AT206582B

AT206582B - Verfahren zur biosynthetischen Herstellung des neuen O-Diazoacetyl-1-serins

Info

Publication number: AT206582B
Application number: AT408654A
Authority: AT
Original assignee: Parke Davis & Co
Priority date: 1953-05-02
Filing date: 1953-05-02
Publication date: 1959-12-10

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Verfahren zur biosynthetischen Herstellung des neuen   O-Diazoacetyl-l-serins   
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur biosynthetischen Herstellung des neuen   O-Diazo-   acetyl-l-serins (Azaserin), welches besondere therapeutische Eigenschaften besitzt. Die Verbindung enthält nur die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff und besitzt die empirische Formel   C H NO.   Sie hat ein Molekulargewicht von 173,1 und kann durch die Strukturformel 
 EMI1.1 
 
 EMI1.2 
 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 ringe Absorption beobachtet. Dies ist wahrscheinlich auf die Zersetzung des Produktes unter sauren Bedingungen   zurückzutühren.   
 EMI2.1 
 
Erdalkalihydroxyden,-carbonaten,-bicarbonaten,0-Diazoacetyl-l-serin bildethellgelbgrünliche Kristalle wahrscheinlich im rhombischen System.

   Die Kristalle sind zweiachsig mit mässiger positiver Doppelbrechung und gerader Auslösung. 
 EMI2.2 
 



     : < x= 1, 523 0, 002 ; 613. 60   und   13. 78.   



   O-Diazoacetyl-serin bzw. sine Alkali- oder Erdalkalimetallsalze üben eine Hemmungswirkung auf das Wachstum von Neoplasmen bei Tieren und Menschen aus und sind daher wertvoll für die Behandlung solcher Krankheiten bei Tier und Mensch. Das Wachstum von in Mäusen implantierten Tumorzellen wie Sarcom 180, Mecca Lymphosarcom, Ehrlich Carcinom, Walker Carcinosarcom 256   (Ratten), Lewis Sarcom   T 241, Patterson Lymphosarcom, Brust-Adenocarcinom E0771, Ratten Sarcom 39, Bashford Carcinom 63, Miyono Adenocarcinom, Miyono Brust-Adenocarcinom, Sarcom Ma 387, Gardner Lymphosarcom,Hautcarcinom, Murphy Rattenlymphosarcom und Flexner-JoblingRattencarcinom wird durch tägliche Injektionen von 0-Diazoacetyl-l-serin stark gehemmt.

   Bei der klinischen Erprobung an Menschen konnte eine Anzahl von Patienten, die an der bisher unheilbaren Hodgkin'schen Krankheit (Lymphogranulomatose) litten, durch parenterale Verabreichung von 10 mg   O-Diazoacetyl-l-serin   je kg Körpergewicht und Tag eifolgreich behandelt werden. 



   Gemäss der Erfindung wird 0-Diazoacetyl-l-serin durch ein Verfahren hergestellt, welches darin besteht, dass man einen Stamm von Streptomyces fragilis NRRL 2424 in einer sterilen   wässerige11   Nährlösung, die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen natürlicher Herkunft, vorzugsweise ölhaltiges Sojamehl, Weizenkleber, Bierhefe, Salzextrakt aus Schweinemagen, Fleischextrakt, lösliche Rückstände der Branntweinerzeugung,   Maisquellwasserkonzentrat,   insbesondere eine Mischung von ölhaltigem Sojamehl mit einem 
 EMI2.3 
 moniumsalze in einer Menge von 0, 1 bis   0, 5 % enthielt,   bei einem PH-Wert zwischen 5, 0 und 8, 5 unter aeroben Bedingungen, zweckmässig im Submersverfahren, bei einer Temperatur zwischen ungefähr   200   und 350 C solange züchtet,

   bis eine erhebliche Menge an 0-Diazoacetyl-l-serin entstanden ist und diese Substanz aus dem wässerigen Kulturfiltrat in an sich bekannter Weise, vorzugsweise mit Hilfe von Adsorptionsverfahren, isoliert. Als Mineralstoffquellen können neben Ammoniumsalzen, wie Ammoniumchlorid und Ammoniumnitrat, auch Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat   u. dgl.   verwendet werden. 



   Streptomyces fragilis ist ein bisher unbekannter Mikroorganismus, der erstmalig aus einer Bodenprobe aus Lago San Roque (Cordoba) Argentinien gewonnen und in üblicher Weise reingezüchtet wurde. 



