DE1792390A1 - Getrocknetes stabiles Praeparat mit Antitumorwirkung,das Zellen von haemolytischen Streptococcen enthaelt sowie Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents
Getrocknetes stabiles Praeparat mit Antitumorwirkung,das Zellen von haemolytischen Streptococcen enthaelt sowie Verfahren zu seiner HerstellungInfo
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Description
• HONCHIHM - «lEQESSTHASSEa« · TfLtPONHMtT · TILEQIIAMM-ADIICtSE: IHVENT/MDNCHEH
28. Aug. 1968
UoZc: D 485 (Vo/kä)
POS - 15 117
CHÜGAI SEIYJKU KABCSHlKI KAISHA Tokyo, Japan
"Getrocknetes 3tabile3 Präparat mit Antitumorwirkung, das Zellen von hämolytischen Streptococcen enthält
sowie Verfahren zu seiner Herstellung"
Priorität: 3o. August 1967* Japan, Anmelde-Nr.: 55 178/67 und 55 179/6-7
Sie Erfindung betrifft getrocknete stabile Präparate mit Antitumorwirkung, die Zellen von hämolytischen Streptococcen
mit Antitumoraktivität enthalten, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Bekanntlich besitzen lebende Zellen von hämolytischen Streptococcen, die die Fähigkeit zur Bildung von Streptolysin
S haben, das eines der hämoiytischen Streptococcentoxine
ist, Antitumoraktivität. Diese lebenden Zellen werden seit kurzem zur Therapie von Tumoren verwendet,. Wenn jadoch
diese lebenden Zellen in Form von Suspensionen eingesetzt
werden, is-t ihre Antifcumorwirkung ziemlich instabil, u.id ei
209817/1416 ^1.,
BAD ORlGlNAI.
ist schwierig, die Suspension ohne Verringerung der AntLtu-■orwirkung zu lagern, bis sie verabreicht wird.
Aufgabe der Erfindung let es, stabile Präparate von hä,ao~
Iytischen Streptococcen zur Verfügung zu stellen, deren
Antitumoraktivität selbet nach längerer Lagerung nicht verringert ist. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein
Verfahren zur Herstellung derartiger Präparate zur Verf igun*; zu stellen.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur He >■
stellung stabiler Präparate mit Antitumorwirkung, die Ziller
Ton hämolytisehen Streptococcen enthalten, welches dadurch
gekennzeichnet ist, dass man eine Zellensuspension hämo .y~
tischer Streptococcen mit einem Disaccharid oder Polysajcharid, nachstehend kurz als Saccharid bezeichnet, oder ei:ier
Aminosäure versetzt und das erhaltene Gemisch trocknet.
Die im Verfahren der Erfindung verwendete Zellensuspens on
kann z.B. eine Kulturbrühe hämolytischer Streptococcen »ein,
die durch Züchten der Bakterien in eines Fleischlnfusione-■edium oder in einem hauptsächlich Hefeextrakt enthalte:iden
lährmedium erhalten worden sind» Gewöhnlich verwendet m;in
jedoch eine Suspension, die durch Suspendieren der aus ler
Kulturbrühe isolierten Bakterien in einem geeigneten Medium erhalten worden ist. Vorzugsweise wird als Suspendlermeilium
Bernheimers* Basalmedium verwendet, das 1,35 g Maltoset
12 ml 20 f^igß wässrige Kaliumdihydrogenphosphatlöeung, ein
gestellt mit Natriumhydroxyd auf Pjj 6,9 ble 7fO, 24 ml
ige waserige Magnesiumsulfat,TH0O Lösung und 132 ml
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BAD ORIQfNAL
destilliertes Wasser enthält* Nachstehend wird dieses Ilediua
als "BBM* bezeichnet. Als Suspendiermedium kann nan auch
destilliertes Wasser, Kochsalzlösung, 8.B. physiologische Kochsalzlösung, oder eine Phosphatpuffer enthaltende
physiologische Kochsalzlösung verwenden. Zur Verstärkung der Antitumorwirkung der lebenden Zellen und zur gleichzeitigen Verminderung der Toxizität und ihrer Fähigkeit zur
Bildung von Streptolysin S, verwendet man vorzugsweise Suspensionen, denen Antibiotika einverleibt worden sind, ;;.B.
ein Penicillin oder Cephalosporin C. Die auf diese Weine erhaltenen Suspensionen der lebenden Zellen werden 10 bis
30 Minuten auf 30 bis 380C und hierauf 20 bis 40 Minuton auf
38 bis 50 C erhitzt· Man kann auch eine Suspension verwenden,
die durch Isolieren der Zellen nach der vorstehend beschriebenen Behandlung und erneutes Suspendieren der Zellen :.n
einen geeigneten Medium erhalten worden ist.
