SE466207B - 4'-desklorrebeccamycin och saett att framstaella detsamma - Google Patents

Description

15 25 30 35 466 207 2 myces staurosporeus. Staurosporin beskrives i J.C.S. Chem.

Comm., 1978, sid. 800-801 och i J. Antibiotics §Q(4): 275-282 (1977).

Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 12(6): 459-460 (1980) beskriver olika indolpigment framställda av fruktkropparna av slemmög- let Arcyria denudata, som är strukturelltbesläktadnæd stau- rosporin. Vissa av pigmenten visar en aktivitet gentemot Ba- cillus brevis och B. subtilis.

Sammandrag av uppfinningen tïpfhufingen hänför sig till ett nytt antitumörantibiotikum, som här betecknas som 4'-desklorrebeccamycin med struktur- formeln _ och till sätt att framställa, isolera och rena 4'-desklor- rebeccamycin i huvudsakligen ren form.

Antibiotikumet enligt föreliggande uppfinning framställes genom jäsning av en 4'-desklorrebeccamycin-alstrande stam av Nocardia aerocolonigenes, företrädesvis Nocardia aero- colonigenes-stam C38,383-RK2 (ATCC 39243) eller en mutant 10 15 203 25 30 35 3' 466 207 därav, i ett vattenhaltigt näringsmedium under nedsänkta aerobiska förhållanden tills en betydande mängd av 4'-des- klorrebeccamycin alstrats medelst nämnda mikroorganism i nämnda kulturmedium och godtyckligt utvinning av 4'-desklor- rebeccamycinet från kulturmediet i huvudsak fritt från sam- tidigt bildade substanser.

Föreningen 4'-desklorrebeccamycin visar antimikrobiell ak- tivitet och även aktivitet gentemot experimentella djurtu- mörsystem, exempelvis P-388 leukemia hos möss.

Detaljerad beskrivning 4'-desklorrebeccamycin enligt föreliggande uppfinning fram- ställes genom jäsning av en 4'-desklorrebeccamycin-alstran- de stam av Nocardia aerocolonigenes.

En särskilt föredragen 4'-desklorrebeccamycin-alstrande stam är den, som beskrives i den amerikanska patentansökningen SerialnNom@461 Bâinøinlämnadx28#januarifnl9&3~och'somæutgöæ- den organism som alstrar rebeccamycin. Det har visat sig att under odling av denna mikroorganism bildas samtidigt till- sammans med rebeccamycin 4'-desklorrebeccamycin-produkten enligt föreliggande uppfinning. Denna föredragna alstrande mikroorganism, som är betecknad stam C38,383-RK2, isolera- des från ett jordprov uppsamlat i Panama. Kulturer av denna stam har deponerats hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland och har tillförts deras permanenta sam- ling av mikroorganismer såsom ATCC 39243.

Resultaten av taxonomiska studier utförda på stammen C38,383-RK2 anger att stammen klassifieras som en atypisk sortav släktet Nocardia. Baserat på nedan angivna egenskaper anser man att stammen C38,383-RK2 hör till artgruppen Nocar- dia aerocolonigenes.

Stammen C38,383-RK2 har följande egenskaper: 10 15 20' 25 30 35 466 207 4 Morfologi Stammen C38,383-RK2 bildar encelliga trâdlika celler, som utvecklas till substrat- och luftmycelia. Båda mycelia är långa, väl förgrenade och icke fragmenterade till korta trådar (0,5 Pm 1 bredd). Arthrosporer bildas inom hela luftmyceliet. Dessa sporer är anordnade med inskjutning av tomma hyfer eller bildade som en kontinuerlig kedja.

Liksom sporbildningen av Nocardiopsis dassonvillei, Intl.

J. Syst. Bacteriol. gg: 487-493 (1976) är lufthyferna av stammen C38,383 uppdelade i långa segment, som därefter un- deruppdelas till sporer av oregelbunden storlek. Kedjorna av inskjutna eller kontinuerliga sporer är till formen raka eller böjda. Extremt långa sporkedjor, som innehåller 50- -100 sporer i kedjan bildas tillsammans med korta eller måttliga kedjelängder. Sporerna är cylindriska till formen (O,5\f0,7 x 0,7rv5 Pm i storlek och har en jämn yta.

Sclerotia bildas på luftmyceliet, men sporangia, böjliga t sporer!ooh*kransar^äamwïcke'ïakfiüaqïfisrflag,«~» Odlingskarakteristika Stammen C38,383 är en obligatoriskt aerobisk aktinomycet och växer bra i de flesta agarmedia. Luftmyceliet bildas rikligt på Czapeks sackarosnitratagar, ISP Medium Nos. 2, 4, 5 och 7, näringsagar och Bennetts agar, men sparsamt på glukos-asparagin-agar och ISP Medium Nos. 3 och 6. Färgen på luftmyceliet är vit, gulaktigt vit eller ljusgul. Ett gulaktigt pigment bildas i substratmyceliet, som sprider sig svagt in i agarmediet. Detta pigment är icke en pH-in- dikator. Melanoidpigment bildas icke. Odlingskarakteris- tika visas i tabell 1.