   In der Reinkultur auf einem   Nährboden, der 1, 0 % Dextrose. 0, 5 %   Pepton (Tryptonart),   0,   05 % Di- 
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 luPigment. Streptomyces fragilis besitzt die folgenden mikroskopischen Charakteristiken : Das feuchte pri-   märe   Mycel ist glasklar und verzweigt. Das sekundäre Luftmycel ist verzweigt ; primäre, sekundäre und manchmal tertiäre Verzweigungen treten auf und können abwechselnd entgegengesetzt gerichtet und gelegentlich lockenförmig sein. Das Luftmycel ist kurz, gerade oder schwach gebogen und bildet gelegentlich Endschleifen oder Spiralen, deren Enden sich in Konidienketten von 8 bis 20 Mikron Länge unterteilen.

   Die Konidien sind glasklar, kugel- bis eiförmig, mit einem mittleren Durchmesser von   1, 2 m p   (im Bereich von 0, 8 bis   1, 5 m u)   und einer mittleren Länge von 1,5 m 11 (im Bereich von   1, 2   bis   2, 0 m/l).    



   Streptomyces fragilis   verflüssigt   Gelatine langsam ohne Pigmentbildung und peptisiert Lackmusmilch langsam, gewöhnlich unter geringer Änderung des pH-Wertes. Der Mikroorganismus verwertet gut   1-Ara-   

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 EMI3.1 
 hydrat,   0, 00079 % Manganchlorid-Tetrahydrat, 0, 00015   % Zinksulfat-Pentahydrat und   1, 5 % Agar 3'1t-   hält. 



   Eine Kultur von Streptomyces fragilis wird in der Dauersammlung des Parke, Davis & Company, Culture Bureau,Detroit,Michigan, unter der Nr.04926 und in der Fermentationsabteilung des Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois unter der   Nr. NRRL2424   aufbewahrt. 



   Die folgende Tabelle gibt einen Vergleich der kulturellen Eigenschaften von Streptomyces fragilis und von bekannten, Antibiotika erzeugenden Streptomycetenstämmen auf Agarnährböden der oben genannten Zusammensetzung : 

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 Tabelle 1 
 EMI4.1 
 
<tb> 
<tb> Streptomyces <SEP> Antobiotikum <SEP> Form <SEP> des <SEP> Luftmycels <SEP> Farbe <SEP> von <SEP> Luftmycel <SEP> Farbe <SEP> der <SEP> Rückseite <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> Art <SEP> und <SEP> S <SEP> ren <SEP> der <SEP> Kultur <SEP> 
<tb> Fragilis <SEP> 0-Diazoacetyl-kurz, <SEP> gerade <SEP> bis <SEP> weiss-hellrosa- <SEP> farblos-gelb- <SEP> kein
<tb> l-serin <SEP> schwach <SEP> gewellt,

   <SEP> lohfarben <SEP> lohfarben
<tb> manchmal <SEP> Schleifen
<tb> hod <SEP> spirales <SEP> 
<tb> Antibiotikus <SEP> Aktiuomycin <SEP> gerade <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> grau <SEP> schwarz <SEP> schwarz
<tb> Aureofaciens <SEP> Aureomycin <SEP> gerade <SEP> bis <SEP> leicht
<tb> gewellt <SEP> weiss-grau <SEP> gelb-lohgelb <SEP> kein
<tb> Floridae <SEP> Viomycin <SEP> gerade <SEP> bis <SEP> leicht <SEP> weiss-lavendel
<tb> gewellt <SEP> graugrün <SEP> purpurrot <SEP> kein
<tb> Fr <SEP> adiae <SEP> Neomycin <SEP> gerade,

   <SEP> manchmal <SEP> weiss-seemuschel- <SEP> farblos-gelb
<tb> Fradicin <SEP> Schleifen <SEP> und <SEP> Spiralen <SEP> rosa <SEP> lohgelb <SEP> kein
<tb> Grisens <SEP> Streptomycin <SEP> gerade-leicht <SEP> weiss-hellrosa- <SEP> farblos-hellbraunAktidion <SEP> gewellt <SEP> hellgrau-grün <SEP> lavendel <SEP> kein
<tb> Griseus <SEP> Grisein <SEP> gerade-leicht <SEP> weiss-hellrosa-farblos- <SEP> 
<tb> gewellt <SEP> hellgrau-grün <SEP> lohgelb <SEP> kein
<tb> Streptothrizin <SEP> gerade, <SEP> manchmal <SEP> 
<tb> Lavendulae <SEP> Lavendulin <SEP> Schleifen <SEP> und <SEP> weiss-rosa-schwarz <SEP> schwarz
<tb> Streptolin <SEP> Spiralen <SEP> lavendel
<tb> Rimosus <SEP> Terramycin <SEP> Spiralen <SEP> weiss <SEP> gelb <SEP> kein
<tb> Sp.

   <SEP> A <SEP> 105 <SEP> Akdnorubia <SEP> Spit.den <SEP> weiss-rosagrau <SEP> rosa-roi <SEP> kein
<tb> Verezuelae <SEP> Chloramphenicol <SEP> getade <SEP> weiss-grau <SEP> schwarz <SEP> schwarz
<tb> 
 Die folgende Tabelle gibt einen   Überblick   über die Kohlehydratverwertung der in Tabelle 1 genannten   Streptomycetenstamme.   

