DE1717100B

DE1717100B - Verfahren zur Herstellung von Präparaten hämolytischer Streptococcen zur unterstützenden Behandlung von Carcinomerkrankungen

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Publication number: DE1717100B
Authority: DE
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd

Description

Bekanntlich befinden sich unter den lebenden Zellen hämolytischer Streptococeen solche, die aniiearcinomatöse Wirkung besitzen. Die Verwendung von lebenden Zellen in einer für die Tumortherapie ausreichenden Menge ist jedoch sehr gefährlich, da diese Bakterien z. B. Erysipel erzeugen.

D:e pathogene Wirkung der hämolytischen Sireptococcen (worunter im folgenden auch die Virulenz oder die Toxizität verstanden werden soll) nimmt ab und die antiearcinomatöse Wirkung zu. wenn die Zellen der hämolyiischen Streptococcen kurze Zeit bei etwa 37 C in einem Medium behandelt werden, das Penicillin in verhältnismäßig hoher Konzentration enthält (vgl. S. K ο s h i m u r a. R.Shimizu. A. Fujimura und H. Okamol o. GANN. Bd. 55 [1964]. S. 233 bis 236). Es ist ferner bekannt, daß bessere Ergebnisse erhalten werden, wenn die Zellen der hämolytischen Streptococcen nach der Behandlung bei etwa 37 C in einem penicillinhaltigen Medium kurze Zeit einer Wärmebehandlung in der Nähe von 45 C unterworfen werden (vgl. The Japanese Journal of Experimental Medicine. Bd. 36 [1966]. S. 161 bis 174).

Durch eine derartige Penicillinbchandlung kann die antitumoröse Wirkung der hämolytischen Streplococcen erhöht und ihre pathogene Wirkung gesenkt werden. Das auf diese Weise hergestellte Präparat kann jedoch nicht Patienten verabreicht werden, bei denen die Gefahr des anaphylaktischen Schocks durch Penicillin besteht. Dieses Problem darf nicht unterschätzt werden, da die Zahl der überempfindlichen Menschen angestiegen ist infolge des schnell ansteigenden Gebrauchs von Penicillin bei der Therapie verschiedener Krankheiten. Weiter ist zu befürchten, daß wegen der leichten Bindung des Penicillins an Protein im alkalischen Milieu eine Verbindung ims Penicillin und Zellprotein gebildet wird, die die Aiiligenwirkung von Penicillin erhöht, wodurch schwere allergische Reaktionen hervorgerufen werden können

Aufgabe der Erfindung war es. die Nachteile der durch Penicillinbehandluiig erhaltenen Präparate hämolvtiseher Streptococcen /u vermeiden und neue Präparate mit anticarcinomatöser Wirkung zu schaffen, die nicht pathogen sind und keine Antigenwirkung hervorrufen Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit cm Verfahren zur Herstellung von Präparaten /ur unterstützenden Behandlung von Carcinomerkrankungen durch Beliandlung einer Suspension lebender /eilen häniohtischer Streptocoecen mit anticarcinomatöser Wirkung mit einem Antibiotikum und kurzzeitigem zweistufigem Erwärmen auf Temperaturen von 3⁷ bzw. 45 C. das dadurch gekennzeichnet ist. daß man als Antibiotikum Cephalosporin C oder Cycloserin verwendet und in der ersten Stufe 20 bis 60 Minuten auf 30 bis 3S (und in der zweiten Stufe 20 bis 6" Minuten auf 38 bis 50 C erwärmt

Es wurde gefunden, daß lediglich Cephalosporin C und Cycloserin die antiearcinomatöse Wirkung der hämolytischen Streptococcen noch besser erhöhen als Penicillin und außerdem ihre Virulenz eliminiert Streptomycin und viele andere Antibiotika und auch Chemotherapeutika rufen bei hämolytischen Streptococccη überhaupt keine VerbessErung der anticarcinomatösen Wirkung hervor. Da Cephalosporin C und Cycloserin keine Krcuzungsallergic mit Peni

cillin zeiuen. tritt die Gefahr des anaphylaktischen Schocks nicht auf. und man kann das erfindungsgemäß hergestellte Präparat auch an Patienten verabreichen, die gegen Penicillin überempfindlich sind

