DE1792390C3 - Verfahren zur Stabilisierung der carcinostatischen Wirksamkeit von Zellpräparaten haemolytischer, Streptolysin-S bildender Streptococcen - Google Patents
Verfahren zur Stabilisierung der carcinostatischen Wirksamkeit von Zellpräparaten haemolytischer, Streptolysin-S bildender StreptococcenInfo
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Description
Bekanntlich besitzen lebende Zellen von haemolytischen
Streptococcen, die die Fähigkeit zur Bildung i.on Streptolysin S h-'bfn, das eines der haemolytischen
Streptococcentoxme ist, carcinostatische Wirkung. Diese lebenden Zellen werden seit l.drzem zur Therapie
von Tumoren verwendet; vgl. S. Koshimura u. Mitarb., The Japanese Journal of Experimental
Medicine, Bd. 25 (1965),«. 93 bis 102 und H. O k a m ο t ο
u. Mitarb, The Japanese Journal of Experimental Mediane. Bd. 36 (1966), S. 161 bis 174undS. i75 bis 186.
Wenn jedoch diese lebenden Zellen in Form von Suspensionen eingesetzt werden, ist ihre carcinosutiiche
Wirkung ziemlich instabil, und es ist schwierig, die
Suspension ohne Aktivitätsverlust zu lagern, bis sie verabreicht wird.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde. Zellpräparate
haemolytischer. Streptolysin S bildender Streptococcen zur Verfugung /u stellen, deren carcinostatische
Wirksamkeit stabilisiert und selbst nach längerer Lagerung nicht verringert ist. Diese Aufgabe wird
gemäß dem Kennzeichen des Anspruches 1 gelost.
Die im Verfahren der Erfindung verwendete Zellcniuspension
kann ι. B. eine Kulturbrühe haemolytischer. Slreptolysin S bildender Streptococcen sein, die durch
Züchten der Bakterien in einem Fleischinfustonsmedium oder in einem hauptsächlich Hefeextrakt enthaltenden
Nährmedium erhalten worden sind. Gewöhnlich vor wendet man jedoch eine Suspension, die durch
Suspendieren der aus der Kulturbrühe isolieren Bakterien in einem geeigneten Medium erhallen
worden ist. Vorzugsweise wird als Suspendiermedium Bernheimers Basalmedium verwendet,das 1.35 g Maltose,
12 ml 2Ö%ige wäßrige Kaliumhydrogenphosphatlösung,
eingestellt mit Natriumhydroxyd auf pH 6,9 bis J1O,
24 ml 2°/oige wäßrige Magnesiumsulfat · 7 HaO-Lösuing
und 132 ml destilliertes Wasser enthält. Nachstehend
wird dieses Medium als »BBM« bezeichnet. Als Suspendiermedium kann man auch destilliertes Wasier,
Kochsalzlösung, z. B. physiologische Kochsalzlösung, oder eine Phosphatpuffer enthaltende physiologische
Kochsalzlösung verwenden. Zur Verstärkung der Äntitumorwirkung der lebenden Zellen und a'.ur
gleichzeitigen Verminderung der Toxizität und ihrer Fähigkeit zur Bildung von Streptolysin S, verwendet
man vorzugsweise Suspensionen, denen Antibiotika einverleibt worden sind. z. B. ein Penicillin oder
Cephalosporin C. Die auf diese Weise erhaltenen Suspensionen der lebenden Zellen werden 10 bis 30
Minuten auf 30 bis 38°C und hierauf 20 bis 40 Wnuten
auf 38 bis 50°C erhitzt Man kann auch eine Suspension verwenden, die durch Isolieren der Zellen nach der
ίο vorstehend beschriebenen Behandlung und erneutes
Suspendieren der Zellen in einem geeigneten Medium erhalten worden ist; vergl. The Japanese Journal of
Experimental Medicine, Bd. 36 (1966), S. 161 bis 17+ und
S. 175 bis 186.
Spezielle Beispiele für Disaccharide, die im Verfahren der Erfindung als Stabilisator verwendet werden
können, sind insbesondere Rohrzucker und Lactose. Diese Saccharide können entweder allein oder als
Gemisch aus mindestens zwei dieser Saccharide verwendet werden.
Beispiele für Aminosäuren, die im Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind die nachstehend
genannten Aminosäuren, die entweder in der D-, L- oder DL-Form verwendet werden:
Arginin, Ornithin and Methionin, die besonders wirksam sind, ferner Alanin, Asparaginsäure, Citrullin,
Cystein, Cystin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Hydroxyprolin. Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Prolin, Serin,
Threonin, Tyrosin und Valin. Diese Aminosäuren
jo können entweder allein oder als Gemisch aus mindestens 2 dieser Aminosäuren verwendet werden. In
vielen Fällen werden sie in Form der Hydrochloride oder ihrer Metallsalze verwendet.