Beispiele für Saccharide, die im Verfahren der Erfindung als
Stabilisatoren verwendet werden können, sind insbesondere Rohrzucker, Lactose, Dextran und lösliche Stärk·, da s:<.e besonders wirksam sind* Diese Saccharide können entweder allein
oder als Gemisch aus mindestens 2 dieser Saccharide veirwencet
werden.
Beispiele für Aminosäuren, die im Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind die nachstehend genannten Aminosäuren, die entweder in der D-, L- oder DL= Form verwände·*
werden:
«AD ORIGINAL 209817/U16
Arginin, Ornithin und Methionin sind besonders wirksam.
Alanin, Asparaginsäure, Citrullin, Cyetein, Cystin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Hydroxyprolin, Isoleucin, Lauein,
Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tyrosin und VaIiA sind
ebenfalls wirksam. Diese Aminosäuren können entweder allein oder als Gemisch aus mindestens 2 dieser Aminosäuren verwendet werden. In vielen Fällen werden sie in Form der Hydrochloride oder ihrer Metallsalze verwendet.
Die optimale Menge des Saccharide oder der Aminosäure hingt von der Menge der Zellen in der Suspension und der Art iee
verwendeten Mediums ab. Im allgemeinen wird das Saccharid oder die Aminosäure in einem Gewichtsverhältnis der troskenon
Zellen der hämolytischen Streptococcen turn Saccharid odar der
Aminosäure von etwa 1 : 0,5 bis 1 : 5 verwendet. Wenn man E.B. eint BBM-Suspension verwendet, die bei 20-facher Yardünnung eine Absorption von etwa 0,5 bei 660 mu aufweist,
gibt man das Saccharid oder die Aminosäure vorzugsweise in solcher Menge su, dass die Konzentration etwa 1 bis 2 f>
beträgt (Gewichtsverhältnis trockene Zellen gu Saccharid oder Aminosäure «1:1 bis 1:3)· Wenn die gleiche Suspension
bei 40-facher Verdünnung eine Absorption von 0,5 bei 660 au aufweist, beträgt die Stabilisatorkonzentratlon vorzugsweise
3 bis 5 1» (Gewichtsverhältnis der trockenen Zellen zu Saccharid oder Aminosäure =1:2 bis 1:3).
Beim Trocknen der Suspension im erfindungsgemä3sen Verf.ihrer
ist keine besondere Sorgfalt erforderlich, die Bakterien Iebensfähig zu erhalten. Aus diesem Grunde sind die Trockaungt
bedingungen in dieser Hinsicht nicht beschränkt. Wenn man j<·
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ORiGiNAL
doch die Trocknung unter Erhitzen durchfuhrt, fällt die Ant:.-tumorwirkung des Präparates ab. Xn der Praxis zieht man es
daher vor, die Trocknung bei Temperaturen von höchstens 200O
und insbesondere bei etwa -100C oder darunter und unter vermindertem Druck durchzuführen, solange Wasser in grösseren
Mengen vorliegt, und die Trocknung bei etwa 200C zu beendigen.
Bas auf diese Weise erhaltene Präparat besitzt praktisch dio
gleiche Antitumorwirkung, wie die Suspension der lebenden Zöllen vor dem trocknen, und ihre Wirkung fällt auch nach langorer Lagerzeit nicht ab. Erforderlichenfalls kann man das Präparat zur Anwendung in Wasser oder einem anderen geeigneten
Medium oder Lösungsmittel wieder suspendieren. Wenn ttax) die
Suspension der lebenden Zellen ohne Zusatz des Saocharila
oder der Aminosäure trocknet und ansohllessend die trockenen
Zellen mechanisch mit dem Saccharid oder der Aminosäure vermischt, bleibt die Antitumorwirkung nicht erhalten»
(a) 300 g Hefeextrakt werden in 10 Liter destilliertem Wastor
gelöst. Die Lösung wird mit 10 jt-lger Natronlauge auf p^ 7,0
bis 7|2 eingestellt und 60 Minuten auf 10O0C erhitzt. Nach
dem Abkühlen werden aus der Lösung ausgeschiedene unlösliche Stoffe abfiltriert, und der powert des Piltrats wird aaf 7 0
bis 7,2 eingestellt. Anschliessend wird das Filtrat in 3ter:.~
lisierte Kolben gegossen und 10 Minuten bei 1200C dampf3ter:.-lißiert. Diese Lösung wird für das Hefeextraktmedium verwendet. Sämtliche nachfolgenden Arbeitsgänge werden untsr s ;e-
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rilen Bedingungen durchgeführt.