Fysiologiska karakteristika Den optimala tillväxttemperaturen för stammen C38,383 sträcker 10 15 20,fix 25 30 35 s 466 207 sig från 28 till 37°C och en måttlig tillväxt förefinnes vid 20°C och 41°C. Ingen tillväxt observeras vid 7°C och 45°C. Gelatin och stärkelse nedbrytes. Tyrosinasreaktionen är negativ. Tillväxten inhibiteras i närvaro av 8 % NaCl, men icke genom lysozym vid 0,01 %. Stammen C38,383 använder huvudsakligen sockerarter för tillväxt. De fysiologiska ka- rakteristika och utnyttjandet av kolhydrater visas i tabell 2 respektive 3.

Cellvägg-aminosyra och hel cell-sockerkomponenter.

Aminosyrasammansättningen i cellväggen undersöktes enligt de metoder, som beskrives av Becker et al. (Appl. Microbial. lå: 236-243 (1965)) och Yamaguchi (S.»Bacteri01.]§2: 441-453 g(1965)ï“och sockerkomponenten i helcellhydrolysatet identi- _fierades enligt de förfaranden som utarbetats av Lechevalier och Lechevalier i Biology of the Actinomycetes and Related Organisms ll: 78-92 (1976). Cellväggen av stammen C38,383 innehåller meso-diaminopimellinsyra men saknar glycin. Hel- cellhydralysateütvisarsnärvaronravzglykosï galaktoshymannasa och rhamnos. Den ovan nämnda cellväggsammansättningen och de ovan nämnda helcellsockerkomponenterna visar att stammen C38,383 är en aktinomycetart av cellväggtyp IIIC.

Taxonomi Stammen C38,383 jämfördes med åtta släkten av ordningen Aktinomycetales, inkluderande Nocardia, Micropolyspora, _ Microtetraspora, Nocardiopsis, Saccharopolyspora, Pseudono- cardia, Actinomadura och Streptoalloteichus, vilka samtliga alstrar sporkedjor på luftmyceliet och innehåller mesodiami- nopimellinsyra i cellväggen. Bland dessa åtta släkten är släktet Nocardiopsis mest besläktat med stammen C38,383 i sporkedjan och spormorfologin, men skiljer sig från stammen C38,383 genom frånvaro av galaktos och mannos i helcellhydr- olysatet. 10 15 zo- 466 207 s Gordon et al. (J. Gen. Microbiol; 122: 69-78 (1978)) har karakteriserat 14 taxa av nocardiae baserat på de fysiolo- giska egenskaperna och den kemiska sammansättningen av hel- cellhydrolysatet. Stammen C38,383 liknade mest Nocardia aerocolonigenes ifråga om aminosyra- och sockersammansätt- ning i helcellhydrolysatet. Stammen C38,383 jämfördes därför med de diagnostiska fysiologiska egenskaperna av N. aero- colonigenes. Såsom framgår av tabell 4 visade sig stammen C38,383 vara starkt besläktad med1i.aerocolonigenes men sig- nifikant skild från Nocardia (Nocardiopsis) dassonvillei.

Alla 14 stammarna av N. aerocolonigenes saknar eller förlorar dock förmågan att bilda sporer och luftmycelium. Man anser såle- des att stammen C38,383 är ett sporogeniskt släkte i taxon av Nocardia aerocolonigenes.

Stammen C38,383 visade sig även förlora sin förmåga att bil- da luftmycelium och sporer. Efter fem följande överföringar förlorar 70 % av enkla isolat denna förmåga. En sådan egen- skap hos stammen C38,383 synes likna den för Nocardia aeroco- glonigenesflangivna~variationenflvid;bdldningzagmsporersochá~ luftmycelium. 10 15 20 25 30 35 TABELL 1 Odlingskarakteristika för stammen nr. C38,383* 466 2Û7 Trypton-jästextraktbuljong G**:1æüx1flg;flockig, ljusgula pelhe (ISP NO. 1) Sackaros-nitratagar (Czapeks agar) Glukøs-asparaginêgar Glycerol-asparaginagar (ISP No. 5) Oorganiska salter-stär- kelseagar (ISP No. 4) Tyrosinagar (ISP No. 7) Näringsagar Jästextrakt-ma1textrakt- agar (ISP No. 2) D G R W .w q ha w nu U W UIFFUGIU Gl : inget : riklig : starkt gul (84)*** till ljust gul (az) : måttligt gulaktigt vitt (92) till svagt gult (89) : mörkt gråaktigt gult (91) till ljust olivbrunt (94) : dålig : vit (263) : sparsamt, gulaktigt vitt (92) 00 till svagt gult (89) inget riklig : klargul (83) till starkt gul ( rikligt, svagt gult (89) till ljusgult (86) gulgrâtfl (93) tillfgråaktigt gult (90) = riklig svagt gul (89) till starkt gul (84) rikligt, vitt (263) till gul- aktigt vitt (92) inget : riklig : klargul(83) till starkt gul (84 : måttligt, svagt gult (89) till ljusgult (86) svagt gult (89) : riklig gulaktigt vit (92) till svagt gul (89) : rikligt, vitt (263) : inget : riklig klart orafigegul (67) till stark orangegul (68) 10 15 20"* 25 466 207 ' a TABELL 1 (fortsättning) Havremjölsagar (ISP No.3) G W w Bennetts agar U mf w nä U Pepton-jästextrakt-järn- agar (ISP No. 6) CD FU D., Ia rikligt, gulaktigt vitt (92) till svagt gult (89) mörkt orangegult (72) till mått- ligt, gulaktigt brunt (77) måttlig ljusgul (86) till klargul (83) sparsamt, gulaktigt vitt (92) till svagt gult (89) inget riklig klargul (83) till starkt gul (84) rikligt, gulaktigt vitt (92) till svagt gult ljusgul (82) måttlig svagt gul (89) till ljusgul (86) ringa, vitt (263) till gulaktigt vitt (92) -ingetß *øbserverat efter inkubering vid 28°C under 3 veckor.