Die optimale Menge des Sacchands oder der
η Aminosäure hängt von der Menge der Zellen in der
Suspension und der Art des verwendeten Mediums ab. Im allgemeinen wird das Saccharid oder die Aminosäure
in einem Gewichtsverhältnis der trockenen Zellen der haemolytischen Streptococcen /um Saccharid oder der
jn Aminosäure von I :0,5 bis 1 : 5 verwendet. Wenn man
z. B. eine BBM-Suspension verwendet, die bei 20facher
Verdünnung eine Absorption von etwa 0,5 bei 660 nm aufweist, gibt man das Saccharid oder die Aminosäure
vorzugsweise in solcher Menge zu. daß die Konzcntra-
4i tion etwa I bis 2% beträgt (Gewithtsverhälmis
trockene Zellen /u .Saccharid oder Aminosäure ='1:1 bis 1 3). Wenn die gleiche Suspension bei 40facher
Verdünnung eine Absorption von 0,5 bis 61)0 nm
aufweist, beträgt die Stabilisatorkonzenlration vor/ugs-
-.0 weise 3 bis 5% (Gewichtsverhältnis, der trockenen
Zellen zu Saccharid oder Aminosäure =1:2 bis 1-3).
Wird die Trocknung unter Erhitzen durchgeführt, fällt
die Aktivität der Präparate ab Deshalb wir I die
Trocknung bei Temperaturen von höchstens 20 Γ und
Vi insbesondere bei etwa - IOC oder darunter und unter
vermindertem Druck durchgeführt, solange Wasser in größeren Mengen vorliegt, und die Trocknung bc etwa
20"C beendet.
Die auf diese Weise erhaltenen Präparate besitzen
praktisch die gleiche carcinostatische Wirkung wie die Suspension der lebenden Zellen vor dem Trocknen, und
ihre Wirkung fällt auch nach längerer Lagerzeit nicht ab. Erforderlichenfalls kann man die Präparate zur
Anwendung in Wasser oder einem anderen geeigneten Medium oder Lösungsmitlei wieder suspendieren.
Wenn man die Suspension der lebenden Zellen ohne Zusatz des Saccharids oder der Aminosäure trocknet
und anschließend die trockenen Zellen mechanisch mit
dem Saccharic! oder der Aminosäure vermischt, bleibt
die carcinostatische Wirkung nicht erhalten.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
(a) 300 g Hefeextrakt werden in 10 Liter destilliertem
Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 1 OG/oiger Natronlauge
auf pH 7,0 bis 7,2 eingestellt und 60 Minuten auf 1000C erhitzt Nach dem Abkühlen werden aus der
Lösung ausgeschiedene unlösliche Stoffe abfiltriert, und der pH-Wert des Filtrats wird auf 7,0 bis 7,2 eingestellt-Anschließend
wird das Filtrat in sterilisierte Kolben gegossen und 10 Minuten bei 120° C dampfsierilisiert
Diese Lösung wird für das Hefeextraktmedium verwendet Sämtliche nachfolgenden Arbeitsgänge
werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt
Das auf die vorstehend geschilderte Weise erhaltene Hefeextraktmedium wird mit einer Kulturbrühe von
Streptococcus haemolyticus Stamm Su (ATCC Nr. 21060) beimpft die vorher 20 Stunden in 500 ml eines
gewöhnlichen Fleischinfusionsmediums kultiviert worden war. Die Kultur im Hefeextraktmedium *ird 20
Stunden bei 37°C unter statischen Bedingungen durchgeführt Anschließend wird die Kulturbrühe mit
Eis gekühlt, zentrifugiert und die Bakterienzellen werden zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung
gewaschen und anschließend in 500 ml BBM suspendiert. Die erhaltene Suspension wird auf das
20fache verdünnt und zeigt eine Absorption von 0.47 bei 660 nm.
(b) 300 mi der erhaltenen BBM-Suspension werden mit 60 ml physiologischer Kochsalzlösung des pialiumsalzes
von Penicillin G (1,6 χ 105Einheiten/iii,j versetzt,
und das Gemisch wird 20 Minuten auf 37°C und hierauf 30 Minuten auf 45"C erhitzt. Die auf diese Weise
behandelte Suspension wird nachstehend als »PC B-45« bezeichnet.
(c) 50 ml der erhaltenen PCB-4? Suspension werden mit 50 ml 4%iger wäßriger Rohrzuckerlösung versetzt.
