DK160280B

DK160280B - 4'-deschlorrebeccamycin, fremgangsmaade til fremstilling heraf samt farmaceutisk praeparat indeholdende det

Info

Publication number: DK160280B
Application number: DK195585A
Authority: DK
Inventors: James Andrew Matson
Original assignee: Squibb Bristol Myers Co
Priority date: 1984-09-04
Filing date: 1985-05-01
Publication date: 1991-02-18
Also published as: IT1186723B; DK195585D0; DK195585A; JPH0362715B2; CA1249235A; HK22191A; HU193973B; GB2164035B; CY1584A; HUT39479A; FR2569702A1; SE8502135D0; JPS61148192A; DK160280C; IT8521002A0; GB8512334D0; GB2164035A; FR2569702B1; SE466207B; US4524145A

Description

i

DK 160280 B

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt antitumoranti-biotikum, benævnt 4'-deschlorrebeccamycin, en fremgangsmåde til fremstilling heraf samt et farmaceutisk præparat indeholdende det.

Fra dansk patentansøgning nr. 356/84 er det kendt, at rebeccamycin, 5 som har formlen 10 !CflSrS‘· I 3 i U*ri· 15 p ho 51) VV 3"

K* OH

0CH3 20 og opnås ved dyrkning af Nocardia aerocolonigenes stamme C38.383-RK2 (ATCC 39243), er aktivt over for eksperimentelle animalske tumorsystemer, f.eks. P-388 leukæmi hos mus.

25 Det hidtil ukendte antitumor-antibiotikum, benævnt heri som 4'-des- chlorrebeccamycin, er ejendommeligt ved at have formlen 30 35 DK 160280 B : 2 ,03CO·-· ΙΓτ r 10 /'i* ο Λ.ΟΗ \ r J|3"

4-//^H

15 1 0CH3

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er ejendommelig ved dyrkning af en 4,-deschlorrebeccamycin-producerende stamme af 20 Nocardia aerocolonigenes, fortrinsvis den kendte Nocardia aerocolonige-nes stamme C38.383-RK2 (ATCC 39243) eller en mutant heraf med væsentlig samme egenskaber i et vandigt næringsmedium indeholdende assimilerbare carbon- og nitrogenkilder under submerse, aerobe betingelser, indtil en væsentlig mængde 4/-deschlorrebeccamycin er produceret af den førnævnte 25 mikroorganisme i dyrkningsmediet, hvorefter 4'-deschlorrebeccamycin udvindes fra dyrkningsmediet i en form, der i det væsentlige er fri for samtidig producerede substanser.

Forbindelsen 4,-deschlorrebeccamycin udviser antimikrobi el aktivitet og også aktivitet over for eksperimentelle animalske tumorsystemer, 30 f.eks. P-388 leukæmi hos mus. Den udviser betydelig højere antimikrobi el aktivitet end rebeccamycin over for de vigtige sygdomsfremkaldende organismer S. pneumoniae og $. pyogenes, ligesom den giver en bedre middeloverlevelsestid i eksperimentelle tumorsystemer ved lave doser.

Det har vist sig, at der under kultiveringen af den kendte, fore-35 trukne mikroorganisme Nocardia aerocolonigenes stamme C38.383-RK2 (ATCC 39243) sammen med rebeccamycin produceres 4'-deschlorrebeccamycin ifølge den foreliggende opfindelse. Denne foretrukne producerende mikroorganisme, betegnet stamme C38.383-RK2, blev isoleret fra en jordprøve indsam- 3

DK 160280 B

let i Panama. Kulturer af denne stamme er deponeret i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, og indføjet i den permanente samling af mikroorganismer som ATCC 39243.

Resultaterne af de taxonomiske undersøgelser udført på stamme 5 C38.383-RK2 indikerer, at stammen klassificeres som en atypisk art af slægten Nocardia. Baseret på de nedenfor anførte karakteristika ser det ud til, at stammen C38.383-RK2 tilhører artsgruppen Nocardia aerocoloni-genes.

Stamme C38.383-RK2 har følgende egenskaber: 10

Morfologi

Stamme C38.383-RK2 danner encellede trådformede celler, som udvikler sig til substrat- og luftmycelium. Begge mycelier er lange, velfor-grenede og ikke fragmenteret i korte tråde (0,5 μια i bredden). Artrospo-15 rer dannes i hele luftmyceliet. Disse sporer er arrangeret med indskudte tomme hyfer eller dannet som en kontinuert kæde. Ligesom ved sporedannelsen hos Nocardiopsis dassonvillei, (Inti. J. Syst. Bacteriol. 26: 487-493, 1976) er stamme C38.383's lufthyfer inddelt i lange segmenter, der efterfølgende deles op i sporer af uregelmæssig størrelse. Kæderne 20 af indskudte eller kontinuerte sporer er lige eller bugtede. Ekstremt lange sporekæder, der indeholder 50 til 100 sporer i en kæde, dannes samtidig med kæder af kort eller moderat længde. Sporerne er cylindrisk formede, 0,5 - 0,7 x 0,7 - 5 pi i størrelse og har en glat overflade.

Sclerotia dannes på luftmyceliet, men sporangia, bevægelige sporer 25 og snoninger observeres ikke.

Dyrkningskarakteristika

Stamme C38.383 er en obligat aerob actinomycet, der vokser godt i de fleste agarmedier. Luftmyceliet dannes i rigelig mængde på Czapek's 30 saccharose-nitratagar, ISP-Medium nr. 2, 4, 5 og 7, næringssubstratagar og Bennett's agar, men i ringe mængde på giucoseasparaginagar og ISP-me-dium nr. 3 og 6. Luftmyceliets farve er hvid, hvidgul eller bleggul. Et gulligt pigment dannes i substratmyceliet, hvilket pigment diffunderer en smule ind i agarmediet. Dette pigment er ikke en pH-indikator. Mela-35 noidpigment produceres ikke. Dyrkningskarakteristika er vist i tabel 1.

