MXPA00011760A

MXPA00011760A - Metodo para modular la eficiencia de terminacion de traduccion y degradacion de arn mensajero aberrante, que incluye un complejo de vigilancia que comprende upf1p de humana, factor de liberacion eucariotico 1 y factor de liberacion eucariotico 3.

Info

Publication number: MXPA00011760A
Application number: MXPA00011760A
Authority: MX
Inventors: Stuart Peltz
Original assignee: Univ New Jersey Med
Priority date: 1998-05-28
Filing date: 1999-05-27
Publication date: 2002-10-17
Also published as: KR20010082559A; US6486305B1; CA2329267C; CA2329267A1; EP1102838B1; WO1999061600A2; WO1999061600A3; EP1102838A2; JP4889150B2; WO1999061600A9; JP2002516091A; AU4318099A; ATE332365T1; DE69932246D1

Abstract

La invencion provee un metodo para modular la eficiencia de terminacion de traduccion de ARNm y/o para promover la degradacion de transcritos aberrantes; tambien, esta invencion provee un metodo para seleccionar un farmaco activo que afecta el incremento de terminacion de traduccion, y un metodo para identificar un estado de enfermedad que involucra el complejo de proteina defectuoso; esta invencion provee un complejo purificado que comprende una cantidad de una proteina Upf1p humana, un factor de liberacion de peptidilo eucariotico 1 (eRF1) y un factor de liberacion de peptidilo eucariotico 3 (eRF3), efectivo para modular terminacion de traduccion; ademas, esta invencion provee un vector de expresion que comprende un acido, nucleico que codifica para una proteina Upfip humana, un factor de liberacion de peptidilo eucariotico 1 (eRFI) y un factor de liberacion de peptidilo eucariotico 3 (eRF3), ligados de manera operable a un elemento regulador; esta invencion provee un anticuerpo que se une al complejo que comprende una cantidad de una proteina Upf1 p humana, un factor de liberacion de peptidilo eucariotico 1 (eRF1) y un factor de liberacion de peptidilo eucariotico 3 (eRF3), efectiva para modular terminacion de traduccion; esta invencion provee un agente que inhibe o modula la union de Upf1p humana a eRF1 o a eRF3; el agente puede inhibir o facilitar la union de Upf1 p humana a eRF1 o eRF3.

Description

MÉTODO PARA MODULAR LA EFICIENCIA DE TERMINACIÓN DE TRADUCCIÓN Y DEGRADACIÓN DE ARN MENSAJERO ABERRANTE.

QUE INCLUYE UN COMPLEJO DE VIGILANCIA QUE COMPRENDE UPF1P HUMANA. FACTOR DE LIBERACIÓN EUCARIOTICO 1 Y FACTOR DE LIBERACIÓN EUCARIOTICO 3 CLAUSULA DE DERECHOS GUBERNAMENTALES La investigación que conduce a la presente invención fue apoyada, por lo menos en parte, por una subvención de The National Institutes of Health (GM48631-01) [E.U.A.]. Por lo tanto, el gobierno puede tener ciertos derechos sobre esta ¡nvención.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un complejo de vigilancia multiproteínico que comprende Factor de liberación eucariótico 1 y Factor de liberación eucariótico 3 de Upfl p humana, los cuales están implicados en ia modulación de la eficiencia de terminación de traducción, y la degradación de ARNm aberrante. La identificación de este complejo provee un sistema de prueba in vitro para identificar agentes que: afectan la actividad funcional de ARNm's alterando la frecuencia de alteración de marco; permiten monitorear un evento de terminación; promueven la degradación de transcritos aberrantes; proveen moduladores (inhibidores/estimuladores) de la actividad de peptidil transferasa durante el inicio, alargamiento, terminación y degredación de ARNm de traducción. Dichos agentes, que pueden ser antagonistas o agonistas, son útiles para fines de selección y diagnósticos, y como agentes terapéuticos para enfermedades o condiciones que son resultado de traducción prematura o que son causantes de la misma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Estudios recientes han demostrado que las células han desarrollado mecanismos elaborados para deshacerse de proteínas y transcritos aberrantes que pueden interferir dominantemente con su funcionamiento normal (revisado por Gottesman y otros, 1997, He y otros, 1993; Jacobson y Peltz, 1996; Ruiz-Echevarria y otros, 1996; Suzuki y otros, 1997; Weng y otros, 1997; Maquat, 1995; Pulak y Anderson, 1993). Tales rutas se pueden considerar como reguladoras de la expresión genética y como sensoras de la síntesis de polipéptidos inapropiados. La ruta de declinación de ARNm mediada por sin sentidos (NMD) [abreviación en inglés de Nonsense Mediated Decay) es un ejemplo de una ruta de vigilancia de terminación de traducción, ya que elimina ARNm's aberrantes que contienen mutaciones sin sentido dentro de la región codificadora de proteína (Gottesman y otros, 1997; He y otros, 1993; Jacobson y Peltz, 1996; Ruiz-Echevarria y otros, 1996; Suzuki y otros, 1997; Weng y otros, 1997; Pulak y Anderson, 1993; Caponigro y Parker, 1996; Maquat, 1995). Se ha observado que la ruta de NMD funciona en todos los sistemas eucarióticos examinados hasta ahora y parece haber evolucionado para asegurar que la terminación de traducción ocurre en el codón apropiado dentro del transcrito. Los transcritos que contienen codones sin sentido prematuros son degradados rápidamente, impidiendo así la síntesis de proteínas incompletas y potencialmente nocivas. Existen más de doscientos trastornos genéticos que son el resultado de terminación de traducción prematura (McKusick, 1994). Las proteínas implicadas en la promoción de NMD se han investigado en C. elegans, células de mamífero, y en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Se han identificado en levadura tres factores implicados en NMD. Se mostró que mutaciones en los genes UPF1, UPF2 y UPF3 estabilizan selectivamente ARNm's que contienen mutaciones sin sentido tempranas, sin afectar la velocidad de declinación de la mayoría de ARNm's de tipo silvestre (He y Jacobson, 1995; Lee y Culbertson, 1995; Leeds y otros, 1992; Leeds y otros, 1991 ; Cui y otros, 1995). Resultados recientes indican que los genes Upfl p, Upf2p y Upf3p interaccionan y forman un complejo (He y Jacobson, 1995; He y otros, 1997; Weng y otros, 1996b). En C. elegans, se han identificado siete alelos smg que dan como resultado una mayor abundancia de transcritos que contienen sin sentidos (Pulak y Anderson, 1993). Se ha identificado un homólogo humano del gen UPF1, denominado RENT1 o HUPF1 , indicando que NMD es una ruta conservada evolutivamente (Perlick y otros 1996; Applequist y otros 1997).