Jeweils 2 ml des Gemisches werden unter sterilen Bedingungen in Reagenzgläser abgefüllt, 2 Stunden bei
-3O3C vorgefroren und anschließend 20 Stunden bei einer Temperatur von höchstens 20" C und einem Druck
von 0.01 Torr getrocknet. Nach dem Trocknen wird das Vakuum durch Einleiten von steriler trockener Luft
aufgehoben, und die Reagenzgläser werden sofort zugeschmolzen. Diese trockenen Präparate zeigten
keine nennenswerte Verminderung der Antitumorwrkung nach 6monatigem Lagern bei }7 C.
30 ml der gcnäß Beispiel l(b) erhaltenen PCB-45-Suspcnsion werden bei niedriger Temperatur
zentrifugiert. Der Überstand wird abgegossen und die Fallung einmal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung
gewaschen und dann in 2%iger wäßriger Rohr/uckerlösung auf 30 ml aufgefüllt und suspendiert.
Jeweils 3 ml Anteile dieser Suspension werden in Reagenzgläser abgefüllt und hierauf gemäß Beispiel l(a)
getrocknet.
30 ml der gemäß Seispiel l(b) erhaltenen PCB-45-Suspension
werden mit 30 ml 4°/oiger wäßriger Lactoselösung versetzt. Jeweils 2ml Anteile des Gemisches
werden in Reagenzgläser gegeben und gemäß Beispiel lfcl eetrocknet.
30 ml der gemäß Beispiel l(b) erhaltenen PCB-45-SuFpension
werden mit 30 ml 4°/oiger wäßriger Dextranlösung
versetzt Jeweils 2 ml des erhaltenen Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und
gemäß Beispiel Uc) getrocknet
30 ml der gemäß Beispiel l(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden mit 30 ml einer 4%igen wäßrigen
Lösung von löslicher Stärke versetzt Jeweils 2 ml des erhaltenen Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt
und gemäß Beispiel l(c) getrocknet
(a) 100 ml einer gemäß Beispiel l(a) erhaltenen BBM-Suspeasion lebender Zellen werden mit 20 ml
physiologischer Kochsalzlösung verseht,die 108 mg/ml
Cephalosporin C enthalten. Das Gern· xh wird 20
Minuten auf 37°C und anschließend 30 Minuten auf 45° C erhitzt Die erhaltene Suspension wird nachstehend
als CEB-45 Suspension bezeichnet
(b) 50 ·λΙ der erhaltenen CEB-45-Suspension werden
mit 50 ml 4%iger wäßriger Rohrzuckerlösung versetzt.
Jeweils 2 ml des erhaltenen Gemisches werden unter sterilen Bedingungen in Reagenzgläser abgefüllt und
gemäß Beispiel l(c) getrocknet. Das Gefriertrocknen wird auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1
j'< durchgeführt
(a) Auf die gleiche Weise wie in Beispiel l(a) wird Streptococcus haemolyticus kultiviert und durch Abzen-
!5 trifugieren isoliert. Die erhaltenen lebenden Zellen
werden in physiologischer Kochsalzlösung in einem Mengenverhältnis von 5 ml, bezogen auf die lebenden
Zellen aus 100 ml des Kulturmediums, suspendiert. Nach
dem 20fachen Verdünnen zeigt die erhaltene Suspension eine Absorption von 0,47 bei 660 mu,
(b) 30 ml der erhaltenen Suspension in physiologischer
Kochsalzlösung werden mit 30 ml 4°/oiger wäßriger Rohrzuckerlösung versetzt. Jeweils 2 ml des
Gemisches werden in Reagenzgläser unter sterilen
•ϊ Bedingungen abgefüllt und gemäß Beispiel l(c) getrocknet.
(a) 300 g Hefeextrnkt werden in 10 Liter destilliertem
>o Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 10%iger Natronlauge
auf pH 7,0 bis 7.2 eingestellt und 60 Minuten auf 10TC erhitzt. Nach dem Abkühlen der Lösung werden
ausgefällte unlösliche Stoffe abfiltriert, und der pH-Wert des Filtrjies wird erneut auf ίΡ bis 7.2
eingestellt Danach wird das Filtrat in sterilisierte Kolben gegossen und 10 Minuten bei 120'Cdampfsteri
lisiert Sämtliche lachfolgenden Arbeitsgänge werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Der erhallene Hefeextrakt wird mit einer Kulturbrühe
von Streptococcus haemolyticus Stamm Su (ATCC Nr. 21060) beimpft, der vorher 20 Stunden in 500 ml
eines üblichen Fleischinfusionsmediums kultiviert worden war. Die Kultur in dem Hefeextraktmedium wird als
statische Kultur 20 Stunden bei 37°C durchgerührt.