Fysiologiske karakteristika

Den optimale væksttemperatur for stamme C38.383 ligger mellem 28°C

4

DK 160280 B

og 37°C, og moderat vækst ses ved 20°C og 41°C. Ingen vækst observeres ved 7°C og 45°C. Gelatine og stivelse bliver nedbrudt. Tyrosinasereak-tionen er negativ. Væksten inhiberes ved tilstedeværelse af 8% NaCl, men ikke af 0,01% lysozym. Stamme C38.383 udnytter de fleste sukkerarter til 5 vækst. De fysiologiske karakteristika og udnyttelsen af carbonhydrater er vist i henholdsvis tabel 2 og 3.

Aminosyrekomponenter i cellevæggen og sukkerbestanddele i hele cellen Aminosyresammensætningen i cellevæggen blev undersøgt i overens-10 stemmel se med metoderne beskrevet af Becker et al. (Appl. Microbiol. 13: 236-243, 1965) og Yamaguchi (J. Bacteriol. 89: 441-453, 1965), og suk-kerbestanddelene i hel cellehydrolysatet blev identificeret i overensstemmelse med de procedurer, som er angivet af Lechevalier og Lechevalier i Biology of the Actinomycetes and Related Organisms 11: 78-15 92, 1976. Stamme C38.383's cellevæg indeholder mesodiaminopimelinsyre, men mangler glycin. Hydrolysatet af hele cellen viser tilstedeværelsen af glukose, galaktose, mannose og rhamnose. Den ovennævnte cellevægsam-mensætning og helcellesukkerbestanddelene indikerer, at stamme C38.383 er en actinomycetart af cellevægstype IIIC.

20

Taxonomi

Stamme C38.383 blev sammenlignet med otte slægter af ordenen Acti-nomycetales, deriblandt Nocardia, Micropolyspora, Microtetraspora, No-cardiopsis, Saccharopolyspora, Pseudonocardia, Actinomadura og Strepto-25 alloteichus, der alle producerer sporekæder på luftmyceliet og indeholder mesodiaminopimelinsyre i cellevæggen. Blandt disse otte slægter er slægten Nocardiopsis nærmest beslægtet med stamme C38.383 med hensyn til sporekæderne og sporemorfologien, men er forskellig fra stamme C38.383 ved mangel af galaktose og mannose i hel cel!ehydrolysatet.

30 Gordon et al. (J. Gen. Microbiol. 109: 69-78, 1978) karakteriserede 14 taxa af nocardiae baseret på de fysiologiske egenskaber og den kemiske sammensætning af hel cel!ehydrolysatet. Stamme C38.383 lignede mest Nocardia aerocolonigenes med hensyn til aminosyresammensætning og sukkersammensætningen i hel cellehydrolysatet. Derfor sammenlignedes stamme 35 C38.383 med de diagnostiske fysiologiske egenskaber af N. aerocolonige-nes. Som vist i tabel 4 viste det sig, at stamme C38.383 er nært beslægtet med N. aerocolonigenes, men er signifikant forskellig fra Nocardia (Nocardiopsis) dassonvillei. Imidlertid mangler eller mister alle 14 5

DK 160280 B

stammer af N. aerocolonigenes evnen til at danne sporer og luftmycelium. Således må stamme C38.383 betragtes som værende en sporedannende art af klassen Nocardia aerocolonigenes.

Stamme C38.383 viste sig også at miste evnen til at danne luftmyce-5 lium og sporer. Efter fem på hinanden følgende overføringer havde 70% af enkel ti sol aterne mistet disse evner. Sådanne egenskaber ved stamme C38.383 ser ud til at stemme overens med de rapporterede variationer hos Nocardia aerocolonigenes ved dannelsen af sporer og luftmycelium.

6

DK 160280 B

Tabel 1

Dyrkningskarakteristika for stamme nr. C38.383*

Trypton-gærekstraktnæringsmedium: G**: moderat; fnuggede, bleggule 5 (ISP nr. 1) pellets D ; intet

Saccharose-nitratagar G : rigelig (Czapek's agar) R : stærk gul (84)*** til livlig gul (82) 10 A : moderat, gullighvidt (92) til bleggult (89) D : mørkt grågult (91) til lyst olivenbrunt (94) GIukose-aparaginagar G : ringe 15 R ; hvid (263) A : sparsomt, gullighvidt (92) til bleggult (89) D ; intet

Glycerol-asparaginagar G : rigelig 20 (ISP nr. 5) R : strålende gul (83) til stærk gul (84) A : rigeligt, bleggult (89) til lysegult (86) D : gulligt gråt (93) til gråligt 25 gult (90)

Uorganisk salte-stivelsesagar G : rigelig (ISP nr. 4) R : bleggul (89) til stærk gul (84) A : rigeligt, hvidt (263) til gul-30 lighvidt (92) D : intet

Tyrosinagar G : rigelig (ISP nr. 7) R : strålende gul (83) til stærk gul (84) 35 A : moderat, bleggult (89) til lysegult (86) D : bleggult (89) Næringsagar G : rigelig 7

DK 160280 B

Tabel 1 - fortsat R : gul1 ighvid (92) til bleggul (89) 5 A : rigeligt, hvidt (263) D : intet Gærekstrakt-maltekstraktagar G : rigelig (ISP nr. 2) R : strålende orangegul (67) til stærk orangegul (68) 10 A : rigeligt, gul 1ighvidt (92) til bleggult (89) D : mørkt orangegult (72) til moderat gulligt brunt (77)

Havremelsagar G : moderat 15 (ISP nr. 3) R : lysegul (86) til strålende gul (83) A : sparsomt, gullighvidt (92) til bleggult (89) D : intet 20 Bennet's agar G : rigelig R : strålende gul (83) til stærk gul (84) A : rigeligt, gul!ighvidt (92) til bleggult 25 D : livligt gult (82)

Pepton-gærekstrakt-jernagar G : moderat (ISP nr. 6) R : bleggul (89) til lysegul (86) A : ringe, hvidt (263) til gullig-hvidt (92) 30 D : intet

* observeret efter inkubation i 3 uger ved 28°C

** Forkortelser: G = vækst; R = bagsidefarve; A = luftmycelium; D = diffunderbart pigment 35 *** Farve og nummer i parenteser følger farvestandarden i Kelly, K.L. & D.B. Judd: ISCC-NBS farvebetegnelses-kort illustreret med Centroid-farver. US Dept, of Comm. Cir. 553, Washington, D.C., nr., 1975.

