DE1792390C3 - Verfahren zur Stabilisierung der carcinostatischen Wirksamkeit von Zellpräparaten haemolytischer, Streptolysin-S bildender Streptococcen - Google Patents

Verfahren zur Stabilisierung der carcinostatischen Wirksamkeit von Zellpräparaten haemolytischer, Streptolysin-S bildender Streptococcen

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DE1792390C3
DE1792390C3 DE1792390A DE1792390A DE1792390C3 DE 1792390 C3 DE1792390 C3 DE 1792390C3 DE 1792390 A DE1792390 A DE 1792390A DE 1792390 A DE1792390 A DE 1792390A DE 1792390 C3 DE1792390 C3 DE 1792390C3
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Takashi Itabashi Tokio Matsuno
Takao Tokio Noto
Haruki Tokio Ogawa
Hiroshi Musashino Okazaki
Motoharu Omiya Saitama Shiba
Shigeo Mitaka Suzuki
Sakae Wada
Akihiro Higashi Yamamoto
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Description

Bekanntlich besitzen lebende Zellen von haemolytischen Streptococcen, die die Fähigkeit zur Bildung i.on Streptolysin S h-'bfn, das eines der haemolytischen Streptococcentoxme ist, carcinostatische Wirkung. Diese lebenden Zellen werden seit l.drzem zur Therapie von Tumoren verwendet; vgl. S. Koshimura u. Mitarb., The Japanese Journal of Experimental Medicine, Bd. 25 (1965),«. 93 bis 102 und H. O k a m ο t ο u. Mitarb, The Japanese Journal of Experimental Mediane. Bd. 36 (1966), S. 161 bis 174undS. i75 bis 186. Wenn jedoch diese lebenden Zellen in Form von Suspensionen eingesetzt werden, ist ihre carcinosutiiche Wirkung ziemlich instabil, und es ist schwierig, die Suspension ohne Aktivitätsverlust zu lagern, bis sie verabreicht wird.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde. Zellpräparate haemolytischer. Streptolysin S bildender Streptococcen zur Verfugung /u stellen, deren carcinostatische Wirksamkeit stabilisiert und selbst nach längerer Lagerung nicht verringert ist. Diese Aufgabe wird gemäß dem Kennzeichen des Anspruches 1 gelost.
Die im Verfahren der Erfindung verwendete Zellcniuspension kann ι. B. eine Kulturbrühe haemolytischer. Slreptolysin S bildender Streptococcen sein, die durch Züchten der Bakterien in einem Fleischinfustonsmedium oder in einem hauptsächlich Hefeextrakt enthaltenden Nährmedium erhalten worden sind. Gewöhnlich vor wendet man jedoch eine Suspension, die durch Suspendieren der aus der Kulturbrühe isolieren Bakterien in einem geeigneten Medium erhallen worden ist. Vorzugsweise wird als Suspendiermedium Bernheimers Basalmedium verwendet,das 1.35 g Maltose, 12 ml 2Ö%ige wäßrige Kaliumhydrogenphosphatlösung, eingestellt mit Natriumhydroxyd auf pH 6,9 bis J1O, 24 ml 2°/oige wäßrige Magnesiumsulfat · 7 HaO-Lösuing und 132 ml destilliertes Wasser enthält. Nachstehend wird dieses Medium als »BBM« bezeichnet. Als Suspendiermedium kann man auch destilliertes Wasier, Kochsalzlösung, z. B. physiologische Kochsalzlösung, oder eine Phosphatpuffer enthaltende physiologische Kochsalzlösung verwenden. Zur Verstärkung der Äntitumorwirkung der lebenden Zellen und a'.ur gleichzeitigen Verminderung der Toxizität und ihrer Fähigkeit zur Bildung von Streptolysin S, verwendet man vorzugsweise Suspensionen, denen Antibiotika einverleibt worden sind. z. B. ein Penicillin oder Cephalosporin C. Die auf diese Weise erhaltenen Suspensionen der lebenden Zellen werden 10 bis 30 Minuten auf 30 bis 38°C und hierauf 20 bis 40 Wnuten auf 38 bis 50°C erhitzt Man kann auch eine Suspension verwenden, die durch Isolieren der Zellen nach der
ίο vorstehend beschriebenen Behandlung und erneutes Suspendieren der Zellen in einem geeigneten Medium erhalten worden ist; vergl. The Japanese Journal of Experimental Medicine, Bd. 36 (1966), S. 161 bis 17+ und S. 175 bis 186.