Anschließend wird die Kulturbrühe mit Eis abgekühlt und zentrifugiert. Die erhaltenen Bakterienzellen
werden zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in 500 ml BBM
suspendiert. Nach dem 20fachen Verdünnen zeigt diese
Suspension eine Absorption von 0,48 bei 660 nm.
(b) 300 ml der erhaltenen BBM-Suspension werden mit 60 ml einer physiologischen Kochsalzlösung des
Kaliumsalzes von Penicillin G (1,6 χ 105 Einheiten/ml) Versetzt, das Gemisch wird 20 Minuten auf 37°C und
hierauf 30 Minuten auf 45°C erhitzt. Die erhaltene Suspension wird nächstehend als PCB-45-Suspensiön
bezeichnet.
(c) 50 ml der PCB-45-Suspension werden mit 50 ml 4%iger wäßriger L-Arginin-hydrochloridlösung versetzt
Jeweils 2 ml des Gemisches werden in Reagenzgläser unter sterilen Bedingungen abgefüllt, 2 Stunden
bei — 300C vorgefroren und anschließend 20 Stunden
bei einer Temperatur von höchstens 200C und einem Druck von 0,01 Torr getrocknet Nach dem Trocknen
wird das Vakuum durch Einleiten von steriler, trockener Luft aufgehoben, und die Reagenzgläser werden sofort
zugeschmolzen. Die erhaltenen Trockenpräparate zeigten selbst nach 6monatiger Lagerung bei 37° C keine
nennenswerte Verminderung der Antitumorwirkung.
30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden bei niedriger Temperatur zentrifugiert.
Der Überstand wird dekantiert und die Fällung einmal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung
gewaschen und hierauf in 30 ml 2%iger wäßriger L-Arginin-hydrochlorid-Lösung suspendiert. Jeweils
I ml Anteile dieser Suspension werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c) getrocknet.
Beispiel 10
30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden mit 30 ml 40%iger wäßriger
L-Ornithin-hydrochlorid-Lösung versetzt. Jeweils 2 ml
Anteile des Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c) getrocknet
Beispiel 11
40
5S Beispiel
erha!'er"r; PCB-4C;-
Suspension werden mit 30 ml 4°/oiger wäßriger L-Methionin-Lösung
versetzt. Jeweils 2 ml Anteile des Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und
gemäß Beispiel 8(c) getrocknet.
Beispiel 12
30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden mit 30 ml 4%iger wäßriger L-Cystein-Lösung
versetzt Jeweils 2 ml Anteile des Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß
Beispiel 8(a) getrocknet
Beispiel 13
30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspension
werden mit 30 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung des Natriumsalzes der L-Asparaginsäure
versetzt Jeweils 2 ml Anteile des Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(C)
getrocknet
Beispiel 14
30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspension
werden mit 30 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung des Natriumsalzes von L-Glutaminsäure versetzt
Jeweils 2 ml des erhaltenen Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c)
getrocknet.
Beispiel 15
30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden mit 30 ml 4%iger wäßriger
L-Threoninlösung versetzt. Jeweils 2 ml des erhaltenen
Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c) getrocknet.
Beispiel 16
(a) 100 ml einer gemäß Beispiel 8(a) erhaltenen BBM-Suspension lebender Zellen werden mit 20 ml
physiologischer Kochsalzlösung versetzt, die 108 mg/ml Cephalosporin C enthält, und das Gemisch wird 20
Minuten auf 370C und hierauf 30 Minuten auf 45°C erhitzt. Diese Suspension wird nachstehend als CEB-45-Suspension
bezeichnet.
(b) 5 mi der erhaltenen CEB-45-Suspension werden
mit 50 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung von L-Arginin-hydrochlorid versetzt Jeweils 2 ml dieses
Gemisches werden in Reagenzgläser unter sterilen Bedingungen abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c) getrocknet.
Die Gefriertrocknung wird auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 durchgeführt.
Beispiel 17
(a) Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8(a) wird Streptococcus haemolyticus gezüchtet und durch
Zentrifugieren isolier!. Die erhaltenen lebenden Zellen werden in physiologischer Kochsalzlösung in einer
Menge von 5 ml, bezogen auf die lebenden Zellen, aus 100 ml des Kulturmediums suspendiert
Die erhaltene Suspension zeigt nach 20facher Verdünnung eine Absorption von 0,47 bei 660 nm.
(b) 30 ml der erhaltenen Suspension in physiologischer
Kochsalzlösung werden mit 30 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung von L-Arginin-hydrochlorid versetzt.
Jeweils 2 ml dieses Gemisches werden in Reagenzgläser unter sterilen Bedingungen abgefüllt und gemäß
ßoienial Q//>\ ir»trr^Un*»t
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Mit den Präparaten der Erfindung sowie Kontrollpräparaten werden die nachstehend erläuterten Versuche
durchgeführt.