Aunque está en controversia el compartimiento celular en el cual ocurre la NMD en células de mamífero (Weng y otros 1997; Maquat, 1995; Zhang y Maquat, 1997), parece que en la levadura, no obstante, la NMD ocurre en el citoplasma cuando el transcrito está asociado con ribosomas. Los resultados que apoyan esta conclusión son los siguientes: (1 ) ARNs que contienen sin sentidos y que contienen intrón, que son substratos de la ruta NMD en levadura, se llegan a asociar en polisoma y se estabilizan en presencia del inhibidor de alargamiento de traducción cicloheximida (Zhang y otros, 1997). Sin embargo, los ARNs asociados a polisoma, recuperan su cinética normal de rápida declinación cuando se remueve el fármaco del medio de crecimiento y se reanuda la traducción (Zhang y otros, 1997); (2) Se ha visto que Upfl p, Upf2p y Upf3p están asociados con polisomas (Peltz y otros, 1993a, 1994; Atkin y otros, 1995; Atkin y otros, 1997); (3) como fue revelado por análisis de hibridación in situ, la abundancia citoplásmica de un ARN reportero de LacZ que contiene intrón, con mutaciones en el sitio de empalme 5', se redujo dramáticamente en la cepa UPF1 pero aumentó la abundancia citoplásmica en células up ? (Long y otros, 1995); (4) la NMD puede ser impedida por medio de ARNt's de supresión de sin sentidos (Losson y Lacroute, 1979; Gozalbo y Hohmann, 1990; Belgrader y otros, 1993); (5) La ruta de NMD es funcional sólo después de haberse completado por lo menos un ciclo de inicio/terminación de traducción (Ruiz-Echevarria y Peltz, 1996; Ruiz-Echevarria y otros, 1998; Zhang y Maquat, 1997). Además, un evento de reinicio de traducción puede impedir la activación de la ruta NMD (Ruiz-Echevarria y Peltz, 1996; Ruiz-Echevarria y otros, 1998; Zhang y Maquat, 1997). Tomados juntos estos resultados, indican que la ruta NMD en levadura es un evento citoplásmico y dependiente de la traducción. También, la proteína rent1/hupf1 es predominantemente citoplásmica (Applequist y otros, 1997). El gen UPF1 de levadura y su producto proteínico han sido el factor investigado más extensamente del complejo de vigilancia putativo (Czaplinski y otros, 1995; Weng y otros, 1996a, b; Weng y otros, 1998, Altamura y otros, 1992; Cui y otros, 1996; Koonin, 1992; Leeds y otros, 1992, Atkin y otros, 1995, 1997). El Upfl p contiene una región rica en cisteína e histidina cerca de su extremo amino y se requiere que todos los motivos sean un miembro de la superfamilia de helicasas del grupo I. Se ha purificado la Upflp de levadura y muestra unión de ARN y actividades ATPasa y ARN helicasa dependientes de ARN (Czaplinski y otros, 1995; Weng y otros, 1996, a, b). La interrupción del gen UPF1 da como resultado la estabilización de ARNm's que contienen sin sentidos, y la supresión de ciertos alelos sin sentido (Leeds y otros, 1991 ; Cui y otros, 1995; Czaplinski y otros, 1995; Weng y otros, 1996a; Weng y otros, 1996b).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION La capacidad para modular la terminación de traducción tiene importantes implicaciones para el tratamiento de enfermedades asociadas con mutaciones sin sentido. Como con cualquier sistema biológico, habrá una pequeña cantidad de supresión de una mutación sin sentido, dando como resultado la expresión de una proteína de longitud completa (que puede o no incluir una sustitución o supresión de aminoácido). En estado natural, son producidas cantidades tan bajas de proteína de longitud completa, que se origina patología. Sin embargo, estabilizando el ARNm sin sentido, aumenta dramáticamente la probabilidad de transcritos de "lectura completa", y puede permitir una suficiente expresión de la proteína para superar el fenotipo patológico. La ruta de declinación de ARNm mediada por sin sentidos es un ejemplo de una ruta de vigilancia conservada evolutivamente que libera a la célula de transcritos que contienen mutaciones sin sentido. El producto del gen UPF1 es un componente necesario del complejo de vigilancia putativo que reconoce y degrada ARNm's aberrantes. Los resultados presentados aquí demuestran que las formas de levadura y humanas del Upfl p interaccionan con los factores eucarióticos de terminación de traducción eRF1 y eRF3. Consistentemente con la interacción de Upfl p y los eRFs, la Upfl p se encuentra en los agregados semejantes a prion que contienen eRF1 y eRF3 observados en cepas de levadura [PSr]. Estos resultados indican que la interacción del Upfl p con los factores de liberación de peptidilo, es un evento clave en el ensamble del complejo de vigilancia putativo que incrementa los monitores de terminación de traducción si la terminación ha ocurrido prematuramente, y promueve la degradación de transcritos aberrantes. Esta invención provee un complejo aislado que comprende proteína Upfl p humana, un factor de liberación de peptidilo eucariótico 1 (eRF1) y un factor de liberación de peptidilo eucariótico 3 (eRF3); dicho complejo es efectivo para modular la actividad de peptidil transferasa. En una modalidad, esta invención comprende también Upf3p y Upf2p humanos. Esta invención provee un agente que se une al complejo que comprende una cantidad de una proteína Upfl p humana, un factor de liberación de peptidilo eucariótico 1 (eEF1 ) y un factor de liberación de