KR20010083141A - 해독 종결 정확성 조절자인 ｒｎａ 헬리카제 서브패밀리및 이의 용도 - Google Patents

해독 종결 정확성 조절자인 ｒｎａ 헬리카제 서브패밀리및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 mRNA의 전사 종결 효율을 조절하고/하거나 변형 전사체의 분해를 촉진하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 해독 종결을 강화시키는데 관련된 활성 약물을 선별하는 방법 및 결손 단백질 복합체와 관련된 질병 상태를 동정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 해독 종결을 조절하는데 유효한 양의 MTT1, 사람 Upflp, 펩티딜 진핵성 방출 인자 1(eRF1) 및 펩티딜 진핵성 방출 인자 3(eRF3)을 포함한 정제된 복합체를 제공한다. 또한, 본 발명은 조절 요소에 작동적으로 연결된 MTT1, 사람 Upflp, 펩티딜 진핵성 방출 인자 1(eRF1) 및 펩티딜 진핵성 방출 인자 3(eRF3) 암호화 핵산을 포함한 발현 벡터를 제공한다. 본 발명은 해독 종결을 조절하는데 유효한 양의 MTT1, 사람 Upflp 단백질, 펩티딜 진핵성 방출 인자 1(eRF1) 및 펩티딜 진핵성 방출 인자 3(eRF3)을 포함한 복합체와 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 eRF3에 대한 MTT1의 결합을 억제 또는 조절하는 제제를 제공한다. 이 제제는 eRF3에 대한 MTT1의 결합을 억제 또는 촉진할 수 있다.

Description

해독 종결 정확성 조절자인 ＲＮＡ 헬리카제 서브패밀리 및 이의 용도 {A subfamily of RNA helicases which are modulators of the fidelity of translation termination and uses thereof}
정부 권리 조항
본 발명을 주도하는 연구는 부분적으로 미국 국립위생연구소(The National Institutes of Health, GM48631-01)의 보조금에 의해 적어도 일부가 지원되었다. 따라서 정부는 본 발명에 대해 일정 권리를 가질 수 있다.
해독 기구는 세포내 단백질 합성을 책임지고 있다. 이러한 기관은 해독이 개시되고 종결되어야만 하는 mRNA상의 정확한 위치를 결정할 수 있어야만 한다. 해독 개시 부위의 선택은 일반적으로 메티오닌 아미노산을 암호화하는 첫번째 AUG 코돈에 의해 나타난다. 해독 개시 후, 리보솜은 mRNA를 따라 5'에서 3' 방향으로 진행하면서 한번에 한 코돈을 해독하여 폴리펩타이드를 제조한다. 3개의 종결 코돈 중 하나가 리보솜의 A-부위를 차지하여 펩타이드를 가수분해시키는 경우에 해독 과정의 최종 단계가 일어난다[참조 문헌: Buckingham et al., 1997].
전장 폴리펩타이드가 완성된 후에 해독 종결이 일반적으로 일어나지만, DNA에서의 염기 치환 및 프레임이동 돌연변이로 인해 단백질 암호화 영역내에 부적절한 종결 코돈을 포함하는 mRNA가 종종 합성된다. 이러한 미성숙 종결 코돈의 발생은 초기 종결 부위에서 해독을 정지시켜, 끝이 절단된 단백질을 합성하고 mRNA를 신속하게 분해시킨다[참조 문헌: Ruiz-Echevarria et al., 1996; Weng et al., 1997]. 흥미롭게도 넌센스 및 프레임이동 돌연변이는 240가지 이상의 상이한 유전 질환의 약 20 내지 40%를 발생시킨다[참조 문헌: McKusick, 1994]. 따라서, 넌센스 억제를 촉진시켜 수많은 유전 질환을 치료하는 것이 고려될 수 있다. 넌센스억제는, 동종에 가까운 tRNA가 넌센스 돌연변이에서 종결 인자와 경쟁하여 해독이 미성숙하게 종결되지 않게하면서 오히려 아미노산을 펩타이드 쇄로 혼입시키는 경우에 일어난다(도 1). 충분한 수준의 넌센스 억제는 완전한 폴리펩타이드 단백질 생성을 가능하게 한다. 단지 1%의 기능적인 단백질만이 생성되는 다수의 질환에서는 환자가 심각한 질환 증상으로 고통받지만, 정상 수준의 5%로 발현을 증강시키는 것만으로도 고통을 크게 감소시키거나 질환을 제거할 수 있다[참조 문헌: McKusick, 1994; Cooper etc.]. 최근의 보고서에는 억제 농도 미만의 특정 아미노글리코시드가 해독 종결 과정을 억제하여 전장 CFTR을 발현시키고 사이클릭 AMP-활성화된 클로라이드 채널 활성을 복구하는 것으로 입증되었다[참조 문헌: Bedwell et al., 1997; Howard et al., 1996]. 따라서, 해독 종결 효율을 조절하는 인자를 확인하고 특성을 규명하는 것은, 상기한 과정의 생물현상을 이해하고 넌센스 돌연변이의 결과로서 발생하는 각종 유전 질환을 치료하기 위한 치료제 개발에 있어 중요하다.
해독 종결은 진핵성 펩타이드 방출 인자 1(eRF1) 및 방출 인자 3(eRF3)에 의해 수행된다. eRF1 및 eRF3 모두는 진핵세포에서 상호작용하여 펩타이드 방출을 촉진시키는 보존된 단백질이다[참조 문헌: Frolova et al., 1994, Stansfield et al., 1995, Zhouravleva et al., 1995]. 효모에서 eRF 1 및 eRF3은 각각 SUP45 및 SUP35 유전자에 의해 암호화된다[참조 문헌: Frolova et al., 1994, Zhouravleva et al., 1995]. Sup45p(eFR1) 및 Sup35p(eRF3)은 상호작용하는 것으로 나타난다[참조 문헌: Stansfield et al., 1995., Paushkin et al., 1997a,b]. eRF1은 고유한 펩타이드 가수분해 활성을 지니지만, 해독 신장 인자 EF1α[참조 문헌: Didichenko et al., 1991]와 상동성인 eRF3은 GTPase 활성[참조 문헌: Frolova et al., 1996]이 있어 GTP-의존적인 방식으로 eRF1의 종결 활성을 향상시킨다[참조 문헌: Zhouravleva et al., 1995].
해독 종결 과정의 효율을 조절하는 인자는 이미 확인되었다[참조 문헌: Weng et al., 1996a,b; Czaplinski et al., 1998; Song and Liebman, 1987; All-Robyn et al., 1990]. 예를 들어, 최근 결과는, Upf1p가 해독 종결 효율을 조절하는 인자임을 제시한다. UPF1 유전자 파괴는 넌센스 함유 mRNA를 크게 안정화시켜 특정한 넌센스 대립유전자 억제를 증진시킨다[참조 문헌: Leeds et al., 1991, Cui et al., 1995, Czaplinski et al., 1995, 1998, Weng et al., 1996a, 1996b]. 최근 결과는 Upf1p가 eRF1 및 eRF3과 직접 상호작용하여 해독 종결 과정을 조절할 수 있음을 제안하였다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1998]. Upf1p은 이의 아미노 말단 근처에 시스테인 및 히스티딘이 풍부한 영역을 포함하고 서브패밀리 그룹 I의 헬리카제 구성원에 요구되는 모든 모티프를 포함한다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1995, Weng et al., 1996a,b, 1998, Altamura et al., 1992, Cui et al., 1996, Koonin, 1992, Leeds et al., 1992, Atkin et al., 1995, 1997]. 효모 Upf1p가 정제되었으며, 이의 RNA-의존적인 ATPase 및 헬리카제 활성이 입증되었다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1995, Weng et al., 1996a,b, 1998]. RENT1 또는 HUPF1이라고 불리는 UPF1P 유전자의 사람 동족체[참조 문헌: Perlick et al., 1996, Applequist et al., 1997]가 확인되었고 효모 세포에서 해독 종결을 향상시키는 기능이 있는 것으로 나타났는데, 이는 상기한 과정에서 이의 역할이 진화적으로 보존되었음을 의미한다[참조 문헌: Czaplinski et al., 1998].
본원에 제시된 결과로 Upf1p와 유의적인 상동성을 갖는, 효모 세포에서의 슈퍼패밀리 그룹 I의 헬리카제 세트가 확인되었다. 특히 MTT1으로 불리는 한개의 유전자와 이의 단백질 산물(해독 종결 조절자인 경우)의 특성이 규명되었다. Mtt1p는 슈퍼패밀리 그룹 I의 헬리카제를 암호화하고, 이의 아미노 말단에 시스테인-히스티틴이 풍부한 영역을 갖는다. Upf1p와 유사하게, Mtt1p는 해독 종결 인자 eRF3과 상호작용하여 해독 종결 과정을 조절할 수 있다. 의미심장하게도, Upf1p 및 Mtt1p 모두의 불활성화가 다른 결실에서 관찰되는 넌센스 억제 표현형보다 훨씬 극적인 넌센스 억제 표현형인 것으로 입증되었다. 이러한 결과는 RNA 헬리카제 패밀리가 해독 종결 과정의 조절자임을 입증한다.
발명의 요약
본 발명은 (a) MTT1과 시험 조성물 사이의 결합을 허용하는 조건하에 MTT1과 시험 조성물을 접촉시키고; (b) MTT1에 대한 조성물의 특이적인 결합을 측정하며; (c) 시험 조성물이 MTT1을 억제하여 시험 화합물이 해독 종결 효율을 조절하는 지를 확인하여 측정함을 포함하여, 해독 종결 효율을 조절하는 시험 조성물 또는 제제를 확인하는 방법을 제공한다. 한가지 양태에서, 제제는 MTT1의 ATPase/헬리카제 활성, Upf1p의 ATPase; eRF1 또는 eRF3의 GTPase 활성; RNA 결합; 리보솜에 대한 인자의 결합; 또는 인자 서로간의 결합을 억제한다. 다른 양태에서, 제제는MTT1이 폴리좀에 결합하는 것을 조절한다. 다른 양태에서, 제제는 사람 MTT1이 eRF3에 결합하는 것을 억제한다. 또다른 양태에서, 제제는 사람 MTT1이 eRF3에 결합하는 것을 용이하게 한다.
본 발명은 (a) 성분들이 상호작용하기에 충분한 조건하에, 시험 조성물 및 MTT1을 포함한 성분들을 항온처리하고; (b) 시험 조성물의 MTT1에 대한 결합 효과를 측정함을 포함하여, MTT1에 대한 결합을 조절하는 시험 조성물 또는 제제를 확인하는 방법을 제공한다. 한가지 양태에서 상기한 방법은, (a) MTT1에 대한 결합을 조절하는 시험 조성물을 세포내에 도입하고; (b) (a) 이후의 세포 표현형을 측정하고; (c) (a) 이후의 세포내 표현형을 (a) 이전의 세포내 표현형과 비교하며; (d) 시험 조성물이 도입된 세포의 유전자를 확인함을 포함하여, 유전자를 확인함을 추가로 포함한다.
본 발명은 MTT1 폴리뉴클레오타이드 발현 또는 MTT1 폴리펩타이드의 기능을 조절하는 벡터를 제공한다. 한가지 양태에서, 조절은 억제이다. 다른 양태에서, 조절은 증진이다.
본 발명은 MTT1 유전자, 사람 Upf1p 단백질, 펩티틸 진핵성 방출 인자 1(eRF1) 및 펩티딜 진핵성 방출 인자 3(eRF3)을 포함하는 분리된 다단백질 복합체를 제공하는데, 이 복합체는 해독 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절하는데 효과적이다. 한가지 양태에서, 복합체는 사람 Upf3p 및/또는 Upf2p를 추가로 포함한다.
본 발명은 mRNA 해독 정확성을 조절하는 복합체에 결합하는 제제를 제공한다. 해독에는 개시, 신장, 종결뿐만 아니라 분해도 포함된다. 한가지 양태에서, 제제는 MTT1의 ATPase/헬리카제 활성, Upf1p의 ATPase; eRF1 또는 eRF3의 GTPase 활성; RNA 결합; 리보솜에 대한 인자의 결합; 또는 인자 서로간의 결합을 억제한다. 다른 양태에서, 제제는 MTT1이 폴리좀에 결합하는 것을 조절한다. 다른 양태에서, 제제는 사람 MTT1이 eRF3에 결합하는 것을 억제한다. 또다른 양태에서, 제제는 사람 MTT1이 eRF3에 결합하는 것을 용이하게 한다.
본 발명은 넌센스 해독 종결을 억제하는데 유효한 양의 제제를 세포와 접촉시켜 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절함을 포함하여, 해독 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 해독 동안의 펩티딜 트랜스퍼라제 활성은 해독 개시, 신장, 종결 및 mRNA 분해 중에 생성된다.
본 발명은 Mtt1 및 eRF3의 결합을 억제하는데 유효한 양의 제제를 세포와 접촉시켜 넌센스 코돈에서 mRNA의 해독 종결 효율을 조절하고/하거나 변형 전사체의 분해를 촉진시킴을 포함하여, 넌센스 코돈에서 mRNA의 해독 종결 효율을 조절하고/하거나 변형 전사체의 분해를 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 MTT1의 ATPase/헬리카제 활성을 억제하는 제제를 세포와 접촉시켜 넌센스 코돈에서 mRNA의 해독 종결 효율을 조절하고/하거나 변형 전사체의 분해를 촉진시킴을 포함하여, 넌센스 코돈에서 mRNA의 해독 종결 효율을 조절하고/하거나 변형 전사체의 분해를 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 질환이 있거나 질환이 의심되는 개체의 샘플을, mtt1 단백질 또는 이의 돌연변이체의 발현을 검출하는 시약과 접촉시켜 샘풀중에서 시약의 결합을 검출함을 포함하여, Mtt1 단백질 발현과 관련된 질환을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 복합체, mtt1 단백질, 돌연변이 mtt1 단백질 또는 이로부터의 제제 및 약제학적 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 개체에게 투여하여 개체를 치료함을 포함하여, 펩티틸 트랜스퍼라제 활성과 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 문제의 유전자를 분리시키고; (b) 문제의 유전자가 모티프 I 내지 IX를 포함하는지를 측정함을 포함하여, 해독 종결 정확성을 조절하는데 관련된 유전자를 확인하는 방법을 제공하는데, 이때 유전자가 9개 모티프 중 하나를 포함하는 경우에 유전자가 해독 종결을 조절한다. 한가지 양태에서 모티프 I은 서열 GppGTKTxT-X(n)을 포함한다. 다른 양태에서, 모티프 II는 서열 riLxcaSNxAvDxl-X(n)을 포함한다. 다른 양태에서, 모티프 III은 서열 vviDExxQaxxxxxiPi-X(n)을 포함한다. 다른 양태에서, 모티프 IV는 서열 xxil aGDxxQLp-X(n)을 포함한다. 다른 양태에서, 모티프 V는 서열 lxx SLF erv-X(n)을 포함한다. 다른 양태에서, 모티프 VI는 서열 LxxQYRMhpxisefpxYxgxL-X(n)을 포함한다. 다른 양태에서, 모티프 VII는 서열 IgvitPYxxQvxx1-X(n)을 포함한다. 다른 양태에서, 모티프 VIII은 서열 vevxtVDxFQGreKdxIiLSc VR-X(n)을 포함한다. 다른 양태에서, 모티프 IX는 서열 iGFLxdxRRINValTRak를 포함한다.
본 발명은 해독 종결 정확성을 조절하는 것중 하나인 MTT1 유전자의 RNA 헬리카제 서브패밀리에 관한 것이다. 본 발명은 해독 종결 효율 및 이상 mRNA 분해를 조절하는데 관련되는, MTT1, 사람 Upf1p, Upf2p, Upf3p, 진핵성 방출 인자 1 및 진핵성 방출 인자 3을 포함하는 다단백질 감시 복합체에 관한 것이다. 이러한 복합체를 확인하는 것은, 프레임이동(frameshift) 빈도를 변화시켜 mRNA의 기능적인 활성에 영향을 미치고; 종결 반응 모니터링하는 것을 가능하게 하고; 변형 전사체의 분해를 촉진시키며; 해독의 개시, 신장(elongation), 종결 및 mRNA 분해 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성의 조절자(억제자/자극자)를 제공하는 제제를 확인하기위한 시험관내 검정 시스템을 제공한다. 길항제 또는 효능제일 수 있는 이러한 제제는 스크리닝 및 진단 목적에 유용하고, 미성숙한 해독의 결과이거나 이를 유발시키는 질환 또는 상태에 대한 치료제로서 유용하다.
도 1: 5개의 효모 단백질은 슈퍼패밀리 그룹 I 헬리카제의 아부류를 한정한다. MTT1, UPF1, DIP1, SEN1 및 DNA 2 헬리카제 도메인은 PILEUP를 사용하여 정렬하고, 결과는 GCG 프래그램에서 BOXSHADE를 사용하여 플롯팅한다. 컨센서스 서열을 하단에 열거한다. 보존된 동일한 잔기(어두운 회색 박스)는 대문자로 나타내고, 보존된 유사 잔기는 소문자(밝은 회색 박스)로 나타낸다. 개별적인 유전자의 1차 서열내의 아미노산 수는 도에 나타내었다.
도 2: mtt1△이 넌센스 억제임을 입증한다. MTT1, UPF1, 또는 MTT1 및 UPF1은 효모 균주 KC2(ura3-52 trp1D leu2-2 tyr7-1)로부터 결실시키고, 이러한 세포를 OD600이 1.0이 되도록 성장시킨다. 이러한 세포를 연속적으로 희석시켜 -ura-leu-tyr상에 플레이팅하여 넌센스 억제를 검정하고, 세포 성장용 대조로서 -ura에 플레이팅한다. 30℃에서 성장을 모니터링하고 10일 동안의 성장을 도시한다.
도 3: Mtt1은 넌센스 매개된 mRNA 분해에 필요없다. UPF1, 또는 MTT1 및 UPF1을 효모 균주 KC2(ura3-52 trp1D leu2-2 tyr7-1)로부터 결실시키고, 이러한 세포를 OD600이 0.8이 되도록 성장시킨다. 전체 RNA를 준비하고 CYH2 mRNA용 프로브를 사용하여 RNA 블롯팅 분석을 실시한다.
도 4: Mtt1은 eRF3과 상호작용한다. pG-1(벡터) 또는 pG-1FLAGMTT1(Flag-Mtt1p)으로 형질전환시킨 효모 균주 BJ3505로부터의 세포질 추출물을 IBTB중에 준비하고, GST, GST-eRF1, GST-eRF3, GST-eRF3NM 또는 GST-eRF3C 세파로스-단백질 복합체 30㎕와 함께 항온처리한다. 세파로스-단백질 복합체를 IBTB(재료 및 방법 참조)로 2회 세척하고 SDS-PAGE 로딩 완충액에 재현탁시키고, 8% SDS-PAGE 겔상에서분리하고 항-FLAG 항체를 사용하여 면역블롯팅한다.
도 5: Mtt1은 폴리좀과 연관되어 있다. pG-1FLAGMTT1으로 형질전환시킨 효모 균주 BJ3505로부터의 세포질 추출물을 준비하고, RNase A로 처리하거나 처리하지 않은채 둔다. 이어서, 추출물을 7 내지 47%의 슈크로스 구배를 통해 원심분리한다. 구배를 수집하고 A254에서 모니터하면서 분획을 수집한다. 구배 분획은 프로브로서 Flag 에피토프에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅한다. A254프로파일은 상단 패널에 나타내었고, 상응하는 분획의 웨스턴 블롯은 하단 패널에 나타내었다.