Sas auf die vorstehend geschilderte Weise erhaltene Heleextraktmediuffl wird mit einer KuItürbrühe von Streptococcus
hemolyticus Stamm Su (ATCC Xr. 21060) beimpft, die vorher
20 Stunden in 500 ml eines gewöhnlichen Pleischinfuaiorenediums kultiviert worden war. Die Kultur im Hefeextraktaediua
wird 20 Stunden bei 370C unter statischen Bedingungen <!urohgeführt. Anschliessend wird die Kulturbrühe alt Sie gekühlt,
zentrifugiert, und die Bakterienzellen werden zweimal ο it
kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaechen und amohliassend in 500 ml BBM euependiert. Die erhaltene Suspension wird
auf das 20-fache verdünnt und zeigt eine Absorption vor 0,47
bei .660 au.
(b) 300 ml der erhaltenen BBM-Suspension werden mit 60 ml
physiologischer Koohaalelöeung des Kallumsalsea von Penicillin
ΰ (1,6 χ ΙΟ5 Sinneiten/ml) versetzt,und das Genieoh wird
20 Minuten auf 370O und hierauf 30 Minuten auf 450C erhitzt.
Die auf diese Weise behandelte Suspension wird nachstellen als"PCB-45" bezeichnet.
(o) 50 ml der erhaltenen PCB-45-Suepeneion werden mit 50 ml
4 jt-iger wässriger Rohrzuckerlesung versetzt. Jeweils I ml
des Gemisches werden unter sterilen Bedingungen in Reagenzgläser abgefüllt, 2 Stunden bei -300C vorgefroren und mschlieseend 20 Stunden bei einer Temperatur von höchstane
200C und einejn Druck von 0,01 Torr getrocknet. Haeh den
Trocknen wird das Vakuum durch Einleiten von steriler trockener Luft aufgehoben, und die Reagenzgläser werden sofort zu-·
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geschmolzen. Biese trockenen Präparate zeigten keine nennenswerte Verminderung der Antitumorwirkung nach 6 monatigem Lagern bei 370C.
30 al der gemäße Beispiel 1 (b) erhaltenen PCB~45-Suspension
werden bei niedriger Temperatur zentrifugiert. Der überstand
wird abgegossen und die Fällung einaal mit kalter phyeiologL-soher Kochsalzlösung gewaschen und dann in 2 £-iger wäcerigsr
Rohrzuckerlösung auf 30 ml aufgefüllt und suspendiert. Jeweils 1 al Anteile dieser Suspension werden in Rqagensglaser
abgefüllt und hierauf gemäss Beispiel 1 (o) getrocknet.
30 ml der gemäss Beispiel 1 (b) erhaltenen PCB-45-Susptnsioa
werden Bit 30 ml 4 jt-iger wässriger Lactoeelösung versetzt.
Jeweils 2 ml Anteile des Gemisches werden in Reagenzgläser gegeben und geaäss Beispiel 1 (o) getrocknet.
30 al der geaäss Beispiel 1 (b) erhaltenen PCB-45-Susp*nsion
werden mit 30 al 4 jt-iger wässriger Dextranlösung versetzt.
Jeweils 2 al des erhaltenen Gemisches werden in Reagem.gläser abgefüllt und geaäss Beispiel 1 (c) getrocknet.
30 ml der gemäas Beispiel 1 (b) erhaltenen PCB-45-Suspt.neicn
werden mit 30 ml einer 4 %-ißen wässrigen Lösung von löslicher
Stärke versetzt. Jeweils 2 ml des erhaltenen Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gernäss Beispiel 1 (c) getrocknet.
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ßAO ORIGINAL·
(a) 100 ml einer gemäss Beispiel 1 (a) erhaltenen BBM-fuspea-8ion lebender Zellen werden mit 20 ml physiologischer i.ochsalzlösung versetzt, die 108 mg/ml Cephalosporin C enthalten. Das Gemisch wird 20 Minuten auf 370C und anschliec send
30 Hinuten auf 450C erhitzt. Die erhaltene Suspension vird
nachstehend als CEB-45-Suspension bezeichnet.
(b) 50 ml der erhaltenen CEB-45-Suspension werden mit ί 0 ml
4 #-iger wässriger Rohrzuckerlösung versetzt. Jeweils ϊ ml
des erhaltenen Gemisches werden unter sterilen Bedingungen in Reagenzgläser abgefüllt und gemäss Beispiel 1 (c) getrocknet. Das Gefriertrocknen wird auf die gleiche Weine wie
in Beispiel 1 durchgeführt.
(a) Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 (a) wird Streptococcus heinolyticus kultiviert und durch Abzentr:.fugieren isoliert. Die erhaltenen lebenden Zellen werden in
physiologischer Kochsalzlösung in einem Mengenverhältnis veη
5 ml, bezogen auf die lebenden Zellen aus 100 ml dee KuItux—
mediums, suspendiert« Nach dem 20-fachen Verdünnen sei^t die
erhaltene Suspension eine Absorption von 0,47 bei 660 192.