Das" erfindungsgemäße Verfahren wird praktisch folgendermaßen ausgeführt: Cephalosporin C oder Cycloserin wird zu einer Suspension lebender Zellen von hämolyiischen Strepiococcen gegeben. Die Zellen werden in üblichen Nährmedien, z. in Pepton-Fleischbrühe. Herztleischbrühe oder jinem hauptsächlich Hefeextrakt enthaltenden Medium, bei Temperaturen von 30 bis 38 C unter .stationären Bedingungen oder unter Belüften und Rühren gezüchtet. Sodann werden die Zellen in üblicher Weise abgetrennt und z. B. in Bernheimers Basalmediu η suspendiert (Zusammensetzung: 675 mg Maltose. 6 ml einer 20°oiiien Lösung von Kaliumdihydrogenphosphat in Wasser, die auf einen pH-Wert 6.9 bis 7.0 mit Natriumhydroxyd eingestellt ist. 12 ml einer 2%igen wäßrigen Lösung von Magnesiumsulfat-heptahydrat und 66 ml destilliertes Wasser, irn folgenden als BBM bezeichnet). Das Cephalosporin C oder Cycloserin werden zu der Zellsuspension zugesetzt, so daß diese Stoffe in einer Endkonzentration \on 3 χ 10"^: Mol pro Liter oder mehr vorliegen. Es ist natürlich auch möglich, das Cephalosporin C oder Cycloserin in BBM vorher zu lösen und anschließend die lebenden Zellen darin zu suspendieren.

Das für die Zwecke der Erfindung verwendete Cephalosporin C kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Es können natürliches Cephalosporin C. Cephalothin oder Cephaloridin verwendet werden. Als Suspendiermedium für die Zellsuspension kai.η auch eine andere Salzlösung, z. B. eine mn Phosphat gepufferte Kochsalzlösung an Stelle von BBM. verwendet werden.

Für das erlindungsgemäße Verfahren kommen lebende Zellen aller hämolvsierendeii Sireptococcen (Streptococcus hemolyticus) in Frage, die antiearcinomatöse Wirkung besitzen, insbesondere hämolvsierendc Sireptococcen der Gruppe A (Klassifikation nach nach L a η c e £ i e 1 dl. die Streplolysin S bilden (viii, auch The Japanese Journal <if Exptl. Med.. Bd. 25 [1955]. S. 93 bis 102.

l.'ni eine bessere Einwirkung des zugesetzten Cephalosporins C oder des {.'\eloserins in der Zellsuspension zu erreichen, wird diese 20 bis 60 Minuten auf Temperaturen von 30 bis 38 C. insbesondere auf etwa }ⁿ C. erwärmt. Eine Uchandlungsdauer von 20 Minuten ist im allgemeinen ausreichend. Auf diese Wärmebehandlung folgt eine weitere Wärmebehandhms¹ während elwa 20 bis 60 Minuten bei Temperaüiien von 3X bis 50 C. vorzugsweise in der Nähe von 45 C.

Durch das erfif'.liingsgemäße Verfahren wird die antiearcinomatöse Wirkung der lebenden Zellen der hämolytischen Streptococcen gegenüber einer Pemcillinbchandlung erhöht, während die pathogene Wirkung durch diese Behandlung verschwindet. Bei Verwendung von Cephalosporin C wird insbesondere die Fähigkeit der Streptococcen zur Bildung von Streptolvsin S ebenfalls /um Verschwinden gebracht.

Die erfindungsgemäß hergestellten Präparate können Patienten nach ausreichender Verdünnung gewöhnlich intravenös oder lokal in Form einer wäßrigen Suspension applizicrt werden. Die Verabreichung kann über lange Zeiträume auch an solche Patienten erfolgen, die konstitutionell zu einer Hhercmpfinillichkcit gegenüber Penicillin neigen.

ι,

Die Erfindung uird durch die folgenden Beispiele (.'Häuten.

Beispiel 1

4 g Hefeexlrakt (Hersteller Ehios Yakuhin Kogvo K. K.) werden in 200 ml destilliertem Wasser gelost. Die Lösung wird mit 10"„iger Natronlauge auf einen pH-Wert von 7.0 bis 7.2 eingestellt und 60 Minuten auf 100 C erhitzt. Nach dem Abkühlen uird der ausgefallene Niederschlag ablllirieri. der pH-Wert des .Filirats mit 10'Oigcr Natronlauge erneut auf 7.11 his 7.2 eingestellt, wieder 30 Minuten auf 100 C erhitzt und filtriert. Das Filirat wird mit destilliertem Wasser auf 300 ml aufgefüllt und diese Lösung in sterilisierte Kolben gegossen und bei einem Druck \on 1 kg cnr ill) Minuten dampfsterilisiert.

