DE1792390B2

DE1792390B2 - Verfahren zur Stabilisierung der carcinostatischen Wirksamkeit von Zellpraparaten haemolytischer, Streptolysin-S bildender Streptococcen

Info

Publication number: DE1792390B2
Application number: DE1792390A
Authority: DE
Inventors: Toyoo Kono; Takashi Itabashi Tokio Matsuno; Takao Tokio Noto; Haruki Tokio Ogawa; Hiroshi Musashino Okazaki; Motoharu Omiya Saitama Shiba; Shigeo Mitaka Suzuki; Sakae Wada; Akihiro Higashi Yamamoto
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1967-08-30
Filing date: 1968-08-28
Publication date: 1979-03-29
Also published as: FR8144M; DE1792390A1; DE1792390C3; CH545109A; CA953668A; US3632746A; GB1189935A; FR1587689A

Description

Bekanntlich besitzen lebende Zellen von haemolytischen Streptococcen, die die Fähigkeit zur Bildung von Streptolysin S haben, das eines der haemolytischen Streptococcentoxine ist, carcinostatische Wirkung. Diese lebenden Zellen werden seit kurzem zur Therapie von Tumoren verwendet; vgl. S. Koshimura u. Mitarb., The Japanese Journal of Experimental Medicine, Bd. 25 (1965), S. 93 bis !02 und H. O k a m ο t ο u. Mitarb., The Japanese Journal of Experimental Medicine, Bd. 36 (1966), S. 161 bis 174 und S. 175 bis 186. Wenn jedoch diese lebenden Zellen in Form von Suspensionen eingesetzt werden, ist ihre carcinostatische Wirkung ziemlich instabil, und es ist schwierig, die Suspension ohne Aktivitätsverlust zu lagern, bis sie verabreicht wird.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Zellpräparate haemoiytischer, Streptolysin S bildender Streptococcen zur Verfügung zu stellen, deren carcinostatische Wirksamkeit stabilisiert und selbst nach längerer Lagerung nicht verringert ist. Diese Aufgabe wird gemäß dem Kennzeichendes Anspruches 1 gelöst.

Die im Verfahren der Erfindung verwendete Zellensuspension kann z. B. eine Kulturbrühe haemoiytischer, Streptolysin S bildender Streptococcen sein, die durch Züchten der Bakterien in einem Fleischinfusionsmedium oder in einem hauptsächlich Hefeextrakt enthaltenden Nährmedium erhalten worden sind. Gewöhnlich verwendet man jedoch eine Suspension, die durch Suspendieren der aus der Kulturbrühe isolierten Bakterien in einem geeigneten Medium erhalten worden ist. Vorzugsweise wird als Suspendiermedium Bernheimers Basalmedium verwendet, das 1,35 g Maltose, 12 ml 20°/oige wäßrige Kaliumhydrogenphosphatlösung, eingestellt mit Natriumhydroxyd auf pH 6,9 bis 7,0, 24 ml 2%ige wäßrige Magnesiumsulfat · 7 H2O-Lösung und 132 ml destilliertes Wasser enthält. Nachstehend wird dieses Medium als »BBM« bezeichnet. Als Suspendiermedium kann man auch destilliertes Wasser, Kochsalzlösung, z. B. physiologische Kochsalzlösung, oder eine Phosphatpuffer enthaltende physiologische Kochsalzlösung verwenden. Zur Verstärkung der Antitumorwirkung der lebenden Zellen und zur

·τ> gleichzeitigen Verminderung der Toxizität und ihrer Fähigkeit zur Bildung von Streptolysin S. verwendet man vorzugsweise Suspensionen, denen Antibiotika einverleibt worden sind, z. B. tin Penicillin oder Cephalosporin C. Die auf diese Weise erhaltenen Suspensionen der lebenden Zellen werden 10 bis 30 Minuten auf 30 bis 38° C und hierauf 20 bis 40 Minuten auf 38 bis 50" C erhitzt. Man kann auch eine Suspension verwenden, die durch Isolieren der Zellen nach der vorstehend beschriebenen Behandlung und erneutes Suspendieren der Zellen in einem geeigneten Medium erhalten worden ist; vergl. The Japanese Journal of Experimental Medicine, Bd. 36 (1966), S. 161 bis 174 und S. 175 bis 186.

Spezielle Beispiele für Disaccharide, die im Verfahren der Erfindung als Stabilisator verwendet werden können, sind insbesondere Rohrzucker und Lactose. Diese Saccharide können entweder allein oder als Gemisch aus mindestens zwei dieser Saccharide verwendet werden.

