SE464524B

SE464524B - Antibiotisk antitumoerfoerening

Info

Publication number: SE464524B
Application number: SE8502996A
Authority: SE
Inventors: J A Matson; J A Bush
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1984-06-18
Filing date: 1985-06-17
Publication date: 1991-05-06
Also published as: PT80656A; ZA852370B; GB8515256D0; DE3521436A1; NL8501708A; GR851452B; GB2160529A; AU4048085A; FI80475B; IE58629B1; JPS6122099A; GB2160529B; FR2568892A1; DK272985A; ES8609485A1; JPH0158200B2; KR930003107B1; MY100478A; KR860000382A; SE8502996D0

Description

464 524 H ;C\ FH; çH3 H3C C-OH C330 \ OH EÛ-NH-CHZ-CO-N-CHg-CO-ﬁ-šﬂ j; s N, CO-NH-CH-Cp-rgj/ÛR: 50 ' Ns l | çHz 0 I 9 ß” -°"* s §0 3,0 i N-co-cu-NH-co f" g çH-:y-co-cHZ-N-co-cHrNH-co 2 "° * OCH; I :ao-IQ en, ca, H,c ca, 10 R: Rz Lvmgptin A -cocrg -cocæg _ s -cocna H 15 ' " rg -Coga cn -can 2 3 3 Luzopeptinerna A, B, C och D innehåller sådana strukturella särdrag som 3-hydroxi-6-metoxikinaldinsyra som kromofor och 20 4-hydroxi-2,3,4,5-tetrahydropyridazin-3-karboxylsyra, var- vid den strukturella skillnaden mellan de tre komponenterna uteslutande ligger i graden av acetylering av hydroxylgrup- pen i tetrahydropyridazingruppen. 25 Detaljerad beskrivning av uppfinningen Uppfinningen avser ettnyttcykliskt depsipeptid-antitumör- antibiotikum, som i föreliggande sammanhang betecknas som sandramycin och har strukturformeln 30 CPëcáCH, \ ou ' ﬂfﬂ. clzu,| / °°'NH°H=“C0-N-ca,-co-u-cﬂ .

N coNH-çH-co- Åo cH 35 (I, ' J* “ än, | f° -co-cÉH-NHo ,~ TH-:y-co-cH,-_-r|«-co-c|-:,NH o H \ I CH CH, gg' O 10 15 20 25 30 35 464 524 och ett förfarande för framställning, isolering och rening av sandramycin i väsentligen ren form.

Det nya antibiotikumet sandramycin erhålles genom jäsning av en ny mikroorganism, som preliminärt klassificeras som en art tillhörande släktet Nocardioides, ackumulering av sandramycin som alstras av nämnda organism och tillvarata- gande av antibiotikumet sandramycin från odlingsvätskan.

En föredragen sandramycin-alstrande mikroorganism är No- cardioides sp. stam C49 009, som har isolerats från ett jordprov uppsamlat i Mexico och mutanter därav. Denna stam har deponerats hos the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland och därvid erhållit depositionsnumret ATCC 39419.

Mikroorganismen Nedan följer en allmän beskrivning av den föredragna mikro- organism som alstrar antitumörantibiotikumet sandramycin.

Morfologi - Stam nr. C49 009 bildar både substrat- och luft- ' mycelium (0,4 pm brett) och substratmyceliet är långt, välgrenat och fragmenterat i korta trådar eller stavar efter 1 vecka. Stam nr. C49 009 har benägenhet att förlora sin förmåga att bilda luft- mycelium vid fortsatt odling. Hyferna hos luftmy- celiet är grenade i ringa utsträckning. Mikrosko- piska observationer visar att lufthyferna är mer eller mindre sick-sack-formade frân början och ut- vecklas till långa raka kedjor av artrospor-lik- nande cylindriska segment (0,5 x 1 till ca 3 pm), vilka senare separerar med genomskinliga hyfer.

Ytan hos de sporliknande segmenten är slät. Stam nr. C49 009 är grampositiv och är icke syrafast.

Sporangium, mobila sporer eller sclerotium ob- serveras ej. 464 524 Cellväggssammansättning och helcellsockerkomponenter Cellväggen till stam C49 009 innehåller LL-diamino- pimellinsyra och glycin som karakteristiska aminosyra- 5 komponenter i cellväggen enligt de metoder som har be- skrivits av B. Becker et al i Appl. Microbiol., lå, 236-243 (1965) och T. Yamaguchi i J. Bacteriol., §2, 441-453 (1965). Helcellhydrolysat visar närvaron av glukos, mannos och ribos men uppvisar frånvaro av di- 10 agnostiskt socker vid bestämning enligt den metod som har angivits av M.P. Lechevalier et al. i Biol. Actino- mycetes Related Organisms, ll, 78-92 (1976). Ovannämn- da cellväggsammansättning och helcellsockerkomponenter visar att stam nummer C49 009 är en actinomycetesart 15 av cellväggstyp I.