Line Kultur von Streptococcus hemohticus. Stamm Su. ATCC Nr. 21 060 (ein fast avirulenter Siammi. der 20 Stunden in 15 ml Fleischbrühe ge/üchiet worden war. wird zur Beimpfung von 300 ml des genannten Hefeextrakts als Nährmedium verwendet und 20 Stunden statisch bei 37 C kultiviert. Sodann wird die Kulturbrühe mit Eis gekühlt und zentrifugiert. Die erhaltenen Zellen werden zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in I 5 ml BBM suspendiert. Die Absorption dieser Zeilen-■~u-.pen.sion bei 660 nvj betragt 7.S0.

5 ml dieser ZJisuspension in BBM werden mit 1 ml einer physiologischen Kochsalzlösung versetzt, die O.25Xnmlar an Cephaloridin ist. und 20 Minuter auf 37 C erhitz.;. Das Ergebm . der \ntitumorversuche mit dieser Streptococcensuspension ist in Tabelle ! unter Gruppe I angegeben.

Beispiel 2

Line gemäß Beispiel I hergestellte wärmebehandelle Zellsuspension von Streptococcus hemohticus. Stamm Su. ATC C Nr. 21 OW). wird weitere 30 Minuten .nil' 45 C erwärmt. Die erhaltene Streptococcensi.speiision zeigt noch bessere Ergebnisse als die gemäß Beispiel I erhaltene Suspension.

Beispiel 3

30g Hefee\trakt (Hersteller Ebio> Yakuhin Kogvo K. K.ι werden in 500 ml destilliertem Wasser gelösi. Die Lösung wird mit 10",,iger Natronlauge aiii einen pH-Wert von 7.0 bis 7.2 eingestellt und 60 Minuten auf 100 C erhitzt. Nach dem Abkühlen wird der gebildete Niederschlag abfiltriert, der pH-Wert des Eillrats mit HVOiger Natronlauge erneut auf ".0 bis 7.2 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Die Lösung wird in sterilisierte Kolben gegossen und bei einem Druck \on ι kg cnr 10 Minuten dampfsterilisieri. lOOOml dieser I IeIV--extr.iktlösung werden dann mit einer Kultur μίι Streptococcus hemolvticus. Stamm Su. AKt Nr. 21 060 (fast avirulcnter Stamm), beimpft, der 20 Stunden in 50 ml Fleischbrühe gezüchtet worden war. Die Züchtung erfolgt 14 Stunden statisch bei 37 C. Die Kulturbrülle wird anschließend mit Eis abgekühlt und zentrifugiert. Die erhaltenen Zellen werden zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in 50 ml BBM suspendiert.

Die Absorption dieser Zellsuspension bei 660 um beträgt ⁽).7.

5 ml der erhaltenen Zellsuspension in BBM werden mit I ml einer physiologischen Kochsalzlösung versetzt, die ;i.25Xmolar an Cycloserin ist. Die Suspension wird 2o Minuten auf 37 C erwärmt. Es wird eine Suspension hämolvtischer Sireptocoecen mit günstiger Aniitumorw irkung erhalten.

B e ι s ρ i e I 4

Eine gemäß Beispiel 3 hergestellte wä.niebehandelte Zeüsiispension von Streptococcus hemolvticus. Stamm Su. ATCC Nr 21 060. wird weitere 30 Minuten ίο auf 45 C erwärmt. Die erhaltene Streptoeoccen-Suspension zeigt eine noch bessere aniicarcinomatose Wirkung.

Beispiel 5

is Kulturen von Streptococcus hemolviicus. ATCC Nrn. 21 o59. 21 546. 21 54S und 12 202. die jeweils 20 Stunden in 15 ml Fleischbrühe gezüchtet worden waren, werden zur Beimpfung von jeweils 300 ml des im Beispiel I beschriebenen Hefeextrakts als Nährmedium verwendet und 20 Stunden statisch bei 37 C kulii\iert. Sodann wird die Kuliurhrühe mit Eis gekühlt und zentrifugiert. Die erhaltenen Zellen werden zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 15 nil 3BM suspendiert.

2s Die Absorption der Zellensuspension bei 660 um wird gemessen.

Jeweils 5 ml dieser Zellensuspensionen in BBN! werden mit 1 ml einer physiologischen Kochsalzlösung versetzt, die 0.25Kmolar an Cycloserin. Cephaloridin oder dem Kaliumsalz \<>n Penicillin (i ist. und 20 Minuten auf 37 C und hierauf weitere 30 Minuten auf 45 C erhitzt. F> werden Suspensionen hämolytischer Sireptocoecen mit .iiiticarcinomatöser Wirkung erhalten.