Beispiele für Aminosäuren, die im Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind die nachstehend genannten Aminosäuren, die entweder in der D-, L- oder DL-Form verwendet werden:

Arginin, Ornithin und Methionin, die besonders wirksam sind, ferner Alanin, Asparaginsäure, Citrullin, Cystein, Cystin, Glutaminsäure, Glycin. Histidin, Hydroxyprolin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tyrosin und Valin. Diese Aminosäuren können entweder allein oder als Gemisch aus mindestens 2 dieser Aminosäuren verwendet werden. In vielen Fällen werden sie in Form der Hydrochloride oder ihrer Metallsalze verwendet.

Die optimale Menge des Saccharids oder der Aminosäure hängt von der Menge der Zellen in der Suspension und der Art des verwendeten Mediums ab. Im allgemeinen wird das Saccharid oder die Aminosäure in einem Gewichtsverhältnis der trockenen Zellen der haemolytischen Streptococcen zum Saccharid oder der Aminosäure von 1 :0,5 bis 1 :5 verwendet. Wenn man z. B. eine BBM-Suspension verwendet, die bei 20facher Verdünnung eine Absorption von etwa 0,5 bei 660 nm aufweist, gibt man das Saccharid oder die Aminosäure vorzugsweise in solcher Menge zu, daß die Konzentration etwa 1 bis 2% beträgt (Gewichtsverhältnis trockene Zellen zu Saccharid oder Aminosäure =1:1 bis 1 :3). Wenn die gleiche Suspension bei 40facher Verdünnung eine Absorption von 0,5 bis 660 nm aufweist, beträgt die Stabilisatorkonzentration vorzugsweise 3 bis 5% (Gewichtsverhältnis der trockenen Zellen zu Saccharid oder Aminosäure = 1 : 2 bis 1 :3).

Wird die Trocknung unter Erhitzen durchgeführt, fällt die Aktivität der Präparate ab. Deshalb wird die Trocknung bei Temperaturen von höchstens 20°C und insbesondere bei etwa — 10⁰C oder darunter und unter vermindertem Druck durchgeführt, solange Wasser in größeren Mengen vorliegt, und die Trocknung bei etwa 20° C beendet.

Die auf diese Weise erhaltenen Präparate besitzen praktisch die gleiche carcinostatische Wirkung wie die Suspension der lebenden Zellen vor dem 1 rocknen, und ihre Wirkung fällt auch nach längerer Lagerzeit nicht ab. Erforderlichenfalls kann man die Präparate zur Anwendung in Wasser oder einem anderen geeigneten Medium oder Lösungsmittel wieder suspendieren. Wenn man die Suspension der lebenden Zellen ohne Zusatz des Saccharids oder der Aminosäure trocknet und anschließend die trockenen Zellen mechanisch mit

dem Saccharid oder der Aminosäure vermischt, bleibt die carcinostatisch2 Wirkung nicht erhalten.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

(a) 300 g Hefeextrakt werden in 10 Liter destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 10%iger Natronlauge auf pH 7,0 bis 7,2 eingestellt und 60 Minuten auf 100⁰C erhitzt. Nach dem Abkühlen werden au.·, der Lösung ausgeschiedene unlösliche Stoffe abfiltriert, und der pH-Wert des Filtrats wird auf 7,0 bis 7,2 eingestellt. Anschließend wird das Filtrat in sterilisierte Kolben gegossen und 10 Minuten bei 120⁰C dampfsterilisiert. Diese Lösung wird für das Hefeextraktmedium verwendet. Sämtliche nachfolgenden Arbeitsgänge werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.

Das auf die vorstehend geschilderte Weise erhaltene Hefeexlraktmedium wird mit einer Kulturbrühe von Streptococcus haemolyticus Stamm Su (ATCC Nr. 21060) beimpft, die vorher 20 Stunden in 500 ml eines gewöhnlichen Fleischinfusionsmediums kultiviert worden war. Die Kultur im Hefeextraktmedium wird 20 Stunden bei 37°C unter statischen Bedingungen durchgeführt. Anschließend wird die Kulturbrühe mit Eis gekühlt, zentrifugiert, und die Bakterienzellen werden zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in 500 ml BBM suspendiert. Die erhaltene Suspension wird auf das 20fache verdünnt und zeigt eine Absorption von 0,47 bei 660 mn.