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  Tabelle II 
 EMI5.1 
 
 EMI5.2 
 
<tb> 
<tb> Strephtomyces <SEP> 1-Ara- <SEP> Dul- <SEP> d-Fruk- <SEP> d-Galak- <SEP> i-Inosit <SEP> Inulin <SEP> Laktose <SEP> Maltose <SEP> d-Mannit <SEP> Raffi-Rham-d-Sorbit <SEP> Saccha-d-Xylose <SEP> 
<tb> Arten <SEP> binose <SEP> cit <SEP> tose <SEP> tose <SEP> nose <SEP> nose <SEP> rose
<tb> Str. <SEP> fragilis <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> +++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> schw. <SEP> + <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> +++
<tb> Str. <SEP> antibioticus <SEP> + <SEP> 0 <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> +++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> ++
<tb> Str. <SEP> aureofaciens <SEP> +++ <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> ++
<tb> Str.

   <SEP> florida <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> +bis <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> ++++
<tb> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<tb> Str. <SEP> fradiae <SEP> t-+++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> schw.+ <SEP> ++ <SEP> bis <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> +++
<tb> + <SEP> + <SEP> bis <SEP> + <SEP> +++ <SEP> schw. <SEP> + <SEP> 
<tb> Str. <SEP> griseus <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> ++++
<tb> schw. <SEP> + <SEP> schw. <SEP> + <SEP> +++ <SEP> schw. <SEP> + <SEP> schw. <SEP> +
<tb> Str.

   <SEP> griseus <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> ++++
<tb> schw. <SEP> + <SEP> +++ <SEP> schw. <SEP> + <SEP> schw. <SEP> +
<tb> Str. <SEP> lavendulae <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> 0 <SEP> 0bis <SEP> schw.+ <SEP> 0 <SEP> Obis <SEP> Obis <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> 
<tb> ++++ <SEP> ++++ <SEP> bis <SEP> schw. <SEP> + <SEP> +++ <SEP> + <SEP> ++++ <SEP> 
<tb> ++++
<tb> Str. <SEP> rimosus <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> +bis <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> schw,'1-
<tb> +++bis+
<tb> Sp.

   <SEP> A105 <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> +++ <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> bis <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> schw. <SEP> +
<tb> Str. <SEP> venezuelae <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> + <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> ++++
<tb> 
 0 = kein Wachstum, + = schlechtes Wachstum, ++ = einiges Wachstum, +++ = gutes Wachstum,   -     =   sehr kräftiges Wachstum 

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 EMI6.1 
 der folgenden Tabelle zusammengestellt :

   
 EMI6.2 
 
<tb> 
<tb> Streptomyces
<tb> Eigenschaft <SEP> fragilis <SEP> fradiae
<tb> Lange <SEP> der <SEP> Sproenketten
<tb> (üblicher <SEP> Bereich) <SEP> 8- <SEP> 20 <SEP> m <SEP> t <SEP> 25-70 <SEP> m <SEP> 
<tb> Sporengrösse <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 1,5 <SEP> m  <SEP> 0,8 <SEP> x <SEP> 1,4 <SEP> m 
<tb> (Mittel)
<tb> Farbe <SEP> der <SEP> Sporen <SEP> hellrosa <SEP> bis <SEP> loh- <SEP> seemuschelrosa
<tb> farben
<tb> Erzeugte <SEP> Wirkstoffe <SEP> O-Diazoacetyl- <SEP> Neomyein, <SEP> Fradicin
<tb> 1-serin
<tb> 
 
 EMI6.3 
 Streptomyces fragilis vorteilhafter. 



   Die Ernährungsbedingunen von Streptomyces fragilis sind nicht genauer bekannt, jedoch kann auf Grund umfangreicher Versuche angenommen werden, dass die oben angeführten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen gewisse Wirkstoffe oder Wirkstoffkombinationen enthalten, die zur Bildung von O-Diazo- 
 EMI6.4 
 
 EMI6.5 
 
<tb> 
<tb> wie <SEP> :Glucose <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> Glucose <SEP> 1,0%
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> NatriumchlorM <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> 
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0,1% <SEP> Calciumcarbonat <SEP> 0,3%
<tb> Kasein <SEP> oder <SEP> säurehydro- <SEP> Entbitterte <SEP> Speziallysiertes <SEP> Kasein <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> hefe <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> od' <SEP> :