종결 코돈에서의 해독 종결은 폴리펩타이드 합성을 완료하는 최종 단계이다. 미성숙한 해독 종결은 끝이 절단된 단백질을 합성하고 이상 mRNA를 신속하게 분해시킨다. 이러한 돌연변이는 유전 질환의 상당한 부분을 차지하며, 이러한 질환을 치료하기 위해 해독 종결 과정 효율을 감소시키는 새로운 전략이 개발되고 있다. 따라서, 종결 효율을 조절하는 인자를 확인하고 특성규명하는 것은, 상기한 과정의 생물현상을 이해하고 치료제를 확인하는데 있어 중요하다.
본 발명은 해독 종결을 조절하는데 관련된 RNA 헬리카제 패밀리, 특히 MTT1 유전자 및 이의 단백질 산물을 확인하고 특성규명하는 방법을 제공한다. mtt1△ 균주는 mRNA 분해에는 영향을 미치지 않지만 넌센스 억제 표현형인 것으로 나타난다. mtt1△upf1△ 균주는 단일 결실을 갖는 균주에서 관찰되는 것보다 훨씬 더 극적인 넌센스 억제 표현형인 것으로 나타난다. 생화학적 결과는, 관련된 Mtt1p ATPase/헬리카제가 폴리좀과 관련되어 있으며, 해독 종결 인자 eRF3과 상호작용한다는 것을 입증한다. 이들과 함께 본원에서 제시한 결과는 세포에서 해독 종결 효율을 조절하는 RNA 헬리카제 패밀리임을 확인시킨다.
본 발명은 돌연변이 mtt1△ 균주를 제공한다. 본 발명은 단일 결실을 갖는 균주에서 관찰되는 것보다 훨씬 더 극적인 넌센스 억제 표현형으로 입증된 돌연변이 mtt1△upf1△ 균주를 제공한다. 본 발명은 넌센스 억제를 조절하는 길항제 또는 효능제로서 작용하는 검정, 치료제 및 스크리닝 방법을 제공한다. 본원에서 제시된 바와 같이, mtt1△upf1△ 균주는 upf1△ 또는 mtt1△ 균주와 비교시 극적인 넌센스 억제 표현형인으로 입증되었다.
본 발명은 MTT1, 사람 Upf1p 단백질, 펩타이드 진핵성 방출 인자 1(eRF1) 및 펩타이드 진핵성 방출 인자 3(eRF3)을 포함하고, 펩티틸 트랜스퍼라제 활성을 조절하는데 효과적인 분리된 복합체를 제공한다. 본원에서 정의된 바와 같이, "감시 복합체"는 적어도 MTT1, Upf1p, 및 진핵성 방출 인자 1 및 3을 포함한다. "UPF1" 유전자는 또한 RENT1 또는 HUPF1으로도 불린다. 복합체는 또한 Upf2p 및/또는 Upf3p를 포함할 수 있다.
본 발명은 해독 종결 정확성을 조절하는 복합체에 결합하는 제제를 제공한다. 해독 종결에는 개시, 신장, 종결 및 분해가 포함된다. 한가지 양태에서, 제제는 MTT1이 폴리좀에 결합하는 것을 조절한다. 다른 양태에서, 제제는 사람 MTT1이 eRF3에 결합하는 것을 억제한다. 다른 양태에서, 제제는 MTT1이 eRF3에 결합하는 것을 용이하게 한다.
본원에서 제시된 결과는 정제된 Mtt1p가 또한 RNA-의존적인 ATPase 및 헬리카제 활성을 나타낸다는 것을 입증한다(도 7). 몇몇 증거들은 Mtt1p가 해독 종결과 관련되어 있음을 제시한다. 본원에 제시된 결과는, 1) mtt1△ 균주가 넌센스 억제 표현형임을 입증하고(도 4), 2) Mtt1p가 폴리좀과 관련되어 있으며(도 6), 3) Mtt1p가 펩타이드 방출 인자 eRF3과 직접 상호작용하며(도 5), 4) mtt1△ 균주가 파로모마이신 감수성이 있다는 것을 나타낸다. upf1△ 균주와 달리 mtt1△ 균주가 넌센스 함유 전사체를 안정화시키지 않는다는 것을 고려하면, RNA 분자당 넌센스 억제의 양은 upf1p△ 균주에서보다 mtt1△ 균주에서 더 크다(도 3).
다수의 관찰 결과는 mRNA 분해 과정이 단백질 합성에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 지적하고 있다. 사실상, 상기한 2가지 과정은 함께 진화되었고 한가지 과정에 필수적인 인자는 다른 과정에서도 기능하는 것으로 보인다. 이러한 연계에 관한 증거는, a) 해독 신장을 방해하는 약물 또는 돌연변이가 mRNA 안정화를 촉진시키고, b) 신속한 mRNA 분해를 지시하는 서열 요소가 mRNA 암호화 영역에 국소화될 수 있으며 이러한 요소의 활성이 이의 해독에 좌우되고, c) 분해 인자가 리보솜과 관련될 수 있으며, d) 미성숙 해독 종결이 mRNA 분해률을 향상시킬 수 있음을 입증하는 실험을 포함한다.
소정의 시간내에 합성되는 특정 단백질의 양이 이의 mRNA의 세포내 농도에 의존적이므로, mRNA 분해률 조절은 유전자 발현을 조절하는 강력한 수단을 제공한다. 포유동물 세포에서, mRNA 분해률(반감기로서 표현됨)은 짧으면 15 내지 30분이고 길면 500시간일 수 있다. 명백하게, mRNA 분해률의 이러한 차이는 특정 단백질의 농도를 1000배까지 차이나게 할 수 있다. 개별적인 mRNA에 대한 분해률이 고정될 필요는 없지만, 내인성 피드백 기전, 특정 호르몬의 존재, 분화 또는 세포 주기의 특정 단계, 또는 바이러스 감염의 결과로서 조절될 수 있다는 관찰에 의해 추가의 조절 수준이 제공된다.
아마도, 해독 및 mRNA 분해의 통합 과정의 가장 훌륭한 예는 미성숙 해독 종결의 결과를 나타내는 연구일 것이다. 이는 DNA내의 결실, 염기 치환 또는 프레임이동 돌연변이로 단백질 암호화 영역내에 부적절한 종결 코돈(넌센스 코돈)을 포함하는 mRNA가 합성되는 경우에 발생한다. 이러한 미성숙 종결 코돈의 발생은 어얼리 종결 부위에 해독을 정지시키고 끝이 절단된 단백질을 합성하게 된다. 이의 "정상" 분해률에 관계없이, 넌센스 돌연변이를 지닌 유전자로부터 전사된 mRNA("넌센스 함유 mRNA"로 칭함)는 매우 신속하게 분해된다. 이러한 "넌센스-매개된 mRNA 분해"는 편재하는데, 즉 이는 모든 시험 유기체에서 관찰되며 특정 mRNA의 양을 10배 내지 100까지 감소시킨다. 매우 감소된 mRNA 양과 미성숙하게 종결된 해독이 결합되어, 극단적으로는 유전자 결실의 결과로서 특정 유전자의 전체 발현 수준을 감소시킨다. 사람의 건강에 대한 넌센스-매개된 mRNA 분해의 중요성은, 넌센스 돌연변이가 질환 상태를 유발하고 각각의 mRNA가 넌센스-매개된 mRNA 분해 경로의 기질인 것으로 나타나는 유전 질환의 수가 증가되고 있음이 확인됨으로써 설명된다.
중요한 것은 넌센스-매개된 mRNA 분해 경로의 불활성화가 세포 성장을 방해하지 않으면서 수행될 수 있고, 넌센스 함유 mRNA에 대한 정상 수준 및 정상 분해률을 회복시킨다는 점이다. 보다 상세하게, 효모 실험(및 기타)은, mRNA가 여전히 넌센스 코돈을 함유하더라도, 상기한 분해 경로의 불활성화가 합성되는 단백질이 충분히 기능하도록 하여 세포가 본래의 유전적 결함을 극복할 수 있음을 입증하고 있다. 즉, 넌센스-매개된 mRNA 분해 경로를 하향조절함으로써 넌센스 돌연변이에 의해 유발되는 질환을 치료할 수 있다.
본 발명은 조절 요소에 작동가능하게 연결되어 있는 MTT1, Upf1p, Upf2p, Upf3p 단백질, 펩타이드 진핵성 방출 인자 1(eRF1) 및 펩타이드 진핵성 방출 인자 3(eRF3)을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에 따라서, 당해 분야의 숙련가는 통상의 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 이러한 기술은, 예를 들어 다음 문헌에 예시되어 있다[참조 문헌: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York("Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II(D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985)); Transcription And Translation(B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1984)); Animal Cell Culture(R.I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984); F.M. Ausubel et al.(eds.), Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)].
"벡터"는 다른 DNA 단편이 연결되어 연결된 단편을 복제시킬 수 있는 플라스미드, 파아지 또는 코스미드와 같은 리플리콘(replicon)이다. "리플리콘"은 생체내에서 DNA 복제의 자율 단위로서 작용하는, 즉 자체 조절하에 복제될 수 있는 임의의 유전자 단위(예: 플라스미드, 염색체, 바이러스)이다. "카세트"는 특이적인 제한 부위에서 벡터에 삽입될 수 있는 DNA 단편을 의미한다. DNA 단편은 문제의 폴리펩타이드를 암호화하고, 카세트 및 제한 부위는 전사 및 해독용의 적절한 판독 프레임에 카세트가 삽입되도록 디자인된다.
"핵산 분자"는 일본쇄 또는 이본쇄 나선형인 리보뉴클레오사이드(예: 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오사이드(예: 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 포스페이트 에스테르 중합체형 또는 이의 임의의 포스포에스테르 유사체(예: 포스포로티오에이트 또는 티오에스테르)를 의미한다. 이본쇄 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선이 가능하다. 용어 핵산 분자, 구체적으로는 DNA 또는 RNA 분자는 분자의 1차 및 2차 구조만을 의미하고 임의의 특정한 3차 구조에 제한되지는 않는다. 따라서, 상기 용어에는, 특히 선형 또는 환형 DNA 분자(예: 제한 단편), 플라스미드 및 염색체에서 발견되는 이본쇄 DNA가 포함된다. 특정 이본쇄 DNA 분자의 구조를 논의하는데 있어, 본원에서는 DNA의 비전사된 쇄(즉, mRNA에 대한 서열 상동성을 갖는 쇄)를 따라 5'에서 3' 방향으로만 서열을 제시하는 일반적인 관례에 따라 서열을 기술한다 "재조합 DNA 분자"는 분자생물학적 조작 상태에 있는DNA 분자이다.
전사 및 해독 조절 서열은 숙주 세포에서 암호화 서열의 발현을 제공하는 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등과 같은 DNA 조절 서열이다. 진핵세포에서는, 폴리아데닐화 시그날이 조절 서열이다.
"프로모터 서열"은 세포에서 RNA 폴리머라제가 결합하여 하류(3' 방향) 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명을 명확히 하기 위해, 상기한 배경에서 검출가능한 수준으로 전사를 개시하는데 필요한 최소한의 염기수 또는 요소를 포함하는 프로모터 서열은 전사 개시 부위에 이의 3' 말단이 결합되어 있고 상류(5' 방향)로 확장되어 있다. 프로모터 서열내에서 전사 개시 부위(일반적으로, 예를 들어 뉴클레아제 S1을 사용한 지도화에 의해 확인됨)뿐만 아니라 RNA 폴리머라제 결합을 책임지는 단백질 결합 도메인(컨센서스 서열)을 찾을 수 있다. 암호화 서열은, RNA 폴리머라제가 암호화 서열을, 트랜스-RNA로 스플라이싱되는 mRNA로 전사시킨 다음, 암호화 서열에 의해 암호화되는 단백질로 해독되는 경우, 세포에서 전사 및 해독 조절 서열의 "조절하"에 있다.
당해 분야에서 공지된 다수의 벡터-숙주 시스템을 사용할 수 있다. 가능한 벡터에는 이로써 제한되지는 않는 플라스미드 또는 변형된 바이러스 등이 포함되지만, 벡터 시스템은 사용되는 숙주 세포와 상용성이어야만 한다. 벡터의 예로는 이. 콜라이, 박테리오파아지(예: 람다 유도체), 또는 pBR322 유도체 또는 pUC 플라스미드 유도체(예: pGEX 벡터, pmal-c, pFLAG 등)와 같은 플라스미드가 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다. 클로닝 벡터로 삽입시키는 것은, 예를 들어 DNA 단편을 상보적인 접착성(cohesive) 말단을 갖는 클로닝 벡터와 연결시켜 수행할 수 있다. 그러나, DNA를 단편화하는데 사용되는 상보적인 제한 부위가 클로닝 벡터에 존재하지 않는 경우, DNA 분자의 말단을 효소적으로 변형시킬 수 있다. 또한, 뉴클레오타이드 서열(링커)을 DNA 말단에 연결시켜 목적하는 임의의 부위를 생성시킬 수 있는데, 이렇게 연결된 링커는 제한 엔도뉴클레아제 인지 서열을 암호화하는, 특별하게 화학적으로 합성한 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 재조합 분자는 형질전환, 형질감염, 감염, 전기천공 등을 통해 숙주 세포내로 도입하여 유전자의 다수 복사체를 생성할 수 있다. 바람직하게는, 클로닝된 유전자를 셔틀 벡터 플라스미드상에 포함시켜 클로닝 세포(예: 이. 콜라이)중에서 증식시키고, 경우에 따라 후속적으로 적절한 발현 세포주에 삽입시키기 위해 정제한다. 예를 들어, 한가지 유형 이상의 유기체에서 복제될 수 있는 벡터인 셔틀 벡터는, 이. 콜라이 및 사카로마이세스 세레비지애 모두중에서 복제되기 위해서 이. 콜라이 플라스미드의 서열과 효모의 2μ 플라스미드의 서열을 연결시켜 제조할 수 있다.
본 발명은 해독 정확성을 조절하는 복합체에 결합하는 제제를 제공한다. 해독에는 개시, 신장, 종결뿐만 아니라 분해가 포함된다. 한가지 양태에서, 제제는 ATPase/헬리카제 활성, MTT1의 활성, Upf1p; eRF1 또는 eRF3의 GTPase 활성; RNA 결합; 리보솜에 대한 인자의 결합; 또는 인자 서로간의 결합을 억제한다. 다른 양태에서, 제제는 MTT1이 폴리좀에 결합하는 것을 조절한다. 다른 양태에서, 제제는 사람 MTT1이 eRF3에 결합하는 것을 억제한다. 또다른 양태에서, 제제는 사람 MTT1이 eRF3에 결합하는 것을 용이하게 한다.
본 발명은 복합체 또는 MTT1에 결합하는 항체를 제공한다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 또한 항체는 방사능성, 비색계, 형광성 또는 발광성 마커인 검출가능한 마커로 표지할 수 있다. 표지된 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 한가지 양태에서, 표지된 항체는 정제되고 표지된 항체이다. 항체를 표지하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다.
용어 "항체"에는, 예를 들어 천연 및 비-천연 항체 모두가 포함된다. 상세하게는, 용어 "항체"에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 이의 단편이 포함된다. 또한, 용어 "항체"에는 키메라 항체, 완전하게 합성한 항체 및 이의 단편이 포함된다. 이러한 항체에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리가 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다. 또한 단백질 또는 항체는 방사능성, 비색계, 형광성 또는 발광성 마커인 검출가능한 마커를 포함할 수 있다.
항체를 시험관내에서 검출하기 위해, 예를 들어 효소, 형광단, 발색단, 방사능동위원소, 염료, 콜로이드성 금, 라텍스 입자 및 화학발광제와 같은 표지를 사용하여 표지할 수 있다. 또한, 항체를 생체내에서 검출하기 위해, 예를 들어 방사능동위원소(바람직하게는 테크네튬 또는 요오드), 자기 공명 이동 제제(예: 가돌리늄 및 망간) 또는 방사능 불투과성 제제를 사용하여 표지할 수 있다. 이러한 연구에 가장 널리 사용되는 표지는 방사능 원소, 효소, 자외선에 노출시 형광을 나타내는 화합물 등이다. 다수의 형광성 물질이 공지되어 있으며 표지로서 사용될 수 있다. 여기에는, 예를 들어 플루오레세인, 로다민, 아우라민, 텍사스 레드(Texas Red),AMCA 블루 및 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow)가 포함된다. 특별한 검출 물질은, 염소에서 제조하였으며 이소티오시아네이트를 통해 플루오레세인을 접합시킨 항-토끼 항체이다. 단백질을 또한 방사능 원소 또는 효소로 표지할 수 있다. 방사능 표지는 현재 이용할 수 있는 계수 공정에 의해 검출할 수 있다. 바람직한 이소형은3H,14C,32P,35S,36Cl,51Cr,57Co,58Co,59Fe,90Y,125I,131I 및186Re로부터 선택할 수 있다.
효소 표지도 또한 유용하며, 이는 현재 이용가능한 임의의 비색계, 분광광도계, 형광 분광광도계, 전류계 도는 기체계 기술로 검출할 수 있다. 효소는 브릿지 분자(예: 카보디이미드, 디이소시아네이트, 글루타르알데히드 등)와의 반응시킴으로써 선택된 입자와 접합시킨다. 상기 공정에 사용할 수 있는 다수의 효소가 공지되어 있으며 이용가능하다. 바람직한 것은 퍼옥시다제, β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 글루코스 옥시다제+퍼옥시다제 및 알칼리 포스파타제이다. 또다른 표지 물질 및 방법을 기술하고 있는 문헌, 예를 들어 미국 특허 제3,654,090호, 제3,850,752호 및 제4,016,043호를 참조한다.
복합체에 특이적인 항체 및 핵산을 본 방법에 프로브로서 사용하여 샘플 또는 특이적인 세포 유형에서 복합체 폴리펩타이드(항체 사용) 또는 핵산(핵산 프로브 사용)의 존재를 검출할 수 있다. 이러한 방법에서는, 복합체와 관련된 질환이 의심되는 환자의 샘플을 복합체에 특이적인 항체 또는 핵산 프로브와 접촉시키고 샘플에 대한 항체 또는 핵산 프로브의 특이적 결합을 검출한다. 질환이 의심되는 샘플에 존재하는 복합체 또는 핵산 수준을 대조 샘플(예: 질환이 없는 개체의 동등한 샘플) 수준과 비교하여 환자가 복합체와 관련된 질환을 갖는지를 결정할 수 있다. 진단법에서 또한 복합체 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 프로브로서 사용하여, 예를 들어 샘플에 복합체에 특이적인 항체가 존재하는지를 검출할 수 있다. 또한, 복합체에 특이적인 항체를 사용하여 복합체 또는 이의 단편과 함께 복합체를 형성하는 신규한 보조인자를 검출할 있다.
복합체의 존재, 상대적인 양 또는 부재는 항체 결합으로 측정한다. 친화성 크로마토그래피, 웨스턴 블롯팅 또는 다른 기술을 포함하는 가능한 검출 방법이 당해 분야의 통상의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 이러한 방법은 안티센스 핵산을 사용하여 mRNA를 차단하거나 라이보자임으로 mRNA를 절단함으로써 특정 mRNA의 해독을 차단하는 안티센스 핵산 및 라이보자임을 이용한다.
안티센스 핵산은 특정 mRNA 분자의 적어도 일부와 상보적인 DNA 또는 RNA 분자이다[참조 문헌: Marcus-Sekura, 1988, Anal. Biochem. 172:298]. 세포에서, 이들은 mRNA와 하이브리드화하여 이본쇄 분자를 형성한다. 세포는 이러한 이본쇄 형태의 mRNA를 해독하지 않는다. 따라서, 안티센스 핵산은 mRNA가 단백질로 발현되는 것을 방해한다. AUG 개시 코돈과 하이브리드화하는, 대략 15개의 뉴클레오타이드의 올리고머 및 분자가 특히 효율적인데, 왜냐하면 이들은 합성이 용이하며, 이들을 기관 세포내로 도입하는 경우에 보다 큰 분자보다 문제가 적게 발생하기 때문이다. 안티센스 방법은 시험관내에서 다수의 유전자의 발현을 억제시키는데 사용되어왔다[참조 문헌: 상기한 Marcus-Sekura, 1988; Hambor et al., 1988, J. Exp. Med. 168:1237].