's Die Ergebnisse von Versuchen mit diesen Streptocoecensiispensionen sind im Vj; -uchsbeispiel 12 zusammengestellt.

Yersudisheispi·..·! I

Eine genial' Beispiel I erhaltene Zellsiispension wird fortschreitend mil BBM aiii das 10- bis 40fache verdünnt und sofort hinsichtlich ihrer anticarcmomatösen Wirkung untersucht.

ο Zum Vergleich weiden Suspensionen hämolwischer Slreptoeoccen untersucht, die in ähnlicher Weise mit dem Kahunisalz von Penicillin (Ί oder r.i't Dilivdrostivpiomvcmsullat behandelt waren Fernei wird eine unhehandclie Zellsiispension und eine

y BBM-I c'v.uiig ohne Zellsiispension untersucht.

Es wurden Mause miraperitone.il mit Lhrlich- \sc it es-Ca rciiuMii zellen beimpft. AmX lage nach den. Implen winden die Zellen gesanimelt. mit Eis alig ■ kühl¹, und niit kalter physiologischer K< .chsalzlosur,:

ss versetzt Solann wurden die Zellen 5 Minuten i.w SUO bis !Ov)IiI pM zentrifugiert. Die sediiiienlieriei> Carcinomzclien wurden zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in BB\S suspendiert, so daß die Zahl der Zellen 6 ■,- 10" pro

<>o Millimeter betrug. I ml dieser Suspension von Carcmomzellen wurde mit 3 ml der zu untersuchenden Suspension hämolytischer Streptococcen bzw. der BBM-I.ösung versetzt. 9() Minuten auf 37 C crwärml iiiul aiischließeiRl in einer Menge von jeweils 0.5 ml

('? iiitraperitoneal Mäusen injiziert (ddY-Slamm. durchsi inittliches Körpergewicln etwa 20gl L'iir jede (iruppe wurden fünf Mäuse verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I aimetiehen.

Tabelle

Ciruppe

III

IV

I ümol\ tische SlrepiOLiiccensiispensicin Konzentration

/ugegehene* Antibiotikum

in physiologischer Kochsalzlösung

Cephaloridin

Penieillin-G-Kalium

K)S mc ml
(0.258 Moll

1.6 χ KF E ml (0.258 Moll

Dihydrostrepiormein- < 18S mg ml
sulfat " ; 10.258 Moll

Unbehandehe Zeil- ^!

suspension in physio-

logischerKochsalz- _;

lösung
Vergleich, nur BBM ohne _:

Zcllsuspension

dimnungs faktor

ID 20 30 40 10 2(1

.ilt

40 10 20 30 10 20 30

tiherlchende Mäuse

Tage Tage

-,päter - spüler

Tage später

5 5 4

0 0 0

0 0

Tage ■.paler

Die Konzentration jedes Antibiotikums in physiologischer Kochsalzlösung wurde derart eingestellt. (laß sie einer äquirr.olaren Konzentration von Peni-Cillin-G-Kalium von 1.6 χ 1 (Γ Einheilen ml entsprach. Diese Berechnung basierte auf der Annahme, daß 1 mg Pcnicillin-G-Kalium 1667 Einheiten entspricht und 1.6 y. 1(F Einheiten pro Milliliter einer Konzentration von O.25S Mol. Die Menge Dihydrostreptom wurde als 3 2-Sulfat berechnet.

Unter Veiwendung von acht Mäusen flir Gruppe und einer hämolytischen Streptococci: = ; pension gemäß Beispiel 2 wurden die in Ta bei angegebenen Ergebnisse erhalten.

Tabelle II

in

j llamolytischc Streptocoeccnsuspcnsion

Gruppe j zugegebenes Antibiotik-im

Konzentration

in physiologischer

Kochsalzlösung

Cephaloridin

Pcnicillin-G-Kalium

Vergleich, nur BBM
ohne Zellsuspension

M)M mg ml
(0.258 Mol

1.6 χ K)⁵ F ml (0.258 Mol) Verdünnungsfaktor

20 . 40

20

40 ' 60

Cbcrlebendc Mäuse

10 20

Tage : Tage : Tage später .-.päter \ später

8 8 7 5

I 0

sp.-i,

Versuchsbeispiel 2

Die Präparate wurden folgendermaßen hergestellt: Die Bakterien wurden gemäß Beispiel 3 gezüchtet und die Zellen in BBM suspendiert.