   <SEP> r <SEP> 1, <SEP> 5'7o <SEP> 
<tb> Glucose <SEP> 1, <SEP> 0% <SEP> Glucose <SEP> 1, <SEP> 0% <SEP> 
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0,5% <SEP> Ammoniumchlorid <SEP> 0,2%
<tb> Caleiumcarbonat <SEP> 0,1% <SEP> Natriumchlorid <SEP> 0,5%
<tb> Milcheiweiss <SEP> 0.5, <SEP> 1,0 <SEP> Calciumcarbonat <SEP> 0,1%
<tb> oder <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Sojabohnenpepton <SEP> 1. <SEP> 0 <SEP> oder <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> ja <SEP> 
<tb> 
 bieten zwar günstige Wachstumsbedingungen für Streptomyces fragilis, aus unbekannten Gründen ist aber der Mikroorganismus in diesen Nährmedien nicht imstande,das gewünschte O-Diazoacetyl-1-serin zu bilden. Die Auswahl geeigneter   Nährlösungen   ist daher für das erfindungsgemässe Verfahren wesentlich. 



   Die zur Erzielung maximaler Ausbeute von   0-Diazoacetyl-I-serin   erforderliche Gärdauer schwankt   je nach der Grösse und der Art der verwendeten Einrichtung, bei technischen Gärungen in grossem Massstabe, unter submcrsen Bedingungen beträgt die optimale Gärdauer ungefahr 32h beim Oberf1áchenverfah-   ren und bei der laboratoriumsmässigen Kultur in Schüttelflaschen ungefähr 3 - 8 Tage. Die Durchführung des Verfahrens erfolgt in den bei der Gewinnung der Antibiotika gebräuchlichen Einrichtungen. 



   Nach Beendigung der Gärung wird das Mycel aus der   Kulturflüssigkeit,     z. B.   durch Filtration oder Zentrifugierung   usw.,   entfernt, und das O-Diazoacetyl-serin aus dem Kulturfiltrat isoliert. Diese Isolierung kann zweckmässig durch Einengen des Filtrates auf ein kleines Volumen,   z. B. 1/5-1/20   des ursprilnglichen Volumens und Zusatz der drei- bis zehnfachen Volumsmenge eines mit Wasser mischbaren 
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 propyläther, und Abtrennen der ausgefällten Verunreinigungen aus der Lösung, erfolgen.

   Mit gleichem Erfolg kann man die   geklärteKulturflüssigkeit   zur Trockne eindampfen und den trockenen Rückstand mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, das weniger als 50 % Wasser enthält, extrahier- 
 EMI7.1 
 schen Lösungsmittels mit mehr als 50 % Wasser eluiert. Nach Entfernung des Lösungsmittels, zweckmässig durch Gefriertrocknung, gewinnt man aus dem Eluat ein feines Pulver, das bis zu 25   Gel.-% 0-     Diazoacetyl-l-serin   enthält. 



   Das so gewonnene Pulver wird vorzugsweise in soviel Wasser gelöst, dass eine Lösung mit   3-30   mg O-Diazoacetyl-l-serin je cm3 entsteht, die Lösung auf 6,   5-7, 0 eingestellt   und durch eine Adsorptionssäule mit Aktivkohle geleitet. Die zur Adsorption des gesamten   O-Diazoacetyl-l-serins   aus der Lösung erforderliche Menge Aktivkohle   hängt vom   Gehalt des Rohproduktes an Reinsubstanz ab   ; z. B.   erfordert ein Rohmaterial, das 6 % O-Diazoacetyl-l-serin enthält, ungefähr 4 g Aktivkohle je g, während ein Material mit 12 %   O-Diazoacetyl-l-serin   etwa   5-6   g Aktivkohle je g erfordert. Die besten Ergebnisse werden erhalten, wenn die Aktivkohle mit Kieselgur vermischt wird, der als Filterhilfe dient.

   Nach dem Durchgang der Rohlösung durch die Adsorptionssäule, wird mit einer dem Retentions-Volumen der Säule (Flüssigkeitsmenge, die von der Säule zurückgehalten wird) entsprechenden Menge Wasser gewaschen und das adsorbierte O-Diazoacetyl-serin mit einem Gemisch von Wasser mit   1 - 25   % eines mit Wasser mischbaren organischen   Lösungsmittels,   wie Aceton, Methanol, Äthanol oder Methyläthylketon eluiert. Das Eluat wird soweit eingeengt, dass die Lösung ungefähr   30 - 80   mg der Reinsubstanz je   cm3   enthält   und'das O-Diazoacetyl-l-serin durch   Zusatz eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, wie absoluten   Äthanol,   Aceton oder Isopropanol, gefällt.

   Das Gemisch wird bis zur vollständigen Lösung des Niederschlages erwärmt und dann abgekühlt, worauf O-Diazoacetyl-l-serin in fast reinem Zustande auskristallisiert. Falls gewünscht, kann die Substanz durch Umkristallisation aus einem Gemisch aus Wasser, Pyridin und Äthanol weiter gereinigt werden. Das Produkt ist identisch mit der durch chemische Synthese hergestellten Verbindung. 