Odlingskarakteristika och fysiologiska karakteristika Stam nummer C49 009 är en obligat aerob actinomycet och 20 växer väl i de flesta deskriptiva medier. Luftmyceliet bildas rikligt eller i måttlig utsträckning på ISP-me- dium nummer 3, 5 och 7 och på Czapeks sackaros-nitrit- -agar men sparsamt på näringsmässigt rika organiska me- dier såsom ISP-medium nummer 2 och 6 eller Bennetts agar. 25 Luftmyceliets färg är vit. Melanoid och andra distinkta pigment bildas ej i något ev de hittills iinaereökte dee- kriptiva medierna. Frånsidefärgen hos det vegetativa my- celiet är endast gulaktig. Optimal tillväxt erhålles vid 28°C, måttlig tillväxt vid 15°C och 37°C men ingen 30 tillväxt vid 5°C och 45°C. Gelatin och stärkelse sön- derdelas. Tyrosinasreaktionen är negatv. Tillväxten in- hiberas i närvaro av 7% NaCl eller 0,01 % lysozym. Od- lingskarakteristika och fysiologiska karakteristika för stam nummer C49 009 visas i tabellerna 1 respektive 2. 35 Stam nummer C49 009 utnyttjar de flesta socker för till- växt och utnyttjandet av kolkällor visas i tabell 3. 10 15 20 25 30 35 Tabell 1 464 524 Odlingskarakteristika för stam nummer C49 009* Trypton-jästextrakt-odlingsvätska (ISP nr. 1) Sackaros-nitrat-agar (Czapeks agar) (Czapeks agar) Glukos-asparagin-agar Glycerol-asparagin-agar (ISP nr. 5) Oorganiska salter-stärkelse-agar (ISP nr. 4) Tyrosin-agar (ISP nr. 7) V: måttlig; flockiga, svagt gula sediment : inget :ymug : gulaktigt vit (92)*** till mörkt gråaktigt gul (91) : måttligt, vitt (263) : måttligt, gult (87) : ringa : gulaktigt vit (92) till blekgul (89) L: ringa, vitt (263) D: inget V: måttlig F: ljusmﬂ. (86) till mått- ligt gul (87) L: måttligt, vitt (263) D: inget- V: måttlig F: blekgul (89) till mått- ligt gul (87) L: ringa, vitt (263) D: inget V:ymug F: blekgul (89) till mörk- gul (88) : måttligt, vitt (263) : inget 464 524 Tabell 1 (forts.) Näringsagar V: måttlig F: blekgul (89) 5 L: måttligt, vitt (263) D: inget Jästextrakt-maltextrakt-agar V: ymnig (ISP nr. 2) F: blekgul (89) till mått- 10 ligt gul (87) L: ringa, vitt (263) D: inget Havremjölsagar V: måttlig 15 (ISP nr. 3) F: gulaktigt vit (92) till måttligt gul (87) L: måttligt, vitt (263) D: inget 20 Bennetts agar V: måttlig F: blekgul (89) till mörkgul (88) L: ringa till sparsamt, vitt (263) 25 D: inget Pepton-jästextrakt-järn-agar V: ringa (ISP nr. 6) F: blekorgangegul (73) till ljusorangegul (70) 30 L: sparsamt, vitt (263) D: inget *øbserverad efter inkubation 3 veckor vid 28°C **Förkortningar: V = växt; F = frânsidefärg; L = luftmycelium; D = diffunderbart pigment 35 ***Färgangivelser och siffror inom parentes följer den färg- standard som angivits i "Kelly, K.L. och D.B. Judd: ISCC-NBS color-name charts illustrated with Centroid Colors.

US Dept. of Com. Cir. 553, Washington D.C. Nov., 1975". 10 15 20 25 30 35 Tabe11 2 464 524 Fysioïogiska karakteristika för stam nr. C49 009 Test Temperaturintervaïi för tiïiväxt Geïatinïikvefaktion Stärkeïsehydroiys Reaktioner i skummjöik Biïdning av melanoid- pigment Tyrosinasreaktion Nitratreduktion Nitratreduktion pH-tolerans Svar Maximai växt vid 28%.

Mattiig växt vid 1s°c och 37°C. Ingen växt vid s°c och 4s°c Likvefaktion Hydro1ys Koaguïation Negativt Negativt Negativt Negativt Växt vid pH 5,0 ti11 pH 10,5. Ingen växt vid pH 4,5 Använd metod eller medium Bennetts agar 1 % maïtextrakt, 0,4 % jäst- extrakt, 0,4 % gïukos, 20 % geïatin Stärkeïseagarpïatta Difco skummjöïk Tyrosinagar, pepton-jäst- extrakt-järn-agar och tryp- ton-jästextrakt-odiingsvätska Arais metod* Czapeks sackaros-nitrat- -odiingsvätska 0,5 % jästextrakt, 1 % glukos, 0,5 % KN03, 0,1 % CaC03 Jästextrakt-ma1textrakt- -agar 464 524 10 15 20 25 30 35 Tabe11 2 (forts.) Test NaC1-toïerans Lysozym-to1erans Svar Växt vid 5 % NaC1 ei- Ter därunder. Ingen växt vid 7 % NaC1.

Känslig, men partieiït resistent (växt av några koionier vid 0,01 % ïysozym) Använd metod elïer medium Basmedium: 1 % jästextrakt, ; 2 % 1ös1ig stärkelse, 1,5 % ¿ agar Tryptikas-soja-od1ingsvätska pïus 1,5 % agar *Arai, T. och Y. Mikami, "Chromogenicity of Streptomyces". Appï. Micro- bioï., gå, 402-406 (1972).

Koïhydratutnyttjande hos stam C49 009 Gïyceroï D(-)-arabinos L(+)-arabinos D-xyïos D-ribos L-rhamnos D-gïukos D-gaïaktos D-fruktos D-mannos L(-)-sorbos Sackarøs Laktos Ce11obios Melibios Trehaïos Raffinos D(+)-melezitos Lösïig stärkeïse Ce11u1osa Tabe11 3 + I + + + + + + + I + + + + -l- + + + 10 15 20 25 30 35 JB O\ 4> 01 BJ Fl Tabell 3 (forts.) Dulcitoï Inositoï D-mannitol + D-sorbitol - Saïicín Observationer efter inkubation 3 Basmedium: veckor vid 28°C.

Pridham-Gottliebs oorganiska medium.

Förkortningar: +: positivt utnyttjande, Taxonomi - -: negativt utnyttiande.

Stam nummer C49 009 karakteriseras av sin grampo- sitiva reaktion, icke-syrafasta natur, fragmente- ring av substratmycelium, bildning av vitt luft- mycelium, artrosporliknande segmentering i hela delar av luftmycelium och frånvaro av förmåga att bilda något distinkt pigment. Dessa karakteristi- ka jämte närvaron av LL-diaminopimellinsyra och glycin men frånvaron av diagnostiskt socker i cell- '.väggen placerar stam nummer C49 009 i släktet No- cardioides (H. Prauser, Intl. J. Syst. Bacteriol., gå, 58-65 (1976)). Stam nummer C49009 skiljer sig från luftmyceliumbildande nocardiQform-actinomyce- tes innefattande Nocardiopsis dassonvillei, Saccha- ropolyspora hirsuta och samtliga heterologa arter tillhörande släktet Nocardia vad gäller den diag- nostiska aminosyra- eller sockersammansättningen hos cellväggen och de diagnostiska fysiologiska egenskaper som beskrives av R.E. Gordon et al., J. Gen. Microbiol., lgg, 69-78 (1978)) och som vi- sas i tabell 4. Stam nr. C49 009 skiljer sig vi- vidare från släktet Streptomyces genom sin sporo- gena morfologi av nocardia-tYPï så exempelvis frag- menterar substrattyperna hos stam nummer C49 009 i korta trådar eller stavar. De artrosporliknande segmenten hos stam nummer C49 009 kan särskiljas från sporerna hos Streptomyces vad gäller bild- 464 524 10 ningsstället, arrangemanget i hyfslidor och från- varon av distinkt sporvägg.