DK 160280 B

s- m D> (tf c: S- £ ω 3 CD "Ο -ΙΟ I X S-

•i- +-> Q) fO

+-> Pi £ cn -p I (O (tf CO ·- to Pi coi— s- σι ω s- ~ (tf E O) +j c to to +J &5 S- 3 <uo> co*>- i o σ> Pi in +j >r- S- JZ i. +-> Pi fO (tf - co

X «55 CU« to 3 +J &- r-4 Pi CM

CL) CT> O S- C S- i— Pi -P <Dr-~.

E CM « -P +J CD to (/)--00 CD

δ5 cn Pi -i- ni. ^ o οι π

S_ i fO C 55 O +J CD CO C

O) *. CL) c S- I 1—1 O t/) S- I— -I- *·

r— O CO Cl) O -P 0) to Pi MCUS-CO

1— O X Pi -P CO to •'O CD O)>«0 CD · Pi (tf t— Q. Pi O -P +J -I- C sf

+-> 3 i— M O) Q) S- Pi 55 i— 55 +J CO I

0) Pi i— Q. E O. S_ tO ιί H tS i—i CO >) S- CM

OS- fO O) S- +-> « * -E E S- - E 0(00 0(0 s- (O cu - σ> c o 3 +j o i ·· cn co cn «o-

(O-tJCn -P 55 O) E S- I O) O -i- CO 4-> E -t- I (O

Pi CD (tf CO «ο- (O E (tf C X (tf X Pi ·- Pi 3 I— 01

-r-E Pi - I 3 CD O O CO CD CD CO (tf ·ι- CL) CO 55 CO

+J CO 0) O 0) Pi (tf +J -P E S- O S- X CO (tf LO CM

CO -P +J -P CO CO CQ-CDCOCOMZ+J CL) o O

•i- X -P ,— - r— I -I- >> E Pi C) CT y CO El— -r- i-H

S_ C 0) (O 4-> C) O CO S- I CU O pi CO O. -P i— CD CD C £ Pi > CJ O +j ·<- α '1- s? S? 0) -1-00.(00

Pi > C (tf -r- Cp S- CO (O S- LO LO S- (0 >> 3 -I- (0 C ω 55S_+j-i- >iCnS-N«*>»>« (O 55 S. r Λ

S-CCQ .-H +J CO Q (— O < O COOC13 CO CM f— O. O

(O S-

Pi u * ·!“ 0) O Σ J* o

CO Γ— O O) CD

r no -i— l· i— σι 1-1 · X X O.

O 1— Ό- O C C Q.

^ I- -1-0 « -1- <C

O -P O) LO 4-> E

ΓΤ! -i— O Ό· co · S CO O X S- i— E co 3 >5 o o σ> i— lo ω o >) ω

/“ C4_ co o o 3 - i— (O NU

CM O «0· 1— Z O >i

- CM O CD CO E

CO X O O) I 5? >) o COCDXr·'. O Q. I— 00 I— +-> CO > CU O O Q.

• > x +J - x (tf x 55 (D

00 +J CU CD Μ 0) Z CD r-ι -P

CO CO +J > S- > > O CO

O Pi CO -P CD P 3:55

M Pi +J CD 1— CD Q. +J +J OP

• > « CO S- 3 S- COCO O

S- > Pi CD O) CD X Pi X Pi x C C I— « CO (O CO CD M CD « +-> CD >)

O (tf 4-> > +P >j O -i- > >> > > > > > C > +J

CD -i- E (tf CD 1— Pi C ·ι— -i- -i- -i- (tf -r-

E-P-i-S-C-P O O+J +J+J +J +J C +J C S- -P O

E PC CO cu CD 1— S-CD+J(tf (tf -I- -I- CO CD CO CU CD CO -r- (tf co pi χ σ> cu ό jd α o cn co co Pi σ> pi σ> r— pi c

— +J ω (tf O C E >5 Pi CU CD (DO O M C « C O « CD

00 ΙΛ ci Σ 2 11 M IC ι-t O. C COl Q- 5=- «—i 3» i— 1— > CD

o

E

o s- sz o +J -I-

+J C E

CO CD (tf pi Pi E Pi « i— σ> ·ι— > « s E o.

S- +J X

O CD -1- 5- cp CD E O c σ> co e c o D)

CD C >> 3 <tf -r- CD O

X -r- i— Pi I— -PC O

•ttf c O CO CU Pi O (DC- S- +J S- £ (tf -r- CD O (tf !—

E I— X -I- CD-P U C ίο CD >1 tps-pi C (tf CD

S- ε S- (tf CU 3 ttf S— I— 3 (O (O CU CO X S- CU O ttf +J (D CD C CD (tf CD 0) I— +J S- (tf c CO O CO C 5- i— O E < S- T- !— -P- r— -I- +J O +J >1

0) +j CD +J CD CO (tf +JIIM

+JQ. ttf > Pi C OS- (Di— O

CO E r— -i— (O C 5- +J S- O CO

CU CD CD -P (D ttf >i‘i- >j <tf >> I— I— CJJ CO Oi Q (— Z CO Z —I *

O LO O LO

LO i i—i CM CM

9

DK 160280 B

Tabel 3

Stamme nr. C38.383' carbonhydratudn.yttel se

Glycerol + 5 D(-)-arabinose + L(+)-arabinose + D-xylose + D-ribose + L-rhamnose + 10 D-glukose + D-galaktose + D-fruktose + D-mannose + L(-)-sorbose 15 Saccharose +