Spezielle Beispiele für Disaccharide, die im Verfahren der Erfindung als Stabilisator verwendet werden können, sind insbesondere Rohrzucker und Lactose. Diese Saccharide können entweder allein oder als Gemisch aus mindestens zwei dieser Saccharide verwendet werden.
Beispiele für Aminosäuren, die im Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind die nachstehend genannten Aminosäuren, die entweder in der D-, L- oder DL-Form verwendet werden:
Arginin, Ornithin and Methionin, die besonders wirksam sind, ferner Alanin, Asparaginsäure, Citrullin, Cystein, Cystin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Hydroxyprolin. Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tyrosin und Valin. Diese Aminosäuren
jo können entweder allein oder als Gemisch aus mindestens 2 dieser Aminosäuren verwendet werden. In vielen Fällen werden sie in Form der Hydrochloride oder ihrer Metallsalze verwendet.
Die optimale Menge des Sacchands oder der
η Aminosäure hängt von der Menge der Zellen in der Suspension und der Art des verwendeten Mediums ab. Im allgemeinen wird das Saccharid oder die Aminosäure in einem Gewichtsverhältnis der trockenen Zellen der haemolytischen Streptococcen /um Saccharid oder der
jn Aminosäure von I :0,5 bis 1 : 5 verwendet. Wenn man z. B. eine BBM-Suspension verwendet, die bei 20facher Verdünnung eine Absorption von etwa 0,5 bei 660 nm aufweist, gibt man das Saccharid oder die Aminosäure vorzugsweise in solcher Menge zu. daß die Konzcntra-
4i tion etwa I bis 2% beträgt (Gewithtsverhälmis trockene Zellen /u .Saccharid oder Aminosäure ='1:1 bis 1 3). Wenn die gleiche Suspension bei 40facher Verdünnung eine Absorption von 0,5 bis 61)0 nm aufweist, beträgt die Stabilisatorkonzenlration vor/ugs-
-.0 weise 3 bis 5% (Gewichtsverhältnis, der trockenen Zellen zu Saccharid oder Aminosäure =1:2 bis 1-3).
Wird die Trocknung unter Erhitzen durchgeführt, fällt die Aktivität der Präparate ab Deshalb wir I die Trocknung bei Temperaturen von höchstens 20 Γ und
Vi insbesondere bei etwa - IOC oder darunter und unter vermindertem Druck durchgeführt, solange Wasser in größeren Mengen vorliegt, und die Trocknung bc etwa 20"C beendet.
Die auf diese Weise erhaltenen Präparate besitzen praktisch die gleiche carcinostatische Wirkung wie die Suspension der lebenden Zellen vor dem Trocknen, und ihre Wirkung fällt auch nach längerer Lagerzeit nicht ab. Erforderlichenfalls kann man die Präparate zur Anwendung in Wasser oder einem anderen geeigneten Medium oder Lösungsmitlei wieder suspendieren. Wenn man die Suspension der lebenden Zellen ohne Zusatz des Saccharids oder der Aminosäure trocknet und anschließend die trockenen Zellen mechanisch mit
dem Saccharic! oder der Aminosäure vermischt, bleibt die carcinostatische Wirkung nicht erhalten.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
(a) 300 g Hefeextrakt werden in 10 Liter destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 1 OG/oiger Natronlauge auf pH 7,0 bis 7,2 eingestellt und 60 Minuten auf 1000C erhitzt Nach dem Abkühlen werden aus der Lösung ausgeschiedene unlösliche Stoffe abfiltriert, und der pH-Wert des Filtrats wird auf 7,0 bis 7,2 eingestellt-Anschließend wird das Filtrat in sterilisierte Kolben gegossen und 10 Minuten bei 120° C dampfsierilisiert Diese Lösung wird für das Hefeextraktmedium verwendet Sämtliche nachfolgenden Arbeitsgänge werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt
Das auf die vorstehend geschilderte Weise erhaltene Hefeextraktmedium wird mit einer Kulturbrühe von Streptococcus haemolyticus Stamm Su (ATCC Nr. 21060) beimpft die vorher 20 Stunden in 500 ml eines gewöhnlichen Fleischinfusionsmediums kultiviert worden war. Die Kultur im Hefeextraktmedium *ird 20 Stunden bei 37°C unter statischen Bedingungen durchgeführt Anschließend wird die Kulturbrühe mit Eis gekühlt, zentrifugiert und die Bakterienzellen werden zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in 500 ml BBM suspendiert. Die erhaltene Suspension wird auf das 20fache verdünnt und zeigt eine Absorption von 0.47 bei 660 nm.