Tabell 4 5 Diagnostiska fysiologiska egenskaper hos stam C49 009 Syrafasthet - Sönderdelning av: 10 Adenin - Kasein + Hypoxantin - Tyrosin + Karbamid - 15 Xantin - Resistens mot: Lysozym - Rifampicin + 20 Hydrolys av: Aeskulin ' + Hippurat + Stärkelse + 25 Syra frân: D(-)-arabinos + L(+)-arabinos - Erytritol - Glukos 30 + Inositol + Laktos + D-melezitos + Melibios + Metyl-x -glukosid - Raffinos + 35 å) 10 15 20 25 30 35 4» Q* 45 nn NJ F» 11 Tabell 4 (forts.) Utnyttjande av: Bensoat - Citrat + Mukat - Succinat + Tartrat - Nitrit från nitrat - överlevnad vid 50°C, 8 timmar - Förklaring: +: positiv karakteristik; -: negativ karakteristik Känslighetsprofilen mot en serie taxonspecifika fager skil- jer stammarna tillhörande släktet Nocardioides från besläk- tade släkten såsom Streptomyces eller Nocardia (se H. Prau- ser: Host-phage relationships in nocardioform organisms, “In the biology of the Nocardiae", Edit. M. Goodfellow et al., London, New York och San Francisco, Academic Press (1976)). Känsligheten hos stam nummer C49 009 mot dessa actinofager undersöktes icke eftersom fagerna inte var till- gängliga för oss. Baserat på odlingskarakteristika och fy- siologiska karakteristika har de sjutton stammar av släktet Nocardioides som har isolerats från jodrprover tillvaratagna på olika platser i världen inordnats i en enda art, Nocar- dioides albus. Stam nummer C49 009 skiljer sig från Nocar- dioides albus i sitt utnyttjande av L-arabinos och inositol men liknar den sistnämnda vad gäller de totala odlingska- rakteristika och fysiologiska karakteristika. Således har stam nummer C49 009 preliminärt klassificerats som en art tillhörande släktet Nocardioides.

Det tordes inses att föreliggande uppfinning icke begränsas till användningen av den speciella stammen nummer C49 009 eller till organismer som helt motsvarar ovan angivna be- skrivning. Uppfinningen avser även att innefatta andra sandra- 464 524 12 10 15 20 25 30 35 mycinalstrande stammar eller mutanter av nämnda organism, som kan erhållas utgående från den beskrivna organismen med- elst kända metoder såsom röntgenbestrålning, ultraviolettbe~ strålning, behandling med kvävesenapsgaser, fagexponering och liknande.

Framställning av antibiotikumet Sandramycin framställes genom att man odlar Nocardioides sp. stam nummer C49 009 (ATCC 39419) eller en mutant.därav med väsentligen samma egenskaper som organismen ATCC 39419 i ett konventionellt näringsmedium. Organismen får växa i ett näringsmedium, som innehåller kända näringskällor, dvs. assimilerbara kol- och kvävekällor plus eventuella oorga- niska salter och andra kända tilläggsfaktorer. Submersa aeroba betingelser utnyttjas företrädesvis för framställ- ning av stora mängder av antibiotikumet, ehuru man för framställning av begränsade mängder även kan använda ytkul- turer och flaskor. Z Näringsmediet bör innehålla en eller flera assimilerbara kolkällor såsom glyoerol, glukos, sackaros, mannos, fruktos, majsstärkelse, mannitol, melass och liknande, antingen i ren ' form eller i orent tillstånd. Näringsmediet bör även inne- hålla en eller flera assimilerbara kvävekällor såsom exem- pelvis sojabönmjöl, fiskmjöl, maltextrakt, jästextrakt, pepton, glutenmjöl, bomullsfröembryomjöl, sojamjöl, linfrö- mjöl, bomullsfrömjöl, kasein, hydrolyserade proteinsubstan- ser, nitrater, ammoniumsalter, karbamid och liknande. Oor- ganiska närsalter såsom natriumklorid, kaliumfosfat, magne- siumsulfat, kalciumkarbonat och spårmängder av tungmetall- salter såsom koppar, zink, mangan, järn och liknande kan även sättas till näringsmediet.

Jäsningstemperaturen bör ligga inom intervallet från 15°C till ca 37°C och företrädesvis inom intervallet från ca 25°C till aa 3o°c. ps nos jasnlngsmeaiet bar ligga inom inter- vallet från ca 5 till oa 10,5 och det föredragna interval- _ let är från ca 6 till ca 8,5. Vanligen uppnås optimal produk- 10 464 524 13 tion av sandramycin pâ 2 - 9 dygn, beroende på temperaturen.

När tankjäsning skall utföras är det önskvärt att framställa ett vegetativt inokulat i ett näringsmedium genom ympning av näringsmediet med en sned- eller jordkultur eller en lyo- filiserad kultur av mikroorganismen. Efter erhållande av ett aktivt inokulat på detta sätt överföres detta aseptiskt till jäsningstanksmediet.

Isolering av sandramycin Efter fullbordad jäsning utvinnes sandramycin från odlings- mediet och isoleras i väsentligen ren form enligt det fler- stegsförfarande som åskådliggöres i nedan angivna flödes- schema. 464 524 10 förbrukad vatten- 15 20 25 30 35 Heljäsningsvätska 14 (1) extrahera med etylacetat (2) blanda med diatomacéjord, filtrera (3) separera faser och indunsta lösning antibiotiskt râextrakt (1) extrahera med vattenhaltig metanol coh Skellysolve B och separera faser Skellysolve B-fas, kasseras Ü vatten-metanol (1:9)-fas (1) späd med vatten vatten-metanol (1:3)-fas (1) extrahera med koltetra- klorid och indunsta l återstod A vatten-metanol (1:3)-fas (1) späd med vatten 10 15 20 25 30 35 J» 0\ 4> (Il. nä ß» 15 vatten-metanol (7:13)-fas (1) extrahera med.kloro- form och indunsta I återstod B vatten-metanol (7:13)-fas kasseras (1) kolonnkromatografering av återstod A och B under användning av diatomacêjord- bärare (2) toluenfraktion indunstas W återstod C (1) silikagelkromatografi (2) linjär gradientelueríng \l, sandramycin (1) omkristallisation renad sandramycin A464 524 10 15 20 25 30 35 16 Här följer en redogörelse för flödesschemat i detalj.