(b) 300 ml der erhaltenen BBM-Suspcnsion we-dcn mit 60 ml physiologischer Kochsalzlösung des Kaliumsalzes von Penicillin G (1,6 χ 10^Γ> Einheiten/ml) versetzt, und das Gemisch wird 20 Minuten auf 37°C und hierauf 30 Minuten auf 45"C erhitzt. Die auf diese Weise behandelte Suspension wird nachstehend als »PCB-45« bezeichnet.

(c) 50 ml der erhaltenen PCB-45-Suspension werden mit 50 ml 4%igcr wäßriger Rohrzuckcrlösung versetzt. Jeweils 2 ml des Gemisches werden unter sterilen Bedingungen in Reagenzgläser abgefüllt, 2 Stunden bei -30⁰C vorgefroren und anschließend 20 Stunden bei einer Temperatur von höchstens 20"C und einem Druck von 0,01 Torr getrocknet. Nach dem Trocknen wird das Vakuum durch Einleiten von steriler trockener Luft aufgehoben, und die Reagenzgläser werden sofort zugeschmolzen. Diese trockenen Präparate zeigten keine nennenswerte Verminderung der Antitumorwirkung nach 6monatigcin Lagern bei 37°C.

Beispiel 2

30 ml der gemäß Beispiel l(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden bei niedriger Temperatur zentrifugiert. Der Überstand wird abgegossen und die Fällung einmal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und dann in 2%iger wäßriger Rohrzuckerlösung auf 30 ml aufgefüllt und suspendiert. Jeweils 3 ml Anteile dieser Suspension werden in Reagenzgläser abgefüllt und hierauf gemäß Beispiel l(a) getrocknet.

Beispiel 3

30 ml der gemäß Beispiel l(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden mit 30 ml 4%iger wäßriger Lactoselösung versetzt. Jeweils 2 ml Anteile des Gemisches werden in Reagenzgläser gegeben und gemäß Beispiel l(c) getrocknet.

Beispiel 4

30 ml der gemäß Beispiel l(b) erhaltenen PCß-45

Suspension werden mit ?.O ml 4°/oiger wäßriger Dex-

■> tranlösung versetzt, jeweils 2 ml des erhaltenen Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel l(c) getrocknet.

Beispiel 5

κι 30 ml der gemäß Beispiel l(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden mit 30 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung von löslicher Stärke versetzt. Jeweils 2 ml des erhaltenen Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel l(c) getrocknet.

Beis piel 6

(a) 100 ml einer gemäß Beispiel l(a) erhaltenen BBM-Suspension lebender Zellen werden mit 20 ml physiologischer Kochsalzlösung versetzt, die 108 mg/ml

j» Cephalosporin C enthalten. Das Gemisch wird 20 Minuten auf 37"C und anschließend 30 Minuten auf 45°C erhitzt. Die erhaltene Suspension wird nachstehend als CEB-45-Suspension bezeichnet.

(b) 50 ml der erhaltenen CEB-45-Suspension werden 2~> mit 50 ml 4%iger wäßriger Rohrzuckcrlösung versetzt.

Jeweils 2 ml des erhaltenen Gemisches werden unter sterilen Bedingungen in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel l(c) getrocknet. Das Gefriertrocknen wird auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 so durchgeführt.

Beispiel 7

(a) Auf die gleiche Weise wie in Beispiel l(a) wird Streptococcus haemolyticus kultiviert und durch Abzen-

r> trifugiercn isoliert. Die erhaltenen lebenden Zellen werden in physiologischer Kochsalzlösung in einem Mengenverhältnis von 5 ml, bezogen auf die lebenden Zellen aus 100 ml des Kulturmediums, suspendiert. Nach dem 20fachen Verdünnen zeigt die erhaltene Suspen-

κι sion eine Absorption von 0,47 bei 660 ΐημ.

(b) 30 ml der erhaltenen Suspension in physiologischer Kochsalzlösung werden mit 30 ml 4%iger wäßriger Rohrzuckerlösung versetzt. Jeweils 2 ml des Gemisches werden in Reagenzgläser unter sterilen

π Bedingungen abgefüllt und gemäß Beispiel l(c) getrocknet.

Beispiel 8

(a) 300 g Hefeextrakt werden in 10 Liter destilliertem

->() Wasser gelöst. Die Lösung wird mit IO%iger Natronlauge auf pH 7,0 bis 7,2 eingestellt und 60 Minuten auf 100°C erhitzt. Nach dem Abkühlen der Lösung werden ausgefällte unlösliche Stoffe abfiltriert, und der pH-Wei ι des Filtrates wird erneut auf 7,0 bis 7,2

γ, eingestellt. Danach wird das Filtrat in sterilisierte Kolben gegossen und 10 Minuten bei 120⁰C dampfsterilisiert. Sämtliche nachfolgenden Arbeitsgänge werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.