(b) 300 mi der erhaltenen BBM-Suspension werden mit 60 ml physiologischer Kochsalzlösung des pialiumsalzes von Penicillin G (1,6 χ 105Einheiten/iii,j versetzt, und das Gemisch wird 20 Minuten auf 37°C und hierauf 30 Minuten auf 45"C erhitzt. Die auf diese Weise behandelte Suspension wird nachstehend als »PC B-45« bezeichnet.
(c) 50 ml der erhaltenen PCB-4? Suspension werden mit 50 ml 4%iger wäßriger Rohrzuckerlösung versetzt. Jeweils 2 ml des Gemisches werden unter sterilen Bedingungen in Reagenzgläser abgefüllt, 2 Stunden bei -3O3C vorgefroren und anschließend 20 Stunden bei einer Temperatur von höchstens 20" C und einem Druck von 0.01 Torr getrocknet. Nach dem Trocknen wird das Vakuum durch Einleiten von steriler trockener Luft aufgehoben, und die Reagenzgläser werden sofort zugeschmolzen. Diese trockenen Präparate zeigten keine nennenswerte Verminderung der Antitumorwrkung nach 6monatigem Lagern bei }7 C.
Beispiel 2
30 ml der gcnäß Beispiel l(b) erhaltenen PCB-45-Suspcnsion werden bei niedriger Temperatur zentrifugiert. Der Überstand wird abgegossen und die Fallung einmal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann in 2%iger wäßriger Rohr/uckerlösung auf 30 ml aufgefüllt und suspendiert. Jeweils 3 ml Anteile dieser Suspension werden in Reagenzgläser abgefüllt und hierauf gemäß Beispiel l(a) getrocknet.
Beispiel 3
30 ml der gemäß Seispiel l(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden mit 30 ml 4°/oiger wäßriger Lactoselösung versetzt. Jeweils 2ml Anteile des Gemisches werden in Reagenzgläser gegeben und gemäß Beispiel lfcl eetrocknet.
Beispiel 4
30 ml der gemäß Beispiel l(b) erhaltenen PCB-45-SuFpension werden mit 30 ml 4°/oiger wäßriger Dextranlösung versetzt Jeweils 2 ml des erhaltenen Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel Uc) getrocknet
Beispiel 5
30 ml der gemäß Beispiel l(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden mit 30 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung von löslicher Stärke versetzt Jeweils 2 ml des erhaltenen Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel l(c) getrocknet
Beispiel 6
(a) 100 ml einer gemäß Beispiel l(a) erhaltenen BBM-Suspeasion lebender Zellen werden mit 20 ml physiologischer Kochsalzlösung verseht,die 108 mg/ml Cephalosporin C enthalten. Das Gern· xh wird 20 Minuten auf 37°C und anschließend 30 Minuten auf 45° C erhitzt Die erhaltene Suspension wird nachstehend als CEB-45 Suspension bezeichnet
(b) 50 ·λΙ der erhaltenen CEB-45-Suspension werden mit 50 ml 4%iger wäßriger Rohrzuckerlösung versetzt.
Jeweils 2 ml des erhaltenen Gemisches werden unter sterilen Bedingungen in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel l(c) getrocknet. Das Gefriertrocknen wird auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 j'< durchgeführt
Beispiel 7
(a) Auf die gleiche Weise wie in Beispiel l(a) wird Streptococcus haemolyticus kultiviert und durch Abzen-
!5 trifugieren isoliert. Die erhaltenen lebenden Zellen werden in physiologischer Kochsalzlösung in einem Mengenverhältnis von 5 ml, bezogen auf die lebenden Zellen aus 100 ml des Kulturmediums, suspendiert. Nach dem 20fachen Verdünnen zeigt die erhaltene Suspension eine Absorption von 0,47 bei 660 mu,
(b) 30 ml der erhaltenen Suspension in physiologischer Kochsalzlösung werden mit 30 ml 4°/oiger wäßriger Rohrzuckerlösung versetzt. Jeweils 2 ml des Gemisches werden in Reagenzgläser unter sterilen
•ϊ Bedingungen abgefüllt und gemäß Beispiel l(c) getrocknet.