(b) 30 ml der erhaltenen Suspension in physiologischer Kochsalzlösung werden mit 30 ml 4 #-iger wässriger Rohrzuc.'cerltsung versetzt. Jeweils 2 ml des Gemisches werden in Reigemgläaer unter sterilen Bedingungen abgefüllt und gemäBS Beispiel 1 (c) getrocknet.
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BAD
(a) 300 g Hefeextrakt werden in 10 Liter destilliertem Vastier gelöst. Die Lösung wird mit 10 #-iger Natronlauge auf Pg 7,0
bis 7,2 eingestellt und 60 Minuten auf 1000C erhitzt, fach
dem Abkühlen der Lösung werden ausgefällte unlösliche Stoffe abfiltriert, und der p^-Wert des Filtrates wird erneut auf
7,0 bis 7,2 eingestellt, Danach wird das Filtrat in steril.-eierte Kolben gegossen und 10 Minuten bei 1200C dampfsterilisiert« Sämtliche nachfolgenden Arbeitsgänge werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Der erhaltene Hefeextrakt wird mit einer Kulturbrühe von Streptococcus hemolyticue Stamm Su (ATCC Hr. 21060) beimpft,
der vorher 20 Stunden in 500 ml eines üblichen Fleischinfusionamediums kultiviert worden war. Die Kultur in dem
Hefeextraktmedium wird als statische Kultur 20 Stunder bei 37°C durchgeführt. Anschliessend wird die Kulturbrühe mit
Eis abgekühlt und zentrifugiert. Die erhaltenen Bakterienzellen werden zweimal mit kalter physiologischer Kochtalzlösung gewaschen und anschliessend in 500 al BBM suspenc.iert.
Fach dem 20-fachen Verdünnen zeigt diese Suspension ejne
Absorption von 0,48 bei 660 mu.
(b) 300 ml der erhaltenen BBM-Suspension werden mit 6() ml
einer physiologiechen Kochsalzlösung des Kaliumsalzes von Penicillin G (1,6 χ 105 Einheiten/ml) versetzt, das Gemisch
wird 20 Minuten auf 37°C und hierauf 30 Minuten auf 4li°C erhitzt. Die erhaltene Suspension wird nachstehend als .3CB--45--Suspension bezeichnet.
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(c) 50 ml der PCB-45-Suspension werden ait 50 ml 4 £·-ίέ ar
wässriger L-Arginin-hydrochloridlöaung versetzt, Jeweils 2 ml
des Gemisches werden in Reagenzgläser unter sterilen Bedingungen abgefüllt, 2 Stunden bei -300C yorgefroren uid an-BChlieaaend 20 Stunden bei einer Temperatur von höchstens
200C und einem Druck von 0,01 Torr getrocknet. lach den Troak
nen wird das Vakuum durch Einleiten von steriler, trockener
Luft aufgehoben, und die Reagenzgläser werden sofort zigeschmolzen. Die erhaltenen Trockenpräparate zeigten seilst
nach 6 monatiger lagerung bei 370C keine nennenswerte Verminderung der Antitumorwirkung«
30 Bl der geoäss Beispiel 8 (b) erhaltenen PCB-45-Suepcneioi
werden bei niedriger Temperatur zentrifugiert. Der Obeistani
wird dekantiert und die fällung einmal ait kalter physj ölog Löscher Kochsalzlösung gewaschen und hierauf in 30 ml Z ?~iger
wässriger L-Arginin-hydrochlorid-Löeung suspendiert. Jewell 3
1 ml Anteile dieser Suspension werden in Reagenzgläser abge-. füllt und gemäas Beispiel 8 (c) getrocknet.
30 ml der gemäas Beispiel 8 (b) erhaltenen PCB-45~Suspensio:i
werden mit 30 ml 40 £-iger wässriger L-Ornithin-hydrocblori I-Lösung versetzt. Jeweils 2 ml Anteile des Gemisches werden Ln
Reagenzgläser abgefüllt und gemäss Beispiel 8 (c) getrocknet.
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30 ml der gemäes Beispiel 8 (b) erhaltenen PCB-45-Suspeneion.
werden mit 30 ml 4 jt-iger wässriger L-Methionin-Lösung ver~
setzt. Jeweils 2 ml Anteile des Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäes Beispiel 8 (es) getrocknet.
30 ml der gemäsa Beispiel 8 (b) erhaltenen PCB-45-Suepensiori
werden mit 30 ml 4 Seiger wässriger L-Cystein-Lösung versetzt. Jeweils 2 ml Anteile des Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gemäss Beispiel 8 (c) getrocknet.