**Förkortning: G A tillväxt; R luftmycelium; D = vridbart pigment baksidans färg; ***Färg och nummer inom parentes följer färgstandarden i Kelly, K.L. & D.B. Judd: ISCC-NBS färgbenämningskartor illustrerade med Centroid Colors. US Dept. of Comm. Cir. 553, Washington, D.C., NO. 1975". 10 15 20' 25 30 TABELL 2 466 207 Fysiologiska karakteristika för stammen nr. C 38,383 Test Respons Temp.omr. för tillväxt Max. tillväxt v.28°C t. 37°c. Måttl. till- växt v. 20°C och 41°C Ingen tillväxt v. 7°C och 4s°c Gelatinsmälta Flytande Stärkelsehydrolys Hydrolyserat Reaktioner i skummjölk Icke koag. o.fullst. peptoniserat Bildn. av melanoidpig- Negativt ment Tyrosinasreaktion Negativt Nitratreduktion Positivt Positivt Syratolerans Tillväxt v. pH 5,0 Ing.tillv.v. pH 4,5 NaCl-tolerans Tillv. v. 7% NaCl el.mindre. Ing. tillv. v. 8% NaCl Lysozymtolerans Tolerant Tillv.v. 0 , 01% lysozym Metodik eller använt medium Bennetts agar 1% maltextrakt, 0,4% jästextrakt, 0,4% glukos, 20% ç latin Stärkelseagarplatt Difco-skummjölk Tyrosinagar, peptc jäst extrakt-järn- agar o. tryptonjäs extraktbuljong Arais metod* Czapeksdsackaros- nitratbnljong 0,5 % jästextrakt, 1% glukos, 0,5% KN O: Jästextrakt-malt- extraktagar Basalmedium: 1% jästextrakt, 2% lö lig stärkelse, 1,5 agar Tryptikassojabulj. plus 1,5% * Arai, T och Y. Mikami: Chromogenicity of Streptomyces Appl. Microbiol. 23: 402-406 (1972). 10 15 20 25 466 207 10 TABELL 3 Kolhydrat-utnyttjande av stammen år. C38;383 Glycerol D(-)-arabinos L(+)-arabinos D-xylos D-ribos L-ramnos D-glukos D-galaktos D-fruktos D-mannos L(-)-sorbos 'Sackaros Laktos Melibios Trehalos Raffinos D(«)1melezirQs¿; Löslig stärkelse Cellulosa Dulcitol Inositol D-mannitøl D-sorbitol Salicin + + I+++++++ + + + + + “l- observerad efter inkubering vid 37°C under 3 veckor.

Basalmedium: Pridham-Gottliebs oorganiskt medium Förkortning: +: positivit utnyttjande, -: negativt utnyttjande 1-1 466 207 TÄBELL 4 Jämförelse av diagnostiska fysiologiska egenskaper mellan stammen C38,383, Nocardia aerocolonigenes och Nocardiopsis dassonvillei Nocardia* Nocardiopsis* Stam aerocoloni- dassonvillei C38,383 genes (14)** (31)** Nedbrytning av: Adenin - - + Kasein + + + Hypoxantin + T. + + Tyrosin + + + Karbamid - + - Xantin - - + Resistens mot: Lysozym + + - Rifampin - - - Hydrolys av: Aesculinw» + + V -» Hippurat - V + stärkelse + + + Syra från: Inositol + + - Laktos + + - Melibios + + - Raffinos + V - Utnyttjande av: Bensoat - - - Citrat l+ + + Mukat - - - Succinat + + + Tartrat - - - Nitrit från nitrat + V + överlevnad v.50°C,8h - V + 10 15 20 25 30 35 466 207 1-2 +: positiv, -: negativ, V: 15 - 84 % av stammarna positiva *data enligt Gordon et al. J. Gen. Microbiol. 122: 69-78 (1978) **antal undersökta stammar.

Det skall inses att föreliggande uppfinning icke är begrän- sad till användningen av den särskilt föredragna stammen C38,383-RK2, som beskrives ovan eller till organismer som helt svarar mot ovanstående beskrivningar. Uppfinningen är särskilt avsedd att inkludera andra 4'-desklorrebeccamycin- -alstrande stammar eller mutanter av denna organism, som kan framställas medelst konventionella förfaranden, exem- pelvis röntgenstrâlning, ultraviolett strålning, behandling med kväve-senapsgaser, utsättning för fager och liknande.

Framställningfavi4'-desklorrebeccamycin 4'-desklorrebeccamycin kan framställas genom odling av en 4'-desklorrebeccamycin-alstrande stam av Nocardia aerocoloni- genes3~företnäëësvis~emmsüamamedfiegenskapërnaëfiasämømanflfiäf aerocolonigenes-stammen C38,383-RK2 (ATCC 39243) eller en mu- tant därav underfnedsänktaïaeroba förhållanden i ett vatten- haltigt näringsmedium. Organismen får växa i ett näringsme- dium innehållande en assimilerbar kolkälla, exempelvis sacka- ros, laktos, glukos, ramnos, fruktos, mannos, melibios, gly- cerol eller löslig stärkelse. Näringsmediet bör även innehål- la en assimilerbar kvävekälla, t.ex. fiskmjöl, pepton, soja- bönmjöl, jordnötsmjöl, bomullsfrömjöl eller majsstöpvätska.