peptidilo eucariótico 3 (eRF3), para modular la terminación de traducción. Esta invención provee un agente que se une al complejo como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el agente inhibe ATPasa de Upfl p; la actividad GTPasa de eRF1 o eRF3; o la unión de ARN a un ribosoma. Esta invención provee un agente que inhibe o modula la unión de Upfl p humano a eRF1 , o eRF3, o eRF1 o eRF3 a Upfl p. Esta invención provee un agente que inhibe o modula la unión de Upf3p humano a eRF1 o eRF3, o eRF1 o eRF3 a Upf3p. Esta invención provee un agente que facilita la unión de Upfl p humano a eRF1 o eRF3; o eRF3 o eRF1 o eRF3 a Upfl p. Esta invención provee un agente que facilita la unión de Upf3p humano a eRF1 o eRF3; o eRF3 o eRF1 o eRF3 a Upf3p. Esta invención provee un agente que modula la unión de Upfl p, eRF1 o eRF3 humanos a un ribosoma.

Esta invención provee un método de modulación de actividad de peptidil transferasa durante traducción, que comprende poner en contacto una célula con el complejo en una cantidad efectiva para facilitar la terminación de traducción, modulando con ello la actividad de peptidil transferasa. Esta invención provee un método de modulación de actividad de peptidil transferasa durante traducción, que comprende poner en contacto una célula con el agente, en una cantidad efectiva para suprimir la terminación de traducción sin sentido, modulando así la actividad de peptidil transferasa. La actividad de peptidil transferasa durante la traducción ocurre durante el inicio, alargamiento, terminación y degradación de ARNm. Esta invención provee un método para modular la eficiencia de terminación de traducción de ARNm en un codón sin sentido y/o promover la degradación de transcritos aberrantes, que comprende poner en contacto una célula con el agente, en una cantidad efectiva para inhibir la unión de Upfl p humano a eRF1 o eRF3; o eRF1 o eRF3 a Upfl , modulando así la eficiencia de terminación de traducción de ARNm en un codón sin sentido, y/o promoviendo la degradación de transcritos aberrantes. Esta ¡nvención provee un método para modular ia eficiencia de terminación de traducción de ARNm en un codón sin sentido y/o promover la degradación de transcritos aberrantes, que comprende poner en contacto una célula con un agente que inhibe la actividad ATPasa/helicasa de Upfl p; la actividad GTPasa de eRF1 o eRF3; o la unión de ARN a un ribosoma, modulando así la eficiencia de terminación de traducción de ARNm en un codón sin sentido, y/o promoviendo la degradación de transcritos aberrantes. Esta invención provee un método de selección de un fármaco que afecta la actividad de peptidil transferasa durante la traducción, que comprende: (a) poner en contacto células con un fármaco candidato; y (b) probar la modulación del complejo, en donde un fármaco que modula el complejo afecta la actividad de peptidil transferasa o incrementa la terminación de traducción. Esta invención provee un método de selección de un fármaco que afecta el incremento de la terminación de traducción, que comprende: (a) incubar el fármaco y el complejo; y (b) medir el efecto sobre la supresión sin sentido, seleccionando con ello un fármaco que afecta el incremento de la terminación de traducción. Las pruebas pueden ser un ARN o pruebas de NTPasa tales como ATPasa o GTPasa. Esta invención provee un método de modulación de la eficiencia de terminación de traducción de ARNm, y/o de la degradación de transcritos aberrantes en una célula, dicho método comprende: (a) proveer una célula que contiene un vector que comprende el ácido nucleico que codifica proteínas del complejo, el complejo, o una molécula de antisentido del mismo; (b) sobreexpresar dicho ácido nucleico en dicha célula para producir un complejo sobreexpresado a fin de interferir con la función del complejo. Esta invención provee un método para identificar un estado patológico que implica un defecto en el complejo, que comprende: (a) transfectar una célula con un ácido nucleico que codifica el complejo; (b) determinar la proporción de complejo defectuoso en la célula después de transfección; (c) comparar la proporción de complejo defectuoso en la célula después de transfección, con la proporción de complejo defectuoso en la célula antes de la transfección. Esta ¡nvención provee un método para tratar una enfermedad asociada con actividad de peptidil transferasa, que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene el complejo o los agentes, y un vehículo o diluyente, con lo cual se trata al sujeto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIGURA1. La proteína Upfl de levadura ¡nteracciona específicamente con los factores de liberación de peptidilo. (A) proteínas de fusión GST-eRF1 o GST-eRF3 se unen específicamente a Upfl p en un extracto de levadura. Se prepararon extractos citoplásmicos de una cepa BJ3505 de levadura transformada con pG-1 (vector) o pG-1 FLAGUPF1 (Fiag-Upfl p) en IBTB, y se incubaron con 30 µl de complejos sepharose-proteína de GST, GST-eRF1 o GST- eRF3. Los complejos sepharose-proteína se lavaron 2 veces en IBTB (véase materiales y métodos), se resuspendieron en solución amortiguadora de carga SDS-PAGE, se separaron sobre un gel de s5s 8%-PAGE y se sometieron a inmunoblot usando anticuerpo anti-FLAG. (B) Upfl