Helodlingsvätskan från jäsningen av Nocardioides sp. stam nummer C49 009 extraheras först med ett med vatten icke blandbart organiskt lösningsmedel och företrädesvis med et- ylacetat. Filterhjälpmedel såsom Dicalite (varunamn tillhö- rande Grefco Inc., Torrance, Ca. för diatomacêjord) sättes företrädesvis till extraktionsblandningen och blandningen filtreras därefter för avlägsnande av olösligt material. Ef- ter filtrering separeras den organiska fasen från extraktions- blandningsfiltratet och koncentreras genom indunstning för erhållande av ett råextrakt av nämnda antibiotikum. Råextrak- tet fördelas mellan ett alifatiskt kolvätelösningsmedel så- som Skellysolve B (varunamn tillhörande Skelly Oil Co för isomera hexaner) och ca 10 % vatten i metanol. Den vatten- haltiga metanolfasen spädes med en ytterligare mängd vatten och den resulterande metanollösningen innehållande ca 25 % vatten extraheras med ett organiskt lösningsmedel såsom kol- tetraklorid. Den vattenhaltiga metanolfasen spädes därefter med vatten och den resulterande metanollösningen innehållan- de ca 35 % vatten extraheras med ett organiskt lösningsmedel såsom kloroform. Koltetrakloridextrakten sammanföres och in- dunstas i vakuum för erhållande av återstod A. Kloroformex- trakten sammanföres och indunstas i vakuum för erhållande av återstod B. Aterstoderna A och B kan kombineras och kromato- graferas på en kolonn innehållande diatomacêjord såsom Dica- lite under användning av organiska lösningsmedel av låg till hög polaritet. De fraktioner som innehåller antibiotikumet kombineras och indunstas i vakuum för erhållande av återstod C. Ytterligare rening kan åstadkommas genom silikagel-låg- trycksvätskekolonnkromatografi av återstod C eller högpres- tandavätskekromatografi vid måttligt tryck av återstoderna D, D', E och E', såsom beskrives nedan i exempel 3, steg C, under användning av en linjär gradient av kloroform till 5% metanol i kloroform som elueringsmedel. De lämpliga fraktio- nerna ifråga indunstas till torrhet för erhållande av sandra- mycin och omkristallisation ur ett lämpligt lösningsmedels- system ger ren kristallin sandramycin.

Oh- 10 20 25 30 35 4624 524 17 Strukturen hos sandramycin Sandramycin är ett cykliskt depsipeptid-antitumörantibiotikum innehållande en 3-hydroxikinolinkärna som kromofor och en pipekolinsyrarest. Med ledning av spektralanalys och kemisk analys har strukturformeln för sandramycin fastställts till crëcfclzu, <.=H- <.=~=| \ °H co-uucuçco-N-cnçco-N-fi-I , co N coNH-çH-co- à CH; i à 9"- N 1 - -CH~NHOC cH-n-co-cH,_-|;1-co-<:H,NH-co H \ | CH; CH! . /cH CH; H; Sandramycin är ett vitt kristallint fast material med en smältpunkt av 208 - 212°C, har molekylformeln C60H76O16N12 och en molekyl"ikt av 1221,í312. Det består av grundämnena kol, väte, kväve och syre. Elementaranalysdata är följande: C 52,78 H 6,79 N 12,31 0 (som skillnad), 28,12 C 52,58 H 6,27 N 12,29 O (som skillnad), 28,86 Ber. för C60H76016N12-8H2O: FuIlIleti Högupplösningsmasspektrumet för sandramycin fastställdes med en Kratos MS-50 spektrometer och FAB-jonisation. Observerade massdata är följande: 10464 524 10 15 20 25 30 18 Ber. för (M+H)Ijon= 1221,ss79 Funnet för (M+H)fjon= 1221,s571.

Infrarödabsorptionsspektrumet för sandramycin vid pellet- tering i KBr uppvisar karakteristiska band vid följande frekvenser, som är uttryckta i cm-1: 3500, 3340, 2970, 2940, 2880, 1748, 1660, 1640, 1598, 1520, 1468, 1445, 1420, 1336, 1290, 1265, 1235, 1172, 1138, 1092, 1055, 1018, 922, 885, 855 Och 838.

Ultraviolettabsorptionsspektrumet för sandramycin bestämdes i metanol (0,01798 g/liter) under neutrala, sura och basiska betingelser. Observerade absorptionsmaxima och absorptivi- teter är följande: Ämax i nm (a) i CH3OH : 356(8.1), 296(7.5), 229(62.8), 217(63.7) i CH3OH-HClt: 356(8.3), 306(8.1), 228(58.4), 210(62.3) i CH3OH-NaOH: 395(9.2), 301(7.2), 246(59.8).

Ett protonmagnetresonansspektrum för sandramycin, upplöst i deutererad kloroform, bestämdes med en Bruker-spektrometer modell WM-360, som arbetade vid 360 MHz och utnyttjade tet- rametylsilan som inre standard. De observerade kemiska för- skjutningarna (6 -värden), kopplingskonstanterna (J-värden i Hz) och mönsterbeskrivningarna är följande: 10 20 25 30 35 464 524 19 11.7s(s, za, A;~Qg), 9.se(d, J=6.39, 23, ser Ng). 8.s5(bs. 23. gly NH), 7.az(bs, za, A:-H8), 7.12(m, za, A:-n 1. 7.e3(s; zu.