Oorganiska närsalter kan också ingå i mediet. Sådana salter kan omfatta vilka som helst av de vanliga salterna som är i stånd att tillhandahålla natrium-, kalium-, ammonium-, kal- cium-, fosfat-, sulfat-, klorid-, bromid-, nitrat- och kar- bonatjoner eller liknande joner.

Framställningen av 4'-desklorrebeccamycin kan utföras vid vilken temperatur som helst, som leder till tillfredsstäl- lande tillväxt av organismen, exempelvis 20-41°C och utföres 10 15 zm- 25 30 35 .snabbkromatograferin9'.a 13 466 207 konventionellt vid en temperatur av ca 27°C.

Jäsningen kan utföras i kolvar eller i laboratorie- eller industrijäsningskärl av varierande rymd. Då man använder jäsningskar, är det önskvärt att framställa ett vegetativt inokulum i en näringsbuljong genom att inokulera en ringa volym av odlingsmediet med en lutande kultur eller botten- kultur eller en lyofiliserad kultur av organismen. Sedan man på detta sätt erhållit ett aktivt inokulum, överföres det aseptiskt till det i jäsningskaret för framställning i stor skala av 4'-desklorrebeccamycin. Mediet, i vilket det vege- tativa inokulumet framställes, kan vara detsamma eller skilt från det, som användes i karet om det är sådant atten1xfl'tfll- växt av den alstrande organismen erhålles.

Man uppnår i allmänhet en optimal produktion av 4'-desklor- rebeccamycin efter inkuberingsperioder av ca 7 dagar. 4'-desklorrebeccamycin är en.mindre produkt av jäsningen och kanvutvinnasffnånflodlingsmedíetfochßisaïenasnïßemfihuvudskJ* ligen ren form enligt det i exempel 1 nedan beskrivna fler- stegsförfarandet. Den önskade 4'-desklorrebeccamycinet före- kommer sålunda primärt i myceliumet och utvinning från myce- liumet kan utföras genom extraktion med ett organiskst lös- ningsmedel t.ex. tetrahydrofuran. Man kan efter revision av extraktvolymen erhålla en fast râprodukt innehållande det önskade 4'-desklorrebeccamycinet. Denna fasta råprodukt kan därefter underkastas ett flerstegsreningsschema, som belyses i följande förloppsschema.

Fast 'rågíaafikt 1) Suspendera i kloroformzmetanol (2:1) 2) Tillsätt diatomacëjord 3) Späd med Skellysolve B 4) Indunsta till pulver i vakuum 5) Slamma upp i Skellysolve B och underkasta uppslamningen 466 207 14 I 10 15 20 25 30 35 Skellysolve B To1uLn- ca c I I _ Etyl- THF ' "'-1-* 2 12 acetat Metanol 1) Indunstat till torrhet (åter- "stod A) 2) Kolonnkromatografi 3) Linjär gradienteluering - CHCI3 till 5% CH3OH i CHCl : 3 20 x 200-ml-fraktioner Fraktioner 13 - 16 ' 1) Indunsta till torrhet (återstod B) 2) Extrahera med DMSO 3) Kolonnkromatografi-eluering med CH3CN:CH3OH: O,1M NH4OAc (3:2:4):21 förgenomrinning, däref- ter 40 x 65-ml-fraktioner Fraktioner 9 - 32 1) Extrahera med CHC13* gfig1É¿ . Väåtanäaktigffïg 1) Koncentrera 2) Fäll ut med Skellysolve B I I Filtrera Monoklorrebeccamycin i Kasta bort fast form Eysikalisk-kemiska egenskaper för 4'-desklorrebeccamycin De fysikalisk-kemiska egenskaperna för 4'-desklorrebeccamycin är följande: 4'-desklorrebeccamycin är en gul, amorf, fast substans med en molekylformel av C27H2207N3Cl och en molekylvikt av 535,8397.

Det är sammansatt av grundämnena kol, väte, syre, kväve och klor. Elemantaranalysdata är följande: Ber. för C H O N Cl~H 0: 27 22 7 3 2 C 58,54 H 4,37 C 58,43 H 4,29 N 7,58 Funnet: N 7,29 10 15 201 25 30 35 40 15 466 207 Högupplösningsmasspektrumet för 4'-desklorrebeccamycin bestäm- des medelst en Kratos MS-50-spektrometer och FAB-jonisering.

Den oberservade massan är följande: Ber. för (M+H)*-jan: 53s,1224 Funnet för (M+n)*-jan: s3e,11es 4'-desklorrebeccamycin är olösligt i vatten och lösligt i dimetylsulfoxid.

Det infraröda absorptionsspektrumet,för 4'-desklorrebeccamy- cin, pelleterat i KBr, uppvisar karakteristiska band vid föl- jande frekvenser uttryckta i reciproka centimeter: 3400, 3330, 2930, 1745, 1703, 1575, 1490, 1470, 1458, 1435, 1398, 1380, 1330, 1273, 1238, 1140, 1105, 1083, 1050, 1015, 947, 910, 800, 798, 755, 738, 670, 665, 633.

Det ultravioletta absorptionsspektrumet för 4'-desk1orrebec- -» camycim;bestämdesëï.metanolw(0,034G2¿y/IW underfneuträháßför-“ hâllanden. Observerade absorptionsmaxima och absorptionsförmå- ga är följande: 400 nm (8,6), 315 nm (96,5), 290 nm (107,7), 257 nm (sh), 235 nm (76,3).