Laktose +

Mel i bi ose +

Trehalose +

Raffinose + 20 D(+)-melezitose

Opløselig stivelse +

Cellulose +

Dulcitol

Inositol + 25 D-mannitol + D-sorbitol

Salicin +

30 Observeret efter inkubation i 3 uger ved 37°C

Basis-medium: Pridham-Gottliebs uorganiske medium Forkortelse: +: positiv udnyttelse -: negativ udnyttelse 10

DK 160280 B

Tabel 4

Sammenligning af diagnostiske, fysiologiske egenskaber mellem stamme C38.383, Nocardia aerocolonigenes og Nocardiopsis dassonvillei Stamme Nocardia* Nocardiopsis* 5 C38.383 aerocolonigenes dassonvillei _(14)**_(33)** ___

Dekomponering af:

Adenin - +

Kasein + + + 10 Hypoxanthin + + +

Tyrosin + + +

Urinstof - + -

Xanthin - +

Resistent over for: 15 Lysozym + +

Rifampin - -

Hydrolyse af:

Aesculin + +

Hippurat V + 20 Stivelse + + +

Syre fra:

Inositol + +

Laktose + +

Melibiose + +

25 Raffinose + V

Udnyttelse af:

Benzoat - -

Citrat + + +

Mucat - 30 Succinat + + +

Tartrat - -

Nitrit fra nitrat + V +

Overlevelse ved 50°C, 8 timer_2_V_±_ +: positiv, -: negativ, V: 15 til 84% af stammerne positive * Data fra Gordon et al. (J. Gen. Microbiol. 109: 69-78, 1978) ** Antal undersøgte stammer 35 11

DK 160280 B

I stedet for den ovenfor beskrevne særlig foretrukne stamme C38.383-RK2 kan man anvende sådanne mutanter heraf med væsentlig samme egenskaber, som kan fremstilles ved konventionelle metoder såsom røntgenbestråling, UV-bestråling, behandling med nitrogensennepsgasser, fag-5 eksponering o.l.

Fremstilling af 4'-deschlorrebeccamycin 4'-deschlorrebeccamycin kan fremstilles ved dyrkning af en 4'-des-chlorrebeccamycin-producerende stamme af Nocardia aerocolonigenes, for-10 trinsvis en stamme med karakteristika som Nocardia aerocolonigenes stamme C38.383-RK2 (ATCC 39243) eller en mutant heraf under submerse aerobe betingelser i et vandigt næringsmedium. Organismen dyrkes i et nærings-medium, der indeholder en assimilerbar carbonkilde, f.eks. saccharose, 1 aktose, glukose, rhamnose, fruktose, mannose, mel i biose, glycerol eller 15 opløselig stivelse. Næringsmediet bør også indeholde en assimilerbar nitrogenkilde såsom fiskemel, pepton, soyabønnemel, jordnøddemel, bomuldsfrømel eller majsstøbevæske. Uorganiske næringssalte kan også sættes til mediet. Sådanne salte kan omfatte alle almindelige salte, der kan afgive natrium, kalium, ammonium, calcium, fosfat, sulfat, chlorid, bromid, ni-20 trat, carbonat eller lignende ioner.

Produktion af 4'-deschlorrebeccamycin kan ske ved enhver temperatur, der bidrager til en tilfredsstillende vækst af organismen, f.eks. 20°-41°C, men udføres hensigtsmæssigt ved en temperatur på ca. 27°C.

Fermentationen kan udføres i kolber eller laboratorie- eller indu-25 strifermenteringsapparater af forskellig kapacitet. Når en fermenteringstank anvendes, er det ønskeligt at producere en forkultur i et næringsmedium ved at pode en lille smule af dyrkningsmediet med en skråener jordkultur eller en lyofiliseret kultur af organismen. Efter at en aktiv forkultur er fremstillet på denne måde, føres den aseptisk over i 30 fermenteringstankens medium til fremstilling af 4'-deschlorrebeccamycin i stor målestok. Mediet, i hvilket forkulturen fremstilles, kan være det samme som eller forskelligt fra det, der anvendes i tanken, sålænge det er af en sådan art, at en god vækst af den producerende organisme kan opnås.

35 I almindelighed opnås den optimale produktion af 4'-deschlorre-beccamycin efter ca. 7 dages inkubation.

4'-deschlorrebeccamycin er et biprodukt ved fermentationen og kan udvindes af dyrkningsmediet og isoleres på en i det væsentlige ren form 12

DK 160280 B

ifølge flertrinsfremgangsmåden beskrevet i eksempel 1 nedenfor. Således forekommer det ønskede 4,-deschlorrebeccamycin fortrinsvis i myceliet, og udvinding fra myceliet kan ske ved ekstraktion med et organisk opløsningsmiddel såsom tetrahydrofuran. Efter reduktion af ekstraktvolumenet 5 opnås et råt, fast stof indeholdende det ønskede 4'-deschlorrebeccamy-cin. Dette rå, faste stof kan derefter underkastes et flertrinsrens-ningsskema som vist i det efterfølgende diagram: 13

DK 160280 B

Råt, fast stof (1) suspenderes i chloroform:methanol (2:1) (2) tilsættes diatoméjord (3) fortyndes med "Skel lysol ve B" 5 (4) koncentreres til pulver i vakuum (5) opslæmmes i "Skel lysol ve B" og underkastes flashkromatografi -1--1-1--- 10 "Skel lysol ve B" Toluim CHgClg ethyl- THF methanol acetat (1) inddampes til tørhed (remanens A) (2) søjlekromatografi (3) lineær gradienteluering - 15 CHC13 til 5% CH3OH i CHC13: 20 x 200 ml fraktioner

Fraktioner 13-16 I (1) inddampes til tørhed (remanens B) 20 ; (2) ekstraheres med DMS0

(3) søjlechromatografi - eluering I med CH3CN:CH30H:0,1M NH40AC

1 (3:2:4):21 forløb derefter I 40 x 65 ml fraktioner 25 -j-

Fraktioner 9-32 4 I (1) ekstraheres med CHC13 CHC13 j vandig 30 (1) koncentreres | (2) udfældes med "Skellysolve B"