Der erhaltene Hefeextrakt wird mit einer Kulturbrü-

ho he von Streptococcus haemolyticus Stamm Su (ATCC Nr. 21060) beimpft, der vorher 20 Stunden in 500 ml eines üblichen Fleischinfusionsmediums kultiviert worden war. Die Kultur in dem Hefeextraklmedium wird als statische Kultur 20 Stunden bei 37°C durchgeführt.

Hi Anschließend wird die Kulturbrühe mit Eis abgekühlt und zentrifugiert. Die erhaltenen Bakterienzellen werden zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in 500 ml BBM

suspendiert. Nach dem 20fachen Verdünnen zcigi diese Suspension eine Absorption von 0.48 bei 660 nm.

(b) JOO ml der erhaltenen BBM Suspension weiden mil 60 ml einer physiologischen Kochsalzlösung des Kaliumsalzcs von Penicillin G (1,6 χ 10'' Einhciten/ml) versetzt, das Gemisch wird 20 Minuten auf 37"C und hierauf 30 Minuten auf 45"C erhitzt. Die erhaltene Suspension wird nachstehend als PCB-45-Suspcnsion bezeichnet.

(c) 50 ml der PCB-45-Suspension werden mit 50 ml 4%iger wäßriger L-Arginin-hydrochloridlösung versetzt, leweils 2 ml des Gemisches werden in Reagenzgläser unter sterilen Bedingungen abgefüllt, 2 Stunden bei — 30⁰C vorgefroren und anschließend 20 Stunden bei einer Temperatur von höchstens 20⁰C und einem Druck von 0.01 Torr getrocknet. Nach dem Trocknen wird das Vakuum durch Einleiten von steriler, trockener Luft aufgehoben, und die Reagenzgläser werden sofort zugeschmolzen. Die erhaltenen Trockenpräparatc zeigten selbst nach ömonatigcr Lagerung bei 37°C keine nennenswerte Verminderung der Antitumorwirkung.

Beispiel 9

30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden bei niedriger Temperatur zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert und die Fällung einmal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und hierauf in 30 ml 2%iger wäßriger L-Arginin-hydrochlorid-Lösung suspendiert. Jeweils 1 ml Anteile dieser Suspension werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c) getrocknet.

Beispiel 10

30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden mit 30 ml 40%iger wäßriger L-Ornithin-hydrochlorid-Lösung versetzt, lcwcils 2 ml Anteile des Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c) getrocknet.

Beispiel Il

JO ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspcnsion werden mit 30 ml 4%iger wäßriger I.-Methiomn-Lösung versetzt. Jeweils 2 ml Anteile des Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c) getrocknet.

Beispiel 12

30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden mit 30 ml 4%iger wäßriger L-Cystein-Lösung versetzt. Jeweils 2 ml Anteile des Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(a) getrocknet.

Beispiel 13

30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werdet mit 30 ml einer 4°/oigen wäßrigen Lösung des Natriumsalzes der L-Asparaginsäure versetzt. Jeweils 2 ml Anteile des Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(C) getrocknet.

Beispiel 14

30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-Suspension werden mit 30 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung des Natriumsalzes von L-Glulaminsäure versetzt. Jeweils 2 ml des erhaltenen Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c) set rock net.

Beispiel 15

30 ml der gemäß Beispiel 8(b) erhaltenen PCB-45-

Suspensioii werden mit 30 ml 4%igcr wäßriger

-, L-Thrconinlösung versetzt. Jeweils 2 ml des erhaltenen Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c) getrocknet.

Beispiel 16

(a) 100 ml einer gemäß Beispiel 8(a) erhaltenen BBM-Suspension lebender Zellen werden mit 20 ml physiologischer Kochsalzlösung versetzt, die 108 mg/ml Cephalosporin C enthält, und das Gemisch wird 20

i) Minuten auf 37⁰C und hierauf 30 Minuten auf 45°C erhitzt. Diese Suspension wird nachstehend als CEB-45-Suspcnsion bezeichnet.

(b) 5 ml der erhaltenen CEB-45-Suspcnsion werden mit 50 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung von

:o L-Arginin-hydrochlorid versetzt. Jeweils 2 ml dieses Gemisches werden in Reagenzgläser unter sterilen Bedingungen abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c) getrocknet. Die Gefriertrocknung wird auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 durchgeführt.