I ml der I ösung von Cycloserin. Pcnicillin-G-Kalium oder Dihydrostreptomycinsulfal in physiologischer Kochsalzlösung wurde /u 5 ml dieser ZeIlsuspcnsion zugeben. Sodann wurden die Suspensionen 20 Minuten auf 37 C und anschließend 30 Minuten auf 45 C erwärmt. Hierauf wurden die Suspensionen mit BBM auf das 2-, 4- und Hfuchc verdünnt und sofort hinsichtlich ihrer anticarcinomatösen VV kung untersucht.

Männliehe Mäuse vom ddY-Stamm (durchschni lichcs Körpergewicht etwa 20 g) wurden intrape toneal mi! jeweils etwa K)'' Ehrlich-Ascites-Carcino zellen (aus Mäuseascites am 8. Tag nach der Bcimpfu gewonnen) sowie mit der verdünnten BBM-Lösu in einer Menge von 0.8 ml pro Maus einmal tägli über eine Zeitspanne von 5 Tagen beimpft. ProGrur wurden acht Mäuse verwendet. Nach Verabreicht! der Zcllsuspension wurde die Ubcrlcbensralc Mäuse jeder Gruppe bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle III aufgeführt.

Tabelle III

flämolytische Slrcptoeoccensuspensiou (iruppe zugegebenes Antibiotikum

I Cycloserin

II Pcnicillin-G-Kalium

III Dihydrostreptomvein-
; sulfat

IV Vergleich, nur BBM ohne

Zellsuspension

Konzentralion

in physiologischer

Kochsalzlösung

26.4 mg ml
(0.258 Mol)

1.6 χ 10' E ml (0.258 Mol)

188 mc ml
(0.258 Mol)

■ ■ — —■ r~

V er- 10

ilünniings- Tage

faktor i spüler

- f
ι

κ 4
x8
x4
x8
χ 4
< X

t'berlebemle Mäuse

2(1
lage

30

Tage
spüler

0
0
0

I age
spüler

Die Konzentration jeder Substanz in physiologischer Kochsalzlösung wurde derart eingestellt, daß sieeinerüquimolaren Konzentration von 1.6 ■ KFF: ml Penicillin-G-Kalium entsprach.

Die Berechnung beruhte auf der Annahme, daß 1 mg Penicillin-G-Kalium 1667 Einheiten und 1.6 ■ ICK E ml einer Menge von 0.258 Mol entsprachen. Das Dihvdrostreptomyeinsulfat wurde auf 3 2-Sulfat berechnet.

Versuchsbeispiel 3

Versii'jhsbeispiel 2 wurde wiederholt, die Konzentration von Cycloserin in physiologischer Kochsalzlösung jedoch auf 26.4 ms ml und die Konzentration von Peneillin-G-Kalium in physiologischer Kochsalzlösung auf die gleiche Gowichlskonzentration eingestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV angegeben.

	Hämolytischc zugegebenes Antibiotikum	Tabelle IV	Ver- dünnungs- faklor ι	Kl Tage später	C berlebcnde :o Tage j später ι	Mäuse 30 Tage später	50 Tage später
C iruppe	Cycloserin ; Penicillin-G-Kalium ^; Vergleich, nur BBM ohne i Zellsuspension ;	Strcptococcensuspension Konzentration in physiologischer Kochsalzlösung	i x4 ι x8 ι x4 ! χ 8 : I	OC OC OC OC OC	8 i 7 3 j T j — i 0 i j	8 5 '■ 0 ⁿ i	8 5 I 0 0
I II IH	26.4 me ml (0.258 Mol) 4.4 χ ΙΟ⁴ Ε ml (= 26.4 mg ml)

Versuchsbeispiel 4

1 ml einer Zellsusponsion von Streptococcus hemolyticus. Stamm Su. ATCC Nr. 21 060 (fast avirulenter Stamm ι in BBM. die gemäß Beispiel 1 erhalten wurde, wurde mit jeweils 0.2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung von Cephaloridin bzw. Penicillin-G-Kalium versetzt und 20 Minuten auf 37" C und hierauf 30 Minuten auf 45 C erwärmt. 0.1 ml dieser vorbehandelten Lösung wurde subkutan in den Rücken von Mäusen (ddY-Stamm. Durchschnittskörpergewicht etwa 20 g) injiziert und die Mortalität nach 24 Stunden bestimmt. Für jeden Versuch wurden !0 Mäuse verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle V anaeaeben. ^⁰

Tabelle V

Zugegebenes Antibiotikum

Cephaloridin

Penicillin-G-Kalium
Ohne

Mortalität.'