   In den folgendenBeispielen wird im einzelnen die Herstellung von 0-Diazoacetyl-l-serin auf mikrobiologisch-synthetischem Wege erläutert. 



   Beispiel 1: 37.81 einer Nährlösung mit der folgenden Zusammensetzung: 
 EMI7.2 
 
<tb> 
<tb> Glucose <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 0/0 <SEP> 
<tb> ölhaltiges <SEP> Sojabohnenmehl <SEP> 1, <SEP> 00/0 <SEP> 
<tb> säurehydrolysiertes <SEP> Kasein <SEP> 0. <SEP> 5%
<tb> entbitterteHefe <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP> 
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> Wasser <SEP> bis <SEP> auf <SEP> 100 <SEP> 0/0
<tb> 
 werden in einem Gärgefäss aus rostfreiem Stahl von ungefähr   113,   41 Inhalt auf PH 7, 5 eingestellt, mit   0. 1 % Calciumcarbonat   versetzt und durch halbstündiges Erhitzen auf 1210 sterilisiert, wonach der   pH-   Wert des Nährmediums 6, 85 beträgt. Das abgekühlte Nährmedium wird mit einer Sporensuspension aus 
 EMI7.3 
 und Minute bebrütet.

   Die so erhaltene Vorkultur wird zum Beimpfen der Hauptkultur verwendet. 557   l   eines Mediums folgender Zusammensetzung : 
 EMI7.4 
 
<tb> 
<tb> Glucose <SEP> 1, <SEP> 0%
<tb> ölhaltiges <SEP> Sojabohnenmehl <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> 
<tb> säurehydrolysiertes <SEP> Kasein <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> entbitterte <SEP> Hefe <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb> Ammoniumnitrat <SEP> 0, <SEP> 25% <SEP> 
<tb> Wasser <SEP> auf <SEP> 100 <SEP> %
<tb> 
 
 EMI7.5 
 aufprr 7. 5eingestelltunddanachmit0, l% Calciumcarbonatversetzt, werdenin einemLuftzufuhr mit einer Geschwindigkeit von   1.

   5   Volumina Luft je Volumen Nährmedium und je Minute kultiviert, wobei die Brühe in den ersten 12 Stunden mit einer Geschwindigkeit von 150 Umdr/min und 

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 in den letzten 32 Stunden mit 300 Umdr/min gerührt wird und ungefähr   5,'j7 l   eines sterilisierten Gemisches aus rohem Schweineschmalz und Mineralölen mit einem Gehalt an   Mono-und   Diglyceriden zur Verhinderung des Schäumens zugefügt werden. 



   Je   0, 5 cm*   einer am Ende der Kulturperiode entnommenen und filtrierten Probe, zweimal täglich durch 7 Tage intraperitoneal appliziert, enthalten hinreichend   0-Diazoacetyl-1-serin,   um bei.   Mauser   das Wachstum von implantierten Sarcom-180-Zellen soweit herabzusetzen, dass es weniger als 25 % im Vergleich zu nichtbehandelten Mäusen beträgt. 



   NachBeendigung der Gärung wird die Brühe filtriert und der Filterkuchen mit Wasser gewaschen. Die mit den Waschwässern vereinigten Filtrate (ungefähr 4161) werden mit 2079 g Aktivkohle eine Stunde gerührt. 



  Die Kohle wird abfiltriert und der Filterkuchen mit entionisiertem Wasser gewaschen. Die vereinigten Filtrate (ungefähr 514 I) werden im Vakuum auf ein Volumen von ungefähr 76 1 eingedampft. Dann wird zum Konzentrat ungefähr die dreifache Volumsmenge Aceton unter Rühren zugegeben, die Fällung abfiltriert und der Filterkuchen mit 75 %igem wässerigen Aceton gewaschen. Die vereinigten Filtrate und Waschwässer werden im Vakuum auf ein Volumen von ungefähr 74   l   eingedampft und der Gefriertrocknung unterworfen. Wird eine wässerige Lösung des so erhaltenen trockenen Pulvers Mäusen intraperitoneal zweimal täglich über 7 Tage in einer Dosis von 1000 mg Trockensubstanz je   kg/Körpergewicht   appliziert, so erhält man eine gleich grosse Hemmwirkung auf das Wachstum von   Sarcom-180-Zellen,   wie vorher beschrieben. 



   1 kg trockenes Pulver wird mit   10 l 90 Vol.-%igem   Äthanol und nachfolgend nochmals mit 2 1 des gleichen Lösungsmittels extrahiert. Die vereinigten Extrakte (ungefähr 12 l) werden mit soviel Wasser verdünnt, dass die   Alkoholkonzentration   75   Vol. -10 beträgt   und dann durch eine mit Tonerde beschickte Adsorptionssäule geleitet. 