Beispiel 17

(a) Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8(a) wird Streptococcus haemolyticus gezüchtet und durch

id Zentrifugieren isoliert. Die erhaltenen lebenden Zellen werden in physiologischer Kochsalzlösung in einer Menge von 5 ml, bezogen auf die lebenden Zellen, aus 100 ml des Kulturmediums suspendiert.

Die erhaltene Suspension zeigt nach 20fachcr

i"i Verdünnung eine Absorption von 0,47 bei 660 nm.

(b) 30 ml der erhaltenen Suspension in physiologischer Kochsalzlösung werden mit 30 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung von L-Arginin-hydrochlorid versetzt. Jeweils 2 ml dieses Gemisches werden in Reagenzgläser

in unter sterilen Bedingungen abgefüllt und gemäß Beispiel 8(c) getrocknet.

Mit den Präparaten der Erfindung sowie Kontrollpräparaten werden die nachstehend erläuterten Versuche durchgeführt.

Versuchsbeispiel A

Die gemäß Beispiel 1 bis 6 erhaltenen Trockenpräparatc werden unmittelbar nach ihrer Herstellung in

•.ο destilliertem Wasser in solchen Mengen suspendiert, daß das Volumen der erhaltenen Suspension gleich dem Volumen der Zellensuspcnsionen vor dem trocknen ist. Die Suspensionen werden durch Zusatz von BBM, das 27 000 Einheiten/ml Penicillin enthält, auf das zweifache

5-3 verdünnt. Jeweils 0,1 ml der erhaltenen verdünnten Suspensionen werden einmal täglich für 5 Tage Mäusen des ddY-Stammes intraperitoneal injiziert, denen 24 Stunden vorher intraperitoneal 10⁶ Ehrlich-ascites-Carcinomzellen je Maus injiziert worden waren. Die

mi Herstellung der Suspension in destilliertem Wasser und das Verdünnen der Trockenpräparate wurde täglich unmittelbar vor der Injektion durchgeführt. Für jede Versuchsgruppe wurden 10 Mäuse verwendet. Die Oberlebensrate der Mäuse 40 Tage nach Beginn der

«v"> Injektion (Verhältnis der überlebenden Mäuse zur Gesamtzahl der Mäuse) ist in Tabelle I angegeben. In der Tabelle sind die Versuche Nr. 7 bis 11 Kontrollversuche.

Tabelle I

Ver- Präparat

1 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 1)

2 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 2)

3 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 3)

4 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 4)

5 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 5)

6 CEB-45 Trockenpräparat (Beispiel 6)

7 PCB-45 Trockenpräparat

(ohne Stabilisatorzusatz)

8 CEB-45 Trockenpräparat

(ohne Stabilisatorzusatz)

9 PCB-45

10 CEB-45

11 BBM + Penicillin allein

Versuchsbeispiel B

Die in den Beispielen I bis 6 erhaltenen Trockenpräparate, die 3 Monate bei 37°C gelagert wurden, werden hinsichtlich ihrer Antitumorwirkung in gleicher Weise wie im Versui_hsbeispiel A untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle Il zusammengestellt. In dieser Tabelle sind die Versuche 7 bis 9 Kontrollversuche.

das gleiche ist, wie das der Suspension vor dem

Trocknen. Ferner werden 7 Tage alte Ehrlich-ascites-

Übcr- Carcinomzellen aus Mäusen isoliert, bei niedriger

lebens- Geschwindigkeit zentrifugiert, einmal mit physiologirale ϊ scher Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in ο/ soviel BBM suspendiert, daß eine Suspension mit

_^_ 6 χ 10⁷Zellen/ml erhalten wird.

2 ml dieser Carcinomzellen-Suspension werden mit 5 ml einer Suspension der Trockenpräparate in ι» destilliertem Wasser und 1 ml BBM vermischt und 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wird einmal in einer Dosis von 0,5 ml/Maus Mäusen vom ddY-Stamm intraperitoiieal injiziert. Je Versuchsgruppe werden 10 Mäuse verwen^r> det. Die Überlebensrate der Mäuse nach 40 Tagen nach der Injektion ist in Tabelle III angegeben. In der Tabelle sind die Versuche 2 und 3 Kontrollversuche, und in Versuch 2 sind die Ergebnisse mit einem Präparat gezeigt, dem vor dem Trocknen destilliertes Wasser 2» anstelle der wäßrigen Stabilisatorlösung zugesetzt wurde.

80 80 70 70 70 80 70

70

90

Tabelle III

Ver- Präparat

such

Nr.