Arqiíï' 7_52(m, 43, Ar-HG och Ar-H7), 5.60 (m, 28, aH 1 pipàf s.s6(a, J=17.sa, zu sar acu), s.2s(m, 2H. Ser “C911 5-°1(å' J=12.79, 2H, ser BCH), 4.88(d, J=12.79, 2H, val aCH), 4.45(bä| J=12,79, 4H, ser BCH«och gly aCH), 4.07(bå, J=15-99: 43: 93 i pip Qch g1y acm, sﬂsum, J=12.19, 2:1. eH i piP-h _3-58(ﬁf J=17.sa, zu, sa: ca), 3.14(s, sn, N-ca3), 2.9e(s, sn, N-cH3>, 2.os(m, zu, val ßcn), 1.a2(bS. 4H. ßcn 1 pip.), 1.sa1bm, 4H. ven i pip.), 1.s7(bm, 4n, sen ¿__pip.), o:94(d, J=6.37, en. val-CH3), 0.80(d, J=5-37: 531 Va1'CH3)' Ett kol-13-magnetresonansspektrum för sandramycin, upplöst i deutererad kloroform, bestämdes med en Jeol-spektrometer modell FX90Q, som arbetade vid 22,5 MHz och utnyttjade tet- rametylsilan som inre standard. De observerade kemiska för- skjutningarna (ppm-värden), där varje kemisk förskjutning representerar tvâ kolatomer, och de grupper som tillskrivs dessa är följande: §r¿ kemisk förskjutning (ppm) Tillskriven grupp 1 171.73 karbonyl 168.54 karbonyl 168.37 karbóﬁyl 4,5 166.91, 166.91 karbonyler 6 165.39 karbonyl 7 153.04 3-hydroxikinolin C-3 8 140.64 C-2 9 133.87 C-8a 10 131.22 C-4a 11 128.61 C-8 12 127.64 C-7 13 126.23 C-5 14 125.58 C-6 15 119.45 C-4 16 61 . 4 3 N-metylval in q( CH 17 27.90 ß cn L 464 524 10 15 20 25 20 §r¿ Kemisk förskjutning (ppm) Tillskriven grupp 18 18.58 YCHB 19 17.82 Ycn3 20 29.42 NCH3 21 49.79 glycin MCHZ 22 41 . 02 sarkosin :XcH 23 34.08 N-CH3 24 51.74 serin Ci CH 25 61.11 ß cnz 26 48.49 pipekolinsyraá CH 27 27.91) ß -cnz 28 19.34 V-cnz 29 24.11 8 -CH2 30 43.07 E -CH2 De strukturella nyckelsärdrag hos sandramycin som skiljer denna förening från luzopeptinerna A, B och C är närvaron av 3-hydroxikinaldinsyra- och pipekolinsyrarester istället för 3-hydroxi-6-metoxikinaldinsyra- respektive 4-substituerad tetrahydropyridazin-3-karboxylsyragrupper.

Biologisk aktivitet hos sandramycin De antibakteriella aktiviteterna hos sandramycin fastställdes medelst den metod som utnyttjar tvåfaldig agarserieutspäd- ning. Resultaten visas i tabell 5 i jämförelse med aktiviteter- na förluzopeptin A och echinomycin. Såsom framgår av tabell S uppvisar sandramycin en kraftigt inhiberande verkan mot grampositiva organismer såsom Bacillus subtilis och Staphylo- coccus aureus liksom mot Streptococcus faecalis. 10 15 20 25 30 464 524 21 Tabell 5 Antimikrobiell aktivitet hos sandramycin Minsta inhiberande koncentration (MIK) (P9/ml) Testorganism Sandramycin Lazopeptin A Echinomycin B. subtilis (Rec. +) A22508-2 0.024 0.195 0.049 B. subtilis (Rec. -) A22509-2-2 0.012 0.049 < 0.003 S. aureus 209P-A9497 0.012 0.098 0.012 S. aureus (echinomycin- resistent) A9628 0.098 0.098 0.78 Strep. faecalis A9611 0.024 0.195 0.012 E. coli A15119 12.5 12.5 12.5 E. coli (aktinomycin- känslig) A21780 -(AS-19) 12.5 12.5 6.25 Sandramycin har även testats på den transplanterbara mustu- mörleukemien P-388 och resultaten visas i taßell 6. Den me- tod som användes följde allmänt den metodbeskrivning som har angetts av the National Cancer Institute (Cancer Che- mouherapy rep. Part 3, 3, 1-103 (1972)). ne väsentligaste försöksdetaljerna ges under tabell 6. Två olika doserings- scheman testades; en enkeldos på dag 1 och doser dagligen iader 5 dagar. Med båda behandlingsschemana synes den opti- mala dosen vara ca 0,2 mg/kg/injektion. 1464 524 22 Tabell 6 Effekt av sandramycin på P-388-leukemi 5 Behand- Dos, IP Effekt GVÄ antal lings- mg/kg/ MÖT MÖT gram overlev.

Förening schema inj. dagar % B/K dag 4 dag 5 ; Sandramycin d. 1 3.2 Toxisk Toxisk -2.8 0/6 1.6 ' 11.5 128 -1.3 6/6 0.8 10.0 111 -1.6 6/6- 10 0.4 11.0 122 -0.7 6/s 0.2 14.5 161 -1.4 6/6 0.1 11.0 122 -0.9 6/6 0.05 10.0 111 -0.6 6/6 15 0.025 9.5 106 -0.2 6/6 Sandramycin d-1-95 1.6 Toxisk Toxisk -1.7 2/6 0.8 6.0 67 -1.4 5/6 0.4 11.0 122 -1.3 6/6 0.2 12.0 133 -1.7 5/6 20 0.1 11.5 128 -0.8 6/6 0.05 8.5 94 -1.8 6/6 0.025 10.0 111 -1.4 5/5 0.0125 10.5 117 -0.9 6/6 Kontroll Saltlösn. 9.0 - 0.2 10/10 25 . _ 6 . _ . .

Tumórinokulat: 10 askitesceller implanterade_intraperitonealt Värddjur: CDF1 honmöss Utvärdering: MÖT = medelöverlevnadstid Effekt: % B/K = MÖT för behandlade/MÖT för kontroll- 30 gruppen) x 100 Kriterium: % B/K g 125 anses innebära signifikant anti- tumöraktivitet GVÄ: Genomsnittlig viktändring (behand1ade/kontroll- grupp) i gram (pâ dag 4). 35 Såsom framgår av ovan angivna antimikrobiella data och mus- tumördata är sandramycin användbart som antibiotikum och även som antitumörmedel för inhibition av maligna däggdjurstumörer 10 15 20 25 30 35 -Ph O\ $> (Il ND F- 23 såsom P-388 leukemi.