p interacciona directamente tanto con eRF1 como con eRF3. Se purificó Upfl p como se describió previamente (Czaplinski y otros, 1995). Se agregaron 200 ng de Upfl p a 10 µl de complejos de sepharose- proteína GST, GST-eRF1 o GST-eRF3 en un volumen de reacción total de 200 µl en IBTB suplementado con KCl hasta la concentración final indicada arriba de cada carril. Después de 1 hora a 4°C, los complejos de sepharose-proteína se lavaron 3 minutos con 1 ml de IBTB suplementado con KCl hasta la concentración final indicada arriba de cada carril. Los complejos sepharose-proteína purificados se resuspendieron en solución amortiguadora de carga SDS-PAGE, se separaron sobre un gel de SDS 7.5%-PAGE y se sometieron a inmunoblot como en (A). FIGURA 2. La Upfl p está asociada con agregados eRF3 [PSF]. Se fraccionaron extractos citoplásmicos de variantes ¡sogénicas [PSF] y [psr] de la cepa 7G-H66 upñA y conteniendo FLAG- UPF1 insertado en un plásmido centrómero mediante centrifugación a través de una almohadilla de sacarosa, como se describió previamente (Paushkin y otros, 1997b). El sobrenadante (citosol), la almohadilla de sacarosa (sacarosa) y las fracciones de pella se sometieron a SDS-PAGE, y se determinó la distribución de eRF1 , eRF3 y Upfl p dentro de estas fracciones por medio de ¡nmunoblotting, usando anticuerpo policlonal contra eRF1 , y eRF3 y un anticuerpo monoclonal contra el epítope de FLAG. Una proteína de 95 kDa reacciona cruzadamente con anticuerpo anti-FLAG en la cepa 7G-H66, y tiene la misma distribución en células [PSI*] y [psr]. Esta proteína de 95 kD no está presente en extractos preparados de la cepa BJ3505 (véase la figura 1 ). FIGURA 3. eRF3 y ARN compiten por la unión a Upfl p. (A) ARN poli(U) impide que Upfl p se una a eRF3. Se prepararon mezclas de reacción como se describe en la figura 1 B, pero la unión se realizó en TBSTB (TBST con 100 µg/ml de BSA) y las mezclas de reacción contenían ATP 1 mM, GTP 1 mM, o 100 µg/ml de ARN poli(U) como se indica arriba de cada carril. Las mezclas de reacción se mezclaron durante 1 hora a 4°C. Después de mezclar, los complejos se lavaron como en la figura 1 B con TBSTB conteniendo ATP 1 mM, GTP 1 mM, o 100 µg/ml de ARN pol¡(U) como se indica arriba de cada carril. (B) ARN poli(U) no impide la interacción entre Upfl y eRF1. Se prepararon mezclas de reacción como en la figura 1 B, en presencia o en ausencia de ARN poli(U) 100 mg/ml como se indica arriba de cada carril. (C) eRF3 inhibe la unión de ARN a Upfl p. Por medio de transcripción de SP6 de pGEM5Zf(+) digerido con Sstl, se sintetizó un ARN 32 nt marcado uniformemente. Las cantidades indicadas de GST-eRF3 se incubaron con 200 ng de Upfl p durante 15 minutos a 4°C. Se agregaron 50 fmoles del substrato de ARN y se incubó durante 5 minutos. Se agregó solución de detención, y las reacciones se sometieron a electroforesis en un gel de PAGE 4.5% natural (O.dxTBE, acrilamida:b¡sacrilamida 30:0.5, con glicerol 5%). FIGURA 4. eRF1 y eRF3 inhiben la actividad ATPasa de Upfl p dependiente de ARN. Se determinó la actividad ATPasa de Upfl p dependiente de ARN en presencia de fusiones GST-RF mediante prueba de carbón usando ARN poli(U) 1 µg/ml y BSA 100 µg/ml. Los resultados se grafican como pmoles de 32P liberado contra la cantidad de la proteína indicada. FIGURA 5. Un alelo quimérico RENT1/HUPF1 funciona en la terminación de traducción. (A) Un alelo quimérico RENT1/HUPF1 impide la supresión de sin sentido en una cepa upñ?. La cepa PLY146 (MATa ura3-52 trpl? upf1::URA3leu2-2 tyr7-1) se transformó con YCplac22 (vector), YCpUPFI {UPF1), YCRent1 CHI4-2 o YEpRent1 CHI4-2, y las células se desarrollaron hasta DO6oo = 0.5 en medio -trp-met. Se prepararon diluciones de 1/10, 1/100 y 1/1000 en medio -trp-met y se sembraron en placa 5 µl de estas diluciones simultáneamente sobre medio -trp-met (placa superior) o -trp-met-leu-tyr (placa inferior). Se monitoreó el crecimiento de las células a 30°C. (B) un alelo quimérico RENT1/HUPF1 no promueve declinación de ARNm's que contienen sin sentidos. Se aisló ARN total de células a DO6oo = 0.8 de las cepas descritas en (A). Se sometieron a análisis northern blotting 40 µg de ARN de las cepas PLY146 transformadas con YCplac22 (vector), YCpUPFI (UPF1) o YEpRent1 CHi4-2 (YEpRENT1 CHI4-2) (10), y se sondearon con las sondas LEU2, TYR7 o CYH2. FIGURA 6. Rent1/hupf1 interacciona con eRF1 y eRF3. Se usó pT7RENT1 linealizado con Notl (carriles 1-4) o molde de luciferasa (carriles 5-8) en la traducción de transcripción in vitro de Reticulocito acoplado a TNT según las instrucciones del fabricante (Promega). Se sometieron a electroforesis 2 µl de reacciones de traducción completada en los carriles 1 y 5. Se incubaron 5 µl de las reacciones completadas en 200 µl de IBTB con 10 µl de complejos de sepharose-proteína de GST, GST-eRF1 o GST- eRF3 como se indica arriba de cada carril. Después de mezclar durante 1 hora a 4°C, los complejos sepharose-proteína se lavaron como en la figura 1A, y las proteínas unidas se sometieron a SDS-PAGE en un gel al 8%. Después de electroforesis, los geles se fijaron durante 30 minutos en metanol al 50%, ácido acético al 10%, y después se trataron con ácido salicílico 1 M por 1 hora. Los geles se secaron y se sometieron a autorradiografía.