Uber-

lebens-

rate

Tabelle II	Präparat	Trockenpräparat (Beispiel	1)	Über
Ver		Trockenpräparat (Beispiel	2)	lebens-
such		Trockenpräparat (Beispiel	3)	rate
Nr.	PCB-45	Trockenpräparat (Beispiel	4)	60
1	PCB-45	Trockenpräparat (Beispiel	5)	60
2	PCB-45	Trockenpräparat (Beispiel	6)	60
3	PCB45	Trockenpräparat		50
4	PCB45	(ohne Stabilisatorzusatz)		50
5	CEB-45	Trockenpräparat		60
6	PCB-45	(ohne Stabilisatorzusatz)		40
7		Penicillin allein
	CEB-45	Versuchsbeispiel C		40
8
	BBM +		0
9

Suspensionen lebender Zellen, die nicht der Behandlung mit Penicillin oder Cephalosporin unterworfen wurden und 3 Monate bei 37°C gelagert wurden, werden auf ihre Antitumorwirkung untersucht

Gemäß Beispiel 7 hergestellte Trockenpräparate werden unmittelbar vor der Injektion in destilliertem Wasser in solcher Menge suspendiert, daß das Volumen

1 Trockenpräparat einer Suspension 50

lebender Zellen (Stabilisator zu
Rohrzucker)

j-, 2 Trockenpräparat einer Suspension 30

lebender Zellen (ohne Stabilisatorzusatz)

3 BBM allein 0

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäß hergestellte Präparat eine sehr hohe Antitumorwirkung selbst nach längerer Lagerung besitzt.

>

Versuchsbeispiel D

Die gemäß Beispiel 8 bis 16 hergestellten Trockenpräparate werden unmittelbar nach ihrer Herstellung in destilliertem Wasser in solcher Menge suspendiert, daß

ίο das Volumen der erhaltenen Suspensionen gleich dem Volumen der Zellensuspensionen vor dem Trocknen ist. Die Suspensionen werden einzeln auf das zweifache durch Zusatz von BBM verdünnt, das 27 000 Einheiten/ml Penicillin enthält. Jeweils 0,1 ml der erhaltenen verdünnten Suspension werden einmal täglich über 5 Tage Mäusen vom ddY-Stamm intraperitoneal injiziert Diese Mäuse wurden 24 Stunden vorher mit 10⁶ Ehrlichascites-Carcinomzellen pro Maus gespritzt

Die Herstellung der Suspension in destilliertem

bo Wasser und das Verdünnen der Trockenpräparate wird jeden Tag unmittelbar vor der Injektion durchgeführt. Pro Versuchsgruppe werden 10 Mäuse verwendet Die Oberlebensrate der Mäuse nach 40 Tagen ist in Tabelle IV angegeben. In dieser Tabelle sind die Versuche 11 bis 14 Kontrollversuche und die Versuche 10 und 11 zeigen die Ergebnisse mit Präparaten, bei denen das Trocknen unter Zusatz von destilliertem Wasser anstelle der wäßrigen Stabilisatorlösung durchgeführt wurde.

Tabelle IV

Ver- Präparat
such

Uber-

lebens-

ratc

II/ /Il

1 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 8) 90

2 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 9) 90

3 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 10) 80

4 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 11) 80

5 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 12) 80

6 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 13) 70

7 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 14) 70

8 PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 15) 70

9 CEB45 Trockenpräparat (Beispiel 16) 90

10 PCB45 Trockenpräparat 70

(ohne Stabilisatorzusatz)

11 CEB-45 Trockenpräparat 70

(ohne Stabilisatorzusatz)

12 PCB-45 90

13 CEB45 90

14 BBM + Penicillin allein 0

Versuchsbeispiel E

Die in den Beispielen 8 bis 16 erhaltenen Trockenpräparate, die 3 Monate bei 37°C gelagert wurden, werden miteinander auf ihre Antitumorwirkung auf die gleiche Weise wie in Versuchsbeispiel D verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt. In dieser Tabelle sind sind die Versuche Nr. 10 bis Kontroll versuche, und die Versuche 10 und 11 zeigen die Ergebnisse mit Präparaten, bei denen das Trocknen durch Zusatz von destilliertem Wasser anstelle der wäßrigen Stabilisatorlösung durchgeführt wurde.