3C ml der gemäss Beispiel 8 (b) erhaltenen PCB-45-Suspensioa
werden mit 30 ml einer 4 jt-igen wässrigen Lösung des Hatriunsalzes der L-Asparaginsäure yersetzt. Jeweils 2 ml Anteile
des Gemisches werden in Reagenzgläser abgefüllt und gecäse
Beispiel 8 (o) getrocknet.
. 30 ml der gemäss Beispiel 8 (b) erhaltenen PCB-45-Suepeneion
werden mit 30 ml einer 4 £-igen wässrigen Lösung des Hatriuasalzes von L-Glutaminsäure versetzt. Jeweils 2 ml des erhaltenen Gemisches werden in Reagensgläser abgefüllt und genäse
Beispiel 8 (c) getrocknet.
30 ml der gemäss Beispiel 8 (b) erhaltenen PCB-45~Suspen8ion
werden mit 30ml 4 Seiger wässriger L-Threoninlösung verset-üt.
Jeweils 2 ml des erhaltenen Gemisches werden in Reagenzgläser
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abgefüllt und gemäss Beispiel 8 (o) getrocknet.
(a) 100 ml einer gemäes Beispiel 8 (a) erhaltenen BBW-Suspension lebender Zellen werden mit 20 ml physiologischer
Kochsalzlösung versetzt, die 108 mg/ml Cephalosporin C enthält, und das Gemisch wird 20 Minuten auf 370C und hierauf
30 Minuten auf 45°C erhitzt«, Diese Suspension wird nachstehend als CEB-45-Suspension bezeichnet.
(b) 5 ml der erhaltenen CEB-45-Suspension werden mit S.O ml
einer 4 jt-igen wässrigen LOsung von L-Arginin-hydrochlorid
versetzt. Jeweils 2 ml dieses Gemisches werden in Reagenzgläser unter sterilen Bedingungen abgefüllt und gemäss Beispiel 8 (o) getrocknet. Die Gefriertrocknung wird auf die
gleiche Weise wie in Beispiel 8 durchgeführt.
(a) Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 (a) wird Streptococcus hemolyticus gezüchtet und durch Zentrifugieren
Isoliert. Die erhaltenen lebenden Zellen werden in physiologischer Kochsalzlösung in einer Menge von 5 ml, bezogen auf
die lebenden Zellen, aus 100 ml des Kulturmediums suspendiert.
Die erhaltene Suspension zeigt naoh 20-facher Verdünnung
eine Absorption von 0,47 bei 660 mu.
(b) 30 ml der erhaltenen Suspension in physiologischer Kochsalzlösung werden mit 30 ml einer 4 ^-igen wässrigen lösung
von L-Arginin-hydrochlorid versetzt. Jeweils 2 ml dienes Gemisches werden in Reagenzgläser unter sterilen Bedingungen
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m° ORIGINA
abgefüllt und gemäsB Beispiel 8 (c) getrocknet.
Mit den Präparaten der Erfindung sowie Kontrollpräparaten werden die nachstehend erläuterten Versuche durchgeführt.
Sie geinäse Beispiel 1 bis 6 erhaltenen Trockenpräparate werden unmittelbar nach ihrer Herstellung in destilliertem Wasser in solcher Menge suspendiert, dass da» Volumen der erhaltenen Suspension gleich dem Volumen der Zellensuspension-m
vor dem trocknen ist» Die Suspensionen werden durch Zusatz von BBM, das 27 000 Einheiten/al Penicillin enthält, auf das
zweifache verdünnt· Jeweils 0,1 ml. der erhaltenen verdünntem Suspensionen werden β iniaal täglich für 5 lage Mäusen des
ddY-Stammes intraperitoneal injieiert, denen 24 Stunde» vorher intraperitoneal 10 Ehrlich ascites Caroinomsellen je
Maus injiziert worden waren. Die Herstellung der Suspersion
in destilliertem Wasser und das Verdünnen der Trockenpiäparate wurde täglich unmittelbar vor der Injektion durchgeführt.
Wir jede Versuchegruppe wurden 10 Mause verwendet. Die Überlebensrate der Mäuse 40 Tage nach Beginn der Injektion
(Verhältnis der überlebenden Mäuse zur Gesamtzahl der Pause)
ist in Tabelle I angegeben. In der Tabelle sind die Versuch*
Hr. 7 bis 11 Kontrollversuche.