Beispiel 8
(a) 300 g Hefeextrnkt werden in 10 Liter destilliertem
>o Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 10%iger Natronlauge auf pH 7,0 bis 7.2 eingestellt und 60 Minuten auf 10TC erhitzt. Nach dem Abkühlen der Lösung werden ausgefällte unlösliche Stoffe abfiltriert, und der pH-Wert des Filtrjies wird erneut auf ίΡ bis 7.2 eingestellt Danach wird das Filtrat in sterilisierte Kolben gegossen und 10 Minuten bei 120'Cdampfsteri lisiert Sämtliche lachfolgenden Arbeitsgänge werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Der erhallene Hefeextrakt wird mit einer Kulturbrühe von Streptococcus haemolyticus Stamm Su (ATCC Nr. 21060) beimpft, der vorher 20 Stunden in 500 ml eines üblichen Fleischinfusionsmediums kultiviert worden war. Die Kultur in dem Hefeextraktmedium wird als statische Kultur 20 Stunden bei 37°C durchgerührt.
Anschließend wird die Kulturbrühe mit Eis abgekühlt und zentrifugiert. Die erhaltenen Bakterienzellen werden zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in 500 ml BBM
suspendiert. Nach dem 20fachen Verdünnen zeigt diese Suspension eine Absorption von 0,48 bei 660 nm.
(b) 300 ml der erhaltenen BBM-Suspension werden mit 60 ml einer physiologischen Kochsalzlösung des Kaliumsalzes von Penicillin G (1,6 χ 105 Einheiten/ml) Versetzt, das Gemisch wird 20 Minuten auf 37°C und hierauf 30 Minuten auf 45°C erhitzt. Die erhaltene Suspension wird nächstehend als PCB-45-Suspensiön bezeichnet.
(c) 50 ml der PCB-45-Suspension werden mit 50 ml 4%iger wäßriger L-Arginin-hydrochloridlösung versetzt Jeweils 2 ml des Gemisches werden in Reagenzgläser unter sterilen Bedingungen abgefüllt, 2 Stunden bei — 300C vorgefroren und anschließend 20 Stunden bei einer Temperatur von höchstens 200C und einem Druck von 0,01 Torr getrocknet Nach dem Trocknen wird das Vakuum durch Einleiten von steriler, trockener Luft aufgehoben, und die Reagenzgläser werden sofort zugeschmolzen. Die erhaltenen Trockenpräparate zeigten selbst nach 6monatiger Lagerung bei 37° C keine nennenswerte Verminderung der Antitumorwirkung.
Beispiel 9
30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden bei niedriger Temperatur zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert und die Fällung einmal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und hierauf in 30 ml 2%iger wäßriger L-Arginin-hydrochlorid-Lösung suspendiert. Jeweils I ml Anteile dieser Suspension werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c) getrocknet.
Beispiel 10
30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden mit 30 ml 40%iger wäßriger L-Ornithin-hydrochlorid-Lösung versetzt. Jeweils 2 ml Anteile des Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c) getrocknet
Beispiel 11
40
5S Beispiel
erha!'er"r; PCB-4C;-
Suspension werden mit 30 ml 4°/oiger wäßriger L-Methionin-Lösung versetzt. Jeweils 2 ml Anteile des Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c) getrocknet.
Beispiel 12
30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden mit 30 ml 4%iger wäßriger L-Cystein-Lösung versetzt Jeweils 2 ml Anteile des Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(a) getrocknet
Beispiel 13
30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden mit 30 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung des Natriumsalzes der L-Asparaginsäure versetzt Jeweils 2 ml Anteile des Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(C) getrocknet
Beispiel 14
30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden mit 30 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung des Natriumsalzes von L-Glutaminsäure versetzt Jeweils 2 ml des erhaltenen Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c) getrocknet.
Beispiel 15
30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden mit 30 ml 4%iger wäßriger L-Threoninlösung versetzt. Jeweils 2 ml des erhaltenen Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c) getrocknet.
Beispiel 16
(a) 100 ml einer gemäß Beispiel 8(a) erhaltenen BBM-Suspension lebender Zellen werden mit 20 ml physiologischer Kochsalzlösung versetzt, die 108 mg/ml Cephalosporin C enthält, und das Gemisch wird 20 Minuten auf 370C und hierauf 30 Minuten auf 45°C erhitzt. Diese Suspension wird nachstehend als CEB-45-Suspension bezeichnet.
(b) 5 mi der erhaltenen CEB-45-Suspension werden mit 50 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung von L-Arginin-hydrochlorid versetzt Jeweils 2 ml dieses Gemisches werden in Reagenzgläser unter sterilen Bedingungen abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c) getrocknet. Die Gefriertrocknung wird auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 durchgeführt.