라이보자임은 DNA 제한 엔도뉴클레아제와 다소 유사한 방식으로 다른 일본쇄 RNA 분자를 특이적으로 절단하는 능력을 지닌 RNA 분자이다. 라이보자임은 특정 mRNA가 자체의 인트론을 절단하는 능력을 지니고 있다는 것이 관찰되어 발견되었다. 이러한 RNA의 뉴클레오타이드 서열을 변형시킴으로써, 연구자들은 RNA 분자내에서 특정 뉴클레오타이드 서열을 인지하여 이를 절단하는 분자를 조작할 수 있었다[참조 문헌: Cech, 1988, J. Am. Med. Assoc. 260:3030]. 이들은 서열 특이적이므로, 특정 서열을 갖는 mRNA만이 불활성화된다.
조사자들에 의해 2가지 유형의 라이보자임, 테트라하이메나(Tetrahymena) 유형 및 "햄머헤드(hammerhead)" 유형이 동정되었다. 테트라하이메나 유형 라이보자임은 4개의 염기 서열을 인지하지만, "햄머헤드" 유형은 11개 내지 18개의 염기 서열을 인지한다. 보다 긴 인지 서열이 표적 mRNA 종을 인지하기 쉽다. 따라서, 특정 mRNA 종을 불활성화시키는데 햄머헤드 유형의 라이보자임이 테트라하이메나 유형의 라이보자임보다 바람직하고, 18개의 염기 인지 서열이 보다 짧은 인지 서열보다 바람직하다.
당해 분야에서 공지된 임의의 스크리닝 기술은 해독 종결 또는 mRNA 분해 단백질에 영향을 미치는 제제를 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 본 발명은 소분자 리간드에 대한 스크리닝을 포함한다.
해독 종결 또는 mRNA 분해 단백질의 1차적인 서열에 대한 정보와, 기능이 공지된 단백질과의 서열 유사성에 대한 정보는 단백질 활성에 영향을 미칠 수 있는 제제에 대한 초기 실마리를 제공한다. 이러한 제제를 확인하고 스크리닝하는 방법은, 예를 들어 X-선 결정법, 중성자 회절법, 핵자기 공명 분광법, 및 구조를 결정하기 위한 다른 기술을 사용하여 단백질의 구조적인 특성을 측정함으로써 용이해진다. 이러한 기술로 효능제 및 길항제를 합리적으로 디자인하거나 확인할 수 있다.
해독 종결에 수반되는 단백질 및 복합체 또는 mRNA 분해 단백질을 발현시키는 재조합 세포, 또는 다르게는 정제된 단백질을 사용하여 스크리닝을 수행할 수 있다. 예를 들어, 표지된 단백질이 순열조합적인 라이브러리중의 분자와 결합하는 능력을, 상기 참조 문헌에서 기술한 바와 같이 스크리닝 검정으로서 사용할 수 있다.
본 발명은 a) 상기 후보 숙주 세포의 클론 집단을 제공하고, b) 세포내 단백질이 항체에 근접할 수 있도록 세포의 클론 집단을 처리하고, c) 복합체와 특이적으로 결합하는 항체와 세포내 단백질을 접촉시키며, d) 후보 숙주 세포에 의해 생성된 복합체의 상대적인 양을 측정함을 포함하여, 대조 세포와 후보 숙주 세포에 의해 생성된 복합체의 양을 비교하여 후보 숙주 세포를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명은 돌연변이를 확인하기 위해 MTT1 유전자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은, MTT1 유전자의 일부를 증폭시키는 단계를 추가로 포함할 수 있고, MTT1 유전자의 상기 부분을 증폭시키기 위한 프라이머인 폴리뉴클레오타이드 세트를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 방법은 소인 진단, 및 거핵세포 이상, 조혈성 질환, 골수증식성 질환, 혈소판 질환, 백혈병의 진단 및 치료, 및 산전 진단 및 종양 치료에 사용하기 위해 돌연변이를 확인하는데 유용하다. 유용한 진단 기술에는 원위치 형광 하이브리드화(FISH), DNA의 직접적인 서열화, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 일본쇄 입체형태 분석(SSAC), Rnase 보호 검정, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드(ASO), 돗트 블롯 분석 및 하기에서 논의될 PCR-SSCP이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다.
본 발명은 a) 세포를 후보 약물과 접촉시키고, b) 복합체 조절에 대해 검정함을 포함하여 해독 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성에 관련되는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하는데, 이때 복합체를 조절하는 약물은 펩티딜 트랜스퍼라제 활성에 관련된다. 또한 복합체는 NTPase 활성(ATPase, GTPase), RNA 결합 활성, 복합체에 결합하는 인자(예: eRF1 및 eRF3), 리보솜으로부터 분리된 인자, 응집을 촉진시키는 인자, 펩타이드 가수분해를 지연시킴으로써 해독 종결을 향상시키는 인자에 대해 검정할 수 있다.
본 발명은 a) 세포를 후보 약물과 접촉시키고, b) 단백질 복합체 조절에 대해 검정함을 포함하여, 해독 종결을 향상시키는데 관련된 활성 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하는데, 이때 단백질 복합체를 조절하는 약물은 해독 종결을 향상시키는데 관련된다.
본 발명은 a) 약물과 복합체를 항온처리하고, b) 넌센스 억제에 대한 효과를 측정함으로써 해독 종결을 향상시키는데 관련된 약물을 스크리닝함을 포함하여, 해독 종결을 향상시키는데 관련되는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 검정은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 RNA 결합 또는 NTPase(예: ATPase 또는 GTPase) 검정일 수 있다.
본 발명은 (a) 세포를 MTT1 재조합 발현 벡터로 형질감염시키고; (b) 형질감염 후 세포의 표현형을 측정하고; (c) 형질감염 전의 세포내 표현형과 형질감염 후의 세포내 표현형을 비교하며; (d) 형질감염된 세포의 돌연변이 대립유전자를 포함하는 유전자를 확인하는 것을 포함하여, 돌연변이 대립유전자를 갖는 유전자를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 성분들이 상호작용하기에 충분한 조건하에, 시험 조성물 및 MTT1을 포함한 성분들을 항온처리하고; (b) 시험 조성물의 MTT1에 대한 결합 효과를 측정함을 포함하여, MTT1에 대한 결합을 조절하는 시험 조성물을 확인하는 방법을 제공한다. 한가지 양태에서 상기한 방법은 (a) MTT1에 대한 결합을 조절하는 시험 조성물을 세포내에 도입하고; (b) (a) 이후의 세포 표현형을 측정하고; (c) (a) 이후의 세포내 표현형을 (a) 이전의 세포내 표현형과 비교하며; (d) 시험 조성물이 도입된 세포의 유전자를 확임함을 포함하여, 유전자를 확인함을 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "시험 조성물"은 유전자, 핵산 서열, 폴리펩타이드, 펩타이드 단편과 같은 임의의 조성물, 정해진 용량내에서 기능하는 능력을 검정할 수 있는 순열조합 라이브러리 또는 다른 순열조합 과정을 사용하여 제조한 조성물, 또는 복합체의 활성을 모방한 화합물이다. 핵산 서열 또는 폴리펩타이드와 같은 이러한 시험 조성물은 이의 서열 또는 구조 때문에 정해진 용량내에서 기능할 수 있는 것으로 추정된다.
"보조인자"는 복합체를 조절할 수 있고 NMD 또는 해독 종결 효율에 영향을미칠 수 있는 임의의 조성물(예: 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 유도체 또는 펩타이드 의태체)이다. 조성물에는 복합체를 통해 NMD 또는 해독 종결 효율을 자연적으로 유도하는 조성물이 포함되지만, 자연적으로 NMD를 유도하지 않는 조성물(예: 인공 조성물 및 다른 목적으로 작용하는 천연 조성물)도 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효능제"는 복합체, 또는 복합체의 MTT1과 상호작용하는 복합체의 인자(예: eRF3 또는 upf1)와 상호작용하거나 이에 결합함으로써 해독 종결의 효율 또는 정확성, 또는 mRNA 분해를 증가시키거나 자극시킬 수 있는 임의의 조성물을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "길항제"는 복합체, MTT1, 또는 복합체의 MTT1과 상호작용하는 복합체의 인자(예: eRF3 또는 upf1)와 상호작용하거나 이에 결합함으로써 해독 종결의 효율 또는 정확성, 또는 mRNA 분해를 감소시킬 수 있는 임의의 조성물을 의미한다.
본 발명의 MTT1을 암호화하는 유전자를 확인하고 분리하는 것은, 천연 공급원으로 분리시킬 수 있는 양보다 다량의 MTT1을 발현시키거나, 세포의 형질감염 또는 형질전환 후 발현되는 MTT1의 활성이 나타나도록 특별하게 조작된 지시자 세포중에서 MTT1을 발현시킬 수 있다. 따라서, MTT1의 구조를 기본으로 하여 효능제 및 길항제를 합리적으로 디자인하는것 외에도, 본 발명은 당해 분야에서 공지된 각종 스크리닝 검정을 사용하여 MTT1의 특이적인 리간드를 확인하는 또다른 방법을 포함한다.
당해 분야에서 공지된 임의의 스크리닝 기술을 MTT1 효능제 또는 길항제를 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 본 발명은, MTT1에 결합하고 시험관내 및/또는생체내에서 MTT1을 촉진하거나 길항하는 소분자를 스크리닝하는 것을 포함한다. MTT1 활성을 촉진하거나 길항하는 분자의 경우, 예를 들어, 본 발명의 검정을 사용하여 천연 산물 라이브러리를 스크리닝할 수 있다.
MTT1의 1차적인 서열에 대한 정보와, 다른 DNA 결합 단백질과의 서열 유사성에 대한 정보는 MTT1의 억제제 또는 길항제로서의 초기 실마리를 제공할 수 있다. 길항제를 확인하고 스크리닝하는 방법은, 예를 들어 X-선 결정법, 중성자 회절법, 핵자기 공명 분광법, 및 구조를 결정하기 위한 다른 기술을 사용하여 단백질의 구조적인 특성을 측정함으로써 또한 용이해진다. 이러한 기술로 효능제 및 길항제를 합리적으로 디자인하거나 확인할 수 있다.
또 다른 방법은 재조합 박테리오파아지를 사용하여 거대한 라이브러리를 생성하는 것이다. "파아지 방법"[참조 문헌: Scott and Smith, 1990, Science 249: 386-390 (1990); Cwirla, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:6378-6382(1990); Devlin et al., Science, 249: 404-406(1990)]을 사용하여, 매우 거대한 라이브러리(106-108의 화학적 역가)를 작제할 수 있다. 두번째 방법은 제이슨 방법[참조 문헌: Geysen et al., Molecular Immunology 23: 709-715 (1986); Geysen et al., J. Immunologic Method 102: 259-274(1987)]의 화학법을 1차적으로 사용하는 것인데, 예로는 포도 등의 방법[참조 문헌: Fodor et al., Science 251: 767-773(1991)]이 있다. 후르카 등[참조 문헌: Furka et al., 14th International Congress of Biochemistry, volume 5, Abstract FR: 013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res. 37: 487-493 (1991)], 휴톤[참조 문헌: Houghton, 1986년 12월에 허여된 미국 특허 제4,631,211호] 및 루터 등[참조 문헌: Rutter et al., 1991년 4월 23일자로 허여된 미국 특허 제5,010,175호]은 효능제 또는 길항제로서 시험될 수 있는 펩타이드 혼합물을 생성하는 방법을 기술하고 있다.
다른 양태에서, 본 발명에 따른 MTT1 리간드를 스크리닝하는데 합성 라이브러리[참조 문헌: 전문이 본원에서 참조 문헌으로 인용된 Needeks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10700-4(1993); Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993); Lam et al., 국제 특허 공보 제92/00252호; Kocis et al., 국제 특허 공보 제9428028호] 등을 사용할 수 있다.
스크리닝은 MTT1을 발현하는 재조합 세포, 또는 선택적으로는 MTT1의 정제된 단백질 및/또는, 예를 들어 상기한 바와 같이 재조합적으로 생성된 MTT1의 특별한 구조/기능 도메인을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, MTT12의 이량체화를 억제하는 소분자의 경우에는 표지된 MTT12 이량체화 도메인을 사용하여 상기한 참조 문헌에서와 같이 라이브러리를 스크리닝할 수 있다.
본 발명은 또한 MTT1을 포함하는 샘플을 시험 조성물과 접촉시키고 시험 조성물 적용 후 NMRD의 변화를 측정함을 포함하여, MTT1에 결합하는 신규한 보조인자 또는 억제제를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 MTT1 단백질은 MTT1을 통해 NMRD에 영향을 미치는 신규한 시험 화합물 또는 신규한 시험 조성물을 확인하기 위한 스크리닝 방법에 유용하다. 따라서, 또다른 양태에서, 본 발명은 성분들이 상호작용하기에 충분한 조건하에 시험 조성물 및 MTT1을 포함하는 성분들을 항온처리한 다음, 시험 세포에서 NMRD에 대한 시험 조성물의 영향을 측정함을 포함하여, 시험 조성물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. MTT1과 조성물 사이에서 NMD에 대해 관찰되는 효과는 효능성이나 길항성일 수 있다. 바람직하게는, MTT1을 암호화하는 폴리펩타이드는 MTT1 단백질의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 합성 펩타이드이다.
MTT1이 효모에서의 UPF1 패밀리와 밀접하게 관련되어 있기 때문에, 본 발명에서 용어 "MTT1에 특이적인 프로브"는, UPF1 서열을 암호화하는 핵산 또는 이의 상보적인 서열보다 MTT1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 이의 상보적인 서열에 검출가능할 정도로 잘 결합하는 프로브를 의미한다. 따라서 용어 "MTT1에 특이적인 프로브"는 RF 서열(또는 이의 상보적인 서열)을 암호화하는 핵산이 아니라 MTT1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산(또는 이의 상보적인 서열)에 인지가능할 정도로 결합할 수 있는 프로브를 포함한다.
본 발명은 MTT1에 특이적인 핵산 서열 프로브 제조를 용이하게 한다. 이러한 프로브를 수득하는 방법은 도 1에 나타낸 아미노산 서열 정렬을 기본으로 하여 디자인할 수 있다. 9개 이상, 예를 들어 적어도 12개, 15개, 25개, 35개, 50개, 100개 또는 150개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있는 프로브는 몇몇 표준 방법[참조 문헌: 상기한 Ausubel et al.] 중 하나를 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 바람직하게는, 하기하는 바와 같은 PCR 증폭 방법을 사용하여 프로브를 제조한다. 이 방법에서는, MTT1에 특이적인 아미노산을 포함할 수 있는, MTT1 서열에 상응하는 프라이머를 제조하고, 수득한 PCR 산물을 프로브로서 사용하여 핵산 라이브러리(예: cDNA 라이브러리)를 스크리닝한다.
MTT1에 특이적인 핵산 프로브는 샘플중에서 MTT1 핵산에 대한 결합 검출을 용이하게하는 화합물로 표지할 수 있다. 예를 들어, 프로브는 검출가능하게 표지된 아비딘 접합체(예: 서양고추냉이 퍼옥시다제가 접합된 아비딘)가 결합할 수 있는 바이오티닐화된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 방사능 표지된 핵산 프로브도 또한 사용할 수 있다. 이러한 프로브를 핵산 하이브리드화 검정에서 사용하여 샘플중에서 MTT1의 변화된 수준을 검출할 수 있다. 예를 들어, 반응계 하이브리드화, RNASE 보호 및 노던 블롯 방법을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 다른 표준 핵산 검출 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다[참조 문헌: 상기한 Ausubel et al.]. 또한, 진단 분자가 핵산인 경우에는 MTT1에 특이적인 프로브와 결합시키기 전에 이를 증폭시킬 수 있다. PCR을 사용하는 것이 바람직하지만, 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), 결합된 활성화 전사법(ligated activated transcription; LAT) 및 핵산 서열 기본의 증폭법(nucleid acid sequence-based amplification; NASBA)과 다른 핵산 증폭 방법을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 세포에서 시험 제제 또는 조성물이 복합체를 조절하는지를 측정하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 복합체를 갖는 세포를 제공하고, (ii) 세포를 시험 제제 또는 조성물의 부재하에 세포에서 복합체를 활성화시키는 시험 제제 또는 조성물과 접촉시키며, (iii) 세포의 복합체에서의 변화를 검출함으로써 수행할 수 있다. 본 발명을 실시하는데 있어, 세포는 시험 제제 또는 조성물과 동시에 또는 순자차적으로 접촉시킬 수 있다. 복합체가 증가하는 것은, 시험제제 또는 조성물이 복합체의 효능제임을 나타내고, 복합체가 감소하는 것은, 시험 제제 또는 조성물이 복합체의 길항제임을 나타낸다. 경우에 따라, 복합체 조절자를 확인하는 상기한 방법을 사용하여, 본 발명의 이러한 양태에 사용하기 위해 복합체를 포함하는 복합체 경로내에 있는 조성물, 보조인자 또는 다른 조성물을 확인할 수 있다. 본 발명을 실시하는데 임의의 제제 또는 조성물을 시험 제제 또는 조성물로서 사용할 수 있으며, 바람직한 시험 제제 또는 조성물에는 폴리펩타이드 및 작은 유기 화합물 제제 또는 조성물이 포함된다. 서열 또는 구조적 상동성이 세포에서 시험 제제 또는 조성물이 복합체를 조절할 수 있는지를 추측하는데 있어 기초를 제공하더라도, 무작위적으로 선택된 시험 제제 또는 조성물도 본 발명에 사용하기에 적합하다. 제제 또는 조성물을 무작위적으로 제조하기 위한 공지된 방법(예: 핵산 라이브러리로부터 폴리펩타이드 발현)을 사용하여 적합한 시험 제제 또는 조성물을 제조할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 본원에서 기술한 특정 기술 대신에 대체 기술을 사용할 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명은 또한, 복합체를 포함하는 샘플을 시험 조성물과 접촉시키고 시험 조성물을 적용한 후 복합체의 변화를 측정함을 포함하여, 복합체에 결합하는 신규한 보조인자 또는 억제자를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 복합체는 복합체에 영향을 미치는 신규한 시험 화합물 또는 신규한 시험 조성물을 확인하기 위한 스크리닝 방법에 유용하다. 따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 성분들이 상호작용하기에 충분한 조건하에 시험 조성물 및 복합체를 포함하는 성분들을 항온처리한 다음, 시험 세포에서 복합체에 대한 시험 조성물의 효과를 측정함을 포함하여, 시험 조성물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 복합체 및 조성물에 대해 관찰된 효과는 길항성일 수도 있고 효능성일 수 있다.
본 발명은 해독 종결을 촉진시키는데 유효한 양의 복합체를 세포와 접촉시켜 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절함을 포함하여, 해독 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제의 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명은 넌센스 해독 종결을 억제하는데 유효한 양의 제제를 세포와 접촉시켜 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절함을 포함하여, 해독 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 해독 동안의 펩티딜 트랜스퍼라제 활성은 해독 개시, 신장, 종결 및 mRNA 분해 동안에 생성된다.