SAD ORlGlNAi-209817/U16
|
Versuch
Hr. |
Präparat |
überle b<ms-
rate, «5 |
| 1 | PCB-45 Troekenpräparat (Beispiel 1) | 80 |
| 2 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 2) | 80 |
| 3 | PCB-45 Trockenpräparat (Beiepiel 3) | 70 |
| 4 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 4) | 70 |
| 5, | PCB-45 Trookenpräparat (Beispiel 5) | 70 |
| 6 | CEB-45 Trockenpräparat (Beispiel 6) | 80 |
| 7 |
PCB-45 Trockenpräparat
(ohne Stabiliaatorzusatz) |
70 |
| 8 |
CEB-45 Trockenpräparat
(ohne Stabiliaatorsueatz) |
70 |
| 9 | PCB-45 | 90 |
| 10 | CEB-45 | 90 |
| 11 | BBM + Penicillin allein | 0 |
Sie in den Beispielen 1 bis 6 erhaltenen Trockenpräparate,
die 3 Monate bei 370C gelagert wurden, werden hinsichtlich
ihrer Antitumorwirkung in gleicher Weise wie im Versuchabeispiel A untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zasaa
mengestellt. In dieser Tabelle sind die Versuche 7 bis 9 Kontrollversuche.
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ORIGINA
| Versuch Nr. |
Präparat | überlebet .8» rate, ",< |
| 1 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 1) | 60 |
| 2 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 2) | 60 |
| 3 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 3) | 60 |
| 4 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 4) | 50 |
| 5 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 5) | 50 |
| 6 | CEB-45 Trockenpräparat (Beispiel 6) | 60 |
| 7 | PCB -45 Trockenpräparat (ohne Stabilieatorzusatζ) |
40 |
| 8 | CEB-45 Trockenpräparat (ohne Stabilisatorzusatz) |
40 |
| 9 | BBM + Penicillin allein | 0 |
Suspensionen lebender Zellen, die nicht der Behandlung mit
Penicillin oder Cephalosporin unterworfen wurden und 3 Monete bei 37^C gelagert wurden, werden auf ihre Anti tumor1 /irkung
untersucht.
Gemäss Beispiel 7 hergestellte Trockenpräparate werden unmittelbar
vor der Injektion in destilliertem Wasser in solcher Menge suspendiert, dass das Volumen das gleiche iit, >i«
das der Suspension Tor dem Trocknen. Ferner werden 7 Tage alte Ehrlich ascites Carcinomzellen aus Mäusen isolier;, bei
niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, einmal mit ph/siclogischer
Kochsalzlösung gewaschen und anschliessend i ι so-
•7
viel BBM suspendiert, daß eine Suspension mit 6 χ iO Zoller/m'A
vrhalten wird.
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BAD ORIGINAL
2 ml dieser Caroinomzellen-Suspension werden mit 5 ml «iner
Suspension der Trockenpräparate in destilliertem Wassei und
1 ml BBM vermischt und 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Pie auf diese Weise erhaltene Suspension wird einmal in eirer
Dosis von 0,5 ml/Mau3 Mäusen vom ddY-Stamm intraperitoreal injiziert. Je Versuchsgruppe werden 10 Mäuse verwendete Die
Überlebensrate der Mäuse nach 40 Tagen nach der Injektion
ist in Tabelle III angegeben. In der Tabelle sind die Versuche 2 und 3 Kontrollversuche, und in Versuoh 2 sind cie
Ergebnisse mit einem Präparat gezeigt, dem vor dem Trocknen destilliertes Wasser anstelle der wässrigen Stabilisatcrlösung zugesetzt wurde.
|
Versuch-
Ir. |
Präparat |
Überlebens
rate, ia |
|
1
2 3 |
Trockenpräparat einer Suspension
lebender Zellen (Stabilisator : Rohrzucker) Trookenpräparat einer Suspension lebender Zellen (ohne Stabilisa torzusatz) BBM allein |
50
30 0 |
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass das erfindun^sgemäss hergestellte Präparat eine sehr hohe Antitumorwiriung
selbst nach längerer Lagerung besitzt.
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Versuchsbeiepiel D
Die gemäss Beispiel 8 bis 16 hergestellten Trockenpräperate
werden unmittelbar nach ihrer Herstellung in destillierten Wasser in solcher Menge suspendiert, dass das Volumen der erhaltenen
Suspensionen gleich dem Volumen der Zellensusjenaionen
vor dem Trocknen ist. Die Suspensionen werden einzeln auf das zweifache durch Zusatz von BBM verdünnt, das 2"J 000
Einheiten/ml Penicillin enthält. Jeweils 0,1 ml der erhalte
nen verdünnten Suspension werden einmal täglich über 5 Tage Mäusen vom ddY-Stamm intraperitoneal injiziert. Diese l^äuse
wurden 24 Stunden vorher mit 10 Ehrlich ascites Carciromzellen pro Maus gespritzt.