Tabelle V	Präparat	Trockenpräparat (Beispiel	8)	Über
Ver		Trockenpräparat (Beispiel	9)	lebens-
such		Trockenpräparat (Beispiel	10)	rate %
Nr.	PCB-45	Trockenpräparat (Beispiel	11)	90
1	PCB45	Trockenpräparat (Beispiel	12)	90
2	PCB45	Trockenpräparat (Beispiel	13)	80
3	PCB-45	Trockenpräparat (Beispiel	14)	80
4	PCB-45	Trockenpräparat (Beispiel	15)	80
5	PCB-45	Trockenpräparat (Beispiel	16)	70
6	PCB45	Trockenpräparat		60
7	PCB45	(ohne Stabilisatorzusatz)		60
8	CEB45	Trockenpräparat		90
9	PCB45	(ohne Stabilisatorzusatz)		40
10		Penicillin allein
	CEB-45			40
11
	BBM +		0
12

Versuchsbeispiel F

Es werden Suspensionen lebender Zellen auf ihre Antitumorwirkung untersucht, die keiner Behandlung mit Penicillin oder Cephalosporin C und 3 Monate bei 37°C gelagert wurden.

Gemäß Beispiel 17 hergestellte Trockenpräparate werden unmittelbar vor der Injektion in destilliertem Wasser in solcher Menge suspendiert, daß das Volumen der Suspension gleich dem Volumen der Suspension vor dem Trocknen ist. Andererseits werden 7 Tage alte Ehrlich-ascites-Carcinomzellen, die Mäusen vom ddY-Stamm intraperitoneal injiziert worden waren, isoliert, mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, einmal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in BBM in solcher Menge suspendiert, daß die Suspension 6 χ 10⁷ Zellen/ml enthält. 2 ml dieser Carcinomzellen-Suspension werden mit 5 ml einer Suspension der Trockenpräparate in destillieriem Wasser und 1 ml BBM vermischt und 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Die erhaltene Suspension wird einmal in einer Dosis von 0,5 ml/Maus Mäusen vom ddY-Slamm intraperitoneal injiziert. Je Versuchsgruppe werden 10 Mäuse verwendet. Die Überlebensrate der Mäuse nach 40 Tagen ist in Tabelle Vl angegeben. In der Tabelle sind die Versuche Nr. 2 und 3 Kontrollversuche und Versuch 2 zeigt das Ergebnis mit einem Präparat, bei dem das Trocknen unter Zusatz von destilliertem Wasser an Stelle einer wäßrigen Stabilisatorlösung erfolgte.

Tabelle Vl

Ver- Präparat Über-

such lebens-

Nr. rate

1 Trockenpräparat aus Suspension 70
lebender Zellen (Stabilisator zu
L-Arginin-hydrochlorid)

2 Trockenpräparat aus Suspension 30
lebender Zellen (ohne Stabilisatorzusatz)

3 BBM allein 0

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäß hergestellte Präparat selbst nach langer Lagerung eine hohe Antitumorwirkung besitzt.

Versuchsbeispiel G

Carcinostatische Wirkung gegenüber verschiedenen
Tumoren der Ratte

A) Hemmung des Wachstums von
Ratten- Ascites- Hepatomzellen A H-13

a. Herstellung des Präparates

Das gemäß Beispiel l(b) hergestellte Präparat PCB-45 wurde mit d,l-Methionin in einer Menge von 10 mg/50 KE versetzt (IKe = I klinische Einheit = 0,1 mg getrocknete Bakterienzellen) und gefriergetrocknet

b. Versuchsmethodik

Ratten (Stamm: DONRYU) erhielten durch intraperitoneale Injektion Ratten-Ascites-Hepatomzellen

AH-13 (ΙΟ⁶ Zellen/Tier). Gruppen zu je 10 Tieren wurden behandelt mit 150 oder 50 oder 30 oder 10 oder 5 oder 1 KE/kg (in Form des unter (a) angegebenen Präparates) oder mit Kulturmedium der Bakterien (Mischung aus Bernheimer's Basalmedium und Penicil- ^ri lin) als Vergleich (Kontrolle); und zwar erhielten die Tiere 15 Tage lang täglich eine intraperitoneale Injektion. Die Behandlung wurde 24 Stunden nach der Reimpfung mit den Tumorzellen begonnen. Bis zu 60 Tagen nach der Beimpfung wurde die Zahl der κι überlebenden Tiere relativ zur Zahl der behandelten Ratten festgestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. I und 2 dargestellt.