Beispiel 17
(a) Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8(a) wird Streptococcus haemolyticus gezüchtet und durch Zentrifugieren isolier!. Die erhaltenen lebenden Zellen werden in physiologischer Kochsalzlösung in einer Menge von 5 ml, bezogen auf die lebenden Zellen, aus 100 ml des Kulturmediums suspendiert
Die erhaltene Suspension zeigt nach 20facher Verdünnung eine Absorption von 0,47 bei 660 nm.
(b) 30 ml der erhaltenen Suspension in physiologischer Kochsalzlösung werden mit 30 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung von L-Arginin-hydrochlorid versetzt. Jeweils 2 ml dieses Gemisches werden in Reagenzgläser unter sterilen Bedingungen abgefüllt und gemäß ßoienial Q//>\ ir»trr^Un*»t -"•--•r""· -\-/o— --.*..- .
Mit den Präparaten der Erfindung sowie Kontrollpräparaten werden die nachstehend erläuterten Versuche durchgeführt.
Versuchsbeispie! A
Die gemäß Beispiel 1 bis 6 erhaltenen Trockenpräparate werden unmittelbar nach ihrer Herstellung in destilliertem Wasser in solchen Mengen suspenciicrt daß das Volumen der erhaltenen Suspension gleich dem Volumen der Zellensuspensionen vor dem trocknen ist Die Suspensionen werden durch Zusatz von BBM, das 27 000 Einheiten/ml Penicillin enthält auf das zweifache verdünnt Jeweils 0,1 ml der erhaltenen verdünnten Suspensionen werden einmal täglich für 5 Tage Mäusen des ddY-Stammes intraperitoneal injiziert, denen 24 Stunden vorher intraperitoneal 106 Ehrlich-ascites-Carcinomzellen je Maus injiziert worden waren. Die Herstellung der Suspension in destilliertem Wasser und das Verdünnen der Trockenpräparate wurde täglich unmittelbar vor der Injektion durchgeführt Für jede Versuchsgruppe wurden 10 Mäuse verwendet Die Oberlebensrate der Mäuse 40 Tage nach Beginn der Injektion (Verhältnis der überlebenden Mäuse zur Gesamtzahl der Mäuse) ist in Tabelle I angegeben. In der Tabelle sind die Versuche Nr. 7 bis Π Kontrollversuche.
Tabelle I
Ver- Präparat
Über-
lebens-
rale
1 PGB-45 Trockenpräparat (Beispiel 1) !30
2 PCB45 Tröckenpräparat (Beispiel 2) 30
3 PCB45 Trockenpräparat (Beispiel 3) 70
4 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 4) 70
5 PCB-45 Trockenpräparat (Beispie! 5) 70
6 CEB-45 Trockenpräparat (Beispiel 6) 130
7 PCB-45 Trockenpräparat 70
(ohne Siabiiisaiorzusaiz)
8 CEB45 Trockenpräparat 70
(ohne Stabilisatorzusalz)
9 PCB-45 i)0 10 CEB45 90 Π BBM + Penicillin allein 0
Versuchsbeispiel B
Tabelle II
Ver- Präparat
Überlebens-
1 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 1) 60
2 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 2) 60
3 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 3) 60
4 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 4) 50
5 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 5) 50
6 CEB-45 Trockenpräparat (Beispiel 6) 60
7 PCB-45 Trockenpräparat 40
(ohne Stabilisatorzusatz)
8 CEB-45 Trockenpräparat 40
(ohne Stabilisatorzusatz)
9 BBM + Penicillin allein 0
Versuchsbeispiel C
Suspensionen lebender Zellen, die nicht der Behandlung mit Penicillin oder Cephalosporin unterworfen wurden und 3 Monate bei 37° C gelagert wurden, werden auf ihre Antitumorwirkung untersucht.
Gemäß Beispiel 7 hergestellte Trockenpräparate werden unmittelbar vor der Injektion in destilliertem Wasser in solcher Menge suspendiert, daß das Volumen
das gleiche ist, wie das der Suspension Vor dem Trocknen. Ferner werden 7 Tage alte Ehrlich-ascites-Carcinomzellen aus Mäusen isoliert, bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert einmal mit physiologi- > scher Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in soviel BBM suspendiert, daß eine Suspension mit 6 χ iO'Zellen/ml erhalten wird.