   Zu diesem Zweck werden 3 kg Tonerde mit verdünnter Salzsäure solange gerührt, bis der pH-Wert bei   7, 7   konstant bleibt, worauf abfiltriert, mit Wasser gewaschen und durch 4-stündiges Erhitzen auf 2000 C aktiviert wird. Die Tonerde wird dann mit 75 %igem wasserhaltigem Äthanol gewaschen und in eine Adsorptionssäule von ungefähr 10 cm Durchmesser gefüllt. Das Gesamtvolumen der Füllung beträgt angenähert 3500   cm\  
Die alkoholische Lösung wird der Adsorptionssäule mit einer Geschwindigkeit von 6   l   je Stunde zugeführt und das therapeutisch unwirksame Perkolat verworfen. Die Säule wird mit 35   l 75 Vol.-tigern   Äthanol und   scnliesslich   mit   211 50 % gem   Äthanol gewaschen. Die Waschwässer werden verworfen.

   In der letzten Waschlösung ist eine geringe Menge von Wirkstoff nachweisbar. Nach dem Auswaschen wird das adsorbierte O-Diazoacetyl-1-serin aus der Adsorptionssäule mit 17, 5 1 destilliertem Wasser aus der Säule eluiert, Das wässerige Eluat wird konzentriert und der Gefriertrocknung unterworfen. Eine wässerige Lösung der so erhaltenen Pulvers zeigt bei dem Standard   Mäusetest     gegen Sarcom   180 einen Gehalt an   5, 8 % 0-Diazoacetyl-l-serin.   



   Zur weiteren Reinigung werden 500 g des Rohmaterials mit   5, 8 % O-Diazoacetyi-l-serin   in 1320 1 Wasser gelöst und an einer Säule aus Aktivkohle chromatographiert. Hiezu wird eine breiige Suspension von 2 kg Aktivkohle (Darko-G-60) und 2 kg Kieselgur in Wasser vom PH   = 5,'2 bis 5, 5 in   eine Säule von 15 cm Durchmesser gefüllt und mehrere Stunden unter einem Überdruck von 120 cm Wasser mit Wasser gewaschen. Dann wird die Rohlösung durch die Säule mit einem Überdruck   von etwa ISO   cm (4 Fuss) Wasser durch geleitet. Hierauf werden ungefähr 9 1 Wasser und ungefähr 26 1 einer wässerigen 5 %igen Acetonlösung durchgeleitet.

   Die farblosen Fraktionen des Eluats werden verworfen, die hellgelblichgrüne Fraktion wird aufgefangen und im Vakuum konzentriert, bis eine Konzentration von 20 bis 25   mg/cm3     Trockensubstanz erreicht ist. Diese Lösung wird in gleicher Weise, wie vorher beschrieben, chromatographiert und im Vakuum konzentriert, bis ungefähr 300 cm Lösung mit einer Konzentration von   60 bis 75 mg je   cms   zurückbleiben. Nach Zusatz von wasserfreiem Alkohol (ungefähr 450   ers)   wird bis zur vollständigen Lösung mässig erwärmt und dann mehrere Stunden bei 50 C gelagert.

   Das sich in kristalliner Form abscheidende 0-Diazoacetyl-l-serin wird durch Umkristallisation aus 60 bis 70   % igem   Äthanol ge- 
 EMI8.1 
 sung der Kristalle Mäusen zweimal täglich durch 7 Tage in einer Dosis von 3, 1 mg Wirkstoff je kg Kör- pergewicht intraperitoneal verabreicht, so wird damit die gleiche Hemmungswirkung auf Sarcom-180-
Zellen, wie vorstehend beschrieben, erzielt. 



   Beispiel2 :181einerNahrlösungmitdernachfolgendenZusammeuserzung
Glucose   1,   0%   ! ölhaltiges Sojabohnenmehl 1, 0%    

 <Desc/Clms Page number 9> 

 
 EMI9.1 
 
<tb> 
<tb> entbitterte <SEP> Hefe <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> 
<tb> hydrolysiertes <SEP> Kasein <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> 
<tb> Ammoniumnitrat <SEP> 0,25%
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0,5%
<tb> Rest <SEP> Wasser <SEP> auf <SEP> 100 <SEP> %
<tb> Natriumhydroxyd <SEP> in <SEP> zur
<tb> Einstellung <SEP> des <SEP> pH-Wertes
<tb> auf <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> ausreichender <SEP> Menge <SEP> ; <SEP> 
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> %
<tb> Schweineschmalz <SEP> (Antischaummittel) <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> 
<tb> 
 werden in einem Gärgefäss aus Glas von ungefähr 30 1 Inhalt durch Erhitzen auf etwa   121 c 2 Stunden   sterilisiert.