Die Herstellung der Suspension in destilliertem Wasser und las
Verdünnen der Trockenpräparate wird jeden Tag unmittelbar vor
der Injektion durchgeführt. Pro Versuchsgruppe werden 10 Mäa~
se verwendet. Die Überlebensrate der Mäuse nach 40 Tag€n ist
in Tabelle IV angegeben. In dieser Tabelle sind die Veisucha
11 bis 14 Kontrollversuche und die Versuche 10 und 11 seigen
die Ergebnisse mit Präparaten, bei denen das Trocknen inter Zusatz von destilliertem Wasser anstelle der wässrigen Sta~
bilisatorlösung durchgeführt wurde.
209817/U16 BAD ORK51NM.
|
Versuch-
Nr. |
Pram«·* t |)berleber s - iTaparat [rate, $ |
90 |
| 1 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 8) | 90 |
| 2 | PCB'45 Trockenpräparat (Beispiel 9) | 80 |
| 3 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 10) | 80 |
| 4 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 11) | 80 |
| 5 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 12) | 70 |
| 6 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 13) | • 70 |
| 7 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 14) | 70 |
| 8 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 15) | 90 |
| 9 | CEB-45 Trockenpräparat (Beispiel 16) | 70 |
| 10 |
PCB-45 Trockenpräparat
(Ohne Stabilisatorzusatz) |
70 |
| 11 |
CEB-45 Trockenpräparat
(Ohne Stabillsatorzusatz) |
90 |
| 12 | PCB-45 | 90 |
| 13 | CEB-45 | 0 |
| 14 | BBM + Penicillin allein |
Die in den Beispielen 8 bis 16 erhaltenen Trockenpräparate,
die 3 Monate bei 37°C gelagert wurden, werden miteinander auf ihre Äntitumorwirkung auf die gleiche Weise wie in Ver
Suchsbeispiel D verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt. In dieser Tabelle sind die Versuche ir.
bis 12 Kontrollversuche, und die Versuche 10 und 11 zeigen
die Ergebnisse mit Präparaten, bei denen das Trocknen lurch Zusatz von destilliertem Wasser anstelle der wässrigen Sta
209817/U16
ORIGINAl
bilisatorlösung durchgeführt wurde.
| 7er8uch- Nr. |
Präparat | Überlebens- rate t H |
| 1 | PCB-45 Troekenpräparat (Beispiel 8) | 90 |
| 2 | PCB-45 Troekenpräparat (Beispiel 9) | 90 |
| 3 | PCB- 45 Troekenpräparat (Beispiel 10) | 80 |
| 4 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 11) | 80 |
| 5 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 12) | 80 |
| 6 | PCB-45 Troekenpräparat (Beispiel 13) | 70 |
| 7 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 14) | 60 |
| 8 | PCB-45 Trockenpräparat (Beispiel 15) | 60 |
| 9 | CEB-45 Troekenpräparat (Beispiel 16) | 90 |
| 10 | PCB-45 Troekenpräparat (Ohne Stabilisatorzusatz) |
40 |
| 11 | CEB-45 Troekenpräparat (Ohne Stabilisatorzusatz) |
40 |
| 12 | BBM + Penicillin allein | 0 |
Es werden Suspensionen lebender Zellen auf ihre Antitunorwirkung
untersucht, die keiner Behandlung mit Penicillin od?r Cephalosporin C und 3 Monate bei 37°C gelagert wurden.
Gemäss Beispiel 17 hergestellte Trockenpräparate werder anmittelbar vor der Injektion in destilliertem Wasser in solcher
Menge suspendiert, dass das Volumen der ^uspensior
gleich dem Volumen der Suspension vor dem Trocknen ist. Andererseits werden "· Tage alte Ehrlich ascites Careinem~
209817/1416
~ 20
zellen, die Mäusen vom ddY-Stamm intraperitoneal injiziert
worden waren, isoliert, mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert,
einmal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und anschliessend in BBM in solcher Menge eusptmdiert,
dass die Suspension 6 χ 10 Zellen/ml enthält. ί ml
dieser Carcinomzellen-Suspension werden mit 5 ml einer Sus
peneion der Trockenpräparate in destilliertem Wasser ui.d 1 ml
BBM vermischt und 90 Minuten bei 37°C inkubiert, Die erhaltene Suspension wird einmal in einer Dosis von 0,5 ml/Maus
Mäusen vom ddY-Stamm intraperitoneal injiziert. Je Versuchsgruppe
werden 10 Mäuse verwendet. Die Überlebensrate dtr Mäuse nach 40 Tagen ist in Tabelle Vl angegeben. In der Tabelle
sind die Versuche Nr. 2 und 3 Kontrollversuche v.nd Versuch 2 zeigt das Ergebnis mit einem Präparat, bei atm das
Trocknen unter Zusatz von destilliertem Wasser an Stelle einer wässrigen Stabilisatorlösung erfolgt·.
