haltigen Suspensionsmediums wurde bei einem Versuch auf pH 2,0 angesäuert, bei einem anderen Versuch auf pH 9,0 basisch gemacht und bei einem dritten Versuch unverändert gelassen (pH 6,2), wobei jeder Versuch doppelt durchgeführt wurde. Die Proben wurden 10 min beschallt und 30 min bei 23 000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und 3mal mit gleichen Volumina Ethylacetat extrahiert. Dieses wurde getrocknet (abgedampft) und der Rückstand in Methanol aufgenommen zur HPLC-Analyse. Die HPLC-Analyse wurde in einer 5 µm C-8 Phasenumkehr-Säule durchgeführt unter Verwendung eines Lösungsmittelgradienten von Methanol und Wasser mit t-Butyl-ammonium-phosphat als Modifiziertmittel. Ergebnisse: Anfangs pH-Wert Ausbeute an AVLB (% Trockengewicht)
Ein saurer pH-Wert erhöht daher die Ausbeute an Anhydrovinblastin.

Beispiel 2

Engspektrumanalyse der Wirkung des pH-Werts

Doppelte Proben von 1 g Frischgewicht Blattpulver, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden zunächst mit 3 ml HCl in verschiedenen Konzentrationen extrahiert, anschließend zentrifugiert und mit organischem Lösungsmittel, wie in Beispiel 1, extrahiert. Die durch TLC-Analyse erhaltenen Ergebnisse sind unten angegeben. Die pH-Werte sind sowohl vor der Zugabe des Blattpulvers als auch nach der Zugabe des Blattpulvers angegeben. Ergebnisse HCl Konz. (M) AVLB (% Trockengew.) pH vorher nachher
Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß ein pH-Wert des Anfangs-Suspensionsmediums von etwa 1,5 erforderlich ist, um Anhydrovinblastin zu gewinnen. Das entspricht einem minimalen pH-Wert der Suspension nach der Zugabe des Blattpulvers von etwa 3,5. Es ist ferner zu bemerken, daß ein pH-Wert von etwa 4 bis 6 in dem Medium, in dem die Blätter suspendiert sind, günstige AVLB-Ausbeuten ergibt.
In einem getrennten Versuch wurde die Wirkung verschiedener Säuren auf die Ausbeute an AVLB unter den oben beschriebenen Bedingungen untersucht. Die Ergebnisse sind im Folgenden angegeben: Säure Konzentration (M) pH AVLB vorher nachher
Offensichtlich kann eine Vielfalt von unterschiedlichen Säure erfolgreich angewandt werden, um den pH-Wert in dem Reaktions-Medium einzustellen, ohne daß die Ausbeute nachteilig beeinflußt wird.

Beispiel 3

Natriumchlorid

Wenn Blätter nach dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, extrahiert werden unter Verwendung von Wasser mit normalen pH-Wert (ca. 5,9), konnte die Ausbeute an extrahiertem Anhydrovinblastin erhöht werden, wenn Natriumchlorid in dem Wasser war. Ergebnisse Konzentration an NaCl (M) Ausbeute AVLB (% Trockengewicht)
Optimale Ausbeuten an AVLB wurden mit 1 g NaCl in 7,5 ml Wasser (d.h. bei einer Konzentration von 2,28 M) erzielt, wo eine 61%ige Zunahme gegenüber Proben auftrat, die in Abwesenheit von Natriumchlorid extrahiert wurden.
Wenn verdünnte Säure verwendet wurde, um das AVLB zu extrahieren, wie in Beispiel 1 beschrieben, trat keine weitere Zunahme auf, wenn Natriumchlorid zugesetzt wurde. Konzentration an NaCl (M) Ausbeute AVLB (% Trockengewicht)
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß der niedrigere pH- Wert auch zu einer Art Dissoziation des AVLB führen kann, so daß Natriumchlorid keine zusätzliche Wirkung hat. Der niedrigere pH-Wert kann auch dem AVLB eine größere Stabilität verleihen. Der Abfall der AVLB-Ausbeuten mit zunehmender NaCl-Konzentration kann auf einem Aussalzen des weniger löslichen AVLB beruhen.