Versuchsbeispie! A
Die gemäß Beispiel 1 bis 6 erhaltenen Trockenpräparate werden unmittelbar nach ihrer Herstellung in
destilliertem Wasser in solchen Mengen suspenciicrt
daß das Volumen der erhaltenen Suspension gleich dem Volumen der Zellensuspensionen vor dem trocknen ist
Die Suspensionen werden durch Zusatz von BBM, das 27 000 Einheiten/ml Penicillin enthält auf das zweifache
verdünnt Jeweils 0,1 ml der erhaltenen verdünnten
Suspensionen werden einmal täglich für 5 Tage Mäusen des ddY-Stammes intraperitoneal injiziert, denen 24
Stunden vorher intraperitoneal 106 Ehrlich-ascites-Carcinomzellen
je Maus injiziert worden waren. Die Herstellung der Suspension in destilliertem Wasser und
das Verdünnen der Trockenpräparate wurde täglich unmittelbar vor der Injektion durchgeführt Für jede
Versuchsgruppe wurden 10 Mäuse verwendet Die Oberlebensrate der Mäuse 40 Tage nach Beginn der
Injektion (Verhältnis der überlebenden Mäuse zur Gesamtzahl der Mäuse) ist in Tabelle I angegeben. In
der Tabelle sind die Versuche Nr. 7 bis Π Kontrollversuche.
Ver- Präparat
Über-
lebens-
rale
1 PGB-45 Trockenpräparat (Beispiel 1) !30
2 PCB45 Tröckenpräparat (Beispiel 2) 30
3 PCB45 Trockenpräparat (Beispiel 3) 70
4 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 4) 70
5 PCB-45 Trockenpräparat (Beispie! 5) 70
6 CEB-45 Trockenpräparat (Beispiel 6) 130
7 PCB-45 Trockenpräparat 70
(ohne Siabiiisaiorzusaiz)
8 CEB45 Trockenpräparat 70
(ohne Stabilisatorzusalz)
9 PCB-45 i)0 10 CEB45 90 Π BBM + Penicillin allein 0
Versuchsbeispiel B
Ver- Präparat
Überlebens-
1 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 1) 60
2 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 2) 60
3 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 3) 60
4 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 4) 50
5 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 5) 50
6 CEB-45 Trockenpräparat (Beispiel 6) 60
7 PCB-45 Trockenpräparat 40
(ohne Stabilisatorzusatz)
8 CEB-45 Trockenpräparat 40
(ohne Stabilisatorzusatz)
9 BBM + Penicillin allein 0
Versuchsbeispiel C
Suspensionen lebender Zellen, die nicht der Behandlung mit Penicillin oder Cephalosporin unterworfen
wurden und 3 Monate bei 37° C gelagert wurden, werden auf ihre Antitumorwirkung untersucht.
Gemäß Beispiel 7 hergestellte Trockenpräparate werden unmittelbar vor der Injektion in destilliertem
Wasser in solcher Menge suspendiert, daß das Volumen
das gleiche ist, wie das der Suspension Vor dem Trocknen. Ferner werden 7 Tage alte Ehrlich-ascites-Carcinomzellen
aus Mäusen isoliert, bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert einmal mit physiologi-
> scher Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in soviel BBM suspendiert, daß eine Suspension mit
6 χ iO'Zellen/ml erhalten wird.
2 ml dieser Carcinomzellen-Suspension werden mit 5 ml einer Suspension der Trockenpräparate in
ίο destilliertem Wasser und I ml BBM vermischt und 90
Minuten bei 370C inkubiert. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wird einmal in einer Dosis von
0,5 ml/Maus Mäusen vom ddY-Stamm intraperitoneal injiziert. Je Versuchsgruppe werden 10 Mäuse verwen-
det. Die Überlebensrate der Mäuse nach 40 Tagen nach der Injektion ist in Tabelle III angegeben. Ih der Tabelle
sind die Versuche 2 und 3 Kontrollversuche, und in Versuch 2 sind die Ergebnisse mit einem Präparat
gezeigt, dem vor dem Trocknen destilliertes Wasser anstelle der wäßrigen Stabilisatorlösung zugesetzt
wurde.
25 Ver- Präparat
such
Überlebensrate
Die :n den Beispielen 1 bis 6 erhaltenen Trockenpräparate,
die 3 Monate bei 37&C gelagert wurden, werden 30 —
hinsichtlich ihrer Antitumorwirkung in gleicher Weise wie im Versuchsbeispiel A untersucht. Die Ergebnisse
sind in Tabelle II zusammengestellt. In dieser Tabelle sind die Versuche 7 bis 9 Kontrollversuche.