Ett protonmagnetiskt resonansspektrum för 4'-desklorrebecca- mycin upplöst i dimetylsulfoxid bestämdes medelst en Bruker WM-360-spektrometer, som arbetade vid 360 MHz och med använd- ning av tetrametylsilan som inre steandard. De observerade kemiska förskjutningarna (delta-värden), kopplingskonstanter (J-värden i Hz) och mönsterbeskrivningar är följande: 11,81 (s, 1H, N8-H), 11,24 (s, 1H, N5'-H), 9,26 (d, J=7,9, 1H, Cl-H eller Cl'-H), 9,10 (d, J=7,9, 1H, Cl-H eller Cl'-H) 7,77 (d, J=7,9, 1H, C4'-H), 7,63 (m, 2H, C3-H och C3'-H), 7,42 (m, 2H, C2-H och C2'-H), 6,91 (d, J=9,4, 1H, Cl"-H), 6,30 (bs, 1H, C6"-OH), 5,25 (d, J=5,7, 1H, C3F'-OH), 4,91 (d, J=5,7, 1H, C2"-OH), 4,01 (bs, 2H, C6"-H), 3,90 (d, 1H, C5"-H), 3,67 (t, 1H, C4"-H), 3,62 (s, 3H, C4"-OCH3), 3,53 10 15 25 30 35 466 207 16 (m, 1H, C2"-H överlappning med H20).

Ett kol-13-magnetiskt resonansspektrum för 4'-desklorrebecca- mycin löst i dimetylsulfoxid bestämdes_medelst en Bruker WM- -360-spektrometer, som arbetade vid 22,5 MHz och med anwüflnhm av tetrametylsilan som inre standard. De observerade kemiska förskjutningarna (ppm-värden) och tillordningarna är föl- jande: Kemisk förskjutning Tillordning 170,7 W C7 ? 170,6 C7' 140,7 C4a 138,1 C4a' 130,4 C5a 129,9 C5a' 129,4 C3' 127,3 C3 125,6 C5c ,f2@&@*1*5- íel Cfifiß. 123,9 C1 122,8 C5c' 122,3 C2 121,1 C6 120,6 C2' 119,4 C6' 119,1 C5b' 117,4 C5b 116,4 C4 112,1 C4' 83,9 C1" 77,6 C3" 77,0 C4" 76,6 C5" 72,1 C2" 60,0 OCH3 58,7 C6" 10 15 Zflflff 25 30 35 W 466 207 Biologisk aktivitet för 4*-desklorrebeccamycin Den antibakteriella aktiviteten för 4'-desklorrebeccamycin bestämdes gentemot ett antal grampositiva och gramnegativa organismer medelst en dubbelserie-agarutspädningsmetod. Re- sultaten visas i nedanstående tabell 5 i jämförelse med ak- tiviteten av rebeccamycin.

Tabell 5 W Antibakteriell aktivitet för 4'-desklorrebeccamycin T Min.inhibiteringskonc. (MIC) 3ebecca(m /ml) 4'-desklorre- Organism mycin beëcamzcin .fi-_ eaesflseies Assss >1zs 32 §¿ enes A9604 >125 32 §_-_ 25e_<==_1_1_i_§ Azosaa g 16 å; 1213923 Assa? o.s 2 ä; .lJiäeëLë - A954? 0.; 1 å; 922% (Pen-Res) Assos >zso nä; våsnåâåšäa' “v ' Alfllïflfimi '»>250wfiW szgotn- ._s_~_ SQL-Å A2034l-1 >250 >250 E; Rfleumoniae A9664 >25g >250 E; Bgeumoniae A20468 >250 >25° E; ålâíäâš. A9659 >2So >z5o å; 9.112.292 Assss >zso >25° 2.-. Eišfšèlë Assoo >zso >zso 2:. .Vëlieäåš A21S59. >2so >2sn ä; 2259392. A15153 >2so >zso 2:. .EEESEE 122424 >250 >25o §.-. A2°019 >2sø >2so 2; EEEESÉEQEE Ä9343Ä >250 >250 2; 1-21213 >2sø >25o List. monocytogenes A15121 32 3; List. monocytgggnes A20025 32 53 4'-desklorrebeccamycin testades även mot transplanterat möss- leukemia P-388 och resultaten visas i nedanstående tabell 6.

Den allmänna metodiken följde protokollen enligt National 10. 15 20 25' 30 35 466 207 18 Cancer Institute Lfiancer Chemotherapy Rep., del 3, 3, 1-103 1197217. tabell 6.

De väsentliga försöksdetaljerna anges i slutet av Tabell 6 ¿Verkan av 4'-desklorrebeccamycin pâ P-388 leukemia^< Dos; t n ~ Förändring :Överle- IP MST MST av medel~~ vande "°t°rï°1 mä/kg/iflá dagar- _%T/c vikt. 9 dag 10 Rebeccamycin 'u 512 17,0 155 4,4 5/5 256 15,0 136 -0¿3 5/5 128 14,5 132 QI2 5/5 64 15,0 136 0,3 5/5 32 13,0 118 -0,6 6/s 16 15, 0 156 -0/3 5/5 M , ¿ 5 W I2§e=Gamycin¿@1 25§§«~.L§¿Gà¿}¿ïå&Wfi”+ “-¶¿šåëa_¿~~ > 0%? 128 12,5 159 -0,5 4/5 64 15,0 136 -ufg 4/4 32 15,5 141 -o¿3 4/4 16 18,0 164 -019 3/4 Kontroll 0/5 11¿0 100 0/5 10/10 Tumörinokulum: 106 askitesceller, i.p.