Inom ramen för uppfinningen faller även farmaceutiska kom- positioner, som innehåller en effektiv antimikrobiell eller tumörinhiberande mängd av sandramycin i kombination med en inert, farmaceutiskt godtagbar bärare eller utspädnings- medel. Dylika kompositioner kan även innehålla andra aktiva antimikrobiella medel eller antitumörmedel och kan framstäl- las i vilken farmaceutisk form som helst som är lämﬂig ﬂürdet önskade administreringssättet. Exempel på dylika kompositio- ner innefattar fasta kompositioner för oral administrering såsom tabletter, kapslar, piller, pulver och granulat, fly- tande kompositioner för oral administrering såsom lösningar, suspensioner, siraper eller tinkturer och mixturer och pre- parat för parenteral administrering såsom sterila lösningar, suspensioner eller emulsioner. De kan även tillverkas i form av sterila fasta kompositioner, som kan upplösas i sterilt vatten, fysiologisk saltlösning eller något annat sterilt injicerbart medium omedelbart före användning.

För användning som antimikrobiellt medel administreras sandra- mycin eller den farmaceutiska kompositionen därav så att kon- centrationen av den aktiva beståndsdelen är större än den minsta inhiberande koncentrationen för den speciella organism som skall behandlas. För användning som antitumörmedel kan optimal dosering av sandramycin och optimalt behandlingssche- ma för ett givet däggvärddjur lätt fastställas av fackmannen.

Det inses naturligtvis att den aktuella dosen av sandramycin varierar beroende på den speciella beredningsformen av kom- positionen ifråga, administreringssättet och den speciella lokalisationen och det värddjur och den sjukdom som skall behandlas. Många faktorer, som modifierar verkan av läke- medlet, måste tagas i beaktande innefattande ålder, vikt, kön, diet, administreringstid, administreringssätt, utsönd- ringshastighet, patientens tillstånd, läkemedelskombinatio- ner, reaktionskänslighet och sjukdomens svårighetsgrad.

Uppfinningen åskådliggöres närmare medelst följande utför- 5464 524 10 15 20 25 30 35 24 ingsexempel. Skellysolve B är ett kommersiellt tillgängligt petroleumlösningsmedel (Skelly Oil Co.) innefattande isome- ra hexaner och med en kokpunkt av 60 - 69°C. Dicalite är diatomacêjord tillverkad av Grefco, Inc., Torrance, Cali- fornien. Om ej annat anges är temperaturangivelserna i Cel- siusgrader.

Exemgel 1 Jäsning av sandramycin A. Skakkolvjäsning Nocardioides sp. stam nummer C49 009, ATCC 39419 överfördes till odlingsprovrör på snedagar av jäst-malt-extrakt-agar.

Detta medium utgjordes av 4,0 g glukos, 4,0 g jästextrakt, 10,0 g maltextrakt och 20,0 g agar, som inställdes pâ 1 li- ter med avjoniserat vatten. För varje överföring inkubera- des snedagarkulturen 7 dagar vid 27°C. För framställning av ett inokulat för produktionsfasen överfördes mycelie- växt från snedkulturen till en 500-ml Erlenmeyerkolv innehål- lande 100 ml sterilt medium, som bestod av 30,0 g glukos, 10,0 g sojamjöl, 10,0 g bomullsfröembryomjöl och 3,0 g CaC03, som hade inställts på 1 liter med avjoniserat vatten.

Denna vegetativa kultur inkuberades 48 timmar_vid 27°C på en Gyrotory-skakare modell G53 från New Brunswick Scienti- fic Co., Inc., inställd på 210 varv/minut och beskrivande en cirkel med en diameter av 5,1 cm. 4 ml vegetativ kultur överfördes till en 500-ml Erlenmeyerkolv innehållande 100 ml sterilt produktionsmedium, som bestod av 20,0 g sackaros, 10,0 g sojamjöl, 10,0 g linfrömjöl och 5,0 g CaCO3, som ha- de inställts på 1 liter med avjoniserat vatten. Produktions- kulturen inkuberades i 27°C på en sådan skakare som användes för den vegetativa kulturen, inställd på 250 varv/minut. Ef- ter 96 timmar skördades produktionskulturen för isolering av sandramycin. 'f 10 15 20 25 30 35 -ïäu GW» -IÄ (TI PO 45 25 F "Bench-top"-jäsning För produktion av sandramycin i en "bench-top"-fermentor överfördes 400 ml vegetativ kultur såsom beskrivits i ex- empel 1A till en fermentor (Microgen Model SF-116, New Brunswick Scientific Co., Inc.)med 10 liters produktions- medium, som bestod av 40 g majsstärkelse, 20 g linfrömjöl, 1 g (NH4)2SO4 och 5 g CaCO3 per liter avjoniserat vatten.

Temperaturen hölls vid 27°C, omröringshastigheten var 300 varv/minut och luftflödeshastigheten var 8 liter/minut.Ef- ter 202 timmarsinkubation isolerades sandramycin från kultu- ren.

C. Tankjäsning För produktion av sandramycin i pilotskala överfördes 2 li- ter vegetativ kultur (framställd medelst det allmänna för- farandet enligt exempel 1A) till en fermentor, som innehöll 30 liter produktionsmedium bestående av 40 g majsstärkelse, 20 g linfrömjöl, 1 g (NH4)2SO4 och 5 g CaCO3 per liter av- joniserat vatten. Inkubationstemperaturen var 26,5°C, luft- flödeshastigheten var 80 liter/minut, omröringshastigheten var 375 varv/minut och mottrycket var 1 atmosfär. Efter 183 timmar skördades produktionskulturen för isolering av sandra- mycin.

Exempel 2 Isolering och rening av sandramycin Steg A: Extraktion R; heljäsningsvätska (ca 8 liter) överfördes till en 20-li- ters polyetentank (toppdiameter 48 cm, bottendiameter 44 cm, höjd 55 cm), som var försedd med en tappkran vid bottnen. En lika stor volym etylacetat tillsattes. Blandningen omrördes med en luftdriven omrörare 30 minuter under god omröring. Ca '4e4 524 10 15 20 25 30 35 26 6 liter (2 kg) Dicalite tillsattes och inblandades. Bland- ningen filtrerades på en Dicalite-dyna, som hölls i en Büchner-tratt nummer 12. Filtratet tillvaratogs i en 19- liters flaska försedd med vakuumavtappningsanordning. Dy- nan tvättades med 2 liter etylacetat. Filtratet överfördes :I till en 20-liters separertratt och faserna fick separera. 3 Etylacetatextraktet avlägsnades och koncentrerades till ca 1 liters volym i en glascirkulationsindunstare av laborato- riestorlek försedd med kontinuerlig tillmatning. Koncentratet indundstades ytterligare till en viskös olja i vakuum i en rotationsindunstare för erhållande av 1,94 g râextrakt.