| Versuch Nr. |
Präparat | Oberlebet s- rate, # |
| 1 2 3 |
Trockenpräparat aus Suspension lebender Zellen (Stabilisator : L-Arginin-hydrochlorid) Trockenpräparat aus Suspension lebender Zellen (ohne Stabilisa torzusatz) BBM allein |
70 * 30 0 |
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass das erfindun^sgemäss
hergestellte Präparat selbst nach langer Lagerung eine hohe Antituraorwirkung besitzt.,
209817/U16
Claims (15)
1. Verfahren zur Herstellung stabiler Präparate ait Aititumorwirkungr
die Zellen von hämolytischen Streptococcei enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass
man eine Zellensuspension hämolytiacher Streptococcen α it einem Saccharid oder einer Aminosäure versetzt und das erhaltene
Gemisch trocknet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man eine Kulturbrühe hän :>lytischer
Streptococcen verwendet, die durch Züchten der
Bakterien in einem Pleischinfusionsmedium erhalten worden
sind·
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man eine Kulturbrühe hau olytischer Streptococcen verwendet, die duroh Züchten der
Bakterien in einem hauptsächlich Hefeextrakt enthaltene en Nährmedium erhalten worden sind.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass nan eine Suspension der Mmolytiachei
Streptococcen verwendet, die durch Suspendieren der Zellen in Bernheimers1 Basalmedium erhalten worden sind, das
(a) 1,35 g Maltose, (b) 12 ml 20 #-ige wässrige Kaliumcihydrogenphosphatlösung,
eingestellt mit Katriumhydroxyc auf Pjj 6,9 ~ 7,0, (c) 24 ml 2 #-ige wässrige vMagnesiumsulfi t„7H2O-Löaung
und (d) 132 ml destilliertes Wasser enthält.
2098 1 ?/ U 1 Β bad ORIGINAL
1791390
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Suspension der fcä»o-Iytischen Streptocoecen verwendet, die durch Suupendieien d?r
Zellen in destilliertem Wasser erhalten worden 1st.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Suspension der häaolytisehen Streptocoecen verwendet, die duroh Suependle]en
der Zellen in physiologischer Kochsalzlösung erhalten % orden
ist.
7. Verfahren nach Anspruch I1 dadurch gekennzeichnet, dass man eine Suspension der häaolytir.ohezj
Streptocoecen verwendet, die durch Suspendieren der Ze!len
in Phoaphatpuffer enthaltender physiologischer Kochsäl:.lösung erhalten worden ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k * η r -zeichnet, dass van eine Suspension der häaolyt sehen
Streptooooeen verwendet, die durch Suspendieren der Ze.len
in Bernheimer·1 Baaalmedium, Zusätzen einer Penicillin verbindung oder von Cephalosporin 0 und IG bis 30 minütig*a Erhitzen auf 30 Ms 37°0 und 20 bis 40 ainütigea Erhitze ι auJ
38 bis 500C erhalten worden ist,
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch 5 e ■
kennzeichnet, dass man als Saecharid Rohrzucker
Lactose, Dextran oder lösliche Stärke oder ein Gemisch aus mindestens zwei dieser Saccharide verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8r dadurch ,^ekennzeichnet,
dass man als Aminosäure Argin .nf Ornithin,. Methionin, Alanin, Asparaginsäuret Citrullinf
Cystein, Cystin,, GlutaminsäureF Glycin, Histidin, Hydro Lyprolinf
Isoleucin, Leucin. Phenylalanin Prolin, Serin, Threoninr Tyrosin oder Valin oder ein Gemisch aus minde :tem
zv/ei dieser Aminosäuren verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man die Trocknung bei Te ipert
türen von höchstens etwa 20 C durchführt.
12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch ge kennzeichnet, dass man das Gemisch gefriert :ockiet.
13. Getrocknetes stabiles Antitumorpraparat» enthaltend
hämolytische Streptococcen mit Antitumorwirkung und ein
Saccharid ^der eine Aminosäure.
14. Getrocknetes stabiles Antitumorpraparat nach Anspruch
13, enthaltend mindestens 0,5 Teile eines Saccharide cd ?r
einer Aminosäure auf 1 Teil trockene Zellen hämolytischϊγ
Streptococcen mit Antitumorwirkung.
15. Getrocknetes stabiles Antitumorpraparat nach Anspruch
13 und 14, enthaltend hämolytische Streptococcen mit An:itumorwirkung
und ein Saccharid oder eine Aminosäure im Mengenverhältnis trockene Zellen der Streptococcen zu Saccharic
oder Aminosäure von etwa :. : 0,5 bis 1 : 5«.
209817/1416
BAD
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-
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