Trockenpräparat einer Suspension 50
lebender Zellen (Stabilisator zu
Rohrzucker)
Rohrzucker)
Trockenpräparat einer Suspension 30
lebender Zellen (ohne Stabilisatorzusatz)
BBM allein 0
i-
45
50
55
60
65 /\U5 den crgconisscn ist cfäicniiicn, uau o'as
erfindungsgemäß hergestellte Präparat eine sehr hohe Antitumorwirkung selbst nach längerer Lagerung
besitzt.
Versuchsbeispiel D
Die gemäß Beispiel 8 bis 16 hergestellten Trockenpräparate werden unmittelbar nach ihrer Herstellung in
destilliertem Wasser in solcher Menge suspendiert, daß das Volumen der erhaltenen Suspensionen gleich dem
Volumen der Zellensuspensionen vor dem Trocknen ist. Die Suspensionen werden einzeln auf das zweifache
durch Zusatz von BBM verdünnt, das 27 000 Einheiten/ml Penicillin enthält. Jeweils 0,1 ml der erhaltenen
verdünnten Suspension werden einmal täglich über 5 Tage Mäusen vom ddY-Stamm intraperitoneal injiziert.
Diese Mäuse wurden 24 Stunden vorher mit 106 Ehrlichascites-Carcinomzellen
pro Maus gespritzt
Die Herstellung der Suspension in destilliertem Wasser und das Verdünnen der Trockenpräparate wird
jeden Tag unmittelbar vor der Injektion durchgeführt. Pro Versuchsgruppe werden 10 Mäuse verwendet Die
Oberlebensrate der Mäuse nach 40 Tagen ist in Tabelle IV angegeben. In dieser Tabelle sind die Versuche 1! bis
14 Kontrollversuche und die Versuche 10 und 11 zeigen
die Ergebnisse mit Präparaten, bei denen das Trocknen unter Zusatz von destilliertem Wasser anstelle der
wäßrigen Stabilisatorlösung durchgeführt wurde.
| Tabelle IV | Präparat | Trockenpräparat (Beispiel | 8) | Über* |
| Ver | Trockenpräparat (Beispiel | 9) | leberks- | |
| such | Trockenpräparat (Beispiel | 10) | rate | |
| Nr. | PCB45 | Trockenpräparat (Beispiel | H) | 90 |
| 1 | PCB45 | Trockenpräparat (Beispiel | 12) | 90 |
| 2 | PCB45 | Trockenpräparat (Beispiel | 13) | 80 |
| 3 | PCB45 | Trockenpräparat (Beispiel | 14) | 80 |
| 4 | PCB45 | Trnekp.nnrännrat CBeisniel | IS) | 80 |
| 5 | PCB45 | Trockenpräparat (Beispiel | 16) | 70 |
| 6 | PCB45 | Trockenpräparat | 70 | |
| 7 | PCR-IS | (ohne Stabilisatorzusatz) | 70 | |
| OCI | CEB45 | Trockenpräparat | 90 | |
| 9 | PCB45 | (ohne Stabilisatorzusatz) | 70 | |
| IO | ||||
| CEB45 | 70 | |||
| H | Penicillin allein | |||
| PCB45 | Versuchsbeispiel E | 90 | ||
| 12 | CEB45 | 90 | ||
| 13 | BBM + | 0 | ||
| 14 | ||||
Die in den Beispielen 8 bis 16 erhaltenen Trockenpräparate,
die 3 Monate bei 37°C gelagert wurden, werden miteinander auf ihre Antitumorwirkung auf die gleiche
Weise wie in Versuchsbeispiel D verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt. In dieser
Tabelle sind sind die Versuche Nr. 10 bis 12 kontrollversuche, und die Versuche 10 und 11 zeigen die
Ergebnisse mit Präparaten, bei denen das Trocknen durch Zusatz von destilliertem Wasser anstelle der
wäßrieen StabilisatorlösuitSdurchEeführt wurde.