80

6s Versuchsbeispiel 5
(Toxizitätsversuch)

1 ml einer Zellsuspension von Streptococcus hemolyticus. Stamm Su. ATCC Nr. 21 060 (fast avirulenter Stamm) in BBM. die gemäß Beispiel 3 erhalten wurde, wurde mit 0.2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung von Cycloserin oder Penicillin-G-Kalium der im Beispiel 2 verwendeten Konzentration versetzt und 20 Minuten auf 37 C und anschließend weitere 30 Minuten auf 45 C erhitzt. 0.1 ml dieser vorbehandeln Lösung wurde intraperitoneal in Mäuse injiziert (ddY-Stamm. Durchschnittskörpergewicht etwa 20 g) und die Mortalität nach 7 Tagen bestimmt. Für jeden Versuch wurden zehn Mäuse verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI angegeben.

Tabelle VI

Zugegebenes Antibiotikum ! Mortalität. %

Cycloserin ι 0

Penicillin-G-Kalium j 0

Ohne I 80

109 550/464

Versiielisbeispicl 6

1 ml einer S % ige η Lösung von Natriumriboiuicleat in HBM wurde zu I ml einer vorbehandelten ZellsuspensK;-.. gegeben, die gemäß Versuchsbeispiel 4 erhalten worden war. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei J7 C" inkiibicrt. sodann zentrifugiert und die hämolylischc Aktivität der überstehenden Flüssigkeit unter Verwendung von roten Blutkörperchen von Kaninchen in üblicher Weise bestimmt. Die Ergebnisse sind In Tabelle¹ VII angegeben.

Tabelle VII

/ugepehcncs Antibiotikum

Cephaloridin

!Penieillin-G-Kalium . . .
Ohne

Hi

für Strcpi"l\<in-S

< 1 (Hämolyse-Ein-

heiten mil

< I (Hämolyse-Ein-

heiten mil

2260(Flämolyse-Einheiten mil

Versuchsbeispiel 7

Hemmung des Wachstums von Ratten-Ascites-Hepatomzellen AH 13
al Herstellung der Arzneipräparate PCB-45.

CEB-45 und CYB-45

Die Streptococcenzellen wurden in einer Menge von 10'' Zellen/ml in BBM suspendiert, das entweder 27(XX) I. E. Penicillin-G-Kalium ml BBM (PCB) oder 0.043 Mol Cephaloridin ml BBM (CEB) oder 0.043 Mol Cycloserin BBM (CYB) enthielt. Die Zellsuspension wurde 20 Minuten auf 37 C und hierauf 30 Minuten auf 45 C erwärmt.

Danach wurden die Präparate mit BBM so verdünnt, daß eine Mischung erhalten wurde, die 10 KEmI enthielt. 1 KE*"= I klinische Einheit = 0.1 mg getrocknete Bakterienzellen.

b) Methode des Experiments

Ratten (Stamm: DONRYU) erhielten durch intraperitoneale Injektion Ratten-Ascites-Hepatomzellen AH-13 (10" Zellen/Tier).

Gruppen zu je 10 Tieren wurden behandelt mit 100 KE Tier der verdünnten Präparate PCB-45. CEB-45 und CYB-45. Ferner erhielten Gruppen zu je 10 Tieren nur BBM mit Penicilltn-G-Kalium. BBM mit Cephaloridin bzw. BBM mit Cycloserin. Die Tiere erhielten 10 Tage lang täglich eine i. p.-Injektion. Die Behandlung wurde 72 Stunden nach der Inokulation der Tumorzellen begonnen. Bis zu 60 Tagen nach der Inokulation wurde die Zahl der überlebenden Tiere relativ zur Zahl der behandelten Tiere festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII

aneeeeben. _ , „ ,,„,

Tabelle VIII

45

Präparat

Cberlebensrate nach Tagen
10 ^; :0 . 30 40 .50 . 60

PCB-45 ! 10 I 10

CEB-45 j 10 MO

CYB-45 MO MO

BBM + Penicillin ■ 5 ; 0

BBM + Cephaloridin ] 5 : 0

BBM + Cycloserin ... 5 i 0

10 .	ίο :	10	10
10 ;	10 ;	ίο !	10
10	10 !	10	10

VerMichsbeispiel H

Hemmung des Wachstums von Ratten-Ascites-Hepatom/ellen ΛΙΙ-Ι 3

Das Experiment wurde in gleicher Weise durchgeführt wie Versuchjbeispiel I. jedoch wurden die verdünnten Präparate PCD-4.\ ChB-45 und CYB-4^ intravenös injiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX ankeuchen.