Värd : CDF1F-möss Behandling: Singelinjektion på dag 1 administr i.p.

Utvärdering : MST = medelöverlevnadstid Verkan : % T/C = (MST förbehandl./MST för kontrolldjur) x 100 Kriterium : % T/S > 125 anses som signifikant tumörinhibi- tering Kontroll : Saltlösning (0,5 ml) administr. en gång dagl. i.p. under 5 dagar 10 15 20@a_ 25 30 35 19 466 207 Såsom framgår av de ovan angivna antimikrobiella- och möss- tumördata är 4'-desklorrebeccamycin användbart som antibio- tikum och även som antitumörmedel för inhibetering av malig- na tumörer hosdäggdjur, exempelvis P-388 leukemia.

Uppfinningen inkluderar inom sitt omrâde farmaceutiska kompo- sitioner innehållande en verksam antimikrobiell- eller tu- mörinhibiterande mängd 4'-desklorrebeccamycin i kombination med en inert farmaceutiskt godtagbar bärare eller ett inert farmaceutiskt godtagbart utspädningsmedel. Sådana komposi- »tioner kan även innehålla andra verksamma antimikrobiella substanser eller antitumörsubstanser och kan framställas i vilken farmaceutisk fonnSOmhelst, som är lämplig för det önskade administreringssättet. Sådana kompositioner inklude- rar fasta kompositioner för oral administrering, t.exf tab- letter, kapslar, piller, pulver och korn, flytande komposi- tioner föroral administrering, t.ex. lösningar, suspensioner, siruper eller elixir och preparat för parenteral administre- ring, t.ex. sterila lösningar, suspension eller emulsioner- De kan också?firamställaswfkformwavæsterilawfiásüa@kompøsitroner;¿n som kan lösas upp i sterilt vatten, fysiologisk saltlösning eller vissa andra sterila injicerbara media omedelbart före användning. För användning som en antimikrobiell substans ad- ministreras 4'-desklorrebeccamycinet eller en farmaceutisk komposition därav så att koncentrationen av verksam bestånds- del är större än den minimala inhibiterande koncentrationen för den speciella organism som skall behandlas. För använd- ning som antitumörsubstans kan de optimala doseringarna av och regimerna för 4'-desklorrebeccamycin för ett givet dägg- djur lätt framställas av fackmännen. Det skall givetvis upp- märksammas att den aktielhadoseringenav 4'-desklorrebecca- mycin, som användes, varierar enligt den särskilt formulera- de kompositionen, administreringssättet och den speciella situs, värd och sjukdom, som skall behandlas. Man skall taga hänsyn till mänga faktorer, som modifierar läkemedlets in- verkan, inkluderande ålder, vikt, sex, diet, administre- ringstid, administreringssätt, exkresionshastighet, patien- 10 15 20 25 30 35 466 207 2o tens tillstånd, läkemedelskompositioner, reaktionskänslighet och sjukdomens svårighetsgrad.

Följande exempel anges endast för belysande ändamål. Det avses inte att begränsa uppfinningens omfång. Skellysolve B är ett kommersiellt tillgängligt petroleumlösningsmedel (Skelly Oil Co.) innehållande isomera hexaner och med en kokpunkt av 60-69°C. Decalite är diatomacêjord tillverkad av Grefco Inc.. Om ej annat anges är alla nedanstående tem- peraturer i grader Celsius.

Exemgel 1 Framställning av 4'-desklorrebeccamycin A. Jäsning Nocardia aerocolonigenes-stammen C38,383-RK2 (ATCC 39243) hölls i gott tillstånd och överfördes till lutande agarprov- Lwrörnavïjäst-maltextraktægarw. glukos, 4,0 g jästextrakt, 10 g maltextrakt och 20 g agar utspätt till 1 liter med destillerat vatten. Vid varje över- föring inkuberades det lutande agarröret under 7 dagar vid 27°C. För att framställa ett inokulum för framställningsfa- sen överfördes yttillväxten från den lutande kulturen till .en 500 ml Erlenmeyerkolv innehållande 100 ml sterilt medi- um bestående av 30 g glukos, 10 g sojamjöl, 10 g bomullsfrö- embryomjöl och 3 g CaC03 utspätt till 1 liter med destille- rat vatten. Denna vegetativa kultur inkuberades vid 27°C un- der 48 timmar på en Girotory-varvskakapparat (Model G53, New Brunswick Scientific Co., Inc.) inställd på 210 varv/min., beskrivande en cirkel med en diameter av 5,1 cm. 4 ml vege- tativ kultur överfördes till en 500 ml Erlenmeyerkolv inne- hållande 100 ml sterilt framställningsmedium bestående av 60 g majsstärkelse, 10 g glukos, 15 g linfrömjöl, 5,0 g autolyserad jäst, 1,0 g FeS04-7H2O, 1,0 g NH4H2PO4, 1,0 g (NH4)2S04 och 10 g CaCO3 utspätt till 1 liter med destille- rat vatten. Framställningskulturen inkuberades vid 27°C på 10 15 20 .fn 25 30 35 21 466 207 en sådan skakapparat, som användes för den vegetativa kultu- ren. Omröringshastigheten inställdes på 250 varv/min.. Jäs- ningen avslutades vid 168 timmar.