| Tabelle V | Präparat | 8) | Über |
| Ver | 9) | lebens- | |
| such | 10) | rate | |
| Nr. | PCB45 Trockenpräparat (Beispiel | H) | 90 |
| 1 | PCB45 Trockenpräparat (Beispiel | 12) | 90 |
| 2 | PCB45 Trockenpräparat (Beispiel | 13) | 80 |
| 3 | PCB45 Trockenpräparat (Beispiel | 14) | 80 |
| 4 | PCB45 Trockenpräpsrat (Beispiel | 15) | 80 |
| 5 | PCB45 Trockenpräparat (Beispiel | 16) | 70 |
| 6 | PCB45 Trockenpräparat (Beispiel | 60 | |
| 7 | PCB45 Trockenpräparat (Beispiel | 60 | |
| 8 | CEB45 Trockenpriiparat (Beispiel | 90 | |
| 9 | PCB45 Trockenpräparat | 40 | |
| 10 | (ohne Stabüisatorzusatz) | ||
| CEB45 Trockenpräparat | 40 | ||
| 11 | (ohne Stabilisatorzusatz) | ||
| BBM + Penicillin allein | 0 | ||
| 12 | |||
Versuchsbeispiel F
Es werden Suspensionen lebender Zellen auf ihre Antitumorwirkung untersucht, die keiner Behandlung
niit Penicillin oder Cephalosporin C und 3 Monate bei 37°C gelagert wurden.
Gemäß Beispiel 17 hergestellte Trockenpräparate werden unmittelbar vor der Injektion in destilliertem
Wasser in solcher Menge suspendiert, daß das Volumen der Suspension gleich dem Volumen der Suspension vor
dem Trocknen ist. Andererseits werden 7 Tage alte Ehrlich-ascites-Carcinomzellen, die Mäusen vom
ddY-Stamm intraperitoneal injiziert worden waren, isoliert, mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert,
einmal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in BBM in solcher Menge suspendiert,
daß die Suspension 6 χ 107 Zellen/ml enthält. 2 ml dieser Carcinornzcücr. Suspension werden rrüt 5 m!
einer Suspension der Trockenpräparate in destilliertem Wasser und 1 ml BBM vermischt und 90 Minuten bei
37°C inkubiert. Die erhaltene Suspension wird einmal in einer Dosis von 0,5 ml/Maus Mäusen vom ddY-Stamm
intraperitoneal injiziert. Je Versuchsgruppe werden 10 Mäuse verwendet. Die Überlebensrate der Mäuse nach
40 Tagen ist in Tabelle VI angegeben. In der Tabelle sind die Versuche Nr. 2 und 3 Kontrollversuche und Versuch
2 zeigt das Ergebnis mit einem Präparat, bei dem das Trocknen unter Zusatz von destilliertem Wasser an
Stelle einer wäßrigen Stabilisatorlösung erfolgte.
Ver- Präparat
Überlebensrate
1 Trockenpräparat aus Suspension 70 lebender Zellen (Stabilisator zu
I.-Arginin-hydrochlorid)
2 Trockenpräparat aus Suspension 30 lebender Zellen (ohne Stabilisatorzusatz)
3 BBM allein 0
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäß hergestellte Präparat selbst nach
langer Lagerung eine hohe Antitumorwirkung besitzt
Versuchsbeispiel G
Carcinostatische Wirkung gegenüber verschiedenen Tumoren der Ratte
A) Hemmung des Wachstums von Ratten- Ascites-Hepatomzellen AH-13
a. Herstellung des Präparates
Das gemäß Beispiel l(b) hergestellte Präparat PCB45 wurde mit d,l-Methionin in einer Menge von
10 mg/50 KE versetzt (IKe=I klinische Einheit
= 0,1 mg getrocknete Bakterienzellen) und gefriergetrocknet
b. Versuchsmethodik
Ratten (Stamm: DONRYU) erhielten durch intraperitoneale
Injektion Ratten-Ascites-Hepatomzellen
AH-13 (ΙΟ6 Zellen/Tier). Gruppen zu je 10 Tieren
wurden behandelt mit 150 oder 50 oder 30 oder 10 oder
5 oder 1 KE/kg (in Form des unter (a) angegebenen Präparates) oder mit Kulturmedium der Bakterien
(Mischung aus Bernheimer's Basalmedium und Penicil-Iin)
als Vergleich (Kontrolle); und zwar erhielten die Tiere 15 Tage lang täglich eine intraperitoneale
Injektion. Die Behandlung wurde 24 Stunden nach der Beimpfung mit den Tumorzellen begonnen. Bis zu 60
Tagen nach der Beimpfung wurde die Zahl der überlebenden Tiere relativ zur Zahl der behandelten
Ratten festgestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 und 2 dargestellt
Kontrolltiere, die nur Kulturmedium erhalten hatten, starben alle innerhalb 8 Tagen. Nach 15 Injektionen von
150, 50 oder 30 KE/kg/Tag blieben alle Tiere 60 Tage
am Leben und nach 10 oder 5 KE/kg/Tag überlebten ca.
750/n Her Tier?.. Nach 15 Injektionen von 1 KE/kg/Tag
starben alle Tiere ähnlich wie die Kontrollen innerhalb von 11 Tagen.