Tabelle IX

Präparat

rbcrlebin-rate nach l'agen IO :<l 3(1 40 9) W

PCB-45 9 " 7 5 5 5

CEB-45 9 X S 6 (> (y

CYB-45 9 h 5 4 4 4

BBM - Penicillin 5 0

20

BBM +- Cephaloridin 5 <)

BBM - Cycloserin ... 5 0

Versuchsbeispiel 9

Hemmung des Wachstums von Ratten-Ascites-Hepatomzellen AH 414

Das Experiment wurde in gleicher Weise durch geführt wie Versuchsbeispiel 7. jedoch wurden dii genannten Hepatomzellen verwendet. Die Ergebnisst sind in Tabelle X angegeben.

Tabelle X

,c Cherlehensralc nach Tauen

^J3 Präparat

10 .'" 30 40 50 60

PCB-45 10 : K) S S ■ S S

CEB-45 10 ' 10 S) ; 9 9 9

CYB-45 10 9 7 7 7 7

BBM - Penicillin .... K) _: 3 0 _:

BBM -"- Cephaloridin 10 3 0 ; ■ ■

BBM + Cycloserin ... 1010'

Versuchsbeispiel 10

Hemmuna des Wachstums von Ratten-Ascites-■N'oshida-Sarkomzellen (eines gegen N-Lost-N-oxic resistenten Stamms)

Das Experiment wurde in gleicher Weise durc iiefijhrt wie Versuchsbeispiel 7. jedoch wurden c genannten Yoshida-Sarkomzellen verwendet. Die E gebnisse sind in Tabelle XI angegeben.

Tabelle XI

Cberlebensrate nach Tagen Präparat

10 :0 30 ,40 5Of

PCB-45 10 10

CEB-45 MO : 10

CYB-45 MO 9

BBM + Penicillin 10 0

BBM -f Cephaloridin 10 ! 0

BBM - Cycloserin ... 90

9 : 9

7 7

Vcrsuchsbcispicl 11
Klinische Versuche mit CYB-45

Eine Zellsuspension von Streptococcus hemolyticus in BBM. die 0.043 Mol Cycloserin enthält, wurde 20 Minuten auf 37 C und 30 Minuten auf 45 C erteärml. Das erhaltene Präparat CYB-45 wurde zur Behandlung eines Retieulosarkoms bei einem 73 Jahre tollen Mann verwendet. Ein fingerspitzengroites Finnin (knolliger Auswuchs) wurde am linken Unterkiefer (beobachtet.

Nach etwa 6 Monaten wurde eine Probeexcision durchgeführt und pathohistologisch untersucht. !Diagnose Rcticulosarkom. Im 7. Monat wurde der Patient in die Klinik eingeliefert. Bei der Unter-

suclumg wurden drei harte Knollen von Bohnengröf.le an beiden Seiten des Unterkiefers sowie ein Knollen von Daumengroße an der linken Seile des Halses festgestellt.

CYB-45 wurde intravenös 4 mal in einer (iesamldosisvon K)KE(I KE = 1 klinische Einheit -- 0.1 mg getrocknete Baklerienzclleni verabreicht, und zwar am 11. Tag I KE. am IS. Tag 3 KH. am 25. Tag 3 KE und am 34. Tag 3 KH.

2 Stunden nach jeder Injektion bekam der Patient kurzzeitig Fieber (bis etwa V-) C). /um Zeitpunkt der 4. Injektion hatte sich der Knollen auf kleine Fingerspit/engröße zurückgebildcl. Der Patient hatte 3 kg zugenommen, sein Appetit und Allgemeinzustand sich wesentlich gebessert. Nach 2' , Mnnaten wurde der Patient entlassen.

Versuchsbeispiel 12

Männliche Mäuse vom ddY-Slamm (durchschnittliches Körpergewicht etwa 20 g) wurden intraperitoneal mit jeweils etwa Kf Ehrlich-Ascites-Carcinomzellen (aus Miiuseascites am 8. Tag nach der Beimpfung gewonnen) sowie mit jeweils 0.1 ml pro Maus der im Beispiel 5 erhaltenen Zellensuspensionen in BBM einmal täglich über eine Zeitspanne vor 5 Tagen beimpft. Pro Gruppe wurden acht Müusi verwendet. Nach Verabreichung der Zellensuspensior wurde die Uherlcbensrate der Mäuse jeder G nipp« bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen Xl bis XV aufgeführt.