FIGURA 7. Modelo para la función de Üpf1 en la vigilancia de ARNm. (A) La modulación de la unión de ARN incrementa la interacción de Upfl con factores de liberación de peptidilo. La unión de ATP a Upfl p reduce la afinidad de Upfl por ARN. Puesto que el ARN y el eRF3 compiten por la unión a Upfl , es favorecida la interacción con eRF3. (B) Un modelo para la vigilancia de ARNm. La interacción de Upfl p con factores de liberación de peptidilo, arma un complejo de vigilancia de ARNm en un evento de terminación. Esta interacción impide que Upfl se una a ARN y la hidrólisis de ATP, e incrementa la terminación de traducción. Después de la hidrólisis de péptido, los factores de liberación se disocian del ribosoma, activando la actividad helicasa de Upfl p. Entonces ei complejo de vigilancia barre hacia el extremo 3' del codón de terminación para un DSE. La interacción del complejo de vigilancia con el DSE, da la señal de que ha ocurrido terminación prematura de traducción, y entonces el ARNm es desbloqueado y degradado por la exorribonucleasa Dcpl p y Xm1 p, respectivamente. FIGURA 8. Diagrama esquemático de los vectores usados para medir in vivo las eficiencias de la alteración de marco ribosomal programada - 1. La transcripción es conducida desde el promotor PGK1 y utiliza el codón de iniciación de traducción PGK1. En pTI25, el gen lacZ bacteriano está en el marco 0 con respecto al sitio de inicio. En el plásmido pF8, el gen lacZ está colocado hacia 3' de la señal de alteración de marco del virus L-A y en el marco -1 respecto al sitio de inicio de traducción. FIGURA 9. La cepa upf3? incrementa la alteración de marco ribosomal -1 programada, independientemente de su capacidad para promover la estabilización de transcritos que contienen sin sentidos. Por medio de análisis de protección de ARNasa, se determinó la abundancia del ARNm del reportero -1 de PGK1 - LacZ en las diferentes clases de supresión upf por medio de análisis de protección de ARNasa. La abundancia de ARNsn de U3 se usó como un control interno para carga. La abundancia del transcrito reportero en la cepa de tipo silvestre se tomó arbitrariamente como 1.0. FIGURA 10. Una cepa upf3? no puede mantener el virus asesino Mi. (A) Prueba de asesino de cepas mutantes upf. Se desarrollaron colonias de estas cepas sobre un césped de células que son sensibles a la toxina asesina secretada producida por el virus M-i. La actividad asesina se observó como una zona de inhibición de crecimiento alrededor de las colonias. (B) Se aislaron ARNs totales de las mismas cepas y se analizaron mediante Northern blotting para la presencia de L-A y ARNs virales de M-|. FIGURA 1 1. Se monitoreó sensibilidad a paromomicina en cepas ¡sogénicas tipo silvestre y upf3?, colocando un disco con 1 mg de paromomicina sobre un césped de células y determinando la zona de inhibición de crecimiento alrededor del disco.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION Los transcritos con codones sin sentido prematuros son degradados rápidamente impidiendo así la síntesis de proteínas incompletas y potencialmente nocivas. La ruta de vigilancia elimina ARNm aberrante que contiene mutaciones sin sentido con la región codificadora de proteína. Esta invención está dirigida a tres aspectos de regulación post-transcripcional, que incluyen: supresión de mutaciones sin sentido en enfermedad y cánceres heredados; inhibición de alteración de marco ribosomal en infecciones virales; y alteraciones de las interacciones ARN:proteína que, a su vez, modulan los niveles críticos de ARNm en múltiples enfermedades. La Upfl p incrementa la terminación de traducción interaccionando con los factores eucarióticos de liberación de peptidilo Factor de Liberación eucariótico 1 (eRF1 ) y factor de Liberación eucariótico 2 (eRF2) [abreviaciones en inglés de eucariotic Reléase Factor], para aumentar su actividad. Tanto eRF1 como eRF3 son proteínas conservadas que interaccionan y promueven la liberación de peptidilo en células eucarióticas. En la levadura, eRF1 y eRF3 son codificadas por los genes SUP45 y SUP35, respectivamente (Frolova y otros, 1994; Zhouravleva y otros, 1995). Se ha mostrado que Sup45p y Sup35p interaccionan (Stansfield y otros, 1995, Paushkin y otros, 1997). eRF1 contiene actividad intrínseca de hidrólisis de péptido, mientras que eRF3, que tiene homología con el factor de alargamiento de traducción EF1a (Didichenko y otros, 1991), exhibe actividad GTPasa (Frolova y otros, 1996), e incrementa la actividad de terminación de eRF1 (Zhouravleva y otros, 1995). Los resultados presentados aquí demuestran una interacción bioquímica entre la Upfl p humana y de levadura, y los factores de liberación de peptidilo eRF1 y eRF3. El siguiente es un modelo de cómo funciona la ruta NMD para incrementar la terminación de traducción y para reconocer y degradar subsecuentemente un transcrito que contiene sin sentidos. Un codón de terminación en el sitio A de un ribosoma de traducción, ocasiona que el ribosoma haga pausa (paso 1 ). Los factores de terminación de traducción eRF1 y eRF3 ¡nteraccionan en el sitio A y promueven el ensamble del complejo de vigilancia interaccionando con Upfl p, que muy probablemente está en complejo con otros factores (paso 2). La interacción de Upfl p con los factores de liberación, inhibe sus actividades de ATPasa y de unión de ARN. Esta inhibición puede ser necesaria para que la Upfl p incremente la actividad de los factores de terminación y asegure que el complejo de Upfl p no se disocie prematuramente de los factores de liberación y busque un DSE. Ocurre hidrólisis de péptido mientras los factores de liberación están asociados con el complejo de vigilancia. Después de hidrólisis de GTP con eRF3 y consumación