   Der pH-Wert nach der Sterilisierung beträgt   6, 8.   Nach Abkühlung wird das Nährmedium mit 10 cm3 einer Sporensuspension aus einer 14 Tage alten   Strichkultur   auf   Moyer's   Sporenagar von Streptomyces fragilis in einer sterilen 0,01%igen Marsiller Seifenlösung beimpft. Das Kulturgemisch wird 88   Stunden unter Rühren (350 Umdr/min) und Durchleiten von Luft (Geschwindigkeit von 1, 4 Volumina je Volumen Medium je Minute) bei 270 bebrütet. Werden 0, 5 cm einer entnommenen und filtrierten Probe   in 4-facher Verdünnung Mäusen intraperitoneal zweimal   täglien über   7 Tage verabreicht, so erhält man eine gleich grosse Hemmwirkung auf das Wachstum von Sarkom-180 Zellen wie vorher beschrieben. 



   10   l   der Brühe werden unter Verwendung von 100 g Filterhilfe filtriert und der Filterkuchen mit einem 1 destilliertem Wasser gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum bei einer Temperatur von 40 C oder darunter bis auf etwa 2   l   konzentriert und der PH-Wert wird mit Natronlauge auf 7 eingestellt. Unter starkem Rühren werden 3 Volumina Aceton zugegeben, und die sich absetzende schwarze ölige Fällung abgetrennt. Die Fällung wird zweimal mit 500 cms 75   %igem   Aceton gewaschen,   die Waschflüssigkeiten mit dem überstehenden Aceton vereinigt und der pH-Wert auf 7 eingestellt. 



  Die Lösung wird im Vakuum auf ein Volumen von 1200 cm eingedampft und der Gefriertrocknung   unterworfen. Eine wässerige Lösung des erhaltenen trockenen Pulvers zeigt bei interperitonealer Anwendung bei Mäusen bei zweimal täglichen Dosen von 500 mg je kg Körpergewicht eine Hemmwirkung auf das Wachstum von   Sarcom-180-Ze1le ! l,   wie oben beschrieben.

   Das in diesem Rohprodukt enthaltene 0Diazoacetyl-1-serin kann, wie in Beispiel 1 beschrieben, isoliert werden. 
 EMI9.2 
 
 EMI9.3 
 
<tb> 
<tb> : <SEP> Etwa37, <SEP> 8 <SEP> lGlucose <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> 
<tb> ölhaltiges <SEP> Sojabohnenmehl <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> 
<tb> hydrolisiertes <SEP> Kasein <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> 
<tb> entbitterte <SEP> Hefe <SEP> 0,5%
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0/0 <SEP> 
<tb> Rest <SEP> auf <SEP> Wasser <SEP> 100'o
<tb> 6n-Natronlauge, <SEP> hinreichend
<tb> zum <SEP> Einstellen <SEP> des <SEP> PH-Wertes
<tb> auf <SEP> 7,5;
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0. <SEP> 1 <SEP> 0/0 <SEP> 
<tb> rohes <SEP> Schweineschmalz <SEP> und
<tb> Mineralölgemisch <SEP> 75 <SEP> cm
<tb> 
 
 EMI9.4 
 -Wert 6, 65Luft je Volumen Medium und Minute bebrütet. Die so erhaltene Vorkultur wird zur Beimpfung der Hauptkultur verwendet. 



   Etwa 567   l   des oben beschriebenen Mediums werden in einem Gärgefäss aus rostfreiem Stahl von un- 
 EMI9.5 
 lumina je Volumen   Nährmedium   und Minute kultiviert, wobei die Brühe in den ersten 12 Stunden mit 150 Umdr/min und in den letzten 36 Stunden mit 300 Umdr/min gerührt wird und ungefähr   7, 6 l   eines Gemisches aus rohem Schweineschmalz und Mineralöl zur Schaumverhinderung zugegeben wurden. 

 <Desc/Clms Page number 10> 

 



   Je 0, 5 cms am Ende der Kulturperiode entnommene und filtrierte Probe zweimal täglich 7 Tage hindurch an Mäuse intraperitoneal verabreicht, ergeben eine gleich   grosse Hem Wirkung   auf das Wachstum von Sarcom-180-Zellen, wie vorher beschrieben. 



   NachBeendigung der Gärung wird die Brühe filtriert und der Filterkuchen mit Wasser gewaschen. Die vereinigten Filtrate und Waschwässer (ungefähr 532   l)   werden mit Aktivkohle (Konzentration 5 g je Liter) eine Stunde gerührt. Die Kohle wird abfiltriert und der Filterkuchen mit ungefähr   56, 7 l   entionisiertem Wasser gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum auf ein Volumen von ungefähr 72   l   eingedampft. Dann wird zum Konzentrat ungefähr die dreifache Volumsmenge Aceton unter Rühren zugefügt, die Flüssigkeit von der Fällung dekantiert und die Fällung mit 75 %igem Aceton gewaschen. Die Aceton-Waschwässer werden mit der überstehenden Flüssigkeit vereinigt und im Vakuum auf ungefähr 72 1 eingeengt und der Gefriertrocknung unterworfen.