본 발명은 Mtt1 및 eRF3의 결합을 억제하는데 유효한 양의 제제를 세포와 접촉시켜 넌센스 코돈에서 mRNA의 해독 종결 효율을 조절하고/하거나 변형 전사체의 분해를 촉진시킴을 포함하여, 넌센스 코돈에서 mRNA의 해독 종결 효율을 조절하고/하거나 변형 전사체의 분해를 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 MTT1의 ATPase/헬리카제 활성을 억제하는 제제를 세포와 접촉시켜 넌센스 코돈에서 mRNA의 전사 종결 효율을 조절하고/하거나 변형 전사체의 분해를 촉진시킴을 포함하여, 넌센스 코돈에서 mRNA의 전사 종결 효율을 조절하고/하거나 변형 전사체의 분해를 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 eRF3에 대한 MTT1의 ATPase/헬리카제 활성을 억제하는 제제를 세포와 접촉시켜 넌센스 코돈에서 mRNA의 전사 종결 효율을 조절하고/하거나 변형 전사체의 분해를 촉진시킴을 포함하여, 넌센스 코돈에서 mRNA의 전사 종결 효율을 조절하고/하거나 변형 전사체의 분해를 촉진시키는 방법을 제공한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, 해독 정확성 "조절"은 과정을 완전하게 억제하지 않으면서 반응의 정확성을 증가시키거나 감소시키기 위해 해독 기관의 활성을 변화시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 넌센스 코돈에서 해독 종결을 조절하는 것은 동종에 가까운 tRNA와 경쟁하는 경우 펩타이드 방출을 촉진시키는 종결 코돈에서의 해독 방출 인자 능력을 변화시킨 결과로서 일어난다. 최종 결과는, 동종에 가까운 tRNA가 폴리펩타이드 쇄에 혼입되어 종결을 억제하는 것이다. 대부분의 단백질은 야생형 수준의 5% 내지 20%의 발현만이 필요하므로, 전사 종결을 억제할 필요는 없다. 소분자에 의해 종결 과정이 보다 덜 효과적이도록 조절될 필요가 있다.
특정 양태에서, NTPase 활성(예: ATPase 활성, GTPase, 헬리카제 활성) 또는 아연 핑거 모티프 입체형태를 방해하는 제제를 시험용으로 선택할 수 있다. 다수의 레트로바이러스, 특히 HIV, 코로나바이러스 및 기타 RNA 바이러스가 의학적 및 수의학적 병인과 관련되어 있기 때문에, 상기한 제제는 바이러스 감염을 치료하는데 유용한 약물일 수 있다. 프레임이동 반응을 조절하는 단백질을 확인함으로써, 제제를 위한 초기 스크리닝에 상기한 단백질에 대한 결합 검정을 포함시킬 수 있다. 이러한 검정은 사람뿐만 아니라 효모, 또는 동물을 포함하지만 이로써 제한되지 않는 사람이 아닌 공급원으로부터의, 프레임이동 관련 단백질의 활성에 대한 제제의 유효성을 시험하는데 사용할 수 있다
예를 들어, 분해 경로를 억제하고 넌센스 전사체를 안정화시키거나 해독 종결 효율을 조절하는 제제를 확인하는 것이 안티센스 RNA 기술의 성공을 위해 중요하다. 안티센스 RNA는 상보성 영역에서 특정 표적 RNA와 쌍을 이루어 표적 RNA 기능 또는 발현을 조절하는, 작고 확산가능하고 해독되지 않았으며 고도로 구조화된 전사체이다. 그러나, 안티센스 RNA 기술을 적용하려는 시도가 성공하는데는 한계가 있다. 표적 유전자의 발현을 억제하거나 감소시키기 위해 세포에 안티센스 RNA의 충분한 농도를 제공해야 하는 것이 제한 인자로 나타난다. 또한, 충분한 농도를 수득하는데 있어 넌센스 분해 경로가 방해가 되는데, 왜냐하면 유전자 산물을 암호화하는 것을 의도하지 않은 짧은 넌센스 RNA 전사체에서 해독이 일어나는 경우에 해독이 신속하게 종결되어 결과적으로는 신속한 분해가 일어나 세포에서 안티센스 RNA의 양이 적어지기 때문이다. 따라서, 이상 mRNA 전사체를 안정화시키는 본 발명의 제제는 또한 안티센스 RNA도 안정화시킬 수 있다.
본 발명은 a) 복합체를 암호화하는 핵산을 함유하는 벡터를 포함한 세포를 제공하고, b) 이러한 세포에서 상기한 핵산을 과발현시켜 과발현된 복합체를 생성하여 복합체의 기능을 방해하거나 억제함을 포함하여, 세포에서 mRNA의 해독 종결 효율 및/또는 변형 전사체의 분해를 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명은, a) 개체로부터 적절한 핵산 샘플을 수득하고, (b) 단계(a)의 핵산 샘플 또는 이로부터 유도된 핵산이 돌연변이 MTT1을 암호화하는지를 측정하여 개체가 MTT1 유전자중에 돌연변이를 포함하는지를 측정함을 포함하여, 개체가 MTT1 유전자중에 돌연변이를 포함하는지를 측정하는 방법을 제공한다. 한가지 양태에서, 단계 (a)의 핵산 샘플은 돌연변이 MTT1을 암호화하는 DNA 전사체에 상응하는mRNA를 포함하고, 단계 (b)의 측정은 (i) mRNA와 올리고뉴클레오타이드의 결합을 허용하는 조건하에 올리고뉴클레오타이드와 mRNA를 접촉시켜 복합체를 형성시키고; (ii) 이로써 형성된 복합체를 분리하며; (iii) 분리된 복합체중에서 mRNA를 확인하여 mRNA가 돌연변이 MTT1을 암호화하는 핵산인지 또는 이로부터 유도된 것인지를 측정함을 포함한다. 다른 양태에서, 단계(b)의 측정은 i) 핵산 샘플 및 분리된 핵산을 구별되고 뚜렷한 핵산 단편으로 분해시키는 조건하에 단계 (a)의 핵산 샘플 및 분리된 핵산을 제한 효소와 접촉시키고; ii) 핵산 단편을 분리시키며; iii) 핵산 샘플로부터 유도된 핵산 단편을 분리된 핵산으로부터 유도된 핵산 단편과 비교하여 핵산 샘플이 돌연변이 MTT1을 암호화하는 핵산인지 또는 이로부터 유도된 것인지를 측정함을 포함한다.
본 발명은 포유동물의 배아 단계에서 도입시킨, 적어도 MTT1 유전자를 암호화하는 핵산의 일부와 Upf1p의 일부를 포함하는, 사람이 아닌 형질전환된 포유동물을 제공한다.
본 발명은 질환이 있거나 질환이 의심되는 환자의 샘플을, mtt1 발현을 검출하는 시약과 접촉시켜 샘플중에서 시약의 결합을 검출함을 포함하여, mtt1 발현과 관련된 질환을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 복합체를 암호화하는 핵산으로 세포를 형질감염시키고, (b) 형질감염 후 세포의 결함 복합체의 비율을 측정하며, (c) 형질감염 전 세포의 결함 복합체 비율을, 형질감염 후 세포의 결함 복합체 비율과 비교함을 포함하여, 특허청구범위 제1항의 복합체의 결함이 관련된 질환 상태를 확인하는 방법을 제공한다.
상기한 바와 같이, 넌센스-매개된 mRNA 분해는 필수적인 단백질의 세포내 결핍을 유발시켜 질환을 유발시킨다. 정상 mRNA의 안정성 조절이 변화되면 비교적 끔찍한 결과를 낳을 수 있다.
본 발명은 특허청구범위 제1항의 복합체 또는 복합체를 조절하고 자극하는 제제, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 개체에 투여하여 개체를 치료함을 포함하여, 펩티딜 트랜스퍼라제 활성과 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
넌센스 돌연변이는 240가지 이상의 상이한 유전 질환(예: 낭포성 섬유증, 혈우병, 가족성 고콜레스테롤혈증, 색소성망막염, 뒤시엔느 근위축증 및 마르판 증후군)의 개별적인 원인중 대략 20 내지 40%를 차지한다. 1%의 기능성 단백질만이 생성되는 다수 질환의 경우에, 환자는 심각한 질환 증상으로 고통받지만, 정상 수준의 5%만으로도 발현을 증가시키면 질환의 증상을 크게 감소시키거나 질환을 제거할 수 있다. 또한, 결장암, 유방암, 식도암, 폐암, 머리 및 목의 암, 방광암의 가장 흔한 형태의 대다수가 조절 유전자(예: p53, BRCA1, BRCA2 등)에서의 프레임이동 및 넌센스 돌연변이로부터 발생된다. 각각의 단백질을 합성하도록 조절 유전자에서의 넌센스 돌연변이를 교정하면 암세포를 죽일 수 있다.
다수의 관찰 결과는 해독 종결 정확성 및 mRNA 분해 과정이 단백질 합성에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 지적하고 있다. 사실상, 상기한 2가지 과정은 함께 진화되었고 한가지 과정에 필수적인 인자는 다른 과정에서도 기능하는 것으로 보인다. 이러한 연계에 관한 증거는, a) 해독 신장을 방해하는 약물 또는 돌연변이가 mRNA 안정화를 촉진시키고, b) 신속한 mRNA 분해를 지시하는 서열 요소가 mRNA 암호화 영역에 국소화될 수 있으며 이러한 요소의 활성이 이의 해독에 좌우되고, c) 분해 인자가 리보솜과 관련될 수 있으며, d) 미성숙 해독 종결이 mRNA 분해률을 향상시킬 수 있음을 입증하는 실험을 포함한다.
소정의 시간내에 합성되는 특정 단백질의 양이 이의 mRNA의 세포내 농도에 의존적이므로, mRNA 분해률 조절은 유전자 발현을 조절하는 강력한 수단을 제공한다. 포유동물 세포에서, mRNA 분해률(반감기로서 표현됨)은 짧으면 15 내지 30분이고 길면 500시간일 수 있다. 명백하게, mRNA 분해률의 이러한 차이는 특정 단백질의 농도를 1000배까지 차이나게 할 수 있다. 개별적인 mRNA에 대한 분해률이 고정될 필요는 없지만, 내인성 피드백 기전, 특정 호르몬의 존재, 분화 또는 세포 주기의 특정 단계, 또는 바이러스 감염의 결과로서 조절될 수 있다는 관찰에 의해 추가의 조절 수준이 제공된다.
아마도, 해독 및 mRNA 분해의 통합 과정의 가장 훌륭한 예는 미성숙 해독 종결의 결과를 나타내는 연구일 것이다. 이는 DNA내의 결실, 염기 치환 또는 프레임이동 돌연변이로 단백질 암호화 영역내에 부적절한 종결 코돈(넌센스 코돈)을 포함하는 mRNA가 합성되는 경우에 발생한다. 이러한 미성숙 종결 코돈의 발생은 어얼리 종결 부위에 해독을 정지시키고 끝이 절단된 단백질을 합성하게 된다. 이의 "정상" 분해률에 관계없이, 넌센스 돌연변이를 지닌 유전자로부터 전사된 mRNA("넌센스 함유 mRNA"로 칭함)는 매우 신속하게 분해된다. 이러한 "넌센스-매개된 mRNA 분해"은 편재하는데, 즉 이는 모든 시험 유기체에서 관찰되며 특정 mRNA의 양을 10배 내지 100까지 감소시킨다. 매우 감소된 mRNA 양과 미성숙하게 종결된 해독이 결합되어, 극단적으로는 유전자 결실의 결과로서 특정 유전자의 전체 발현 수준을 감소시킨다. 사람의 건강에 대한 넌센스-매개된 mRNA 분해의 중요성은, 넌센스 돌연변이가 질환 상태를 유발하고 각각의 mRNA가 넌센스-매개된 mRNA 분해 경로의 기질인 것으로 나타나는 유전 질환의 수가 증가되고 있음이 확인됨으로써 설명된다.
중요한 것은 넌센스-매개된 mRNA 분해 경로의 불활성화가 세포 성장을 방해하지 않으면서 수행될 수 있고, 넌센스 함유 mRNA에 대한 정상 수준 및 정상 분해률을 회복시킨다는 점이다. 보다 상세하게, 효모 실험(및 기타)은, mRNA가 여전히 넌센스 코돈을 함유하더라도, 상기한 분해 경로의 불활성화가 합성되는 단백질이 충분히 기능하도록 하여 세포가 본래의 유전적 결함을 극복할 수 있음을 입증하고 있다. 즉, 넌센스-매개된 mRNA 분해 경로를 하향조절함으로써 넌센스 돌연변이에 의해 유발되는 질환을 치료할 수 있다.
넌센스 또는 프레임이동 돌연변이의 결과인 질환, 단백질 또는 유전자는 다음을 포함하지만 이로써 제한되지는 않는다: 헤모글로빈--베타 위치; 낭포성 섬유증 막통과 전위 조절자; 뒤시엔드 및 베커 유형의 진행성 가성비대 근이양증; 페닐케톤뇨증; 인슐린 수용체; 혈우병 A, 선종성 결장폴립증, 가족성 고콜레스테롤혈증, 신경섬유종증 유형 I, 혈우병 B, 과지단백혈증 유형 I, 테이-삭스병, 유방암 유형 1, 부신과형성, 폰 빌레브란트병, 뮤코다당질축적증 유형 I, 백색증 I, 다낭신질환 1, 오르니틴 아미노트랜스퍼라제 결핍 각화혈관증, 다발성 내분비 신생물 유형 1, 성별 결정 영역 Y, 용질 운반체 패밀리 4 음이온 교환기 1, 콜라겐 유형 I알파-1 쇄, 하이포크산틴 구아닌 포스포라이보실트랜스퍼라제 1, 글루코키나제, 종양 단백질 p53, 지단백질성 단백질, 마이엘린, 성장 호르몬 수용체, 황체 호르몬/코리오고나도트로핀 수용체; 고밀도지단백질의 아포지단백질 A-I, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍 과암모니아혈증, 색소성 건피증 I, 페어드 박스 호메오틱(paired box homeotic) 유전자 6, 폰힙펠-린도우 증후군, 사이클린-의존적인 키나제 억제제 2A, 결정성 경화증 2, 티로신혈증 유형 I, 노리에병, 포스포디에스테라제 6B, 팔미토일-단백질 티오에스테라제, 아포지단백질 B, 브루톤 무감마글로불린혈증 타이로신 키나제, 부신 형성부전, 용질 운반체 패밀리 5, 5,10-2메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제, 윌름스 종양, 다낭신 질환, 전사 인자 14, 간 핵 인자, 뮤코다당질축적증 유형 II, 단백질 C 결핍증, 신경섬유종증 유형 II로 인한 선천성 혈전증, 부신백질이영양증, 콜라겐 유형 VII 알파-1, 콜라겐 유형 X 알파 1, 헤모글로빈--알파 위치-2, 당원 축적 질환 VII, 프럭토스 불내성, 유방암 2 초기 발병; BRCA2, 푸코실트랜스퍼라제 2, 헤르만스키-푸들라크 증후군, 티로글로불린, 망막모세포종, 비스코트-알드리치 증후군, 로돕신, 콜라겐 유형 XVII, 콜린 수용체, 사이클릭 뉴클레오타이드 게이트화된 채널, 광수용체, cGMP 게이트화된 콜린 수용체 니코틴 엡실론 폴리펩타이드, 재조합 활성화 유전자-1, 굴곡 이형성증, IgM이 증가된 면역부전증, 레트(RET) 원종양유전자; 레트 뮤코다당질축적증 유형 IVA, 렙틴 수용체, 유전성 구성적혈구증, 아르기닌, 바소프레신, 낭포성 섬유증으로 인한 아포지단백질 C-II 결핍증 유형 I 지단백혈증, 윌슨병, 렙틴, 혈관신경성 부종, 클로라이드 채널 5, 성선이발생증, 급성 간헐성 포르피린증, 헤모글로빈, 감마 A, 크라베병, 당원 축적 질환 V, 유아기 후 이염성 백질이양증, 거대 혈소판 증후군, 비타민 D 수용체, 사코글라이칸 델타 트위스트 드로소필라, 알츠하이머병, 세뇨관 산성혈증을 동반한 골화석증, 법랑질형성부전증, 포우 도메인 부류 1, 전사 인자 1, 당뇨병, 상염색체성 우성 V-KIT 하디-주커만 4-고양이 육종 바이러스 원종양유전자 상동체, 헤모글로빈--델타 위치, 아데닌 포스포라이보실트랜스퍼라제, 포스파타제 및 텐신 상동체, 성장 호르몬 1, 카텝신 K, 베너 증후군, 니만-피크병, 성장 호르몬-방출 호르몬 수용체, 세룰로플라스민, 콜로니 자극 인자 3 수용체, 과립구, 말초 마이엘린 단백질 22, 푸코사이드축적증, 다발성 외골증 유형 II, 판코니 빈혈, 상보성 그룹 C, 모세혈관확장성 운동실조증, 카드헤린 1, 용질 운반체 패밀리 2 멤버 2, UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제 1 패밀리 A1, 결정성 경화증 1, 라미닌 감마 2, 시스타닌 B, 다낭신 질환 2, 미소체성 트리글리세라이드 운반 단백질 88KD, 변형이형성증, 플라빈-함유 모노옥시게나제 3, 당원 축적 질환 III, 포우 도메인 부류 3, 전사 인자 4, 시토크롬 P450 서브패밀리 IID, 포르피린증, 선천성 적혈구생성증, ATPase, Cu(2+)-운반 알파 폴리펩타이드, 결장암, 가족성 비폴립증 유형 1, 포스포릴라제 키나제 알파 1 소단위(근육), 엘라스틴, 카나반병, 차이니즈 햄스터(Chinese hamster)에서의 절단-복구 상보성 결핍증, 야누스 키나제 3, 스테로이드생성 급성 조절 단백질, 푸코실트랜스퍼라제 6, 녹내장 1, 개방각, 다발성 외골증 유형 1, 마이오시클린, 무과립백혈구증, 유아성 유전 적혈구생성 수용체, 운동 뉴런 1 생존, 종말체 소닉 헤지호그(telomeric sonic hedgehog), 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제의 드로소필라 상동체 결핍,감수분열후 분리 증가(씨. 세레비지애)-1, 절단-복구 교차 상보성 설치류의 복구 결핍증 그룹 6, 단풍당밀 뇨질환, 세포분해 항원 1, 전사 인자 1, 간 유비퀴틴-단백질 리가제 E3A, 트랜스글루타미나제 1, 마이오신 VIIA, 세극결합 단백질 베타-1 32-KD, 전사 인자 2, 간 단백질 4.2, 적혈구, 갑상선 자극 호르몬 베타 쇄, 트리처 콜린스-프란세스첼티 증후군 1, 맥락막결함증, 심내막 섬유탄성증-2, 코우덴병, 항-뮐러 호르몬, SRY-박스 10, PTA 결핍 타이로시나제-관련 단백질 1, 포스포릴라제 키나제 베타 소단위, 세린/트레오닌 단백질 키나제 11, 포스포리파제 A2 그룹 IIA, 차이니즈 햄스터 3에서의 절단-복구 상보성 결핍, 부신과형성 II 콜라겐 유형 IV 알파-4 쇄, 글라즈만 및 네겔리 신색소 표피-특이적 단백질 65-KD의 혈소판무력증, 호메오 박스 A13, 칼파인, 거대 폴리펩타이드 L3, 크산틴우리아 라민 알파 2, 시토크롬 P450 서브패밀리 XIX, 뮤코다당질축적증 유형 VI, 세로이드-리포푸신증, 뉴런 3, 청소년 시트룰린증, 운베리히드 및 룬드보르그 포스포릴라제 키나제의 간대성 근경련, 고환/간 감마 2, 용질 운반체 패밀리 3 멤버 1, 프테린-4-알파-카비놀아민 데하이드라타제, 백색증 안 유형 1, 양성 신생아 요정증, 히르쉬스프룽병 골화석증, 상염색체성 열성 RAS p21 단백질 활성자 1, 뮤코다당질축적증 유형 VII 체디악-히가시 증후군, 칼륨 채널 내부 교정 서브패밀리 I 멤버 1, 플라코필린 1, 혈소판 활성화 인자 아세틸하이드롤라제 이소형 1B 알파 소단위, 플렉틴 1, 짧은 신장, MHC 부류 II 트랜스활성자, 저인산혈증, 비타민 D-내성 구루병, 릭 바이코이드(RIEG BIOCOID)-관련 호메오박스 전사 인자 1, 근이양증, 각막윤부연대 유형 2E, 색소성망막염-3, MutS, 이. 콜라이 동족체 3, 타이로신 트랜스아미나제 결핍 로우안뇌신증 증후군, 크산틴성 신결핵증, 가족성 청소년 1 내장역위증, X-연결된 뮐러-디커 뇌회결함 증후군, 프로페르딘 결핍, X-연결된 3-2옥소산 CoA 트랜스퍼라제, 워르덴버그-샨 증후군 근이양증, 각막윤부연대 유형 2, 알포트 증후군, 상염색체성 열성 당원 축적 질환 IV 당뇨병, 상염색체 우성 유형 II 용질 운반체 패밀리 2 멤버 1, 손-발-자궁 시스틴축적증 증후군, 초기 발병 또는 유아 신장병증 유형, 그리글러-나자르 증후군, 인슐린유사 성장 인자 1, 락테이트 데하이드로게나제-A, 스티클러 증후군 유형 II, 레버 I 알파-갈락토시다제 B의 선천성 흑내장, 부신과형성 I 리-프라우메니 증후군, 용질 운반체 12 패밀리 12 멤버 1, 클라인-워덴부르그 증후군 퍼옥시좀 생물발생 인자 7, 페어드 박스 호메오틱 유전자 8, 망막분리, 5-하이드록시트립타민 수용체 2C, 우레이트 옥사다제, 페우츠-제처르스 증후군 승모판 탈출증, 가족성 흑색종, 악성 피부 2, 푸코실트랜스퍼라제 1, 다발이공증, 뮤코다당질축적증 유형 IIIB, P-당단백질-3, 중증 합병형 면역부전증, B-세포 음성 색소성 망막염, 리보솜 단백질 S6 키나제 90KD, 폴리펩타이드 3 증후군, X-연결된 인자 결핍, 상보성 인자의 드로소필라 동족체 4, 데하이드로게나제/델타-이소머라제 유형 I, 진행성 전도성 등골 고정 AQP1 1, 가족성 진행성 간, 유형 III 모노포스페이트 데아미나제-1 및 호메오박스 전사 인자 1.