B. Isolering Den enligt exempel 1A erhållna jäsningsbuljungen filtreras med användning av ett filterhjälpmedel av diatomacêjord (filterhjälpmedlet blandas med buljongen och användes även för att bilda en matta). Filtratet kastas bort och mattan extraheras med tetrahydrofuran (THF)_under 30 - 60 minuter med användning av 0,1 - 0,2 volymer baserade på den ur- sprungliga buljongvolymen (THF innehåller företrädesvis 0,025 % butylerade hydroxitoluener som konserveringsmedel).

THF-extraktet filtreras och de olösliga ämnena kastas bort.

Filtratet indunstas i vakuum tills nästan allt THF är av- lägsnat. Inert filterhjälpmedel blandas därefter koncentra- tet och den bildade blandningen filtreras på en matta av inert filterhjälpmedel. Luft ledes genom mattan under 4 tim- mar eller längrafiför?att#torkafmattanrsâèmyokéüfsommmöjfagü; Den ovan beskrivna mattan extraheras därefter under ca 30 minuter med en tillräcklig mängd THF, så att man erhåller en god uppslamning. Extraktet filtreras och mattan kastas bort. Filtratet indunstas genom kokning vid en atmosfär.

Varm metanol tillsättes samtidigt allteftersom volymen min- skar. Då kristallisering av gula fasta ämnen börjar kokas blandningen varsamt tills problemet med stötning uppstår. Re- aktionsblandningen får därefter svalna och kyles till 5-8°C.

Den fasta produkten filtreras, sköljes med kall metanol och torkas. Detta material innehållande det önskade 4'-desklor- rebeccamycinet användes i följande separeringsförfarande.

C. Separering och rening Fasta råprodukter från exempel 1B (336,9 g) suspenderades 10 15 20 «- 25 30 35 466 207 22 'och löstes delvis i 2,5 liter av 2 delar kloroform, 1 del metanol och överfördes till en 6 liter rundkolv. Till sus- pensionen blandades ungerfär 1 kg filterhjälpmedel (Dica- lite). Blandningen späddes med ungefär 1,5 liter Skelly- solve B. Den bildade uppslamningen koncentrerades till ett pulver i vakuum i en rotationsevaporator. Pulvret slammades i 6 liter Skellysolve B och infördes i en snabbkromatogra- feringskolonn med 12 cm, yttre diameter, x 90 cm. En bädd bildades med övertrycksflöde (N2-0,4 kg/cmz). Den packade kolonnen eluerades med övertrycksflöde medelst följande elutropiska serier:_9 liter Skellysolve B (3 litertnytt + 6 liter packningslösningsmedel), 13 liter toluen, 12 liter metylenklorid, 12 liter etylacetat, 18 liter tetrahydro- furan och 7 liter metanol. Toluenelueringsmedlet indunsta- des till torrhet i vakuum i en rotationsevaporator, varvid man erhöll 5,15 g fast substans betecknad återstod A.

En Glenco Series 3500 Universal LC-kolonn (2,67 cm, inre diamter, x 75 cm) packades med 80 g Woelm-silikagel (0,063- -0,2001mml@iaklureformu-Återstcden%Aälöstesxi¿4®ïmlfkQxnxr* form och pumpades direkt på kolonnen. Elueringen började med en första isokratisk sköljning med 500 ml kloroform. Elu- eringen fortsatte med en 4-liters linjärgradient av kloro- form och 5 delar metanol i 95 delar kloroform, varvid man uppsamlade tjugo 200-ml-fraktioner. Fraktionerna 13 till 16 bedömdes vara nästan homogena. Dessa sammanslogos och indunstades till torrhet, varvid man erhöll 663 mg återstod B.

Glenco-kolonnen (2,67 cm, inre diamter, x 75 cm) packades med Baker Bonded Phase oktadecylsilikagel (C-18) i metanol.

Kolonnen ekvilibrerades med ungefär 2,5 bäddvolymer av elu- eringsmedel: 3 delar acetonitril, 3 delar metanol och 4 de- lar 0,1 M ammoniumacetatlösning. Återstoden B i 3 ml dimetyl- sulfoxid fördes in i testslingan och pumpades på kolonnen med elueringsmedel. Elueringen började under kontroll av elu- eringsmedlet vid 280 nm. Efter en första 2 liter förrinning samlade man upp fyrtio 50-ml-fraktioner. Baserade på UV-kro- 10 15 20 25 30 35 23 466 207 matogram sammanslogos fraktionerna 9 till 32. Blandningen extraherades med 2 liter kloroform. Den lägre fasen separe- rades och indunstades till torrhet i vakuum i en rotations- evaporator. Återstoden löstes delvis i 50 ml kloroform med ljudvibration. Suspensionen sattes till 1 liter Skelly- solve B med snabb omröring. Den bildade fällningen uppsam- lades genom filtrering, varvid man erhöll 606 mg 4'-des- klorrebeccamycin.

Ytterligare detaljer om ovanstående isoleringsförfarande anges i det följande. - Analytisk HPLC Följande komponenter användes för att konstruera ett analy- tiskt HPLC-system: Waters Associates Model 6000A-lösnings- medeltillförselpumpsystem; Varian Varichrom Model VUV-10 uv/vis Detector, inställd på 254 nm 0,1 O.D.; Fisher Record- al Series 5000 Recorder; WatersAssxáa&æ .Model U6K injector; 'Altex SpherisorH*ODS”(T0p)*koIonn (4,6 mm, inre diæmeter«;" x 25 cm). Kmqxmenunna sammanbands med 316 rörledningar av rostfritt stål (1,6 mm, yttre diamter, - 0,23 mm, inre dia- meter). Elueringsmedlet bestående av 4 delar acetonitril, 3 delar metanol och 3 delar 0,1 M ammoniumacetatlösning pumpades med en hastighet av 2 ml/min. för samtliga analyser.