Steg B: Vätske-vätske-fördelning av råextrakt Råextraktet från steg A (1,94 g) upplöstes i en blandning av 200 ml metanol och 200 ml Skellysolve B. Tvåfaslösningen överfördes till en enliters separertratt och späddes med 22 ml vatten. Blandningen skakades och de erhållna faserna fick separera. Den vattenhaltiga metanolen (undre fasen) överför- des till en andra enliters separertratt och extraherades tvâ ytterligare gånger med alikvoter om 200 ml Skellysolve B.

Skellysolve B hade tidigare mättats med en lika stor volym av 10 % vatten i metanol. Den vattenhaltiga metanolfasen späddes med 44 ml vatten och extraherades 3 gånger med 200- -ml-portioner av koltetraklorid. Koltetrakloriden hade tidi- gare mättats med en lika stor volym 25% vatten i metanol.

Den vattenhaltiga metanolfasen späddes med 41 ml vatten och extraherades tre gånger med 200-ml-portioner av kloroform.

Kloroformen hade tidigare mättats med en lika stor volym 35 % vatten i metanol. Koltetrakloridextrakten sammanfördes och indunstades till torrhet i vakuum i en rotationsinduns- tare för erhållande av 595 mg av återstod A. Kloroformex- ß' trakten sammanfördes och indunstades till torrhet i vakuum b i en rotationsindunstare för erhållande av 458 mg av åter- stod B.

Steg C: Triturering av återstoderna A och B Aterstoden A (547 mg) och återstoden B (389 mq), som hade er- 10 15 20 25 30 35 464 524 27 hållits i steg B, sammanfördes och upplöstes i 30 ml av en lösning av två delar kloroform/en del metanol. 17,4 g Dicalite sattes till lösningen och därefter framställdes en uppslamning genom tillsats av 200 ml Skellysolve B.

Lösningsmedlen avdrevs i vakuum med hjälp av en rotations- indunstare. Det resterande pulvret uppslammades i 500 ml toluen och packades i en snabbkromatografikolonn med en längd av 45,7 cm och en inre diameter av 4,1 cm. Dicalite packades i en bädd under tryckflöde (N2-5,7 psi). När pack- ningslösningsmedlet nådde bäddens yta avbröts flödet och trycket över kolonnen avlastades. Ett skikt av Ottawa-sand (ca 2 cm) applicerades på ytan. Kolonnen eluerades därefter under ett flöde serie: 500 ml toluen; 500 ml dietyleter; 500 ml metylenklo- rid; 500 ml kloroform; 500 ml etylacetat; 500 ml aceto- nitril; 500 ml tetrahydrofuran och 500 ml metanol. Toluen- elueringsmedlet och packningsfiltratet kombinerades (ca 1 av kväve under tryck med följande elutrop- liter) och indunstades till torrhet i vakuum i en rota- tionsindunstare för erhållande av 0,699 g av återstod C.

Steg D: Kolonnkromatografering av återstod C En Glenco-kolonn med längden 30 cm och en inre diameter av 2,0 cm fylldes med en uppslamning av 37 g silikagel av fab- rikatet Woelm (0,060 - 0,200 mm, 70 -130 mesh) i kloroform. 0,699 g av återstod C från steg C upplöstes i 5 ml kloro- form och applicerades på kolonnens topp. Provet fick tränga ned i den packade bädden. Utrymmet mellan kolonntoppen och silikagelbädden var fyllt med Ottawa-standardsand. Kolonnen var ansluten till en Glenco gradientelueringsapparat och eluering påbörjades med en 2 liter linjär gradient av klo- roform till 5 % metanol i kloroform under tillvaratagande av 20 fraktioner om vardera 100 ml. Varje fraktion induns- tades till torrhet i vakuum i en rotationsindunstare. Ater- stoden upplöstes i 3 ml av en lösning av 2 delar kloroform/ 1 del metanol. Alikvoter /2 Fl) av varje fraktion applicera- des på silikagel-tunnskiktskromatografiplattor av fabrika- tet Analtech GHLF. Plattorna eluerades med 5 % metanol i I 10 15 20 25 30 35 J 464 524 28 kloroform och visualiserades med 254 nm och 366 nm ultra- violett ljus. Fraktion 6 bedömdes vara homogen. Den kris- tallina återstoden från fraktion 6 omkristalliserades ur kloroform-metanol för erhållande av 215 mg sandramycin.

Detta material omkristalliserades ur kloroform-metanol för erhållande av 188 mg ren sandramycin med smältpunkten 208- -212°c.

Analys Ber. för C H 0 N 8H O: 60 76 16 12 2 c 52,78 H 6,79 N 12,31 Funnet: C 52,58 H 6,29 N 12,29 Exempel 3 Storskaleisolering och -rening av sandramycin Steg A: Extraktion och vätskefördelning av råextrakt Vid upprepning av de allmänna isoleringsförfaranden som har beskrivits i exempel 2, steg A och B, erhölls 1,12 g av återstod A och 3,03 g av återstod B från heljäsningsvätskan (ca 8 liter).

Steg B: Triturering av återstoderna A och B 1,12 g av återstod A, som hade erhållits i steg A, upplöstes i ca 300 ml av en lösning av 2 delar kloroform/1 del metanol. 20 g Dicalite sattes till lösningen. Lösningsmedlet avdrevs till torrhet i vakuum i en rotationsindunstare. Aterstoden uppslammades i 300 ml toluen och indunstades ånyo till torr- het. Detta upprepades en andra gång. Den resulterande åter- stoden uppslammades i 300 ml Skellysolve B och indunsta- des till torrhet i en rotationsindunstare. Detta upprepa- des en andra gång. Dicalite-återstoden uppslammades i 300 ml Skellysolve B och packades i en snabbkromatografikolonn med längden 45,7 cm och en inre diameter av 4,1 cm. Dica- lite packades i en bädd under ett flöde av kväve under tryck (5,7 psi). Ett skikt av Ottawa-sand (ca 2 cm) applicerades 10 15 20 25 30 35 29 524 på bädden. Eluering påbörjades under ett flöde av kväve under tryck med följande elutropserie: 500 ml Skellysol- ve B; 500 nl toluen; 500 ml dietyleter; 500 ml metylenklo- rid; 500 ml kloroform; 500 ml etylacetat; 500 ml aceto- nitril; 500 ml tetrahydrofuran och 500 ml metanol. Toluen- elueringsmedlet indunstades till torrhet i vakuum med ro- tationsindunstare för erhållande av 912,7 mg av återstod B.