Tabelle XII Streptococcus hemolyticus Sv (ATCC Nr. 21 059): Absorption bei 660 nm 7.90

Gruppe

II
III
IV

Streptoeoecensuspension überlebende Mäuse

zugegebenes Antibiotikum

Konzentration

in physiologischer

Kochsalzlösung

Cycloserin

Cephaloridin

Penicillin-G-Kaliumsalz

Vergleich (nur BBM ohne
Zellen)

26.4 mg ml
(0.258 Mol)

108 mc ml
(0.258 Mol)

1.6 χ 10⁵E ml (0.258 Mol)

; Ver- " IO

j dünnungs- Tage
! faktor J später

4
8
4
8
4

lage
später

7
6
8
7
7
3
0

30

Tage später

5 8 5

50

Tage später

Tabelle XIII Streptococcus hemolyticus C-203 S (ATCC Nr. 21 546): Absorption bei 660 nm 5.00

	Streptococcensuspension	Konzentration in physiologischer Kochsalzlösung	. Ver dünnungs- faktor	I i	10 Tage später	überlebende Mäuse	30 Tage später	50 Tage später
Gruppe	zugegebenes Antibiotikum	26.4 ma ml (0.25*8 MoI)	4 i 8 !		8 8	Tage später	4 3	4 3
I	Cycloserin	108 mg ml (0.258 Mol)	4 ! 8 !	OO OO	6	5	\
!I	Cephaloridin	1.6 χ ΙΟ⁵ Ε ml (0.258 Mol)	-t OO	OO OO	7	3	4 2
III	Penicillin-G-Kaliumsalz	—	'■ ι j	6 4	0	0
IV	Vergleich (nur BBM ohne Zellen).		υ

C'iriippc

Ϊ3 14

ir

Tabelle XIV Streptococcus hemolvticus Blackmore (ATCC Nr. 21 548). Absorption bei 660'im 8.60

zugegebenes Antibiotikum

Cycloserin Cephaloridin

Pcnicillin-G-Kaliumsal/

Vergleich (nur BBM ohne Zellen)

ccensiispension	Ver-	10	überlebende	Mäuse	50
Konzentration	diinnungs-	Tage	20	.10	!age
in physiologischer	faktor	>päler	Tage	Tage	später
Kochsalzlösung	4	8	später ,	später	5
26.4 mg ml	: 8	8	6	6	3
(0.258 Mol)	4	8		4	6
108 mg ml	8	8	5	6	4
(O.25H Mol)	4	8	7	4	5
1.6 χ ΙΟ⁵ Ε ml	8	8	6	5	3
(0.258 Mol)		8	6	3	0
			0

5 !
0

Gruppe

Tabelle XV Streptococcus hemolvticus ATCC Nr. 12 202. Absorption bei 660 nm 4.50

Streptococcensuspensi zugegebenes Antibiotikum

Konzentration

in physiologischer

Kochsalzlösung

Cycloserin 26.4 me. ml

(0.258 Mol) Cephaloridin | 108 mg ml

j (0.258 Mol) Penicillin-G-Kaliumsalz j 1.6 χ ΙΟ⁵ Ε ml

I (0.258 MoI) Vergleich (nur BBM ohne j Verdünnung·
faktor

4
8
4

Zellen) in

lage später

8 8 8 8 S 8 8

überlebende Mäuse

^päler

Tage

später

Tage später

Claims

Patentansprüche:

I. Verfahren zur Herstellung von Präparaten hämolytischer Streptococcen zur unterstützenden Behandlung von Carcinomerkrankungen durch Behandlung einer Suspension lebender Zellen hämolytischer Streptococcenwirkung mit einem Antibiotikum und kurzzeitiges zweistufiges Erwärmen auf Temperaturen von 37 bzw. 45 C. dadurch gekennzeichnet, daß man als so Antibiotikum Cephalosporin C oder Cycloserin verwendet und in der ersten Stufe 20 bis 60 Minuten auf 30 bis 38 C und in der zweiten Stufe 20 bis Minuten auf 38 bis 50 C erwärmt.
2. Verfahren nach Anspruch I. dadurch gekennzeichnet, daß man als hämolvtische Streptococcen Streptococcus hemolwicus ATCC Nr. 21 verwendet.

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