Viltrat fast stof kastes bort deschlorre- 35 beccamycin 14

DK 160280 B

4/-deschlorrebeccamycins fysisk-kemiske egenskaber 4'-deschlorrebeccamycin har fysisk-kemi ske egenskaber som følger: 4'-deschlorrebeccamycin er et gult, amorft, fast stof med molekyl-formel ¢27^22^3^ og en molekylvægt på 535,8397. Det er sammensat af 5 carbon, hydrogen, oxygen, nitrogen og chlor. Grundstofanalysedata er som følger:

Beregnet for C27H2207N3C1*H20: C, 58,54; H, 4,37; N, 7,58

Fundet: : C, 58,43; H, 4,29; N, 7,29 4'-deschlorrebeccamycins høje massespektrum med stor opløsning be-10 stemtes med et "Kratos MS-50" spektrometer og FAB ionisering. Der observeredes følgende masse:

Beregnet for (M+H)+ ion: 536,1224 fundet for (M+H)+ ion: 536,1188 4'-deschlorrebeccamycin er opløseligt i vand og opløseligt i dime-15 thyl sul foxid.

4'-deschlorrebeccamycins infrarøde absorptionsspektrum viser, når det er sammenpresset i KBr, karakteristiske bånd ved følgende frekvenser, der er vist i reciprokke centimeter: 3400, 3330, 2930, 1745, 1703, 1575, 1490, 1470, 1458, 1435, 1398, 1380, 1330, 1273, 1238, 1140, 1105, 20 1083, 1050, 1015, 947, 910, 800, 798, 755, 738, 670, 665, 633.

4'-deschlorrebeccamycins ultraviolette absorptionsspektrum bestemtes i methanol (0,03462 g/1) under neutrale betingelser. Observerede absorptionsmaxi ma og absorptionskoefficienter er, som følger: 400 nm (8,6), 315 nm (96,5), 290 nm (107,7), 257 nm (sh), 235 nm 25 (76,3).

Et protonmagnetisk resonansspektrum af 4'-deschlorrebeccamycin opløst i dimethyl sul foxid bestemtes med et "Bruker WM-360" spektrometer, der opererede ved 360 MHz og under anvendelse af tetramethylsilan som intern standard. De observerede kemiske skift (δ-værdier), koblingskon-30 stanter (J-værdier i Hz) og mønsterbeskrivelser er, som følger: 11,81 (s, IH, N8-H), 11,24 (s, IH, N5'-H),9,26 (d, J=7,9, IH, Cl-H eller Cl'-H), 9,10 (d, J=7,9, IH, Cl-H eller Cl'-H), 7,77 (d, J=7,9, IH, C4'-H), 7,63 (m, 2H, C3-H og C3'-H), 7,42 (m, 2H, C2-H og C2'-H), 6,91 (d, J-9,4, IH, Cl"-H), 6,30 (bs, IH, C6"-0H), 5,25 (d, J=5,7, IH, 35 C3"-0H), 4,91 (d, J=5,7, IH, C2"-0H), 4,01 (bs, 2H, C6"-H), 3,90 (d, IH, C5"-H), 3,67 (t, IH, C4"-H), 3,62 (s, 3H, C4"-0CH3), 3,53 (m, IH, C2"-H overlapper med HgO).

Et carbon-13 magnetisk resonanspektrum af 4'-deschlorrebeccamycin 15

DK 160280 B

opløst i dimethylsulfoxid bestemtes med et "Bruker WM-360" spektrometer, der opererede ved 22,5 MHz, og under anvendelse af tetramethylsilan som intern standard. De observerede kemiske skift (ppm-værdier) og assigna-tioner er, som følger: 5

Kemiske skift (ppm) Assignation 170.7 C7 170.6 07' 10 140,7 C4a 138.1 C4a' 130.4 C5a 129.9 C5a' 129.4 C3' 15 127,3 C3 125.6 C5c 124.6 Cl' 123.9 Cl 122.8 C5c' 20 122,3 C2 121.1 C6 120.6 C2' 119.4 06' 119.1 C5b' 25 117,4 C5b 116.4 04 112.1 04' 83.9 Cl" 77.6 03" 30 77,0 04" 76.6 05" 72,1 02" 60,0 0CH3 58.7 06" 16

DK 160280 B

4'-deschlorrebeccamycins biologiske aktivitet 4,-deschlorrebeccamycins antibakterielle aktivitet bestemtes over for et antal gram-positive og gram-negative organismer ved den dobbelte agarseriefortyndingsmetode. Resultaterne vises i tabel 5 nedenfor i sam-5 menligning med rebeccamycins aktivitet.

Tabel 5 4'-deschlorrebeccamycins antibakterielle effekt 10 Minimal inhibitorisk koncentration (MIC) mcg/ml

Rebeccamycin 4'-deschlorrebeccamycin S. pneumoni ae A9585 >125 32 15 S. pyogenes A9604 >125 32 S. faecalis A20688 8 16 S. aureus A9537 0,5 2

M. luteus A9547 0,5 I

S. aureus 20 (Pen-Res) A9606 >250 >250 S. coli A15119 >250 >250 S. coli A2034I-1 >250 >250 K. pneumoniae A9664 >250 >250 K. pneumoni ae A20468 >250 >250 25 E. cloacae A9659 >250 >250 E. cloacae A9656 >250 >250 P. mirabilis A9900 >250 >250 P. vulgaris A21559 >250 >250 M. morganii A15153 >250 >250 30 P. rettgeri A22424 >250 >250 S. marcescens A20019 >250 >250 P. aeruginosa A9843A >250 >250 P. aeruginosa A21213 >250 >250

List.monocytogenes A15121 32 32 35 List.monocytogenes A20025 32 63 17

DK 160280 B

Det bemærkes, at 4'-deschlorrebeccamycin udviser en væsentlig stærkere antibakteriel virkning over for S. pneumoni ae og S. pyogenes end rebeccamycin (MIC-værdi 32 contra >125).