본 발명은 넌센스 및 프레임이동 돌연변이에 의해 유발된 질병의 치료제로서 작용하는 약물을 선별하는 방법을 제공한다. 이 방법은 ATP 결합의 활성, ATPase 활성, RNA 헬리카제 활성, GTP 결합, GTPase 활성, 방출 인자, 복합체에 대한 RNA 결합 또는 eRF3에 MTT1의 결합을 모니터링하고, mRNA 분해 및 해독 억제에 있어서의 사람 유전자 생성물의 활성을 정량할 수 있는 검정을 전개하며, 상기된 검정을 사용하여 화합물을 선별함으로써 이루어진다. 본원에 기술된 실험에 따라, 인자의 복합체(복합체의 단백질)의 활성을 길항/작용시킴으로써 필수 유전자에서의 넌센스 돌연변이의 치명적인 결과를 극복할 수 있음이 제시되었고/거나 사람 제제 또는 화합물을 얻을 수 있는 약물 개발을 위한 모델 시스템으로서 효소가 설정되었다.
본 발명은 (a) 단백질 복합체를 암호화하는 핵산으로 세포를 형질감염시키고, (b) 형질감염 후 세포의 결손 단백질 복합체의 비율을 결정하며, (c) 형질감염 후 세포의 결손 단백질 복합체의 비율을 형질감염 전 세포의 결손 단백질 복합체의 비율과 비교함을 포함하여, 결손 단백질 복합체와 관련된 질병 상태를 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 세포를 특허청구항의 벡터로 형질감염시키고, (b) 형질감염 후 세포의 결손 다량체 단백질의 비율을 결정하며, (c) 형질감염 후 세포의 결손 다량체 단백질의 비율을 형질감염 전 세포의 결손 다량체 단백질의 비율과 비교함을 포함하여, 결손 다량체 단백질과 관련된 질병 상태를 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 해당 유전자를 분리하고, (b) 해당 유전자가 모티프 I-IX를 포함하는 지를 결정함을 포함하여 해독 종결의 조절과 관련된 유전자를 동정하는 방법을 제공한다. 여기서, 만일 그 유전자가 9개의 모티프중 어느 하나라도 포함하고 있다면, 그 유전자는 해독 종결을 조절하는 것이다. 한가지 양태로서, 모티프 I은 서열 GppGTKTxT-X(n)을 포함한다. 다른 양태로서, 모티프 II는 서열riLxcaSNxAvDx1-X(n)을 포함한다. 다른 양태로서, 모티프 III은 서열 vviDExxQaxxxxxiPi-X(n)을 포함한다. 또 다른 양태로서, 모티프 IV는 서열 xxi1 aGDxxQLp-X(n)을 포함한다. 또 다른 양태로서, 모티프 V는 서열 1xx SLF erv-X(n)을 포함한다. 또 다른 양태로서, 모티프 VI는 서열 LxxQYRMhpxisefpxYxgxL-X(n)을 포함한다. 또 다른 양태로서, 모티프 VII는 서열 IgvitPYxxQvxx1-X(n)을 포함한다. 또 다른 양태로서, 모티프 VIII은 서열 vevxtVDxFQGreKdxIilSc VR-X(n)을 포함한다. 또 다른 양태로서, 모티프 IX는 서열 iGFLxdxRRINValTRak를 포함한다. 대문자는 일차 서열에서 특정 아미노산이 이 그룹의 일원가운데 보존되고 있는 위치를 나타낸다. 소문자는 일차 서열에서 화학 특성이 보존되어 있으나 반드시 정확하게 동일하지 않은 위치를 나타낸다.
DNA 서열 변이를 탐지하는데 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있다. 수동 서열분석 또는 자동 형광 서열분석을 포함한 직접적인 DNA 서열분석으로 서열변이를 탐지할 수 있다. MTT1 정도로 큰 유전자의 경우, 수동 서열분석은 너무 노동 집약적이지만 최적 조건하에서 유전자의 암호 서열에 있어서의 변이가 좀처럼 누락되는 일은 없다. 다른 방법은 일본쇄 입체구조 다형성 검정(SSCA)[Orita et al., 1989]이다. 이 방법은 특히 DNA 단편 크기가 200 bp이상인 경우 모든 서열 변이를 탐지하지 않지만 대부분의 DNA 서열 변이를 탐지하는데 가장 적합한 것일 수 있다. 감소된 검출 감도가 단점이기는 하나 SSCA에 의한 가능한 증가된 작업처리량으로 인해 연구를 목적으로 돌연변이를 탐지하기 위해 서열을 분석할 수 있는 인기있고 유용한 대안이다. SSCA 겔상에서 이동한 단편을 서열분석하여 DNA 서열 변이의 정확한 성질을 결정한다. 두 상보 DNA 가닥사이의 부정합 탐지를 토대로하는 다른 방법으로서, 클램프 변성 겔 전기영동(CDGE)[Sheffield et al., 1991], 헤테로이본쇄 분석(HA)[White et al, 1992] 및 화학적 부정합 절단(CMC)[Grompe et al., 1989]이 포함된다. 상기된 방법중 어느 것도 많은 결실, 중복 또는 삽입은 탐지할 수 없으며 또한 단백질의 전사 또는 해독에 영향을 미치는 조절 변이도 탐지하지 못한다. 이러한 계열의 변이를 탐지할 수 있는 다른 방법으로는 단백질 절두 검정 또는 비대칭 검정을 예로 들 수 있는데 단지 특정 유형의 변이만을 탐지하며 미스센스 돌연변이는 탐지하지 못한다. DNA 서열 변이를 탐지하는 것으로 현재 이용되고 있는 방법에 대한 평론을 그롬페의 최근 평론지(1993)에서 찾아 볼 수 있다. 일단 돌연변이가 밝혀지면, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드(ASO) 하이브리드화와 같은 대립유전자 특이적 검출 방법을 사용하여 그러한 동일한 돌연변이에 대해 다수의 다른 샘플을 신속하게 선별할 수 있다.
하나 이상의 제한 효소, 바람직하게는 다수의 제한 효소에 의해 절단된 DNA의 일련의 써던 블롯을 관찰함으로써 DNA 서열의 다형성을 탐지하는 신속한 예비 분석을 실시할 수 있다. 각 블롯은 일련의 정상 개체와 일련의 종양을 함유한다. 하이브리드화하는 단편을 나타내는 써던 블롯(MTT1 유전자에 근접한 또는 이 유전자를 포함한 서열로 탐지했을 때 대조 DNA와 길이가 다른 것)은 가능한 돌연변이를 가리킨다. 아주 많은 제한 단편을 생성하는 제한 효소가 사용되는 경우에는 펄스 전장 겔 전기영동(PFGE)를 사용한다.
점 돌연변이의 탐지는 당해 분야에 잘 알려진 기술을 사용하여 MTT1 대립유전자의 분자 클로닝에 이어 대립유전자를 서열분석함으로써 달성할 수 있다. 대안으로서, 공지 기술을 사용하여 종양 조직으로부터의 게놈 DNA 제제로부터 직접 유전자 서열을 증폭시킬 수 있다. 감수성 대립유전자의 존재를 검증하는 보다 완전하고 그러나 간접적인 시험으로서 6가지의 잘 알려진 방법이 있다: (1) 단일 가닥 입체구조 분석(SSCA)[Orita et al., 1989]; (2) 변성 구배 겔 전기영동(DGGE) [Wartell et al., 1990; Sheffield et al., 1989]; (3) RNase 보호 검정 [Finkelstein et al., 1990; Kinszler et al., 1991]; (4) 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오타이드(ASO)[Conner et al., 1983]; (5) 이.콜라이 mutS 단백질 [Modrich, 1991]과 같이 뉴클레오타이드 부정합을 인식하는 단백질의 사용; 및 (6) 대립유전자-특이적 PCR[Rano & Kidd, 1989]. 대립유전자-특이적 PCR의 경우, 특정 MTT1 돌연변이에 3' 말단에서 하이브리드화하는 프라이머가 사용된다. 만일 특정 MTT1 돌연변이가 존재하지 않는 경우, 증폭 생성물은 관찰되지 않는다. 유럽 공개 특허 제0332435호 및 문헌[Newton et al., 1989]에 기술된 바와 같이 증폭 불응성 돌연변이 시스템(ARMS)이 또한 사용될 수 있다. 또한 유전자의 삽입 및 결실은 클로닝, 서열분석 및 증폭에 의해 탐지될 수 있다. 또한, 유전자 및 주위 마커 유전자에 대한 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 탐침을 사용하여 대립유전자의 변형 또는 다형성 단편에서의 삽입을 기록할 수 있다. 이러한 방법은 특히 개체에서 발견된 MTT1 돌연변이의 존재에 대해 영향을 받은 개체의 인척을 선별하는데 유용하다.
유사한 방식으로, DNA 탐침을 사용하여 효소적 또는 화학적 분해를 통해 부정합을 탐지할 수 있다[참조: Cotton et al, 1988; Shenk et al, 1975; Novack etal., 1986]. 대안으로, 정합된 이본쇄에 대하여 부정합된 이본쇄의 전기영동 이동에 의해 부정합을 탐지할 수 있다[참조: Cariello, 1988]. 돌연변이를 함유할 수 있는 세포 mRNA 또는 DNA를 하이브리드화 이전에 PCR(하기 참조)을 사용하여 리보탐침 또는 DNA 탐침으로 증폭시킬 수 있다. 또한, MTT1 유전자의 DNA에 있어서의 변화는, 특히 변화가 결실 및 삽입과 같이 전체 재배열인 경우, 써던 하이브리드화를 사용하여 탐지할 수 있다.
PCR을 사용하여 증폭된 MTT1 유전자의 DNA 서열은 또한 대립유전자-특이적 탐침을 사용하여 선별할 수 있다. 이들 탐침은 핵산 올리고머이며 이들 각각은 공지된 돌연변이를 갖는 MTT1 유전자 서열의 영역을 함유한다. 예를 들면, 한 개의 올리고머는 길이가 약 30개 뉴클레오타이드일 수 있고 MTT1 유전자 서열의 일부에 상응한다. 그러한 한 벌의 대립유전자-특이적 탐침을 사용하여 PCR 증폭 생성물을 선별하여 MTT1 유전내의 종래 동정된 돌연변이의 존재를 동정할 수 있다. 증폭된 MTT1 서열로 대립유전자-특이적 탐침의 하이브리드화는 예를 들면 나일론 필터상에서 실시할 수 있다. 엄격한 하이브리드화 조건하에서 특정 탐침에 대한 하이브리드화는, 대립유전자-특이적 탐침에서와 같이, 종양 조직내에 동일한 돌연변이의 존재를 가리킨다.
MTT1 mRNA 발현의 변화는 본 분야에 공지된 기술에 의해 탐지될 수 있다. 이러한 기술로는 노썬 블롯팅 분석, PCR 증폭 및 RNase 보호이 포함된다. 감소된 mRNA 발현은 야생형 MTT1 유전자의 변이를 가리킨다. 야생형 MTT1의 변이는 또한 야생형 MTT1 단백질의 변이를 선별함으로써 탐지할 수 있다. 예를 들면, MTT1과 면역반응하는 모노클로날 항체를 사용하여 조직을 선별할 수 있다. 동종 항원의 결핍은 MTT1 돌연변이를 가리킨다. 또한, 돌연변이 대립유전자의 생성물에 대해 특이적인 항체를 사용하여 돌연변이 MTT1 유전자 생성물을 검출할 수 있다. 이러한 면역학적 검정은 본 분야에 공지된 어떠한 편리한 형식으로도 실시할 수 있다. 이들로서는 웨스턴 블롯팅, 면역조직화학 검정 및 ELISA 검정이 포함된다. 변이된 MTT1 단백질을 검출하는 어떠한 수단도 야생형 MTT1 유전자의 변이를 탐지하는데 사용할 수 있다. 단백질 결합 결정과 같은 작용성 검정이 사용될 수 있다. 돌연변이 MTT1 유전자 생성물의 발견은 야생형 MTT1 유전자의 변이를 가리킨다. 돌연변이 MTT1 유전자 또는 유전자 생성물은 또한 혈청, 대변, 소변 및 타액과 같은 다른 인체 샘플에서 검출될 수 있다.
본 발명은 또한 MTT1 폴리펩타이드 및 단편을 포함한 융합 폴리펩타이드를 제공한다. 동종 폴리펩타이드가 두 개 이상의 MTT1 폴리펩타이드 서열간에 융합되거나 MTT1 서열과 관련된 단백질간에 융합될 수 있다. 마찬가지로, 유도체 단백질의 특성 또는 활성이 결부되어 나타나는 이종 융합이 작제될 수 있다. 예를 들면, 리간드-결합 또는 다른 도메인이 상이한 새로운 융합 폴리펩타이드 또는 단편사이에 "교환"될 수 있다. 이러한 동종 또는 이종 융합 폴리펩타이드는 예를 들면 변화된 결합 세기 또는 결합 특이성을 나타낼 수 있다. 융합 파트너로는 면역글로불린, 세균성 베타-갈락토시다제, trpE, 단백질 A, 베타-락타마제, 알파 아밀라제, 알콜 데하이드로게나제 및 효모 알파 교배 인자가 포함된다[참조: Godowski et al., 1988]. 융합 단백질은 전형적으로 하기된 바와 같이 재조합 핵산 방법에 의해 제조하거나 화학적으로 합성할 수 있다. 폴리펩타이드의 합성 기술은 예를 들면 문헌[Merrifield, 1963]에 기술되어 있다.
본 발명의 진단 검정은 핵산과 같은 핵산 검정, 하이브리드화 검정 및 본원에 기술된 사람 MTT1의 핵산 서열을 탐지하는데 특이적인 핵산의 증폭을 탐지하는 검정일 수 있다.
하이브리드화 검정을 실시하는데 허용되는 수단은 공지되어 있고 이러한 기술의 일반적인 개요는 문헌[Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (72); Hybridization of Nucleic Acids Immobilized on Solid Supports (4); Analytical Biochemistry (4) and Innis et al., PCR Protocols (74)]에서 찾아 볼 수 있다. 이들 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다.
표적 특이적 탐침은 핵산 하이브리드화 진단에 사용할 수 있다. 탐침은 해당 표적에 대해 특이적이거나 상보적이다. 정미한 대립유전자 분화 때문에 탐침은 길이가 약 14개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 20 내지 30개 뉴클레오타이드이어야 한다. 본 발명의 사람 MTT1의 보다 일반적인 탐지를 위해 핵산 탐침은 길이가 약 50 내지 약 1000개 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 약 200 내지 약 400개 뉴클레오타이드이다.
특이적 핵산 탐침은 RNA 또는 DNA 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드, 또는 이들의 유사체일 수 있다. 탐침은 단일 또는 이본쇄 뉴클레오타이드일 수 있다. 본 발명의 탐침은 본 분야에 잘 알려진 방법(예, 닉 해독, 프라이머 연장, 역전사, 중합효소 연쇄 반응 등)을 사용하여 효소적으로 합성하거나 예를 들면 문헌[Beaucage and Carruthers (19)]에 기술된 포스포르아미다이트 방법과 같은 방법 또는 문헌[Matteucci et al. (62)]에 기술된 트리에스테르 방법에 의해 화학적으로 합성할 수 있다. 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다.
사람 MTT1의 존재를 결정하는 다른 수단은 동일반응계 하이브리드화이며, 보다 최근의 것으로는 동일반응계 중합효소 연쇄 반응이다. 동일반응계 PCR은 문헌[Neuvo et al. (71), 중합효소 연쇄 반응(PCR)-증폭된 C형 간염 cDNA의 세포내 국재; Bagasra et al. (10), 동일반응계 중합효소 연쇄 반응에 의한 단핵 세포내 면역결핍 바이러스 I형 프로바이러스의 검출; 및 Heniford et al. (35), 동일반응계 역전사효소 중합효소 연쇄 반응에 의해 증명된 세포 EGF 수용체 mRNA 발현의 변이]에 기술되어 있다. 동일반응계 하이브리드화 검정은 잘 알려져 있으며 일반적으로 문헌[Methods Enzymol (67)]에 기술되어 있다. 이 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다. 동일반응계 하이브리드화에서, 세포는 고체 지지체상에, 전형적으로 유리 슬라이드상에 고정된다. 그런 다음, 세포를 표지된 표적 특이적 탐침의 어닐링을 허용하는데 적당한 온도에서 하이브리드화 용액과 접촉시킨다. 탐침은 바람직하게는 방사성동위원소 또는 형광 리포터로 표지된다.
상기된 탐침은 또한 동일반응계 하이브리드화에 유용하거나 그 유전자를 발현하는 조직을 추적하는데 유용하거나 여러 생물학적 조직내에서 그 유전자 또는 이의 mRNA의 존재에 대한 다른 하이브리드화 검정에 유용하다. 동일반응계 하이브리드화는 항원의 발현 또는 천연 대 변성 조건에 종속되지 않는 민감한 국재 방법이다.
억제 핵산이 mRNA를 표적으로 할 수 있다. 이 방법에서, 억제 핵산은 암호화된 단백질의 해독을 특이적으로 차단하도록 고안된다. 이 방법에 따르면, 억제 핵산을 사용하여 중요한 단백질을 암호화하는 mRNA의 해독을 억제함으로써 특정 세포 기능을 선택적으로 억제할 수 있다. 예를 들면, c-myc mRNA의 영역에 상보적인 억제 핵산은 c-myc 원종양 유전자과 과다발현하는 사람 전골수구성 백혈병 세포주 HL60에서의 c-myc 단백질 발현을 억제한다[참조: Wickstrom E.L., et al. (93) 및 harel-Bellan, A., et al. (31A)]. 이 문헌에 기술된 바에 의하면, mRNA를 표적으로 하는 억제 핵산은 수 개의 다른 메카니즘에 의해 암호화된 단백질의 해독을 억제하도록 작용하는 것으로 제시되었다.