Beispiel 4

Natriumborhydrid-Zugabe

Blätter wurden in flüssigem Stickstoff gemahlen und 1 g Anteile in 3 ml 0,025 M HCl vermischt. Es wurde 0,1 M Magnesiumchlorid und 3 c 10&supmin;³ % Wasserstoffperoxid zu dem Gemisch zugegeben. Nach dem Zentrifugieren wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt und Natriumborhydrid so zugegeben, daß ein Bereich an Endkonzentrationen von 0 bis 3,33 mg/ml untersucht werden konnte. Ergebnisse der HPLC-Analyse auf AVLB sind unten angegeben. Endkonzentration an Natriumborhydrid (mg/ml) AVLB-Ausbeute (% Trockengewicht)
So erhöht die Zugabe von Natriumborhydrid zu dem sauren Auszug die Ausbeute an AVLB. Das muß nach der Zentrifugierstufe geschehen - wenn NaBH&sub4; vor dem Zentrifugieren zugegeben wird, kann kein AVLB extrahiert werden.
Es zeigte sich nachher, daß Magnesiumchlorid und Wasserstoffperoxid für die Borhydrid-Wirkung nicht erforderlich waren.

Beispiel 5

Spektralanalyse

Es wurden Doppelproben von 1 g Frischgewicht Blattpulver (hergestellt durch Mahlen in flüssigem Stickstoff) jeweils in 3 ml 0,03 M HCl, enthaltend 0,4 g Natriumchlorid vermischt. Das Gemisch wurde 30 min mit 23 000 g zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit 2mal mit Ethylacetat extrahiert. Dann wurde das Ethylacetat getrocknet (abgedampft) und der verbleibende Rückstand in 500 µl Methanol aufgenommen zur Untersuchung durch TLC und HPLC.

HPLC:

Es wurden Proben auf einer C-8 HPLC-Säule, wie oben beschrieben, untersucht. 3',4'-Anhydrovinblastin wurde durch seine Retentionszeit, UV Spektrum und die erste Ableitung des Spektrums untersucht, die alle mit denjenigen einer autentischen Standardprobe übereinstimmten. Die Ausbeute an AVLB wurde zu 0,089 %, bezogen auf das Trockengewicht, berechnet. Vindolin, Catharanthin und Spuren von Leurosin wurden ebenfalls durch ihre Rententionszeiten und Spektren identifiziert. Die berechneten Ausbeuten an diesen drei Alkaloiden sind unten angegeben. Trockengewicht % Leurosin Vindolin Catharanthin

TLC:

Es wurde eine Normalphasen-Dünnschichtchromatographie durchgeführt unter Verwendung von Silicagel und einer mobilen Phase aus Toluol:Aceton:Methanol:Ammoniumhydroxid (28:10:2:0,5). Anhydrovinblastin, Catharanthin und Vindolin wurden jeweils durch ihre Rf-Werte und UV-Spektren identifiziert, die mit denjenigen einer autentischen Standardprobe übereinstimmten. Außerdem wurden die bei der TLC eluierten Flecken mit Cer-ammonium-sulfat besprüht und ergaben die charakteristischen Farbreaktionen für alle drei Alkaloide. Rf-Werte bei TLC Anhydro-VLB Catharanthin Vindolin Probe Standard

Beispiel 6

Wirkung von Beschallung

2,5 g Proben von frischem Blattpulver wurden wie in Beispiel 1 beschrieben bei saurem pH-Wert unter Verwendung von verdünnter HCl (0,03 M) extrahiert. Es wurden doppelte Inkubations-Lösungen während verschiedener Zeiträume beschallt, wonach sie durch Miracloth filtriert wurden. Das Filtrat wurde zentrifugiert und die erhaltene überstehende Flüssigkeit wie oben mit Ethylacetat extrahiert. Ergebnisse Beschallungszeit (min) Ausbeute an AVLB (% Trockengewicht)
Diese Ergebnisse zeigen, daß eine Beschallung nicht erforderlich ist, und daß, wenn eine derartige Inkübation verlängert wird, tatsächlich eine Abnahme in der Ausbeute an AVLB auftritt, möglicherweise aufgrund von Luftoxidation.
Folglich wird eine Beschallung bei dem AVLB-Extraktions- Verfahren bevorzugt vermieden.