4'-deschlorrebeccamycin blev også testet over for transplanteret 5 museleukæmi P-388, og resultaterne vises nedenfor i tabel 6. Den anvendte metodik fulgte generelt protokollerne fra National Cancer Institute [Cancer Chemotherapy Rep. del 3, 3, 1-103 (1972]. De væsentlige forsøgsdetaljer findes nederst i tabel 6.

DK 160280B

18

Tabel 6 4'-deschlorrebeccam.ycins effekt over for P-388 leukæmi Materiale Dosis,IP MST MST Gennemsnitlig Over-mg/kg/inj dage % T/C vægtforandring levende 5 g dag 5 dag 10

Rebeccamycin 512 17,0 155 -1,4 6/6 256 15,0 136 -0,3 6/6 128 14,5 132 0,2 6/6 10 64 15,0 136 0,3 6/6 32 13,0 118 -0,6 6/6 161 5,0 136 -0,8 6/6 4'-deschlor- 512 15,5 141 -1,0 4/4 15 rebeccamycin 256 15,0 136 -1,5 4/4 128 17,5 159 -0,6 4/4 64 15,0 136 -0,8 4/4 32 15,5 141 -0,8 4/4 16 18,0 164 -0,9 3/4 20

Kontrol 0,5 ml 11,0 100 0,6 10/10

Tumorpodestof: 10β ascitescell er, ip 25 Værtsdyr: CDFj hunmus

Behandling: enkelt injektion på dag 1 givet i.p.

Vurdering: MST = middel overlevelsestid

Effekt: % T/C = (MST behandlet/MST kontrol) x 100

Kriterium: % T/C > 125 anses for at være signifikant anti- 30 tumorinhibering

Kontrol: Saltvand (0,5 ml) givet én gang daglig i.p. i 5 dage

Det ses, at selv ved en dosis på 32 mg/kg giver 4'-deschlorrebecca-35 mycin en % T/C på 141, mens rebeccamycin kun giver en % T/C på 118, dvs. under grænsen for signifikant antitumorinhibering.

Som vist gennem de antimikrobielle data og musetumordata, der er tilvejebragt ovenfor, er 4,-deschlorrebeccamycin værdifuldt som antibio- 19

DK 160280 B

ti cum og også som antitumormiddel til inhi bering af maligne tumorer såsom P-388 leukæmi hos pattedyr.

Opfindelsen angår derfor også farmaceutiske præparater, der er ejendommelige ved, at de indeholder en effektiv antimikrobiel eller tu-5 mor-i nhi berende mængde af 4,-deschlorrebeccamycin i forbindelse med en inert farmaceutisk acceptabel bærer eller fortynder. Sådanne præparater kan også indeholde andre aktive antimikrobielle midler eller antitumormidler og kan fremstilles på enhver farmaceutisk form, der passer til den ønskede administreringsvej. Eksempler på sådanne præparater inklude-10 rer faste præparater til oral administrering, såsom tabletter, kapsler, piller, pulvere og granulater, flydende præparater til oral administrering såsom opløsninger, suspensioner, siruper eller eleksirer og præparater til parenteral administrering såsom sterile opløsninger, suspensioner og emulsioner. De kan også fremstilles som sterile faste stoffer, 15 der kan opløses i sterilt vand, fysiologisk saltvand eller andre sterile injicerbare medier umiddelbart før brug.

Anvendt som antimikrobielt middel administreres 4'-deschlorrebecca-mycin eller et farmaceutisk præparat deraf således, at koncentrationen af den aktive bestanddel er større end den minimale inhiberende koncen-20 tration for den særlige organisme, der behandles for. Anvendt som antitumormiddel kan fagfolk hurtigt fastsætte optimale doser af og behandlingsmønstre med 4'-deschlorrebeccamycin i forhold til en given mammal vært. Det er naturligvis åbenbart, at den aktuelt anvendte dosering af 4'-deschlorrebeccamycin vil variere i overensstemmelse med formuleringen 25 af det særlige præparat, anvendelsesmåden og det særlige sted, pattedyret og sygdommen, der behandles. Mange faktorer, der modificerer virkningen af et lægemiddel, må tages i betragtning, f.eks. alder, vægt, køn, diæt, administreringstid- og vej, ekskretionshastighed, patientens tilstand, lægemiddelkombinationer, reaktionsfølsomhed og sygdommens al-30 vor!ighed.

Det følgende eksempel er tilvejebragt for nærmere at belyse fremgangsmåden ifølge opfindelsen. "Skellysolve B" er et kommercielt tilgængeligt petroleumsopløsningsmiddel (Skelly Oil Co.), der omfatter isomere hexaner og har et kogepunkt på 60-69°C. "Dicalite" er diatoméjord 35 fremstillet af Grefco, Inc. Medmindre andet er angivet, er alle efterfølgende temperaturer i grader Celcius.

20

DK 160280 B

Eksempel 1

Fremstilling af 4'-deschlorrebeccamycin A. Fermentering ! 5 Nocardia aerocolonigenes stamme C38.383-RK2 (ATCC 39243) opbevare des og overførtes i testrør på skråagar bestående af gærmaltekstrakt.

Dette medium består af 4,0 g glukose, 4,0 g gærekstrakt, 10 g maltekstrakt og 20 g agar fyldt op til 1 liter med destilleret vand. For hver overføring inkuberedes skråagaren i 7 dage ved 27°C. For at fremstille 10 en forkultur til produktionsfasen overførtes overfladevæksten fra skråkulturen til en 500 ml Erlenmeyer-kolbe, der indeholdt 100 ml sterilt medium bestående af 30 g glukose, 10 g soyamel, 10 g bomuldsfrøspi remel og 3 g CaCOj fyldt op til 1 liter med destilleret vand. Denne vækstkultur inkuberedes i 48 timer ved 27°C i en "Gyrotory" rækkeryster (model 15 G53, New Brunswick Scientific Co., Inc.) indstillet til 210 omdr./min. i en cirkel med en diameter på 5,1 cm. 4 ml vækstkultur overførtes til en 500 ml Erlenmeyer-kolbe indeholdende 100 ml sterilt produktionsmedium bestående af 60 g majsstivelse, 10 g glukose, 15 g hørfrømel, 5,0 g autolyseret gær, 1,0 g FeSO^HgO, 1,0 g NH^PO^ 1,0 g (NH^SQ^ og 10 20 g CaC03 fyldt op til 1 liter med destilleret vand. Produktionskulturen inkuberedes ved 27°C i samme rysteapparat, som blev brugt til den vegetative kultur. Omdrejningshastigheden blev sat til 250 omdr./min. Fermentationen afsluttedes efter 168 timer.