2 ml dieser Carcinomzellen-Suspension werden mit 5 ml einer Suspension der Trockenpräparate in
ίο destilliertem Wasser und I ml BBM vermischt und 90 Minuten bei 370C inkubiert. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wird einmal in einer Dosis von 0,5 ml/Maus Mäusen vom ddY-Stamm intraperitoneal injiziert. Je Versuchsgruppe werden 10 Mäuse verwen-
det. Die Überlebensrate der Mäuse nach 40 Tagen nach der Injektion ist in Tabelle III angegeben. Ih der Tabelle sind die Versuche 2 und 3 Kontrollversuche, und in Versuch 2 sind die Ergebnisse mit einem Präparat gezeigt, dem vor dem Trocknen destilliertes Wasser anstelle der wäßrigen Stabilisatorlösung zugesetzt wurde.
Tabelle III
25 Ver- Präparat
such
Überlebensrate
Die :n den Beispielen 1 bis 6 erhaltenen Trockenpräparate, die 3 Monate bei 37&C gelagert wurden, werden 30 — hinsichtlich ihrer Antitumorwirkung in gleicher Weise wie im Versuchsbeispiel A untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt. In dieser Tabelle sind die Versuche 7 bis 9 Kontrollversuche.
Trockenpräparat einer Suspension 50
lebender Zellen (Stabilisator zu
Rohrzucker)
Trockenpräparat einer Suspension 30
lebender Zellen (ohne Stabilisatorzusatz)
BBM allein 0
i-
45
50
55
60
65 /\U5 den crgconisscn ist cfäicniiicn, uau o'as erfindungsgemäß hergestellte Präparat eine sehr hohe Antitumorwirkung selbst nach längerer Lagerung besitzt.
Versuchsbeispiel D
Die gemäß Beispiel 8 bis 16 hergestellten Trockenpräparate werden unmittelbar nach ihrer Herstellung in destilliertem Wasser in solcher Menge suspendiert, daß das Volumen der erhaltenen Suspensionen gleich dem Volumen der Zellensuspensionen vor dem Trocknen ist. Die Suspensionen werden einzeln auf das zweifache durch Zusatz von BBM verdünnt, das 27 000 Einheiten/ml Penicillin enthält. Jeweils 0,1 ml der erhaltenen verdünnten Suspension werden einmal täglich über 5 Tage Mäusen vom ddY-Stamm intraperitoneal injiziert. Diese Mäuse wurden 24 Stunden vorher mit 106 Ehrlichascites-Carcinomzellen pro Maus gespritzt
Die Herstellung der Suspension in destilliertem Wasser und das Verdünnen der Trockenpräparate wird jeden Tag unmittelbar vor der Injektion durchgeführt. Pro Versuchsgruppe werden 10 Mäuse verwendet Die Oberlebensrate der Mäuse nach 40 Tagen ist in Tabelle IV angegeben. In dieser Tabelle sind die Versuche 1! bis 14 Kontrollversuche und die Versuche 10 und 11 zeigen die Ergebnisse mit Präparaten, bei denen das Trocknen unter Zusatz von destilliertem Wasser anstelle der wäßrigen Stabilisatorlösung durchgeführt wurde.
Tabelle IV Präparat Trockenpräparat (Beispiel 8) Über*
Ver Trockenpräparat (Beispiel 9) leberks-
such Trockenpräparat (Beispiel 10) rate
Nr. PCB45 Trockenpräparat (Beispiel H) 90
1 PCB45 Trockenpräparat (Beispiel 12) 90
2 PCB45 Trockenpräparat (Beispiel 13) 80
3 PCB45 Trockenpräparat (Beispiel 14) 80
4 PCB45 Trnekp.nnrännrat CBeisniel IS) 80
5 PCB45 Trockenpräparat (Beispiel 16) 70
6 PCB45 Trockenpräparat 70
7 PCR-IS (ohne Stabilisatorzusatz) 70
OCI CEB45 Trockenpräparat 90
9 PCB45 (ohne Stabilisatorzusatz) 70
IO
CEB45 70
H Penicillin allein
PCB45 Versuchsbeispiel E 90
12 CEB45 90
13 BBM + 0
14
Die in den Beispielen 8 bis 16 erhaltenen Trockenpräparate, die 3 Monate bei 37°C gelagert wurden, werden miteinander auf ihre Antitumorwirkung auf die gleiche Weise wie in Versuchsbeispiel D verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt. In dieser Tabelle sind sind die Versuche Nr. 10 bis 12 kontrollversuche, und die Versuche 10 und 11 zeigen die Ergebnisse mit Präparaten, bei denen das Trocknen durch Zusatz von destilliertem Wasser anstelle der wäßrieen StabilisatorlösuitSdurchEeführt wurde.