마지막으로, 억제 핵산을 사용하여 표적 유전자 또는 mRNA의 화학적 불활성화 또는 분해를 유도할 수 있다. 화학적 불활성화는 세포내에서 억제 핵산과 표적 핵산간의 가교를 유도함으로써 일어날 수 있다. 적절히 유도체화된 억제 핵산에 의해 유도된 표적 핵산의 다른 화학적 변형이 또한 사용될 수 있다.
표적 핵산의 분해 및 이에 따른 불활성화는 분해 반응을 유도하도록 활성화될 수 있는 억제 핵산에 치환체를 연결시킴으로써 달성될 수 있다. 대안으로서, 분해는 리보자임 또는 촉매 RNA의 사용에 의해 유도될 수 있다. 이 방법에서 억제 핵산은 촉매 활성을 갖는 천연 RNA(리보자임) 또는 합성 핵산을 포함한다.
또한, 본 발명은 MTT1 유전자의 분리된 핵산과 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 안티센스 분자를 제공한다. 본 발명은 분리된 DNA 분자에 의해 암호화된 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 발현을 차단할 수 있는 길항제를 제공한다. 한가지양태로서, 길항제는 이본쇄 DNA 분자와 하이브리드화할 수 있다. 다른 양태로서, 길항제는 DNA 분자와 하이브리드화할 수 있는 삼본쇄 올리고뉴클레오타이드이다. 또 다른 양태로서, 삼본쇄 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열로 분리된 DNA 분자의 적어도 일부와 결합할 수 있다.
안티센스 분자는 DNA 또는 RNA 또는 이의 변이체(즉, 단백질 골격을 갖는 DNA 또는 RNA)일 수 있다. 본 발명은 mRNA를 안티센스 핵산으로 엄폐시키거나 mRNA를 리조자임으로 분해시킴으로써 특정 mRNA의 해독시 수용체 인식 단백질의 발현을 차단하는데 사용할 수 있는 안티센스 뉴클레오타이드 및 리보자임의 제조를 포함한다.
안티센스 핵산은 특이적 mRNA 분자의 적어도 일부와 상보적인 DNA 또는 RNA이다. 세포내에서, 이들은 그 mRNA와 하이브리드화하여 이본쇄 분자를 형성한다. 세포는 이본쇄 형태의 mRNA를 해독하지 못한다. 따라서, 안티센스 핵산은 mRNA의 단백질로의 발현을 차단한다.
안티센스 뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 당업자가 인지할 수 있는 바와 같이 MTT1 유전자의 발현을 억제하거나 감소시키는데 유용하다. 예를 들면, MTT1 유전자의 전부 또는 일부 또는 MTT1으로부터의 다른 서열(특히, MTT1 유전자에 인접한 것)을 함유한 폴리뉴클레오타이드 벡터를 안티센스 방향으로 프로모터의 조절하에 배치시키고 세포내로 도입시킬 수 있다. 세포내에서의 그러한 안티센스 작제물의 발현은 MTT1 전사 및/또는 해독 및/또는 복제를 차단한다. AUG 개시코돈과 하이브리드화하는 약 15개 뉴클레오타이드 및 분자의 올리고머가 특히 효율적인데, 그 이유는 이들이 합성하기가 쉽고 세포내로 도입되었을 때 보다 큰 분자보다 문제를 덜 유발하기 때문이다.
본 발명은 (a) DNA를 함유한 세포를 제공하고, (b) 세포에서 DNA를 과다발현시켜 MTT1과 결합하고 MTT1 기능을 차단하는 과다발현된 폴리펩타이드를 생성함을 포함하여, 세포내에서의 mRNA의 해독 종결 효능 및/또는 변형 전사체의 분해를 실질적으로 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 a) 세포를 제공하고; b) 복합체에 결합하기에 충분한 양으로 복합체의 안티센스 전사체를 발현시킴을 포함하여, 세포내에서의 mRNA의 해독 종결 효능 및/또는 변형 전사체의 분해를 실질적으로 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 어떠한 작용성 복합체도 세포에서 생성되지 않도록 MTT1, Upf1p, Upf2p, Upf3p, eRF1 및 eRF3을 포함한 복합체를 변이시킴을 포함하여, 세포내에서의 해독 종결을 실질적으로 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 대상자의 세포내로 유입되는 복합체 및 약제학적 담체 또는 희석제를 함유한 치료 유효량의 약제학적 조성물을 대상자에게 투여하여 대상자를 치료함을 포함하여, mRNA의 해독 종결 효율 및/또는 변형 전사체의 분해와 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
한가지 양태로서, 본 발명은 유전자 결핍, 질병 또는 임상 치료의 결과로서 결손과 관련된 병적 증세의 초기 단계의 위험에 있는 환자에게 복합체의 발현을 조절하는 치료 유효량의 제제 또는 조성물을 투여하여 환자의 상태를 경감시킴을 포함하여, 상기 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
본원에 사용된 "치료 유효량"은 치료받는 환자의 상태를 경감시키기에 충분한 제제의 양을 의미한다. 용어 "경감"은 치료를 받는 환자에게서 질병 상태의 해로운 결과를 감소시키는 것을 의미한다. 본 발명에서의 대상자는 바람직하게는 사람이나 어떠한 동물도 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있음은 명백하다.
이것은 예를 들면 병합 라이브러리 기술 또는 적합한 약물 다지인 기술을 사용한 약물 개발을 위해 여러 도메인을 표적으로 할 수 있다는 점에서 약물 표적에 밀접하게 관련되어 있다.
상기된 바로부터, 본 발명이 수 개 관점의 해독 정확성, 즉 항바이러스 요법 및 병인성 넌센스 변이의 억제에 중요하게 관련되어 있는 억제, 신장 및 종결을 유도하는 많은 경로를 제공한다. 따라서, 본 발명은 항바이러스 화합물로서 또는 리보좀 분해를 변경시키기 위해 사용하는 약물을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "약물"은 개시, 신장, 종결, mRNA 분해동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 중심의 기능에 영향을 미칠 수 있는 항생물질 또는 단백질과 같은 화합물 또는 제제를 의미한다. 이러한 화합물은 변형 mRNA 및 해독 종결의 효율을 증가 또는 감소시킬 수 있다.
유전자 요법 및 형질전환 벡터
한가지 양태로서, 복합체 또는 이의 인자를 암호화한 핵산, 복합체에 특이적이거나 방출 인자의 영역에 대해 특이적인 안티센스 또는 리보자임, MTT1 및 Upf1p를 생체내에서 바이러스 벡터내로 도입시킨다. 이러한 벡터로는 이들로 한정되는것은 아니지만 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 유두종바이러스, 엡스타인 바르 바이러스(EBV), 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스(AAV) 등과 같은 약독화 또는 결손 바이러스가 포함된다. 바이러스 유전자가 완전히 또는 거의 완전히 결핍된 결손 바이러스가 바람직하다. 결손 바이러스는 세포내로의 도입 후 감염성이 없다. 결손 바이러스 벡터의 사용은 벡터가 다른 세포를 감염시킬 수 있다는 우려가 없는 한편 특정한 한정 영역에서 세포로의 투여를 가능하게 한다. 따라서, 지방 조직을 특정적으로 표적으로 할 수 있다. 특정 벡터의 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 결손 헤르페스 바이러스 1(HSV1) 벡터[Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)], 문헌[Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90:626-630 (1992)]에 기술된 벡터와 같은 약독화 아데노바이러스 벡터 및 결손 아데노-관련된 바이러스 벡터[Samulski et al., J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828 (1989)]가 포함된다.
다른 양태로서, 유전자는 예를 들면 앤더슨 등의 미국 특허 제5,399,346호, 문헌[Mann et al., 1983, Cell 33:153], 테민 등의 미국 특허 제4,650,764호, 테민 등의 미국 특허 제4,980,289호, 문헌[Markowitz et al., 1988, J. Virol. 62:1120], 테민 등의 미국 특허 제5,124,263호, 도거티 등의 국제 특허 공개 공보 제WO95/07358호(공개일: 1995년 3월 6일) 및 문헌[Kuo et al., 1993, Blood 82:845]에 기술된 바와 같이 레트로바이러스 벡터에 도입시킬 수 있다. 표적된 유전자 전달은 국제 특허 공개 공보 제WO95/28494호(공개일: 1995년 10월)에 기술되어 있다.
대안으로, 벡터는 생체내에서 리포좀 감염에 의해 도입될 수 있다. 과거 10년 동안 시험관내에서 핵산의 피막형성 및 형질감염을 위해 리포좀의 사용이 증가되어 왔다. 리포좀 매개된 형질감염에 의해 유발된 난제 및 위험을 최소하기 위해 고안된 양이온성 합성 지질을 사용하여 마커를 암호화한 유전자의 시험관내 형질감염을 위한 리포좀을 제조할 수 있다[Felgner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417 (1987); Mackey, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031 (9188)]. 리포좀 감염을 사용하여 외래 유전자를 생체내 특정 기관내로 도입하는 것은 특별한 실질적인 이점이 있다. 특정 세포에 대한 리포좀의 분자적 표적화는 하나의 유익한 영역을 나타낸다. 특정 종류의 세포로 형질감염을 유도하는 것은 췌장, 간, 신장 및 뇌와 같이 세포 이질성을 가진 조직에서 특히 유리할 수 있음은 명백하다. 지질은 표적화의 목적상 다른 분자에 화학적으로 결합될 수 있다[참조: 상기 Mackey et al.]. 표적화된 펩타이드(예, 호르몬 또는 신경전달물질 및 항체와 같은 단백질) 또는 비-펩타이드 분자가 리포좀에 화학적으로 결합될 수 있다.
또한, 생체내에서 벡터를 나(naked) DNA 플라스미드로서 도입하는 것이 가능하다. 유전자 요법을 위한 나 DNA 벡터는 목적하는 숙제 세포내로 본 분야에 공지된 방법, 예를 들면 형질감염, 전기천공, 미세주사, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 유전자 총의 사용 또는 DNA 벡터 트랜스포터의 사용에 의해 도입할 수 있다[참조: Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); Hartmut et al., 캐나다 특허원제2,012,311호(출원일: 1990년 3월 15일)].
추가의 양태로서, 본 발명은 펩티딜 트랜스퍼라제 중심의 조절자를 암호화하는 유전자(이들로 한정되는 것은 아니지만 돌연변이 프레임이동 또는 mRNA 분해 반백질에 대한 유전자 또는 이러한 단백질을 암호화한 mRNA에 대해 특이적인 안티센스 RNA 또는 리보자임을 포함) 및 비관련된 안티센스 핵산 또는 리보자임에 대한 유전자를 조화된 발현 조절하에 포함하는 유전자 요법 발현 벡터를 제공함으로써 특정 DNA 인식 서열의 조절하에 펩티딜 트랜스퍼라제 중심에서 활성을 조절하는 유전자 생성물 및 치료학적 이종 안티센스 또는 리보자임 유전자의 동시-발현을 제공한다. 한가지 양태로서, 이들 요소는 별도의 벡터에 제공될 수 있으며, 대안으로서 이들 요소는 하나의 발현 벡터에 제공될 수 있다.
항바이러스 요법
추가의 다른 양태로서, 본 발명은 해독 정확성을 조절하고 그럼으로써 바이러스 복제 또는 바이러스 입자의 집합에 직접적인 영향을 미치는 제제를 제공함으로써 바이러스 감염을 치료하는 수단을 제공한다.
본 발명은 유리하게는 4개의 큰 계열의 동물 바이러스 및 3개의 큰 계열의 식물 바이러스를 포함하여 기본적인 -1 리보좀 프레임이동 메카니즘을 사용하는 바이러스의 항바이러스 요법에 사용하기 위한 약물 및 이러한 약물을 동정하는 방법을 제공한다. 특정적으로, 본 발명은 복합체와 관련된 프레임이동에 영향을 미치고 Upf3p와 연관이 있는 제제, 길항제/효능제를 선별하는 검정을 제공한다. 또한 본발명은 돌연변이 Upf3을 제공한다.
예를 들면, HIV-1 및 HIV-2와 같은 렌티바이러스(면역결핍 바이러스), SIV, FIV, BIV, 비스나 바이러스, 관절염-뇌염 바이러스 및 말 감염성 빈혈증 바이러스; 사람 포말성 바이러스 및 다른 포유류 포말성 바이러스와 같은 스푸마바이러스(포말성 바이러스); HTLV-I, HTLV-II, STLV 및 BLV와 같은 T 세포 임파추향성 바이러스; 시판되는 가금을 포함한 많은 조류의 백혈병 및 육종 바이러스와 같은 금류 백혈증 바이러스; 마우스 포유류 종양 바이러스를 포함한 B형 레트로바이러스; 및 메이슨-파이자 원숭이 바이러스 및 양의 폐 선암 바이러스와 같은 D형 레트로바이러스를 포함한 거의 모든 레트로바이러스는 -1 리보좀 프레임이동을 사용한다. 또한, 229-E, OC43와 같은 사람 코로나바이러스; 송아지 코로나바이러스, 돼지의 전파성 위장염 바이러스, 돼지의 응집 뇌척수염 바이러스 및 돼지 유행성 이질 바이러스와 같은 동물 코로나바이러스 많은 코로나바이러스; 개 코로나바이러스; 고양이 감염성 복막염 바이러스 및 고양이 장 코로나바이러스; 가금의 감염성 기관지염 바이러스; 터어키 자람병 바이러스; 마우스 간염 바이러스, 랫트 코로나바이러스 및 토끼 코로나바이러스를 포함한 많은 코로나바이러스가 가 -1 프레임이동을 사용한다. 유사하게, 장 및 호흡기 질환과 관련된 사람 토로바이러스; 송아지의 브레다 바이러스 및 소 호흡기 바이러스; 말의 베른 바이러스; 돼지 토로바이러스; 고양이 토로바이러스와 같은 토로바이러스(코로나바이러스의 유형)가 관련되어 있다. 다른 코로나바이러스는 원숭이 출혈열 바이러스, 말 동맥염 바이러스, 렐리스태드 바이러스(돼지), VR2332 바이러스(돼지) 및 렉테이트 데하이드로게나제-상승 바이러스(설치류)를 포함한 아테리바이러스이다. 다른 동물 바이러스는 홍역에서 보고된 사람 -1 리보좀 프레임이동과 같은 파라믹소바이러스 및 사람 아스트로바이러스 1-5 및 소, 양, 돼지, 개 및 오리 아스트로바이러스와 같은 아스트로바이러스이다.
-1 프레임이동 메카니즘과 관련된 식물 바이러스로는 소베모바이러스(예, 남부 강낭콩 모자이크 바이러스, 오리새 기질 바이러스), 류테오바이러스(예, 보리 황색부스러기 바이러스, 사탕무우 웨스턴 옐로우스 바이러스 및 감자 잎 롤 바이러스), 에나모바이러스(예, 완두콩 모자이크 바이러스) 및 움브라바이러스(예, 홍당무 반점 바이러스)와 같은 테트라바이러스; 톰부스바이러스(예, 토마토 덤불 발육저지 바이러스), 카르보바이러스(예, 카아네이션 반점 바이러스), 네크로바이러스(예, 담배 괴사 바이러스)와 같은 톰부스바이러스; 디안토바이러스(예, 적색 클로버 괴사성 모자이크 바이러스) 및 마키오모바이러스(예, 옥수수 백화 반점 바이러스)가 포함된다.
또한, L-A 및 L-BC(효모) 및 다른 진균 바이러스와 같은 토티바이러스, 지라디아 람블리아 바이러스(장 기생충), 트리코넬라 바지넬 바이러스(사람 기생충), 레쉬마니아 브라질리엔시스 바이러스(사람 기생충) 및다른 원생동물 바이러스가 -1 프레임이동 바이러스이다.
본 발명에 따른 치료 조성물의 성분은 비경구로, 암주위로, 경점막으로, 경피로, 근육내로, 정맥내로, 내피로, 피하로, 복강내로, 심실내로 또는 두 개내로 주입 또는 투여할 수 있다.
전달 방식은 이들로 한정되는 것은 아니지만 나 DNA, 단백질, 펩타이드, 바이러스 벡터내 또는 리포좀내이다. 한가지 양태로서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노-관련된 바이러스 또는 아데노바이러스이다.
당업자에 의해 쉽게 인지될 수 있듯이, 본 발명의 조성물 및 방법은 어떠한 동물도 치료하는데 적합하며, 특히 포유류, 더욱 특정적으로는 사람이 적합하다. 이들로 한정되는 것은 아니지만 고양이 또는 개와 같은 집동물, 소, 말, 염소, 양 및 돼지 등과 같은 농장동물, 야생동물(야생 또는 동물원 동물), 연구용, 즉 수의학용 동물(예, 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양, 돼지, 개, 고양이 등)이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "약제학적 조성물"은 SCF 요법에 유용한 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 배합된 치료 유효량의 복합체를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "치료 유효량"은 주어진 증세 및 투여 섭생에 대해 치료 효과를 제공하는 양을 의미한다. 이러한 조성물은 액체이거나 동결건조 또는 다른 방식으로 건조된 제제이며 여러 완충 희석제(예, 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 세기 조절제, 표면에의 흡착을 방지하는 젤라틴 또는 알부민과 같은 첨가제, 세정제(예, 트윈 20, 트윈 80, 플루로닉 F68, 담즙산염), 가용화제(예, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜) 산화방지제(예, 아스코르빈산, 나트륨 메타비설파이트), 보존제(예, 티메로살, 벤질 알콜, 파라벤), 충전 물질 또는 강성 조정제(예, 락토즈, 만니톨), 단백질에 중합체(예, 폴리에틸렌 글리콜)의 공유결합, 금속 이온과의 착염화 또는 폴리락트산, 폴리글리콜산 하이드로겔 등과 같은 중합체 화합물의 입자 제제내로 또는 제제상에 또는 리포좀, 미세캡슐, 이셀, 단독박막 또는 다중박막 소낭상에 물질의 혼입, 적혈구 고스트 또는 스페로플라스트를 포함한다. 이러한 조성물은 SCF의 물리적 상태, 용해성, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 분해 속도에 영향을 미친다. 조성물의 선택은 SCF 활성을 갖는 단백질의 물리화학적 특성에 의해 결정된다. 예를 들면, SCF의 막-결합된 형태로부터 유도된 생성물은 세정제를 함유한 제제를 필요로 할 수 있다. 조절된 또는 지속된 방출 조성물은 호지성 데포(예, 지방산, 왁스, 오일)에 제제를 함유한다. 또한, 본 발명은 조직-특이적 수용체, 리간드 또는 항원에 대한 항체에 연결되거나 조직-특이적 수용체의 리간드에 연결된 SCF 및 중합체(예, 폴록사머 또는 폴록사민)로 피복된 과립 조성물을 포함한다. 다른 양태로서, 본 발명의 조성물은 비경구, 폐내, 비후 및 경구를 포함한 여러 투여 경로를 위해 보호 피복제, 프로테아제 억제제 또는 침투 촉진제를 입자 형태로 함유한다.