25 B. Isolering

Det ifølge eksempel 1A opnåede fermentationsmedium filtreres under anvendelse af diatoméjord-filterhjælpemiddel (filterhjælpemidlet blandes med mediet og bruges også til at danne filterkage). Filtratet kasseres, og filterkagen ekstraheres med tetrahydrofuran (THF), i 30 - 60 minutter 30 under anvendelse af 0,1 - 0,2 volumen baseret på det oprindelige medievolumen (THF indeholder fortrinsvis 0,025% butylerede hydroxytoluener som konserveringsmiddel). THF ekstrakten filtreres, og de uopløselige stoffer kastes bort. Filtratet koncentreres i vakuum, indtil alt THF er fjernet. Det inerte filterhjælpemiddel blandes med koncentratet, og den 35 resulterende blanding filtreres på en filterkage af et inert filterhjælpemiddel. Luft suges gennem filterkagen i 4 timer eller mere for at tørre kagen så meget som muligt.

Filterkagen, der er opnået som beskrevet ovenfor, ekstraheres der- 21

DK 160280 B

efter i ca. 30 minutter med THF i tilstrækkelig mængde til, at der opnås en god opslæmning. Ekstrakten filtreres, og filterkagen kastes bort. Filtratet koncentreres ved kogning ved én atmosfære. Varm methanol tilsættes samtidig med, at volumenet svinder ind. Efter begyndende krystal -5 lisation af gule faste stoffer koges blandingen sagte, indtil stødkogning bliver et problem. Reaktionsblandingen sættes derefter til at køle af og afkøles til 5-8eC. Det faste stof frafiltreres, skylles med kold methanol og tørres. Dette materiale, der indeholder det ønskede 4'-des-chlorrebeccamycin, anvendes ved den følgende adskillelsesprocedure.

10 C. Adskillelse og rensning Rå faste stoffer fra eksempel IB (336,3 g) suspenderedes og opløstes delvis i 2,5 liter af 2 dele chloroform: 1 del methanol og overførtes til en 6 liter rundbundet kolbe. Ca. 1 kg filterhjælpemiddel 15 "(Dicalite)" blandedes i suspensionen. Blandingen fortyndedes med ca.

1,5 liter "Skellysol ve B". Den resulterende opslæmning koncentreredes til et pulver i vakuum på en rotationsinddamper. Dette pulver opslæmme-des i 6 liter "Skellysolve B" og fyldtes i en 12 cm udvendig diameter x 90 cm flashkromatografikolonne. Der dannedes en pakning under trykgen-20 nemstrømning (^-5,7 psi). Den fyldte kolonne elueredes under trykgennemstrømning med følgende elutrope serier: 9 liter "Skellysolve B" (3 liter frisk + 6 liter pakningsopløsningsmiddel); 13 liter toluen; 12 liter methylenchlorid; 12 liter ethyl acetat; 18 liter tetrahydrofuran og 7 liter methanol. Tolueneluatet inddampedes til tørhed i vakuum i en rota-25 tionsinddamper til dannelse af 5,15 g fast stof betegnet remanens A.

En Glenco "Series 3500 Universal LC" kolonne (2,67 cm indvendig diameter x 75 cm) pakkedes med 80 g "Woelm"-silicagel (0,063-0,200 mm) i chloroform. Remanens A opløstes i 40 ml chloroform og pumpedes direkte på kolonnen. Elueringen indledtes med i sokratisk skylning med 500 ml 30 chloroform. Elueringen fortsatte med 4 liter elueringsmiddel i form af en lineær gradient af chloroform - 5 dele methanol i 95 dele chloroform med opsamling af tyve 200 ml fraktioner. Fraktionerne 13 til 16 bedømtes til at være næsten homogene. Disse forenedes og inddampedes til tørhed til dannelse af 663 mg af remanens B.

35 Glenco kolonnen (2,67 i.d. x 75 cm) fyldtes med "Baker Bonded

Phase" octadecylsilicagel (C-18) i methanol. Kolonnen ækvilibreredes med ca. 2,5 pakningsmaterialevolumener elueringsmiddel: 3 dele acetonitril, 3 dele methanol og 4 dele 0,1 M ammoniumacetat. Remanens B i 3 ml dime- 22

DK 160280 B

thyl sulfoxid blev trukket ind i prøvesløjfen og pumpet på kolonnen med elueringsmiddel. Elueringen begyndte, mens elueringsmidlet kontrollere-des ved 280 nm. Efter et indledende forløb på 2 liter opsamledes fyrre 50 ml fraktioner. Baseret på UV-kromatogram forenedes fraktionerne 9 til 5 32. De forenede fraktioner ekstraheredes med 2 liter chloroform. Den nedre fase separeredes og koncentreredes til tørhed i vakuum på en rota-tionsinddamper. Remanensen opløstes delvis i 50 ml chloroform ved ultralydsbehandling. Suspensionen sattes til 1 liter "Skellysolve B" under hurtig omrøring. Det resulterende bundfald opsamledes ved filtrering, 10 hvilket gav 606 mg 4'-deschlorrebeccamycin som et gult, amorft, fast stof.