Beispiel 7

Enzymabbau von Blattmaterial

Proben von pulverförmigem Blattmaterial (1 g Frischgewicht) wurden mit verschiedenen Enzymzubereitungen 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Doppelt destilliertes Wasser wurde als wäßrigees Extraktions-Medium verwendet, das zentrifugiert und mit organischem Lösungsmittel extrahiert wurde wie üblich. Die Ergebnisse sind unten angegeben. Enzym Konzentration AVLB Alkaloid-Konz. (% Trockengewicht) Catharanthin Vindolin Macerozym (eine rohe Peptinase) Driselase (rohe Zubereitung von Lamarinase, Xylanase und Cellulose β-Glucosidase Vergleich Einheiten
Die erhöhte Alkaloid-Ausbeute, die erhalten wird, wenn Macerozym und Driselase (beides Produkte von Yakult Honsah Co. Ltd., Japan) verwendet werden, ist vermutlich ein Ergebnis der Freisetzung von Alkaloiden aus der Zellwandmatrix des Catharanthus roseus Gewebes.

Beispiel 8

Enzymabbau und Ansäuerung

Doppelproben von jeweils 1 g Blättern (in flüssigem Stickstoff vermahlen) wurden entweder
1. mit 0,4 % Macerozym in 3 ml Wasser 1 h inkubiert und anschließend zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit extrahiert wie üblich oder
2. 0,1 M HCl zu dem Gemisch von Blättern und Wasser (3 ml) zugegeben, um einen End-pH von 1,5 zu erhalten und das Gemisch wurde zentrifugiert und extrahiert wie üblich oder
3. es wurde eine Enzym-Inkubation wie bei 1. durchgeführt und anschließend Säurezugabe wie bei 2. Dann wurde zentrifugiert und extrahiert wie üblich. Alkaloid-Gehalt (mg) Behandlung AVLB Catharanthin Vindolin 0,4 % Macerozym Säure 0,4 % Macerozvm und Säure
So erhöhte eine Konzentration von Enzymbehandlung und anschließendem Ansäuern die Ausbeute an AVLB um 43 % gegenüber der Enzymbehandlung allein.

Beispiel 9

Massenspektrophotometrie

Eine aus Blättern extrahierte Probe AVLB wurde durch Sammeln der entsprechenden Fraktion von HPLC gereinigt. Der normale HPLC-Gradient wurde mit Methanol, Wasser und 0,1 % Triethylamin durchgeführt. Die gesammelte Fraktion wurde dann eingedampft und durch Elektronenmassenspektrophotometrie analysiert. Das erhaltene Auftrennmuster war das gleiche wie für eine authentische Probe von 3',4'-Anhydrovinblastin. Hohe Auflösungsdaten zeigten, daß es eine Masse von 792,4107 Einheiten (± 0,9 % mit einer Abweichung von 0,9 Millimasseneinheiten vom theoretischen Wert) besaß.

Beispiel 10

Identifizierung von Vinblastin

100 g (Frischgewicht) Blätter wurden in 300 ml 0,025 M HCl in einem Waring-Mischer vermahlen. Die Zelltrümmer wurden abzentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit mit Ethylacetat extrahiert. Das Ethylacetat wurde abgedampft und der Rückstand in einem kleinen Volumen Methanol aufgenommen, das auf eine präparative TLC-Platte unter Verwendung von Toluol: Aceton:Methanol:NH&sub4;OH (28:10:2:0,5) zur Elution aufgestrichen wurde. Ein Band mit dem gleichen Rf-Wert wie VLB-Standard wurde nachgewiesen und von der Platte abgeschabt. Dieses wurde von der Kieselsäure unter Verwendung von Methanol: Dichlormethan (2:1) mit 1,55 Triethylamin extrahiert. Das Lösungsmittel wurde dann durch Verdampfen entfernt und das verbleibende Alkaloid über eine präparative TLC-Platte unter Verwendung von Diethylether:Chloroform:Methanol (50:35:20) erneut gereinigt. Ein Band mit dem gleichen Rf-Wert wie VLB- Standard wurde entfernt und wie oben extrahiert. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und das verbleibende Alkaloid wurde in einer kleinen Menge Dichlormethan gelöst, filtriert und dann erneut getrocknet. Das Alkaloid wurde analysiert durch Desorptions-Elektronen-Massenspektrophotometrie und ein Ion entsprechend VLB wurde beobachtet. Hochauflösungsdaten ergaben eine genaue Masse, die innerhalb von 0,8 Millimasseneinheiten des theoretischen Wertes für Vinblastin lag.