Kontrolltiere, die nur Kulturmedium erhalten hatten, starben alle innerhalb 8Tagen. Nach 15 Injektionen von ι-, 150, 50 oder 30 KE/kg/Tag blieben alle Tiere 60 Tage am Leben und nach 10 oder 5 K E/kg/Tag überlebten ca. 75% der Tiere. Nach 15 Injektionen von 1 KE/kg/Tag starben alle Tiere ähnlich wie die Kontrollen innerhalb von 11 Tagen. 2ii

B) Hemmung des Vv achstums von
Ratten-Ascites-Hepatomzellen A H-414

a. Herstellung des Präparates

2 j

Das gemäß Beispiel l(b) hergestellte Präparat PCB-45 wurde mit 1-Arginin-hydrochlorid in einer Menge von 20 mg/50 KE versetzt und gefriergetrocknet.

b. Versuchsmethodik

Ratten (Stamm: DONRYU) erhielten durch intraperitoneale Injektion Ratten-Ascites-Hepatomzellen AH-414 (1O⁶ Zellen/Tier). Gruppen zu je 10 Tieren erhielten 10 Tage lang täglich intraperitoneal entweder r> 100 KE/kg in Form des unter (a) angegebenen Präparates oder 0,9%ige Kochsalzlösung (PSS) als Vergleichsbehandlung (Kontrolle). Die Behandlung wurde 72 Stunden nach der Beimpfung mit den Tumorzellen begonnen. Bis zu 60 Tagen nach der -to Beimpfung wurde die Zahl der überlebenden Tiere relativ zur Zahl der behandelten Tiere festgestellt. Die Ergebnisse sind in F i g. 3 dargestellt.

Kontrolliere, die isotonische Kochsalzlösung (PSS) erhalten hatten, starben alle innerhalb 25 Tagen. Nach 10 Injektionen von 100 KE/kg/Tag blieben ca. 90% der behandelten Tiere 60Tage am Leben.

C) Hemmung des Wachstums von

Ratten-Ascites-YOSHIDA-Sarkomzellen

(eines gegen N-Lost-N-Oxid resistenten Stamms).

a. Herstellung des Präparates

Wie in B).

b. Versuchsmethodik

Wie in B). Die Ergebnisse sind in F i g. 4 dargestellt.

Kontrolltiere, die nur isotonische Kochsalzlösung erhalten hatten, starben alle innerhalb 15 Tagen. Nach 10 Injektionen von 100 KE/kg/Tag blieben ca. 90% der behandelten Tiere 60Tage am Leben.

D) Hemmung des Wachstums von
Ralten-Ascites-Hepatomzellen AH-41 C

a. Herstellung des Präparates

Wie in B).

b. Versuchsmethodik

Wie in B). Die Ergebnisse sind in F i g. 5 dargestellt.

Kontrolltiere, die nur isotonische Kochsalzlösung erhalten hatten, starben alle innerhalb 20 Tagen. Nach 10 Injektionen von 100 KE/kg/Tag blieben ca. 50% der behandelten Tiere 60Tage am Leben.

Inzwischen wurden erfindungsgemäß hergestellte Präparate auch klinisch geprüft; vgl. Gan-no-Rinsho (lapanese Journal of Cancer Clinics). Bd. 15 (1969), S. 1056 bis 1062. Bei 10 von 51 behandelten, an unheilbarem Krebs der verschiedensten Art erkrankten Patienten, wurde eine objektive Besserung festgestellt. Aus einer Arbeit von B. Toyota u. Mitarb., lapanese Journal of Otolaryngology, Bd. 72 (1969), S. 1332 bis 1338, geht hervor, daß bei der Behandlung von malignen Tumoien im Kopf und Hals mit dem erfindungsgemäß hergestellten Präparat bei 25 von 32 behandelten Patienten eine günstige Wirkung erzieh werden konnte.

Hierzu 2 Blatt Zeichnuimen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Stabilisierung der carcinostatischen Wirksamkeit von Zellpräparaten haemolytischer, Streptolysin-S bildender Streptococcen, d a durch gekennzeichnet, daß man

(a) eine Suspension der Streptococcen mit einem Disaccharid, Dextran, löslicher Stärke oder einer Aminosäure in einem G^wichtsverhältnis 1» der trockenen Streptococcen zu Saccharid oder Aminosäure von 1 :0,5 bis 1 :5 versetzt und

(b) das erhaltene Gemisch bei höchstens 20⁰C und unter vermindertem Druck trocknet

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Suspension der haemolytischen Streptococcen verwendet, die durch Suspendieren der Zellen in Bernheimers Basalniedium, Zusatz einer Penicillinverbindung oder von Cephalosporin C und 10- bis 30minütiges Erhitzen auf 30 bis 37°C und 20- bis 40minütiges Erhitzen auf 38 bis 50⁰C erhalten worden ist.