본원에 사용된 "약제학적으로 허용된 담체"는 당업자에게는 잘 알려져 있으며 이들로 한정되는 것은 아니지만 0.01 내지 0.1 M, 바람직하게는 0.05 M 포스페이트 완충액 또는 0.8% 염수가 포함된다. 추가로, 그러한 약제학적으로 허용된 담체는 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼일 수 있다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일(예, 올리브유) 및 주사용 유기 에스테르(예, 에틸 올레이트)를 들 수 있다. 수성 담체로는 염수 및 완충매질을 포함하는 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다. 비경구 비히클로는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로즈, 덱스트로즈와 염화나트륨, 유산을 가한 링거 오일 또는 비휘발성 오일이 포함된다. 정맥내 비히클로는 유액 및 영양 보충물, 링거 덱스트로즈를 기본으로 한 것과 같은 전해질 보충물 등이 포함된다. 항균제, 산화방지제, 킬레이트화제, 불활성 가스 등과 같은 보존제 및 다른 첨가제가 또한 함유될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료 유효량"은 숙주에서의 활성, 작용 및 반응에 있어서의 임상학적으로 유의적인 결손을 약 15% 이상, 바람직하게는 약 50% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 감소시키는데 충분한 양, 가장 바람직하게는 예방하는데 충분한 양을 의미한다. 다르게는, 치료 유효량은 숙주에서의 임상학적으로 유의적인 증세의 호전을 일으키기에 충분한 양이다. 당업자도 알 수 있듯이 화합물의 양은 이의 특이적 활성에 따라 다양할 수 있으며 적합한 용량은 일일당 체중 kg당 활성성분이 약 0.1 내지 20 mg, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 10 mg, 더욱 바람직하게는 1 내지 수 mg일 수 있으며 투여 경로에 따라 변한다. 한가지 양태로서, 용량은 10 내지 20 mg/kg이다. 다른 양태로서, 용량은 10 pg/kg 내지 2 mg/kg이다. 또 다른 양태로서, 용량은 2 내지 80 ㎍/kg이다. 또 다른 양태로서, 용량은 5 내지 20 ㎍/kg이다.
본 발명의 치료 조성물과 관련하여 사용된 용어 "단위 용량"은 사람에 대한 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 양을 의미하는 것으로 각 단위는 필요한 희석제, 즉 담체 또는 비히클과 배합하여 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 물질의 예정된 양을 함유한다.
또 다른 양태로서, 치료 화합물은 조절된 방출 시스템을 통해 전달될 수 있다. 예를 들면, 복합체는 정맥내 주입, 삽입식 삼투성 펌프, 경피 패치, 리포좀 또는 다른 투여 방식을 사용하여 투여할 수 있다. 한가지 양태로서, 펌프가 사용될수 있다[참조: 상기 랭거; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)]. 다른 양태로서, 중합체 물질이 사용될 수 있다[참조: Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)]. 또 다른 양태로서, 조절된 방출 시스템을 치료상 표적(즉, 뇌)에 근접하여 배치할 수 있으며 이에 따라 전신 용량의 단지 일부만을 필요로 한다[참조: Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984)]. 바람직하게는, 조절된 방출 기구를 환자의 부적절한 면역 활성화 부위 또는 종양 부위 근처에 삽입시킨다. 다른 조절된 방출 시스템은 문헌[Langer, Science 249:1527-1533 (1990)]에 논의되어 있다.
당업자가 쉽게 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 방법 및 약제학적 조성물은 어떠한 동물에도 투여하기에 적합하며 동물로는 특이 포유류이며 이들로 한정되는 것은 아니지만 고양이 또는 개와 같은 집 동물, 이들로 한정되는 것은 아니지만 소, 말, 염소, 양 및 돼지와 같은 농장 동물, 야생 동물(야생 또는 동물원 동물 모두 포함), 연구용(즉, 수의학용) 동물(예, 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양, 돼지, 개, 고양이 등)이 포함된다.
실험에 대한 상세한 설명
실시예 1: RNA 헬리카제의 계열은 해독 종결의 조절제이다.
재료 및 방법
일반적인 효모 방법:효모 배지, 형질전환, RNA 분리, 블롯팅 및 하이브리드화는 문헌[Rose et al., 1990, Weng et al., 1996a, Hagan et al., 1995, Schelis시 and Geitz 1989]에 기술된 바와 같다.
글루타티온 세파로즈-RF 융합 복합체의 제조 및 정제된 RF-융합 단백질의 제조:글루타티온 세파로즈-RF 융합 복합체는 전술된 바와 같이 제조되었다[Czaplinski et al., 1998]. 1 μl의 GST-RF 복합체는 전형적으로 0.9 ㎍의 GST-eRF1 또는 1.5 ㎍의 GST-eRF3을 함유한 한편 GST 복합체는 전형적으로 수지 1 μl당 4.5 ㎍의 GST를 함유하였다. 또한, 정제된 GST-RF 복합체는 pGEX2T, pGEX2T-SUP35 또는 pGEX2T-SUP45로 형질전환된 BL21(DE3)pLysS 세포로부터 제조되었고 융합 단백질은 전술한 바와 같이 분리되었다[Czaplinski et al., 1998].
세포질 추출물의 제조:BJ3505(MATα pep4::HIS3 prb-△1.6R HIS3 lys2-208 trp1-△10 ura3-52 gal2 can1) 세포를 OD600=1.0으로 성장시키고 0.5 mM PMSF가 함유된 5 ml의 냉 완충액 IB(BSA가 결여된 IBTB)중에서 세척하였다. 세포를 재펠렛화하고 0.5 mM PMSF 및 프로테아제 억제제(PI, 각각 1 ㎍/ml의 류펩틴, 아프로티닌 및 펩스타틴 A)가 함유된 1.3 ml의 냉 IB중에 현탁시켰다. 거의 동일한 용량의 유리 비드를 가하고 와동사이에 1분동안 빙상에서 냉각시키면서 20초 동안 6회 와동시켜 용해시켰다. 용해물을 제거하고 비드를 동일 용량의 IB(0.5 mM PMSF 및 각각 ㎍/ml의 류펩틴, 아프로티닌 및 펩스타틴 A를 함유함)로 2회 세척하였다. 세척물을 용해물과 혼합하고 세포 파편을 20분동안 30,000 x g로 원심분리하여 제거하였다.
ATPase 검정:1 ㎍/ml의 폴리(U) RNA 및 100 ㎍/ml의 BSA를 사용하고 전술한 바와 같이[Czaplinski et al., 1995] 목탄 검정에 의해 GST-RF 융합 단백질의 존재하에 20 ng Mtt1p를 사용하여 Mtt1p RNA-의존성 ATPase 활성을 결정하였다. 이 결과는 표시된 단백질의 농도에 대해 방출된32P의 pmol로서 점획되었다.
결과
UPF1 유전자와 유사한 효모 상위계열의 제I군 헬리카제의 동정: UPF1유전자와 상동성이 있는 효모의 다른 유전자를 동정하기 위하여 서열 비교 분석을 실시하였고, 그 결과를 도 1에 도시한다. 그 결과,SEN1유전자가UPF1과 유의적인 상동성이 있음을 확인하였다[도 2; Koonin, 1992 문헌 참조].SEN1은 tRNA 접목에 영향을 미치는 돌연변이에 대한 스크리닝에서 동정된 것으로, 상위계열 제I군의 헬리카제로 간주될 수 있는 모든 모티프를 갖고 있다[Winey and Culbertson, 1988, DeMarini et al., 1992]. 또한, 이전에 밝혀진 DNA2 역시 UPF1과 유의적인 상동성을 나타냈다(도 2).DNA2는 DNA 복제, 아마도 오카자키 단편의 프로세싱에 중요한 역할을 하는 것으로 추정된다[Budd et al., 1995, Budd and Campbell 1997]. 또한,UPF1과 상동성이 높은 상위계열 제I군 헬리카제를 암호화하는 또 다른 2개의 유전자가 동정되었고, 이를 이전 연구에서는 헬리카제 A[HCSA, Biswas et al. 1997a,b] 및 헬리카제 B[HCSB, Biswas et al. 1997] 또는 scHel1[Bean and Matson, 1993]라고 명명하였다. 하기 기재되는 이유로 인하여, 헬리카제 B(HCSB)를 암호화하는 유전자는 MTT1(해독 종결 조절인자: Modulator of Translation Termination)이라고 명명하였다. HCSA 및 MTT1 유전자가 암호화하는 단백질들은 이전에 정제되었고, DNA 의존적 헬리카제 활성이 있는 것으로 증명되었다[Biswas et al., 1995; Biswas et al. 1997a,b; Bean and Matson, 1993]. HCSA 및 HCSB는 염색체 복제에 관여한다고 제안되었다[Biswas et al., 1995, 1997a,b]. 이러한 견해는 1) 효모 일본쇄 DNA 결합 단백질 Rpalp가 DNA 헬리카제 활성을 증가시키고, 2) DNA 폴리머라제 α와 동시정제된 HcsA는 복제성 헬리카제들의 생화학적 성질을 나타낸다[Biswas et al., 1997a,b]는 관찰에 기초한 것이다. 현재까지, 복제시 HCSA 또는 HCSB의 관련성을 시사하는 생체내 증거는 없다. hcas△ 및 hcsb△ 균주는 모두 생육성이다. hcsb△ 균주는 성장 결손이나, DNA 손상에 대한 민감성 또는 호흡 결손을 나타내지 않는다[Bean and Matson, 1997]. MTT1의 프로모터 영역내로의 트란스포손 삽입은 세포벽 합성 억제제인 칼코플루오르 화이트(calcofluor white) 및 해독의 오판독(misreading)을 유도하는 약물인 하이그로마이신 B에 대한 과민성을 유발하는 것으로 보고되었다[Lussier et al., 1997]. HcsA와 HcsB의 상동성은 종래 보고된 바 있다(Biswas et al., 1997a). 이와 같은 5가지 효모 헬리카제 간의 상동성은 헬리카제 도메인에서만 나타났다(도 2).
8개의 보존성 모티프는 모든 상위계열 제I군 헬리카제에서 관찰된다 [Gorbalenya, 1988, Koonin, 1992]. 이러한 8개의 모티프 중에서, 일정 수의 잔기는 모든 상위계열 제I군 헬리카제 중에서 관찰된다. 이러한 8개의 모티프는 2개의 상이한 상위계열 제I군 헬리카제의 결정 구조에 의하면 단백질마다 다양하게 이격되어 있지만, 입체적으로는 이들 보존성 잔기들은 모두 밀접하게 근접해있다[2개의 결정 구조 논문]. 보다 신중하게 UPF1과 유사성이 있는 유전자들을 분석한 결과, 이 그룹은 상위계열 제I군의 하위계열, 즉 UPF1 유사 하위계열로서 확인된다. 이 하위계열의 현저한 특징은 종래 보고된 바[Perlick et al. 1996]와 같은 모티프 II, IV, V 및 VI 중의 보존성 잔기들 주위에 보다 넓은 상동성이 존재하는 것이다(도 2). 또한, 이러한 5개의 유전자 중에는 이 도메인내에 2개의 모티프가 더 보존된다. 그 중 한 모티프는 모티프 III과 IV 사이에 위치하고(콘센서스 lexSLFervl, 도 2), 다른 하나는 모티프 IV와 V 사이에 위치하여(콘센서스 IgvitpYxaQ 도 2), 각각 모티프 IIIa 및 IVa라고 불렀다. 이러한 추가 모티프는 또한 Upf1 유전자의 인간 상동체내에 존재한다. 이러한 5가지 효모 유전자 중에서 콘센서스 유전자에 대하여 최저의 적합성을 나타내는 것은 Dna2p로서, 이 서열을 결실시키는 경우 보다 밀착된 콘센서스가 생성되었다. 효모 유래의 다른 2가지 상위계열 제I군 헬리카제인 Pif1과 RadH 및 충분하게 특성이 밝혀진 대장균 유래의 제I군 헬리카제인 Rep와 uvrD는 상기와 같은 변수하에서 상기 5가지 서열과 정렬될 수 없었다. 이것은 상동성이 모든 상위계열 제I군 헬리카제에 일반적인 것이 아니며, 독특한 하위계열임을 입증한다.
전술한 바와 같이, Upflp의 독특한 특징은 그 아미노 말단 부근에 시스테인-히스티딘 고밀도 영역을 포함한다는 것이다(도 2c). 이 영역의 돌연변이들은 넌센스 코돈의 해독 종결 효율을 감소시키고 계획된-1 리보좀 프레임이동 효율을 향상시킨다고 알려져 있다[Weng et al., 1996b; Cui et al., 1996]. 이 영역은 Upf2 상호작용 도메인으로 확인되었다[Weng et al., 1996b, He et al. 1996]. 흥미로운 것은, Mtt1p 역시 그 아미노 말단 부근에 시스테인-히스티딘 고밀도 영역을 포함한다는 것이다[Bean and Matson, 1997]. 처음 127개 아미노산 내에는 13개의 시스테인과 3개의 히스티딘이 존재한다. UPF1 및 MTT1의 시스테인-히스티딘 고밀도 영역은 뚜렷한 상동성을 포함하고 있지는 않지만, 두 영역 모두 고리 핑거를 형성할 수 있는 잠재성을 가지고 있다[Weng et al., 1996b, Bean and Matson, 1997]. 또한, 이 영역들은 복수의 아연 결합 모티프에 정합될 수 있다. 하지만, 시스테인 잔기의 상당한 수로 인하여, 이런 유형의 어떤 정렬 방식도 동일 영역내에서 여러 시스테인 잔기를 미해명 상태로 남기지 않을 수 없다.
mtt1△ 균주는 넌센스 억제 표현형을 입증한다.넌센스 억제는 조기 종결 해독 보다는 펩티드 사슬내에 아미노산 병입이 일어나도록 부근의 동족 tRNA가 넌센스 돌연변이에서 종결 인자와 성공적으로 경쟁할 때 나타난다(도 1). 충분한 정도의 넌센스 억제는 성장을 지지할 수 있는 완전한 폴리펩티드 단백질을 생성시킬 수 있다. upf1△ 균주는 이러한 대립유전자의 논센스 억제를 허용한다. 이러한 관찰에 기초하여 Mtt1p가 종결 코돈에서 해독 종결을 조절하는데 관여한다고 결론지었다. 이러한 가능성을 시험하기 위하여, leu2-2와 tyr7-1 넌센스 대립유전자를 보유하는야생형, mtt1△, upf1△, upf1△,mtt1△ 균주를 상기 대립유전자의 억제성에 대하여 분석하였다. leu2-2와 tyr7-1 넌센스 대립유전자를 보유하는 균주의 억제성 표현형은 세포를 -trp -leu -tyr 배지에서 평판배양하여 분석하였다. 대조군으로서, 이 세포를 -trp 배지에서 평판배양하였다. 그 결과는 leu2-2와 tyr7-1 넌센스 대립유전자를 보유하는 upf1△ 및 mtt1△ 세포가 둘다 상기 2종류의 배지에서 모두 증식하는 것으로 나타났다(도 3a). 이것은 UPF1 또는 MTT1 유전자 중 어느 한 유전자를 결실시켜도 tyr7-1 및 leu2-1 넌센스 대립유전자가 억제된다는 것을 시사한다(도 3a). 야생형(UPF1+MTT1+) 세포는 -trp -leu -tyr 배지에서 증식할 수 없었는데, 이는 상기 유전자의 존재가 넌센스 대립유전자의 억제를 차단한다는 것을 입증하는 것이다(도 3a).
또한, upf1△mtt1△ 균주의 넌센스 억제 표현형은 전술한 바와 같이 관찰되고 단일 결실부를 보유하는 균주와 비교하였다. 이러한 실험의 결과는 upf1△mtt1△ 균주가 UPF1 또는 MTT1 유전자 중 어느 한 유전자의 단일 결실부를 보유하는 균주보다 tyr7-1 및 leu2-1 넌센스 대립유전자를 억제하는데 훨씬 효과적인 것으로 관찰되었다(도 3a). 종합해보면, 상기 결과들은 Upf1p와 Mtt1p가 넌센스 코돈에서 해독 종결을 조절하는데 관여한다는 것을 입증한다.
또한, 종래 실험 결과들은 야생형 UPF1 유전자를 보유하는 균주는 37℃에서 증식할 수 없는 반면, upf1△균주는 his4-38 대립유전자 및 SUF1 tRNA 프레임이동 억제인자를 보유하는 균주들에서 37℃ 에서의 프레임이동 억제성을 향상시킬 수 있다고 입증하고 있다[Leeds et al., 1991, 1992]. 또, mtt1△his4-38 SUF1 균주가프레임이동 억제성을 향상시키는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과들은 upf1△ 균주와 달리, mtt1△his4-38 SUF1 균주가 37℃에서 히스티딘이 결실된 배지에서 증식할 수 없다는 것을 증명하는 것으로, MTT1 유전자의 결실이 이 분석에서 프레임이동의 억제성을 증가시키지 않았음을 시사한다.
mtt1△ 균주는 넌센스 매개의 mRNA 분해에 영향을 미치지 않는다.종래 연구 결과들은 Upf1p가 mRNA 전환 및 해독 종결을 조절하는데 중요한 역할을 한다고 증명하였다[Weng et al., 1996a,b, 1998; Czaplinski et al., 1998]. 이러한 결과에 기초하여, 상기 관찰된 넌센스 억제성 표현형이 해독 종결의 효율에 영향을 미치거나, 넌센스 매개의 mRNA 분해 경로(NMD)를 불활성화시키는 결과이거나 두 경로 모두에 영향을 미치는 결과인지를 측정하였다. 이러한 의문을 묻기 위하여 leu2-2 및 tyr7-1 넌센스 함유 대립유전자를 보유하는 mtt1△ 균주를 작제하였다(실험 절차 참조). mtti△ 균주는 어떤 입증할 수 있는 성장 결손도 없이 생육할 수 있는 것으로 확인되었다(실험 절차 참조). NMD에 대한 mtt1△의 효과는 리보좀 단백질을 암호화하는 성숙 mRNA와 CYH2 전구체의 농도를 모니터하여 조사하였다. 5' 말단 부근에 인트론을 포함하는 불충분하게 접목된 CYH2 전구체는 넌센스 매개의 mRNA 분해(NMD) 경로의 자연 발생적인 기질이다[He et al., 1993]. 또한, 넌센스 함유 tyr7 및 leu2 전사체의 농도 역시 이 균주들에서 측정되었다. 그 결과, CYH2 전구체 및 성숙 mRNA, tyr2 및 leu2 mRNA의 안정 상태 농도가 야생형 균주에서와 동일하게 나타났다(도 3). 대조군으로서, CYH2 전구체 및 넌센스 함유 tyr7 및 leu2 전사체이 upf1△ 균주에서 증가되었다. NMD 경로의 기질이 아닌 야생형 CYH2 전사체의 농도는 시험된 모든 균주에서 동일하였다(도 3). 또한, NMD 경로의 기질인 전사체의 농도는 upf1△ 균주와 비교하였을 때 upf1△mtt1△ 균주에서 전혀 더 크게 영향을 미치지 않았다(도 3). upf1△mtt1△ 균주는 확인할 수 있는 성장 결손이 없는 생육성이었다.
MTT1p는 펩티드 방출 인자 eRF3과 상호작용한다.종래 연구 결과에서는 Upf1p가 해독 종결 인자 eRF1 및 eRF3과 직접 상호작용하여 해독 종결에 영향을 미치며 결과적으로 해독 종결 효율에 영향을 미칠 수 있다고 시사하였다[Czaplinski et al., 1998]. 또한, MTT1 유전자의 결실은 tyr7-1 및 leu2-2 대립유전자의 넌센스 억제를 촉진하기 때문에 Mtt1p 역시 펩티드 방출 인자와 상호작용하는 것이다. 이를 시험하기 위하여, eRF1 및 eRF3은 대장균에서 글루타치온-S-트란스퍼라제(GST)로서 각각 발현되었고, 글루타치온 세파로스 비드를 사용하여 정제하였다. 글루타치온 세파로스 비드에 결합하여 정제된 GST-RF(방출 인자) 융합 단백질을 FLAG 에피토프 태그된 Mtt1p를 함유하는 효모 세포질 추출물에 첨가하였다(실험 절차 참조). 항온처리 후, GST-RF와 결합 단백질을 친화성 크로마토그래피로 정제하고, SDS-PAGE로 처리하였다. 면역블롯팅을 실시하고 FLAG 에피토프에 대한 항체를 사용하여 Flag-Mtt1p의 존재를 분석하였다. 항FLAG 항체는 FLAG-Upflp를 발현하는 플라스미드로 형질전환된 세포 유래의 세포질 추출물에서 127kD Mtt1p만을 인식하였다. 또한, 상기 분석을 통해 Mtt1p가 eRF3과 특이적으로 공동정제된다는 것을 확인하였다(도 5). Mtt1p는 GST-RF1 또는 다른 단백지로가 융합되지 않은 GST 단백질(도 5) 또는 GST-JIP 단백질과 공동정제되지 않았고, 여기에서 GST에 융합된 Jak2 상호작용 단백질은 반응의 특이성을 모니터하는데 사용되었다.