Det ovan angivna allmänna förfarandet upprepades med undan- tag av att den däri använda återstoden A ersattes med 3,03 g av återstod B, varvid man erhöll 766,7 mg av återstod E från toluenelueringsmedlet.

De i exempel 3, 3A och B angivna allmänna förfarandena upp- repades med undantag av att de däri erhållna och använda âterstoderna A och B ersattes med 1,5 g av återstod A' res- pektive 1,97 g av återstod B', varvid man erhöll 993,9 mg av återstod D' respektive 693 mg av återstod E' från tolu- enelueringsmedlet.

Steg C: Kolonnkromatografering av âterstoderna D och E En Glenco-kolonn med längden 30 cm och en inre diameter av 2,0 cm packades med en uppslamning av 40 g silikagel av fabrikatet Woelm (0,063 - 0,200 mm, 70 - 230 mesh) i klo- roform. Kolonnen infördes i ett HPLC-system, som arbetade under måttligt tryck och försattes under jämvikt med klo- roform. Återstoderna D, D', E och E' från steg B sammanför- des (ca 3,366 g) och upplöstes i 6 ml kloroform. Lösning- en insögs i en 15-ml provögla. Provöglan infördes i det un- der måttligt tryck arbetande HPLC-systemet och provet pum- pades till kolonnen med 200 ml kloroform. Eluering påbör- jaden med en 2-liters linjär gradient av kloroform till 5% metanol i kloroform under tillvaratagande av sjutton fraktioner om vardera 117 ml. Alikvoter (6 pl) från varje fraktion analyserades medelst tunnskiktskromatografi under användning av 5% metanol i kloroform som elueringsmedel och visualisering med ljus av våglängden 366 nm. Fraktionerna '#64 524 10 15 30 5 och 6 sammanfördes och indunstades till torrhet för er- hållande av 2,166 g av återstod F. Fraktionerna 7 - 12 sammanfördes och koncentrerades till torrhet i vakuum i en rotationsindunstare. Återstoden (953 mg) upplöstes i 6 ml kloroform och âterkromatograferades enligt ovan under an- vändning av en 2 liter linjär gradient av kloroform till 1,5 % metanol i kloroform under uppsamling av tjugo frak' tioner om vardera 100 ml. Fraktionerna 9 - 20 sammanfördes och indunstades till torrhet i en rotationsindunstare för erhållande av 860 mg av återstod G.

Aterstoderna F och G kombinerades och omkristalliserades ur kloroform-metanol för erhållande av 1,985 g ren sandramycin, som var identiskt med den produkt som hade isolerats i ex- empel 2 . i)

Claims

10 15: 20 25 30 35 31 464 524.

1. Antitumör-antibiotikumet sandramycin med strukturformeln mi, H, ou ' çH' çH' o-reHcH,-co-~-cn,-co-N-§H N' oNH-çH-co- ° n, ~ Ü: ïo + -co-cn-Nuo J' TH-ga-co-cfﬁfu-co-crﬁnn o H x cHÛcH.

2. Förfarande för framställning av antitumör-antibiotikumet sandramycin enligt krav 1 med strukturformeln mi, H, ~ en, cm; ' _ Ûfïc" o-Nucsﬁ-co-å-cn-g-co-rﬁ-IH N" om-z- H-co- ° Ha + ~» io -co-cu-uuo ,u| H-ç-co-ca-:f-N-co-cugaa o H \ L, H, cfﬂxﬂ; ' I K ä n n e t e c X n a t därav, att man odlar en sandramycin- 464 524 12 10 15 20 25 30 35 alstrande stam av en ny Nocardioides-art med de egenskaper som identifierar organismen ATCO 39419 eller en mutant därav, med väsentligen samma egenskaper som organismen ATOO 39419, under submersa aeroba betingelser i ett odlingsmedium, som innehåller assimilerbara källor av kol och kväve, till dess en väsentlig mängd sandramycin har bildats ocn ackumulerats i odlingsmediet.

3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att man dessutom isolerar sandramycin fran odlingsmediet.

4. 4. Biologiskt ren kultur av mikroorganismen Nocardioides sp. ATCC nr. 39419, som har förmaga att alstra antitumör-anti- biotlkumet sandramycin med strukturformeln cøàdácﬂ, s» eH-I \ °" o-NHcr-n-co-n-crn-co-u-:H N' oNH-çH-co- ° en, + ~« ïo -co-cH-Nno J! ïH-N-co-cnf-N-co-crﬁnu o H \ I '¿ en, H, /cs cHÖcH, i en utvinningsbar mängd vid odling i ett odlingsmedium, som innenàller assimilerbara källor av kol och kväve, under sub- mersa aeroba betingelser.

5. Farmaceutisk komposition, k ä n n e t e c k n a d därav, att den innehåller en effektiv antibakteriell mängd av sandramycin enligt krav 1 med strukturformeln 'I- 10 15 20 25 30 35 33 464 524 crädﬁcu, . _ ç", o-Nucæu-co-N-crn-co-N-ÉH 0 ÛÛÛ N' oNH-cH-co- H: H: :o -co-cH-NHo ß' H-n-co-cHL-N-co-cmnﬂ o m, \ /cH CH' H' CH; \CH; l kombination med en farmaceutisk bärare eller utspädnings- medel .

6. Farmaceutisk komposition, k ä n n e t e c k n a d därav, att den innefattar en effektiv tumörinhiberande mängd av sandnamycin enligt krav 1 med atrukturformeln an, u, e» eH-I o-Nucm-co- u- cufco-N-EH _ o 1 Ûfïf" N DNH-?H°C0- cH, H: Yo -co- H-Nﬁo ,N H ca, ån, . caffcu, 1 kombination med en farmaceutisk bärare eller utspädnings- medel.