B) Hemmung des Wachstums von
Ratten-Ascites-Hepatomzellen AH-414
Ratten-Ascites-Hepatomzellen AH-414
a. Herstellung des Präparates
Das gemäß Beispiel l(b) hergestellte Präparat PCB-45 wurde mit 1-Arginin-hydrochlorid in einer
Menge von 20 mg/50 KE versetzt und gefriergetrocknet
b. Versuchsmethodik
Ratten (Stamm: DONRYU) erhielten durch intraperitoneale Injektion Ratten-Ascites-Hepatomzellen
AH-414 (106 Zellen/Tier). Gruppen zu je 10 Tieren
erhielten 10 Tage lang täglich intraperitoneal entweder 100 KE/kg in Form des unter (a) angegebenen
Präparates oder 0,9%ige Kochsalzlösung (PSS) als Vergleichsbehandlung (Kontrolle). Die Behandlung
wurde 72 Stunden nach der Beimpfung mit den Tumorzellen begonnen. Bis zu 60 Tagen nach der
Beimpfung wurde die Zahl der überlebenden Tiere relativ zur Zahl der behandelten Tiere festgestellt Die
Ergebnisse sind in F i g. 3 dargestellt.
Kontrolltiere, die isotonische Kochsalzlösung (PSS) erhalten hatten, starben alle innerhalb 25 Tagen. Nach
10 Injektionen von 100 KE/kg/Tag blieben ca. 90% der
behandelten Tiere 60 Tage am Leben.
C) Hemmung des WadhsHims von
Ratten-Ascites-YOSHIDA-Sarkomzellen
Ratten-Ascites-YOSHIDA-Sarkomzellen
(eines gegen N-Lost-N-Oxid resistenten Stamms).
a. Herstellung des Präparates
Wie in B).
Wie in B).
b. Versuchsmelhodik
Wie in B). Die Ergebnisse sind in F i g. 4 dargestellt.
Kontrolltiere, die nur isotonische Kochsalzlösung erhalten hatten, starben alle innerhalb 15 Tagen. Nach
10 Injektionen von 100 KE/kg/Tag blieben ca. 90% der
behandelten Tiere 60 Τη'Έ am Leben.
D) Hemmung des Wachstums von
Ratten-Ascites-Hepatomzellen AH-41 C
Ratten-Ascites-Hepatomzellen AH-41 C
a. Herstellung des Präparates
Wie in B).
b. Versuchsmethodik
Wie in B). Die Ergebnisse sind in F i g. 5 dargestellt.
Kontrolltiere, die nur isotonische Kochsalzlösung erhalten hatten, starben alle innerhalb 20 Tagen. Nach
10 Injektionen von 100 KE/kg/Tag blieben ca. 50% der
behandelten Tiere 60 Tage am Leben.
Inzwischen wurden erfindungsgemäß hergestellte Präparate auch klinisch geprüft; vgl. Gan-no-Rinsho
(Japanese Journal of Cancer Clinics), Bd. 15 (1969), S.
1056 bis 1062. Bei 10 von 51 behandelten, an unheilbarem Krebs der verschiedensten Art erkrankten
Patienten, wurde eine objektive Besserung festgestellt. Aus einer Arbeil von B. Toyota u. Mitarb., Japanese
Journal of Otolaryngology, Bd. 72 (1969), S. 1332 bis
1338, geht hervor, daß bei der Behandlung von malignen
Tumoren im Kopf und Hals mit dem erfindungsgemäß hergestellten Präparat bei 25 von 32 behandelten
Patienten eine günstige Wirkung erzielt werden konnte.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
Claims (2)
1. Verfahren zur Stabilisierung der carcinostatischen
Wirksamkeit von Zellpräparaten haemolytischer, Streptolysin-S bildender Streptococcen, ei a durch
gekennzeichnet, daß man
(a) eine Suspension der Streptococcen mit einem Disaccharid, Dextran, löslicher Stärke oder
einer Aminosäure in einem Gewichtsverhähnis der trockenen Streptococcen zu Saccharid oder
Aminosäure von 1 :0,5 bis 1 :5 versetzt und
(b) das erhaltene Gemisch bei höchstens 20°C und unter vermindertem Druck trocknet
2. Verfahren nach Anspruch I1 dadurch gekennzeichnet,
daß man eine Suspension der haemolytischen Streptococcen verwendet, die durch Suspendieren
der Zellen in Bernheimers Basalmedium, Zusatz einer Penicillinverbindung oder von Cephalosporin
C und 10- bis 30minütiges Erhitzen auf 30 bis 37°C und 20- bis 40minüliges Erhitzen auf 38 bis
50° C erhalten worden ist.
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| JP5517967 | 1967-08-30 | ||
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