Ibland ersattes Varian Varichrom VUV-10 Detector med ett Hewlett Packard 1040A HPLC Detector System.

Tunnskiktskromatografi (TLC) TLC utfördes på Analtech för belagda silikagel GHLF-plattor (2,5 cm x 10 cm 0,25 mm tjocka skikt). Plattorna utveckla- des i glascylindrar (6,4 cm diamter x 15 cm höga) inköpta hgs Whatman, Inc,, Cisternerna fylldes med 10 ml av 5 delar metanol - 95 delar kloroform och fick utbalansera innan man införde plattan. De utvecklade, lufttorkade plattorna vi- usaliserades med 254 nm och 366 nm ultraviolett ljus med an- 10 15 25 30 35 466 207 25 vändning av antingen en Chrome-VUE model CC-20-ljuslâda (Ultra-Violet Products Inc.) eller en modell UVSL-58-handhâl- len minerallju slampa (Ultra-Violet Products Inc.) .

Freparativ HPLC Följande komponenter användes för att konstruera ett medel- tryck flytande kromatografisystem: Fluid Metering, Inc. Model RP-SY 2CSC FMI Lab Pump; Fluid Metering Inc. Model PD-60-LF FMI Pulse Dampener; en 15 ml provslinga tillverkad av poly- propenrör (3,0 mm, yttre diamter, x 1,5 mm, inre diamter) lindad omkring ett papprör (8,65 cm, yttre diamter); Glenco Series 3500 Universal LC-kolonn (2,67 cm, inre diamter, x 75 cm); Instrumentation Specialities Co. Model UA-5 Ab- sorbance/Fluorescence Monitor med en typ 6 optisk enhet, Instrumentation Specialties Co. Model 590 Flow Interrupter Value och en Instrumentation Specialties Co. Model 328- fraktionsuppsamlare. Komponenterna var förenade med poly- propen- och teflonrör (3,0 mm, yttre diamter, x 1,5 mm, auinrefdïamter) och*Glenco-flermonterafihfikopgïingäræacfiaven-i tiler i angiven ordning.

Glenco series 3500 Universal LC-kolonnen packades med en uppslamning av det bestämda adsorptionsmedlet i det designe- rade lösningsmedlet med användning av standardförfaranden.

Tomrummet mellan den avsatta bädden och rörets topp fyll- des med Ottawa-standardsand. Elueringsmedlet pumpades med en maximal hastighet, som icke skulle överstiga 4,2 kg/cmz mottryck iungefär 20 ml/min.).

Gradienteluering En Glenco-gradient-elueringsapparat bestående av tvâ kamma- re med samma diamter, höjd och volym förenade i tandem med en teflonventil användes för gradientelueringar. En kammare tjänade som blandningskammare och en som statisk reservoar.

Det mindre polara lösningsmedlet lkloroform) infördes i bör- 10 26 466 207 jan i blandningskammaren. Det mera polara lösningsmedlet, 5 delar metanol i 95 delar kloroform infördes 1 den statiska kammaren. Teflonbelagda magnetiska omrörarstänger (1,0 x 3,7 cm) var anbringade i båda kamrarna och drevos medelst Thomas Model 15 Magne-matic-omrörare. Elueringsmedlet pum- pades från blandningskammaren till medeltryck- -systemet genom polypropenrör (1,5 mm, inre diamter, x 3,0 mm, yttre diameter). Aílteftersom elueringsmedlet avlägsnades från blandningskammaren, fick lösningsmedlet i den statiska re- servoaren fritt ersätta det, och sålunda bilda en linjär elueringsmedelsgradient.

Claims (4)

466 207 P A T E N T K R A V

1. Förening med formeln

2. àäf 466 207 ZX k ä n n e t e c k n a t av att man odlar den 4'-desklorrebeccamycin- alstrande stammen Nocardia aerocolonigenes ATCO 39243 eller en mutant därav med väsentligen samma egenskaper som ATCC 39243 i ett vattenhaltigt näringsmedium innehållande assimilerbara källor av kol och kväve under submersa aeroba förhållanden till dess en betydande mängd 4'-desklorre- beccamycin har bildats genom nämnda organism i nämnda kulturmedium och därefter utvinner 4'-desklorrebeccamycinet från kulturmediet 1 huvudsak fritt fràn samtidigt bildade substanser.

3. Farmaceutisk komposition, k ä n n e t e c k n a d av att den innefattar såsom aktiv komponent en verksam antibakteriell mängd av 4'- desklorrebeccamycin med formeln tillsammans med en inert, farmaceutiskt godtagbar bärare eller ett inert, farmaceutiskt godtagbart utspädningsmedel. 466 207 dc?

4. Farmaceutisk komposition, k ä n n e t e c k n a d av att den innefattar såsom aktiv komponent en verksam tumör-inhibiterande mängd av 4'-desklorrebeccamycin med formeln tillsammans med en inert, farmaceutiskt godtagbar bärare eller ett inert, farmaceutiskt godtagbart utspädningsmedel.