de la terminación, los eRFs se disocian del ribosoma (paso 3). La disociación de los factores de liberación, activa la unión de ARN y las actividades de ATPasa de la Upfl p, e impulsa al complejo de Upfl p para barrer hacia 3' del codón de terminación en búsqueda de un DSE (paso 4). Si el complejo se llega a asociar con el DSE o con factores asociados a DSE, se forma un complejo RNP para el cual el ARN es un substrato, para rápido desbloqueo con DCpl p (paso 5). El complejo RNP que se forma como consecuencia de la interacción del complejo de vigilancia con el DSE, impide la interacción normal entre el complejo 3'-poli(A)-PABP y la estructura de tapa 5'. El ARNm desbloqueado es degradado subsecuentemente con la exorribonucleasa Xrnl p (paso 6). Como se define aquí, un "complejo de vigilancia" comprende por lo menos Upfl p; y factores de liberación eucarióticos 1 y 3. El gen "UPF1", también se denomina RENT1 o HUPF1. El complejo puede comprender también Upf2p y/o Upf3p. Un gran número de observaciones señalan una función importante de la síntesis de proteínas en el proceso de declinación de ARNm. De hecho, parece que estos dos procesos han coevolucionado, y que los factores esenciales para un proceso también funcionan en el otro. La evidencia para esta liga incluye experimentos que demuestran que: (a) fármacos o mutaciones que interfieren con alargamiento de traducción, promueven la estabilización de ARNm, (b) elementos de secuencia que dictan rápida declinación de ARNm, pueden estar localizados hacia regiones que codifican ARNm, y la actividad de tales elementos depende de su traducción, (c) factores degradantes pueden estar asociados a ribosoma, y (d) la terminación prematura de traducción puede incrementar las velocidades de declinación de ARNm. Puesto que la cantidad de una proteína particular sintetizada en un tiempo dado depende de la concentración celular de su ARNm, se deduce que la regulación de las velocidades de declinación de ARNm provee un medio poderoso para controlar la expresión de genes. En células de mamífero, las velocidades de declinación de ARNm (expresadas como vidas medias), pueden ser tan cortas como de 15-30 minutos o tan largas como de 500 horas. Obviamente, tales diferencias en velocidades de declinación de ARNm pueden conducir a diferencias de hasta 1000 veces en el nivel de proteínas específicas. Un nivel adicional de control es provisto por la observación de que no se requiere que las velocidades de declinación para ARNm's individuales sean fijas, pero pueden ser reguladas como una consecuencia de mecanismos de retroalimentación autógenos, la presencia de hormonas específicas, una etapa particular de diferenciación o el ciclo celular, o infección viral. Quizás los mejores ejemplos de la integración de traducción y declinación de ARNm, son los estudios que documentan las consecuencias de la terminación prematura de traducción. Esto ocurre cuando mutaciones de supresión, sustitución de base o de alteración de marco conducen a la síntesis de un ARNm que contiene un codón de detención inapropiado (codón sin sentido) dentro de su región codificadora de proteína. La ocurrencia de dicho codón de detención prematura detiene la traducción en el sitio de la terminación temprana y ocasiona la síntesis de una proteína truncada. A pesar de sus velocidades de declinación "normales", los ARNm's transcritos de genes que alojan mutaciones sin sentido (referidas como "ARNm's que contienen sin sentidos"), son degradados rápidamente. Dicha "declinación de ARNm mediada por sin sentidos" es ubicua, es decir, se ha observado en todos los organismos probados, y conduce a una reducción de diez hasta cien veces de la abundancia de ARNm's específicos. La combinación de la abundancia severamente reducida de ARNm, y la traducción terminada prematuramente, ocasiona reducciones del nivel global de expresión de los genes específicos que son tan drásticas como las consecuencias de la supresión de genes. La importancia de la declinación de ARNm mediada por sin sentidos para la salud humana, es ilustrada por la identificación de un número creciente de enfermedades hereditarias en las cuales las mutaciones sin sentido ocasionan el estado patológico y en las cuales se ha visto que los ARNm's respectivos son substratos de la ruta de declinación de ARNm mediada por sin sentidos. Un punto importante, es que la inactivación de la ruta de declinación de ARNm mediada por sin sentidos, puede ser realizada sin impedir el crecimiento celular, y conduce a la restauración de niveles normales y velocidades de declinación normales para los ARNm's que contienen sin sentidos. De manera más significativa, los experimentos con levadura (y otros) demuestran que, aunque un ARNm puede contener todavía un codón sin sentido, la inactivación de esta ruta de declinación permite la síntesis de suficiente proteína funcional para que las células superen el defecto genético original. Así, es posible tratar enfermedades causadas por mutaciones sin sentido por medio de regulación negativa de la ruta de declinación de ARNm mediada por sin sentidos. Esta invención provee un complejo aislado que comprende una proteína Upfl p humana, un factor de liberación de peptidilo 1 eucariótico (eRF1) y un factor de liberación de peptidilo 3 eucariótico (eRF3), en donde el complejo es efectivo para modular la actividad de peptidil transferasa. La Upfl p interacciona con los factores de liberación de peptidilo eRF1 y eRF3: Upfl p modula la terminación de traducción interaccionando con los factores de liberación de peptidilo eRF1 y eRF3. Los eRF1 y eRF3 fueron expresados individualmente en E. coli como proteínas de fusión de glutation-S-transferasa (GST) y se purificaron usando glóbulos