Beispiel 11

Wirkung der Zugabe von Natriumhydroxid und Ammoniumhydroxid

1 g Anteile Blätter (in flüssigem Stickstoff vermahlen) wurden mit 0,025 M HCl auf übliche Weise extrahiert. Nach dem Zentrifugieren wurde der pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit entweder mit NaOH oder NH&sub4;OH auf 7,3 oder 9,0 erhöht. Außerdem wurden in Säure (0,025 M HCl) suspendierte Blätter mit 0,5 g NaCl behandelt und nach dem Zentrifugieren der pH- Wert entweder mit NH&sub4;OH oder NaOH auf 7,3 erhöht. Entsprechende Vergleiche (d.h. ohne Base) wurden gleichzeitig untersucht. Ergebnisse (aus HPLC-Analyse) pH AVLB (% Trockengewicht) Vergleich
So ist es, wenn AVLB extrahiert werden soll bevorzugt, den pH-Wert des wäßrigen Mediums vor der Zweiphasen-Extraktion nicht zu erhöhen.

Beispiel 12

Wirkung der Zugabe von Wasserstoffperoxid

1 g Proben von Blattpulver wurden mit 3 ml 0,025 M HCl vermischt und ein Bereich unterschiedlicher Konzentrationen an H&sub2;O&sub2; zugegeben. Nach dem Zentrifugieren wurde Natriumborhydrid zu der überstehenden Flüssigkeit mit einer Endkonzentration von 0,67 mg/ml zugegeben und die Extraktion mit Ethylacetat wie üblich durchgeführt. Ergebnisse (aus der HPLC-Analyse) H&sub2;O&sub2; Konzentration (mm) AVLB (µg)
So dient die Zugabe von H&sub2;O&sub2; in einer Konzentration von mehr als 8 mM dazu, die Ausbeute an AVLB aus Blättern zu erhöhen.

Claims

1. Verfahren zum Extrahieren eines Alkaloids zus der löslichen Komponente eines sauren, wäßrigen Auszugs von Catharanthus roseus-Gewebe, der entweder frisch oder gefroren ist, wobei das Verfahren umfaßt die Behandlung der löslichen Komponenten mit einem Reduktionsmittel, und Extrahieren der behandelten löslichen Komponente mit einem organischen Lösungsmittel.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei 3',4'-Anhydrovinblastin aus Catharanthus roseus-Gewebe extrahiert wird, umfassend die Stufen.

A) Extrahieren des Gewebes mit einem wäßrigen Medium mit einem sauren pH-Wert,

B) Abtrennen der löslichen Komponente des erhaltenen Auszugs von der unlöslichen Komponente, gegebenefalls durch Zentrifugieren,

C) Behandeln der löslichen Komponente mit einem Reduktionsmittel und

D) Extrahieren der behandelten löslichen Komponente mit organischem Lösungsmittel.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Reduktionsmittel Natriumborhydrid ist.

4. Verfaahren nach Anspruch 3, wobei die Konzentration an Natriumborhydrid in der behandelten Lösung 0,05 bis 4,0 mg/ml beträgt.

5. Verfahren nach einem der voragehenden Ansprüche, wobei das organische Lösungsmittel Ethylacetat ist.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der pH-Wert der löslichen Komponente 3,5 bis 6,5 beträgt.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das wäßrige Medium eine Säure oder ein Salz umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Säure Salzsäure und das Salz Natriumchlorid ist und die Molarität der Natriumchloridlösung 0,9 M bis 3,0 M beträgt.

9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei nach der Extraktion des Gewebes mit einem wäßrigen Medium mit einem sauren pH-Wert Wasserstoffperoxid zugegeben wird, vorzugsweise in einer Menge von mindestens 8 mM.

10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Catharanthus roseus-Gewebe vor der Extraktion verrieben und mit cellulolytischen Enzymen aufgeschlossen wird.