Tabelle V Präparat 8) Über
Ver 9) lebens-
such 10) rate
Nr. PCB45 Trockenpräparat (Beispiel H) 90
1 PCB45 Trockenpräparat (Beispiel 12) 90
2 PCB45 Trockenpräparat (Beispiel 13) 80
3 PCB45 Trockenpräparat (Beispiel 14) 80
4 PCB45 Trockenpräpsrat (Beispiel 15) 80
5 PCB45 Trockenpräparat (Beispiel 16) 70
6 PCB45 Trockenpräparat (Beispiel 60
7 PCB45 Trockenpräparat (Beispiel 60
8 CEB45 Trockenpriiparat (Beispiel 90
9 PCB45 Trockenpräparat 40
10 (ohne Stabüisatorzusatz)
CEB45 Trockenpräparat 40
11 (ohne Stabilisatorzusatz)
BBM + Penicillin allein 0
12
Versuchsbeispiel F
Es werden Suspensionen lebender Zellen auf ihre Antitumorwirkung untersucht, die keiner Behandlung niit Penicillin oder Cephalosporin C und 3 Monate bei 37°C gelagert wurden.
Gemäß Beispiel 17 hergestellte Trockenpräparate werden unmittelbar vor der Injektion in destilliertem Wasser in solcher Menge suspendiert, daß das Volumen der Suspension gleich dem Volumen der Suspension vor dem Trocknen ist. Andererseits werden 7 Tage alte Ehrlich-ascites-Carcinomzellen, die Mäusen vom ddY-Stamm intraperitoneal injiziert worden waren, isoliert, mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, einmal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in BBM in solcher Menge suspendiert, daß die Suspension 6 χ 107 Zellen/ml enthält. 2 ml dieser Carcinornzcücr. Suspension werden rrüt 5 m! einer Suspension der Trockenpräparate in destilliertem Wasser und 1 ml BBM vermischt und 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Die erhaltene Suspension wird einmal in einer Dosis von 0,5 ml/Maus Mäusen vom ddY-Stamm intraperitoneal injiziert. Je Versuchsgruppe werden 10 Mäuse verwendet. Die Überlebensrate der Mäuse nach 40 Tagen ist in Tabelle VI angegeben. In der Tabelle sind die Versuche Nr. 2 und 3 Kontrollversuche und Versuch 2 zeigt das Ergebnis mit einem Präparat, bei dem das Trocknen unter Zusatz von destilliertem Wasser an Stelle einer wäßrigen Stabilisatorlösung erfolgte.
Tabelle VI
Ver- Präparat
Überlebensrate
1 Trockenpräparat aus Suspension 70 lebender Zellen (Stabilisator zu I.-Arginin-hydrochlorid)
2 Trockenpräparat aus Suspension 30 lebender Zellen (ohne Stabilisatorzusatz)
3 BBM allein 0
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäß hergestellte Präparat selbst nach langer Lagerung eine hohe Antitumorwirkung besitzt
Versuchsbeispiel G
Carcinostatische Wirkung gegenüber verschiedenen Tumoren der Ratte
A) Hemmung des Wachstums von Ratten- Ascites-Hepatomzellen AH-13
a. Herstellung des Präparates
Das gemäß Beispiel l(b) hergestellte Präparat PCB45 wurde mit d,l-Methionin in einer Menge von 10 mg/50 KE versetzt (IKe=I klinische Einheit = 0,1 mg getrocknete Bakterienzellen) und gefriergetrocknet
b. Versuchsmethodik
Ratten (Stamm: DONRYU) erhielten durch intraperitoneale Injektion Ratten-Ascites-Hepatomzellen
AH-13 (ΙΟ6 Zellen/Tier). Gruppen zu je 10 Tieren wurden behandelt mit 150 oder 50 oder 30 oder 10 oder 5 oder 1 KE/kg (in Form des unter (a) angegebenen Präparates) oder mit Kulturmedium der Bakterien (Mischung aus Bernheimer's Basalmedium und Penicil-Iin) als Vergleich (Kontrolle); und zwar erhielten die Tiere 15 Tage lang täglich eine intraperitoneale Injektion. Die Behandlung wurde 24 Stunden nach der Beimpfung mit den Tumorzellen begonnen. Bis zu 60 Tagen nach der Beimpfung wurde die Zahl der überlebenden Tiere relativ zur Zahl der behandelten Ratten festgestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 und 2 dargestellt
Kontrolltiere, die nur Kulturmedium erhalten hatten, starben alle innerhalb 8 Tagen. Nach 15 Injektionen von 150, 50 oder 30 KE/kg/Tag blieben alle Tiere 60 Tage am Leben und nach 10 oder 5 KE/kg/Tag überlebten ca. 750/n Her Tier?.. Nach 15 Injektionen von 1 KE/kg/Tag starben alle Tiere ähnlich wie die Kontrollen innerhalb von 11 Tagen.