Yderligere enkeltheder i forbindelse med den ovennævnte isolations-procedure følger nedenfor: 15 Analytisk HPLC:

De følgende komponenter anvendtes til at opbygge et analytisk HPLC-system: Waters Associates "Model 6000A Solvent Delivery System"-pumpe;

Varian "Varichrom Model VUV-10 uv/vis Detector" indstillet på 254 nm og 0,1 O.D. Fisher "Recordal Series 5000 Recorder"; Waters Associates "Mo-20 del U6K"-injektor; Altex "Spherisorb ODS (10/0"-kolonne (4,6 mm i.d. x 25 cm). Komponenterne blev forbundet med rustfri 316-stålrør (1,6 mm udvendig diameter - 0,23 indvendig diameter). Elueringsmidlet bestående af 4 dele acetonitril, 3 dele methanol og 3 dele 0,1 M ammoniumacetat pumpedes gennem systemet med 2 ml/min ved alle analyser. Undertiden an-25 vendtes et Hewlett Packard "1040A HPLC Detector System" i stedet for Varian "Varichorm VUV-10"-detektoren.

Tyndt!agschromatografi (TLC): TLC udførtes på Analtech precoatede "silicagel 6HLF"-plader (2,5 cm 30 x 10 cm, 0,25 mm tykke lag). Pladerne fremkaldtes i glascylindre (6,4 cm i diameter og 15 cm høje) købt fra Whatman, Inc. Cylindrene påfyldtes 10 ml 5 dele methanol - 95 dele chloroform og ækvilibreredes før nedsætning af plader. De fremkaldte lufttørrede plader undersøgtes visuelt med 254 nm og 366 nm ultraviolet lys under anvendelse af enten en "Chromato-VUE 35 model CC-20" lyskasse (Ultra-Violet Products Inc.) eller en håndmodel "UVSL-58" mineral undersøge!seslampe (Ultra-Violet Products Ind.) 23

DK 160280 B

Præparativ HPLC: Følgende komponenter anvendtes til konstruktion af et middeltrykvæ-skekromatografi system: En laboratoriepumpe model "RP-SY 2CSC FMI" fra Fluid Metering, Inc.; en pulsationsdæmper model "PD-60-LF FMI" fra Fluid 5 Metering, Inc; en 15 ml prøvesløjfe fremstillet af polypropylenslange (3,0 mm u.d. x 1,5 mm i.d.) viklet omkring et paprør (8,65 cm u.d.), en Glenco "Series 3500 Universal LC"-kolonne (2,67 cm i.d. x 75 cm); en Instrumentation Specialities Co. model "UA-5 Absorbance/Fluorescense Monitor" med en "type 6" optisk enhed; en Instrumentation Specialities Co.

10 model "590 Flow Interruptor"-ventil samt en Instrumentation Specialities Co. model "328 Fraction Collector". Komponenterne samledes med popypro-pylen- og teflonrør (3,0 mm u.d. x 1,5 mm i.d.) samt Glenco "multifit connectors" og ventiler i den anførte orden.

Glenco "series 3500 Universal LC"-kolonnen opslæmningspakkedes med 15 det angivne kolonnefyld i det angivne opløsningsmiddel under anvendelse af standardmetoder. Rummet mellem kolonnematerialet og kolonnetoppen fyldtes med Ottawa standardsand. Elueringsmidlet pumpedes med en maksimal hastighed, der ikke gav et modtryk, som overskred 414 kpa (ca. 20 ml/min.).

20

Gradienteluering.

Et Glenco gradientelueringsapparat bestående af to kamre med samme diameter, højde og volumen forbundet i serie med en Teflon-ventil anvendtes til gradientelueringer. Et kammer fungerede som blandingskammer 25 og det andet som statisk reservoir. Det mindre polære opløsningsmiddel, chloroform, opbevaredes til at begynde med i blandingskamret. Det mere polære opløsningsmiddel bestående af 5 dele methanol i 95 dele chloroform opbevaredes i det statiske kammer. Tef1onovertrukne magnetiske omrøringspinde (1,0 x 3,7 cm) anbragtes i begge kamre, og omrøringen ud-30 førtes ved hjælp af "Thomas model 15 Magne-matic"-omrørere. Elueringsmidlet pumpedes fra blandingskammeret til middeltryk-hplc-systemet gennem polypropyl ensianger (1,5 mm i.d. x 3 mm u.d.). Efterhånden som elueringsmidlet fjernedes fra bl åndingskammeret, fik opløsningsmidlet i det statiske reservoir frit lov til at erstatte dette elueringsmiddel, hvor-35 ved der frembragtes en lineær elueringsmiddelgradient.

Claims

5 J. OTMa^' 10 1" /7* o l^on
15. V 5-\ \ Jj3" 4'1/*S 0CHo 20 3
2. Fremgangsmåde til fremstilling af 4'-deschlorrebeccamycin med formi en 25 °=J^Vl0 mfe 4[ 5 B 4· 30 da 1" \ v 35 flQ^7/l3" 4'j/oa oce3 DK 160280 B KENDETEGNET ved, at man dyrker en 4'-deschlorrebeccamycin-producerende stamme af Nocardia aerocolonigenes i et vandigt næringsmedium indeholdende assimilerbare carbon- og nitrogenkilder under submerse, aerobe betingelser, indtil en væsentlig mængde 4'-deschlorrebeccamycin er produ-5 ceret af nævnte organisme i dyrkningsmediet, og derefter udvinder 4'-deschlorrebeccamycin fra dyrkningsmediet i en form , der i det væsentlige er fri for medproducerede stoffer.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at den 4'-des-10 chlorrebeccamycin-producerende stamme er Nocardia aerocolonigenes ATCC 39243 eller en mutant deraf med væsentlig samme egenskaber.
4. Farmaceutisk præparat, KENDETEGNET ved, at det omfatter en effektiv antibakteriel eller tumor-inhi berende mængde af 4'-deschlorrebec- 15 camycin med formlen " .Q3CØ· ij 5 g 4> 25 /K \ \ HQ \ 4'1/h
30 OCH3 i kombination med en inert farmaceutisk acceptabel bærer eller fortynder. 35