   Wird eine wässerige Lösung des so erhaltenen trockenen Pulvers an Mäuse zweimal täglich in Dosen von   1000 mg je kg Körpergewicht intraperitoneal   verabreicht, so erhält man eine gleich grosse Hemmwirkung auf das Wachstum von Sarcom-180-Zellen, wie sie oben beschrieben wurde. Das in dem rohen Pulver enthaltene O-Diazocetyl-1-serin kann nach der in Beispiel 1 beschriebenen Methode isoliert werden. 
 EMI10.1 
 
 EMI10.2 
 
<tb> 
<tb> 4 <SEP> : <SEP> JeGiucose <SEP> 1, <SEP> U <SEP> ufo <SEP> 
<tb> mit <SEP> Salz <SEP> extrahierter
<tb> Schweinemagen <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> 
<tb> Ammoniumchlorid <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> % <SEP> 
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> o/J <SEP> 
<tb> Natriumhydroxid <SEP> bis <SEP> PH <SEP> 7,5;
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 0, <SEP> 1%
<tb> 
 
 EMI10.3 
 Lösung von Marseiller Seife beimpft.

   Das Kulturgemisch wird unter Bewegung auf einem mit 160 Umdrehungen rotierenden Schüttelapparat (Durchmesser etwa 6   cm) während S6   Stunden bei 260 C bebrütet. 



   Eine wie oben hergestellte Probe des Kulturgemisches zeigt eine Hemmwirkung, die der beiden vorigen Beispielen angegebenen entspricht. 
 EMI10.4 
 130 g O-Diazoacetyl-1-serin erhalten. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur biosynthetischen Herstellung des neuen   0-Diazoacetyl-1-serins,   dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm von Streptomyces fragilis NRRL 2424 in einer sterilen wässerigen Nährlösung, die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen natürlicher Herkunft, vorzugsweise ölhaltiges Sojamehl, Weizenkleber, Bierhefe, Salzextrakt aus Schweinemagen, Fleischextrakt, lösliche Rückstände der Brannt- 
 EMI10.5 
 einem Säurehydrolysat des Caseins und entbitterter Hefe oder eine Mischung von Sojapepton mit einem Salzextrakt aus Schweinemagen bzw.

   eine Mischung von ölhaltigem Sojamehl mit einem Säurehydrolysat des Caseins in einer Menge von vorzugsweise 1, 5 bis 2 % und Mineralstoffquelien, insbesondere Ammoniumsalze in einer Menge von 0, 1 bis   0, 5 % enthält,   bei einem pH-Wert zwischen 5, 0 und 8, 5 unter aeroben Bedingungen, zweckmässig im   SubmEzverfahren,   bei einer Temperatur zwischen ungefähr 200 und 350 C so lange züchtet, bis eine erheblicne Menge an O-Diazocetyl-1-seri entstanden ist und diese Substanz aus dem wässerigen Kuiturfiltrat in an sich bekannter Weise, vorzugsweise mit Hilfe von Adsorptionsverfahren isoliert.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung bei einem pH-Wert von 6, 5 bis 7, 0 beginnt und die Kultur bei 23-29 C durchführt.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man der Nährlösung als <Desc/Clms Page number 11> zusätzliche KohlenstoffquelleGlykose oder Galaktose in einer Menge von unter 2 % der Gesamtmenge zusetzt.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die O-Diazoacetyl-l- serin enthaltende Kulturflüssigkeit, nach dem Einengen auf ein kleines Volumen, mit der drei-bis zehnfachen Volumsmenge eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, insbesondere Äthanol ver- EMI11.1 dasNatriumaluminiumsilikat beschickt ist, leitet, das adsorbierte O-Diazoacetyl-l-serin mit Wasser oder einet Mischung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels mit mehr als 50 % Wasser eluiert, das Eluat trocknet und den in einer geringen Menge Wasser gelösten Rückstand durch eine mit Aktivkohle beschickte Adsorptionssäule leitet, darauf das adsorbierte O-Diazoacetyl-l-serin mit einer 1-25 % eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels,

insbesondere Aceton enthaltenden wässerigen Lösung eluiert und daraus durch Einengen und Zugabe eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels O-Diazoacetyl-l-serin abscheidet.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die O-Diazoacetyl-l- serin enthaltende Kulturflüssigkeit zur Trockenen verdampt :, des Rückstand mit einem Gemisch aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel, das weniger als 50 % Wasser enthält, extrahiert und den Extrakt der Adsorptionsbehandlung nach Anspruch 4 unterwirft.