B) Hemmung des Wachstums von
Ratten-Ascites-Hepatomzellen AH-414
a. Herstellung des Präparates
Das gemäß Beispiel l(b) hergestellte Präparat PCB-45 wurde mit 1-Arginin-hydrochlorid in einer Menge von 20 mg/50 KE versetzt und gefriergetrocknet
b. Versuchsmethodik
Ratten (Stamm: DONRYU) erhielten durch intraperitoneale Injektion Ratten-Ascites-Hepatomzellen AH-414 (106 Zellen/Tier). Gruppen zu je 10 Tieren erhielten 10 Tage lang täglich intraperitoneal entweder 100 KE/kg in Form des unter (a) angegebenen Präparates oder 0,9%ige Kochsalzlösung (PSS) als Vergleichsbehandlung (Kontrolle). Die Behandlung wurde 72 Stunden nach der Beimpfung mit den Tumorzellen begonnen. Bis zu 60 Tagen nach der Beimpfung wurde die Zahl der überlebenden Tiere relativ zur Zahl der behandelten Tiere festgestellt Die Ergebnisse sind in F i g. 3 dargestellt.
Kontrolltiere, die isotonische Kochsalzlösung (PSS) erhalten hatten, starben alle innerhalb 25 Tagen. Nach 10 Injektionen von 100 KE/kg/Tag blieben ca. 90% der behandelten Tiere 60 Tage am Leben.
C) Hemmung des WadhsHims von
Ratten-Ascites-YOSHIDA-Sarkomzellen
(eines gegen N-Lost-N-Oxid resistenten Stamms).
a. Herstellung des Präparates
Wie in B).
b. Versuchsmelhodik
Wie in B). Die Ergebnisse sind in F i g. 4 dargestellt.
Kontrolltiere, die nur isotonische Kochsalzlösung erhalten hatten, starben alle innerhalb 15 Tagen. Nach 10 Injektionen von 100 KE/kg/Tag blieben ca. 90% der behandelten Tiere 60 Τη'Έ am Leben.
D) Hemmung des Wachstums von
Ratten-Ascites-Hepatomzellen AH-41 C
a. Herstellung des Präparates
Wie in B).
b. Versuchsmethodik
Wie in B). Die Ergebnisse sind in F i g. 5 dargestellt.
Kontrolltiere, die nur isotonische Kochsalzlösung erhalten hatten, starben alle innerhalb 20 Tagen. Nach 10 Injektionen von 100 KE/kg/Tag blieben ca. 50% der behandelten Tiere 60 Tage am Leben.
Inzwischen wurden erfindungsgemäß hergestellte Präparate auch klinisch geprüft; vgl. Gan-no-Rinsho (Japanese Journal of Cancer Clinics), Bd. 15 (1969), S. 1056 bis 1062. Bei 10 von 51 behandelten, an unheilbarem Krebs der verschiedensten Art erkrankten Patienten, wurde eine objektive Besserung festgestellt. Aus einer Arbeil von B. Toyota u. Mitarb., Japanese Journal of Otolaryngology, Bd. 72 (1969), S. 1332 bis 1338, geht hervor, daß bei der Behandlung von malignen Tumoren im Kopf und Hals mit dem erfindungsgemäß hergestellten Präparat bei 25 von 32 behandelten Patienten eine günstige Wirkung erzielt werden konnte.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Stabilisierung der carcinostatischen Wirksamkeit von Zellpräparaten haemolytischer, Streptolysin-S bildender Streptococcen, ei a durch gekennzeichnet, daß man
(a) eine Suspension der Streptococcen mit einem Disaccharid, Dextran, löslicher Stärke oder einer Aminosäure in einem Gewichtsverhähnis der trockenen Streptococcen zu Saccharid oder Aminosäure von 1 :0,5 bis 1 :5 versetzt und
(b) das erhaltene Gemisch bei höchstens 20°C und unter vermindertem Druck trocknet
2. Verfahren nach Anspruch I1 dadurch gekennzeichnet, daß man eine Suspension der haemolytischen Streptococcen verwendet, die durch Suspendieren der Zellen in Bernheimers Basalmedium, Zusatz einer Penicillinverbindung oder von Cephalosporin C und 10- bis 30minütiges Erhitzen auf 30 bis 37°C und 20- bis 40minüliges Erhitzen auf 38 bis 50° C erhalten worden ist.
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