Mtt1p는 폴리좀에 결합되어 있다.mtt1△균주의 넌센스 억제성 표현형에 기초하여 Mtt1p가 리보좀에 결합되어 있는지를 조사하였다. Mtt1p가 리보좀 결합성인지를 측정하기 위하여, Flag-Mtt1 유전자를 보유하는 세포로부터 후기 미토콘드리아 추출물을 제조하고, 폴리좀 분획을 슈크로스 구배를 통해 원심분리하여 분리하였다. 다수의 분획을 모으고, Flag 에피토프에 대하여 지향성인 항체를 사용하여 블롯을 프로빙하는 웨스턴 블롯팅으로 구배 분획 중의 Flag-Mtt1p 단백질의 존재를 측정하였다. 이 실험 결과는 Flag-Mtt1p가 폴리좀 및 모노좀 결합성임을 시사하였고, 상층 분획들에서는 Mtt1p를 전혀 검출할 수 없었다(도 6의 2레인과 3레인). 폴리좀 분획과 결합된 Mtt1p는 주로 127kD 단백질이었다. 폴리좀 추출물을 RNaseA로 처리한 결과 Mtt1p는 40S 서브유닛을 포함하는 분획으로 이동하였다.
Mtt1p는 RNA 의존성 ATPase 활성 및 헬리카제 활성을 나타낸다.종래 연구 결과에서는 Mtt1p가 DNA 의존성 ATPase 활성 및 헬리카제 활성이 있다고 확인되었다[Biswas et al., 1995]. 전술한 결과에 비추어 볼 때, Mtt1p 역시 RNA 의존성 ATPase 및 헬리카제일 것이라는 가능성이 시사되었다. 먼저, 정제된 Mtt1p가 ATPase 활성을 나타내는 지를 조사하였다. ATPase 분석은 폴리우리딘(poly(rU))의 존재 또는 부재하에 방사능표지된 [γ-32P]ATP를 함유하는 반응 혼합물에서 상기 정제된 단백질을 항온처리한 뒤,32PO4의 방출을 분석하여 실시하였다. 그 결과, 폴리(rU)의 부재하에서는 ATPase 활성이 전혀 검출되지 않는 것으로 관찰되었다(도7). 하지만, 폴리(rU)를 함유하는 반응 혼합물은32PO4의 방출을 상당히 자극하였고, 이것은 Mtt1p 역시 RNA 의존성 ATPase 활성을 보유하고 있음을 시사하는 것이다(도 7). 330 nM 이상의 폴리(rU)의 농도는 Upf1p의 ATPase 활성을 최대로 자극하였다.
결론
이상에서 제시된 결과들은 해독 종결 및 NMD를 모두 조절하는 것으로 이미 동정된 인자[Czaplinski et al., 1995, 1998; Weng et al., 1996a,b, 1998]인 Upf1p와 유의적인 상동성이 있는 핵산 의존적 헬리카제인 Mtt1p의 동정에 관한 것이다. 여러 증거들은 Mtt1p 역시 해독 종결 과정을 조절하는데 중요한 역할을 한다는 것을 시사하고 있다. 흥미로운 것은, MTT1 유전자와 다른 상위계열 제I군 헬리카제를 비교한 결과 아마도 RNA 의존성 또는 RNA-DNA 의존성 과정에 관여하는 것으로서 상위계열 제I군 헬리카제 중 상기 상위계열을 표시하는 독특한 표시 모티프를 확인하였다(도 2). 하기 기재되듯이, 이러한 결과는 RNA 헬리카제의 Upf1p과에서 속하는 아군이 해독 종결 과정의 효율을 조절하는데 관여한다는 것을 시사한다.
MTT1 유전자 및 이것의 단백질 생성물은 Upf1p와 유사성을 나타낸다.MTT1 유전자와 UPF1 유전자의 비교를 통해 여러 유사성 영역을 확인하였다. 이 두 단백질은 모두 아미노 말단 단부 부근에 시스테인-히스티딘 고밀도 영역을 포함하고, 상위계열 제I군 헬리카제로 간주되는 모든 모티프를 보유한다(도 2). UPF1 및 MTT1의 시스테인-히스티딘 고밀도 영역은 그다지 상동성이 크지는 않다. 또한, 이러한 시스테인-히스티딘 고밀도 영역이 새로운 유형의 시스테인-히스티딘 고밀도 모티프를 형성하는 것으로 추정된다. 흥미롭게도, UPF1의 시스테인-히스티딘 고밀도 영역의 돌연변이는 계획된 -1 프레임이동 효율을 증가시키고 넌센스 억제성을 촉진하는 것으로 이미 확인되었다[Cui et al., 1996; Weng et al., 1996b].
상위계열 제I군 헬리카제들의 서열을 비교하여 UPF1 유전자 헬리카제 영역과 상동성이 강한 영역을 가진 SEN1 및 MOV-10 유전자를 최초로 확인하였다[Koonin, 1992]. MTT1 유전자는 또한 UPF1 및 다른 UPF1 유사 상위계열의 구성원과 강한 상동성이 있는 것으로 확인되었다(도 2). 이러한 유전자로는 DNA2, HCSA, HCSB/MTT1 및 SEN1이 있다. 특히, UPF1 과의 헬리카제에 속하는 또 다른 구성원은 최근 동정된 HelB 유전자이다[Biswas et al., 1997a,b]. 이 헬리카제는 다중효소 폴리머라제 α 복합체의 일부로서 최초 분리되었다[Biswas et al., 1993, 1993a, 1995]. HCSA의 결실은 넌센스 억제를 일으키지 않았고, 이것은 upf1△ 및 mtt1△ 균주에서 관찰되는 넌센스 억제성 표현형이 제I군 헬리카제를 결실시켜 얻을 수 있는 단순한 것이 아님을 증명한다.
Mttp1p는 해독 종결에 관여하는 RNA 헬리카제이다.종래 연구 결과에서는 Hel1p/Mtt1p가 효모 일본쇄 DNA 결합 단백질 Rpa1p에 의해 자극되는 DNA 헬리카제 활성을 나타내는 것으로 관찰되었다[Biswas et al., 1995; Bean and Matson, 1997]. 본 명세서에 제시된 결과는 정제된 Mtt1p 역시 RNA 의존성 ATPase 활성 및 헬리카제 활성을 나타낸다는 것을 확인하였다(도 7). 따라서, Upf1p[Czaplinski etal., 1995]와 유사하게, Mtt1p 역시 DNA 및 RNA 이본쇄를 푸는 성질이 있다.
여러 가지 증거를 통해 Mtt1p는 해독 종결에 관여하는 것으로 생각된다. 본 명세서에 제시된 결과들은 1) mtt1△ 균주가 넌센스 억제성 표현형을 나타내고(도 4); 2) Mtt1p가 폴리좀 결합성이며; 3) Mtt1p가 펩티드 방출 인자 eRF3과 직접 상호작용하고(도 5); 4) mtt1△ 균주가 파로모마이신 감수성이 있음을 보여주고 있다. upf1△ 균주와 달리 mtt1△ 균주는 넌센스 함유 전사체을 안정화시키지 않는다고 생각하면, RNA 분자당 넌센스 억제 양은 upf1△ 균주에서보다 mtt1△ 균주에서 더 컸다.
mtt1△upf1△ 균주는 upf1△ 또는 mtt1△ 균주와 비교하였을 때 급격한 넌센스 억제성 표현형을 나타낸다. 이러한 관찰을 설명할 수 있는 1가지 가능성은 이 단백질들이 해독 종결의 동일 단계에서 작용을 하고 Mtt1p 또는 Upf1p 중 어느 하나가 다른 인자의 결손에 대해 부분적으로 보상할 수 있다는 점이다. 하지만, 두 인자가 모두 불활성화되면 상당한 넌센스 억제율을 나타낸다. 또 다른 설명으로는, 상기 두 인자가 종결 과정의 다른 단계에서 작용한다는 것이다. Mtt1p와 Upf1p는 모두 해독 종결의 효율을 조절하는데 작용을 하고, Upf1p는 이어서 mRNA의 분해를 촉진하는 역할을 한다. 넌센스 억제의 상승작용적 증가는 넌센스 함유 전사체의 양을 증가시키고 mtt1△upf1△ 균주의 해독 종결 효율을 감소시킨 결과일 수 있다.
2종 이상의 RNA 헬리카제가 해독 종결 효율을 조절하는데 관여한다.흥미롭게도 해독 종결의 효율을 조절하는데 관여하는 헬리카제는 2종 이상인 것으로 보인다. 헬리카제는 핵산 이본쇄를 푸는 효소이다. 현재, 헬리카제로 핵산 이본쇄를 조작하는 기술은 DNA와 RNA가 관여하는 모든 생물학적 과정에 중요한 역할을 한다는 것이 분명해지고 있다. 전사후 조절 기작에 관여하는 것으로 밝혀진 RNA 헬리카제에는 다수가 있다. 관여하는 기작의 예로는, tRNA 프로세싱, 리보좀 생물발생설, 접목, 수송, 해독 및 mRNA 턴오버가 있다. 이러한 RNA 헬리카제들은 최소한 2개의 과로 분류되는데, 가장 주된 상위계열은 "DEAD 박스" 헬리카제 또는 상위계열 제II 그룹이다. 도 2에 도시된 바와 같은 상위계열 제I군 헬리카제는 DNA 및 RNA 이본쇄를 푸는 것으로 밝혀져 있다.
현재, Upf1p 및 Mtt1p가 해독 종결 과정을 조절하는 방법에 대하여 알려지거나 규명된 것은 없다. 해독 종결의 효율은 1) 리보좀과 eRF의 결합율, 2) 펩티드 가수분해를 촉진하는데 있어서의 eRF의 효율 또는 3) 해독 종결이 완료된 후 리보좀으로부터 eRF의 해리율을 변화시켜 영향을 미칠 수 있다. 해독 종결 과정에서 이러한 단계들을 검색하는 분석법을 통해 그 단백질들이 작용하는 단계에 대하여 이해되기 시작하고 있다.
본 명세서에 제시된 결과는 해독 기구가 매우 정확하지만 이 과정의 정확성을 감소시키는 조건하에서는 세포의 성장률이 변화하지 않음을 시사한다. 예를 들어, mtt1△upf1△ 균주는 이들 세포에서 해독 종결이 효율적이지 못했으나 세포 성장에는 어떤 영향도 없는 것으로 확인되었다. 또한, 계획된 프레임이동 효율이 4배 증가된 UPF1의 mof4-1 대립유전자 또는 upf3△를 보유하고 해독 신장 과정의 정확성 감소를 나타내는 균주 역시 성장의 결손을 전혀 나타내지 않았다[Cui et al., 1996; Ruiz-echevarria et al., 1998].
참조 문헌

Claims (41)

  1. (a) MTT1을 시험 조성물 또는 제제와, MTT1과 시험 조성물간의 결합을 허용하는 조건하에서 접촉시키고, (b) MTT1에 대한 시험 조성물 또는 제제의 특이적 결합을 검출하며, (c) 시험 조성물 또는 제제가 MTT1을 억제하는지를 결정하여 해독 종결의 효율을 조절하는 시험 조성물 또는 제제를 동정함을 포함하여, 해독 종결의 효율을 조절하는 시험 조성물 또는 제제를 동정하는 방법.
  2. (a) 시험 조성물 및 MTT1을 포함한 성분을, 이들 성분의 상호작용이 이루어지도록 하기에 충분한 조건하에서 배양하고, (b) MTT1과의 결합에 미치는 시험 조성물의 효과를 측정함을 포함하여, MTT1과의 결합을 조절하는 시험 조성물 또는 제제를 동정하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, (a) 세포내로 MTT1과의 결합을 조절하는 시험 조성물을 도입시키고, (b) (a) 이후의 세포 표현형을 결정하며, (c) (a) 이후의 세포 표현형을 (a) 이전의 세포 표현형과 비교하고, (d) 시험 조성물이 도입된 세포의 유전자를 동정함을 포함하여 유전자를 동정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  4. 질환을 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 예상되는 대상자로부터의 샘플을 mtt1 단백질의 발현을 검출하는 시약과 접촉시키고 샘플중에서 시약의 결합을 검출함을포함하여, mtt1 단백질의 발현과 관련된 넌센스 억제 질환을 검출하는 방법.
  5. MTT1의 헬리카제, ATPase 활성을 억제, 촉진 또는 조절하는 제제.
  6. 제5항에 있어서, 제제가 해독 종결의 길항제 또는 효능제로서 작용하는 리보자임, 안티센스 분자 또는 리간드인 제제.
  7. MTT1 유전자, 사람 Upf1p 단백질, 펩티딜 진핵성 방출 인자 1(eRF1) 및 펩티딜 진핵성 방출 인자 3(eRF3)을 포함하고 해독 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절하는데 효과적인 분리된 다단백질 복합체.
  8. 제7항에 있어서, 사람 Upf3p 및/또는 Upf2p를 추가로 포함하는 복합체.
  9. 제7항의 복합체와 결합하는 항체.
  10. 제9항에 있어서, 모노클로날 또는 폴리클로날인 항체.
  11. 제9항에 있어서, 표지를 갖고 있는 항체.
  12. 제7항 또는 제8항의 복합체와 결합하는 제제.
  13. eRF3에 대한 사람 MTT1의 결합 또는 폴리좀에 대한 MTT1의 결합을 억제 또는 조절하는 제제.
  14. eRF3에 대한 사람 MTT1의 결합 또는 폴리좀에 대한 MTT1의 결합을 촉진하는 제제.
  15. 제12항에 있어서, 표지 또는 마커를 갖고 있는 제제.
  16. 제25항에 있어서, 안티센스 분자 또는 리보자임인 제제.
  17. 세포를 해독 종결을 촉진하는데 유효한 양의 제7항에 따른 복합체와 접촉시켜 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절함을 포함하여, 해독 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절하는 방법.
  18. 세포를 넌센스 해독 종결을 억제하는데 유효한 양의 제12항에 따른 제제와 접촉시켜 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절함을 포함하여, 해독 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성을 조절하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 해독 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성이 mRNA의 개시, 신장, 종결 및 분해를 포함하는 방법.
  20. 세포를 넌센스 코돈에서의 mRNA의 해독 종결의 효율을 조절하는데 유효한 양의 제12항에 따른 제제와 접촉시키고/거나 변형 전사체의 분해를 촉진시킴을 포함하여, 넌센스 코돈에서의 mRNA의 해독 종결의 효율을 조절하고/하거나 변형 전사체의 분해를 촉진하는 방법.
  21. (a) 세포를 후보 약물과 접촉시키고, (b) 제7항에 따른 복합체의 조절을 검정(이때, 복합체를 조절하는 약물이 펩티딜 트랜스퍼라제 활성에 관련되어 있다)함을 포함하여, 해독 동안에 펩티딜 트랜스퍼라제 활성과 관련된 약물을 선별하는 방법.
  22. (a) 세포를 후보 약물과 접촉시키고, (b) 제7항에 따른 단백질 복합체의 조절을 검정(이때, 단백질 복합체를 조절하는 약물이 해독 종결 강화에 관련되어 있다)함을 포함하여, 해독 종결 강화에 활성적으로 관련된 약물을 선별하는 방법.
  23. (a) 약물과 복합체를 배양하고, (b) 넌센스 억제에 미치는 효과를 측정하여 해독 종결을 강화시키는데 관련된 약물을 선별함을 포함하여, 해독 종결을 강화하는데 관련된 약물을 선별하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 검정이 RNA 검정 또는 ATPase 검정인 방법.
  25. (a) 세포를 후보 약물과 접촉시키고, (b) 제7항에 따른 복합체의 조절을 검정(이때, eRF3에 대한 MTT1의 결합을 조절하는 약물이 해독 종결을 강화하는데 관련되어 있다)함을 포함하여, MTT1과 eRF3간의 상호작용을 억제하는 약물을 선별하는 방법.
  26. (a) 제7항의 복합체를 암호화하는 핵산 또는 이의 안티센스를 포함한 벡터를 함유한 세포를 제공하고, (b) 언급된 세포내의 벡터를 과다발현시켜 복합체의 기능을 차단하도록 과다발현된 복합체를 생성함을 포함하여, 세포내에서의 mRNA의 해독 종결의 효율 및/또는 변형 전사체의 분해를 조절하는 방법.
  27. (a) 세포를 복합체를 암호화하는 핵산으로 형질감염시키고, (b) 형질감염 후 세포의 결손 복합체의 비율을 결정하며, (c) 형질감염 후 세포의 결손 복합체의 비율을 형질감염 전 세포의 결손 복합체의 비율과 비교함을 포함하여, 제7항에 따른 복합체의 결손과 관련된 질병 상태를 동정하는 방법.
  28. 제7항의 복합체 또는 제12항의 제제 및 약제학적 담체 또는 희석제를 함유한 치료 유효량의 약제학적 조성물을 대상자에게 투여하여 대상자를 치료함을 포함하여, 펩티딜 트랜스퍼라제 활성과 관련된 질환을 치료하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 질환이 넌센스 또는 프레임이동 돌연변이로부터 기인하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 질환이 β-지중해빈혈, β-글로빈, 디쉬엔느/벡커 근이영양, A형 혈우병, B형 혈우병, 폰윌리브랜드병, 골형성부전증(OI), 유방암, 난소암, 빌름스종양, 히르시스프룽병, 낭포성섬유증, 신장결석, 가계성 과콜레스테롤혈증 (FH), 색소성망막염, 신경섬유종증, 망막아종, ATM 또는 코스트만병인 방법.
  31. (a) 세포를 특허청구항의 벡터로 형질감염시키고, (b) 형질감염 후 세포의 결손 다량체 단백질의 비율을 결정하며, (c) 형질감염 후 세포의 결손 다량체 단백질의 비율을 형질감염 전 세포의 결손 다량체 단백질의 비율과 비교함을 포함하여, 결손 다량체 단백질과 관련된 질병 상태를 동정하는 방법.
  32. (a) 문제의 유전자를 분리하고, (b) 문제의 유전자가 모티프 I 내지 IX를 포함하고 있는지를 결정(이때, 유전자가 9개의 모티프중 어느 하나라도 포함하는 경우 그 유전자는 개시, 신장, 종결 또는 분해를 포함한 해독 정확성을 조절하는 것이다)함을 포함하여, 해독 종결의 조절과 관련된 유전자를 동정하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 모티프 I이 서열 GppGTKTxT-X(n)을 포함하는 방법.
  34. 제32항에 있어서, 모티프 II가 서열 riLxcaSNxAvDx1-X(n)을 포함하는 방법.
  35. 제32항에 있어서, 모티프 III이 서열 vviDExxQaxxxxxiPi-X(n)을 포함하는 방법.
  36. 제32항에 있어서, 모티프 IV가 서열 xxilaGDxxQLp-X(n)을 포함하는 방법.
  37. 제32항에 있어서, 모티프 V가 서열 1xxSLFerv-X(n)을 포함하는 방법.
  38. 제32항에 있어서, 모티프 VI가 서열 LxxQYRMhpxisefpxYxgxL-X(n)을 포함하는 방법.
  39. 제32항에 있어서, 모티프 VII가 서열 IgvitPYxxQvxx1-X(n)을 포함하는 방법.
  40. 제32항에 있어서, 모티프 VIII가 서열 vevxtVDxFQGreKdxIilsc VR-X(n)을 포함하는 방법.
  41. 제32항에 있어서, 모티프 IX가 서열 iGFLxdxRRINValTRak을 포함하는 방법.
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