de giutatión sepharose. Las proteínas de fusión GST-RF (factor de liberación) purificadas asociadas con los glóbulos de glutatión sepharose, se agregaron a un extracto citoplásmico de levadura conteniendo una Upfl p marcada con epítope FLAG. Después de incubación, las GST-RFs y proteínas asociadas se purificaron por cromatografía de afinidad y se sometieron a SDS-PAGE. Se realizó inmunoblotting y se probó la presencia de la Upfl p usando un anticuerpo contra el epítope FLAG. El anticuerpo anti-FLAG reconoció solamente la Upfl p de 109 kD en extractos citoplásmicos de células transformadas con plásmido que expresa la FLAG-Upfl p. Este análisis también demostró que la Upfl p se purificó asociadamente de manera específica con eRF1 o eRF3. La Upfl p no se purificó asociadamente con proteína GST que no fue fusionada a otra proteína ni a una proteína GST-JIP en la cual se usó una proteína interaccionante Jak2 fusionada a GST para monitorear la especificidad de la reacción. También se monitoreó la interacción de Upfl p purificada con eRF1 o eRF3. Se ha descrito previamente la purificación para Upfl p marcada con epítope (FLAG-Upf1 p). La FLAG-Upfl p purificada se incubó con las proteínas de fusión GST-RF en presencia de concentraciones crecientes de sal, y se monitorearon las interacciones de estas proteínas según se describió arriba. Los resultados demostraron que la FLAG-Upfl p purificada interaccionó ya sea con eRF1 o con eRF3. El complejo Upf1 p-eRF3 fue menos sensible a concentraciones crecientes de sal que el complejo Upfl-eRF1. Las interacciones fueron específicas, ya que la Upfl p purificada no interacciona con la proteína GST ni con GST-JIP. Se mostró que la interacción de Upfl p con eRF1 o eRF3 es dependiente de la dosis. En una modalidad, el complejo comprende además Upf3p humana. Los resultados presentados aquí indican que la Upf3p tiene una función en el aseguramiento de mantenimiento apropiado del marco de lectura de traducción. Parece que la función de la Upf3p en este proceso es genéticamente epistática para la Upfl p y Upf2p, ya que en las cepas upfl? y upf2? se observan los fenotipos de alteración de marco programada -1 y mantenimiento de asesino de un upf3?. Los resultados presentados aquí demuestran que las Upfp's tienen distintas funciones que pueden afectar aspectos diferentes de los procesos de traducción y renovación de ARNm. De manera importante, estos resultados también pueden tener implicaciones prácticas, puesto que muchos virus de importancia clínica, veterinaria y agrícola utilizan alteración de marco programada. De esta manera, la alteración de marco ribosomal programada sirve como un blanco único para agentes antivirales, y la identificación y caracterización de los factores implicados en este proceso ayudará a desarrollar pruebas para identificar a estos compuestos. En otra modalidad, ei complejo comprende Upf2p humana. Esta invención provee un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína Upflp humana, un factor de liberación de peptidilo eucariótico 1 (eRF1) y un factor de liberación de peptidilo eucariótico 3 (eRF3) ligado operativamente a un elemento regulador. De conformidad con la presente invención, se pueden emplear técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y ADN recombinante dentro de la práctica de este campo. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase por ejemplo Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" [Clonación molecular: Manual de laboratorio], segunda edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (de aquí en adelante "Sambrook y otros, 1989"); "DNA Cloning: A Practical Approach" [Clonación de ADN: Un enfoque práctico], volúmenes I y II (D.N. Glover, ed., 1985); "Oligonucleotide Synthesis" [Síntesis de oligonucleótidos], M.J. Gait ed., 1984; "Nucleic Acid Hybridization" [Hibridación de ácidos nucleicos] B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1985); "Transcription and Translation" [Transcripción Y traducción] B.D. hames & S.J. Higgins, eds., (1984); "Animal Cell Culture" [Cultivo de células animales], R.l. Freshney, ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" [Células y enzimas inmovilizadas], IRL Press, (1986); B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" [Guía práctica de la clonación molecular], 1984; F.M. Ausubel y otros (eds.), "Current Protocols in Molecular Biology" [Protocolos actuales de Biología Molecular], John Wiiey & Sons, Inc. (1994). Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al cual se le puede añadir otro segmento de ADN a fin de efectuar la replicación del segmento añadido. Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo, es decir, es capaz de replicarse bajo su propio control. Un "cassette" se refiere a un segmento de ADN que puede ser insertado en un vector en sitios de restricción específicos. Ei segmento de ADN codifica para un polipéptido de interés, y el cassette y los sitios de restricción están diseñados para asegurar la inserción del cassette en el marco de lectura apropiado para transcripción y traducción. Una "molécula de ácido nucleico" se refiere a una forma polimérica de éster de fosfato de ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de ARN") o desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina o desoxicitidina; "moléculas de ADN"), o cualquier análogo fosfoéster de los mismos, tales como fosforotioatos y tioésteres, ya sea en forma de una sola cadena, o en hélice de doble cadena. Son posibles hélices de doble cadena de ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN. El término molécula de ácido nucleico, y en particular molécula de ADN o ARN, se refiere sólo a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a ninguna forma terciaria en particular. Así, este término incluye ADN de doble cadena, encontrado, entre otras partes, en moléculas de ADN lineal o circular (por ejemplo, fragmentos de restricción), plásmidos y cromosomas. Al describir aquí la estructura de moléculas particulares de ADN de doble cadena, se pueden describir secuencias de acuerdo con la convención normal de dar sólo la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena no transcrita de ADN (es decir, la cadena que tiene una secuencia homologa al ARNm). Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que ha sufrido una manipulación biológica molecular. Las secuencias de control de transcripción y traducción son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, incrementadores, terminadores, y similares, que producen la expresión de una secuencia codificadora en una célula hospedera. En células eucarióticas, las señales de poliadenilación son secuencias de control. Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a ARN polimerasa en una célula, e iniciar la transcripción de una secuencia codificadora en dirección 3' ("downstream"). Para propósitos de definición de la presente invención, la secuencia promotora está ligada en su extremo 3' por el sitio de iniciación de transcripción, y se extiende en dirección 5' ("upstream") para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima de un nivel basal. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de iniciación de transcripción (definido convenientemente, por ejemplo, mapeando con nucleasa S1 ), así como dominios de unión de proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de ARN polimerasa. Una secuencia codificadora está "bajo el control" de secuencias de control de transcripción y traducción en una célula, cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificadora en ARNm, el cual después es trans-empalmado con ARN y traducido hacia la proteína codificada por la secuencia codificadora. Se puede usar un gran número de sistemas vector-hospedero conocidos en la técnica. Los vectores posibles incluyen, sin limitación, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vector debe ser compatible con la célula hospedera usada. Los ejemplos de vectores incluyen, sin limitación, E. coli, bacteriófagos tales como derivados lambda, o plásmidos tales como derivados pBR322 o derivados de plásmido pUC, por ejemplo, vectores pGEX, pmal-c, pFLAG, etc. La inserción en un vector de clonación, puede llevarse a cabo por ejemplo ligando el fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene extremos cohesivos complementarios. Sin embargo, si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, se pueden modificar enzimáticamente los extremos de las moléculas de ADN. Alternativamente, se puede producir cualquier sitio deseado ligando secuencias de nucleótidos (enlazadores) sobre los extremos de ADN; estos enlazadores ligados pueden comprender oligonucleótidos específicos sintetizados químicamente que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasa de restricción. Las moléculas recombinantes se pueden introducir en células hospederas mediante transformación, transfección, infección, electroporación, etc., de tal manera de generar muchas copias del gen. Preferiblemente, el gen clonado está contenido en un plásmido vector promiscuo, que produce expansión en una célula en clonación, por ejemplo, E. coli, y fácil purificación para inserción subsecuente en una línea celular de expresión adecuada, si así se desea. Por ejemplo, un vector promiscuo, que es un vector que se puede replicar en más de un tipo de organismo, se puede preparar para su replicación tanto en E. coli como en Saccharomyces cerevisiae, ligando secuencias de un plásmido de E. coli con secuencias del plásmido 2 de levadura. La expresión de ADN que codifica las proteínas, Upfl p, Upf2p, Upf3p, y los factores de liberación 1 y 2 del complejo, puede ser controlada por cualquier elemento promotor/incrementador conocido en ia técnica, pero estos elementos reguladores deben ser funcionales en el hospedero seleccionado para la expresión. Los promotores que se pueden usar no están limitados a la región promotora temprana SV40 (Benoist y Chambón, 1981 , Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal 3' larga del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto y otros, 1980, Cell 22:787-797), el promotor de timidina cinasa de herpes (Wagner y otros, 1981 , Proc. Nati.

Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneina (Brinster y otros, 1982\ Nature 296:39-42); vectores de expresión eucarióticos tales como el promotor de ß-lactamasa (Villa-Kamaroff y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731 ) o el promotor tac (DeBoer y otros, 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25). Los vectores se introducen en las células hospederas deseadas con los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, dextrano DEAE, precipitación con fosfato de calcio, lipofección (fusión de lisosoma), usando una pistola de genes, o un transportador de vector de ADN (véase, por ejemplo, Wu y otros, 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu y Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut y otros, solicitud de patente Canadiense No. 2,012,31 1 , presentada el 15 de marzo de 1990). Esta invención provee un agente que se une al complejo que comprende una cantidad de una proteína Upfl p humana, un factor de liberación de peptidilo eucariótico 1 (eRF1 ) y un factor de liberación de peptidilo eucariótico 3 (eRF3), efectiva para modular la terminación de traducción. Esta invención provee un agente que se une al complejo, en donde dicho agente inhibe ATPasa de Upfl p; actividad GTPasa de eRF1 o eRF3; unión de ARN; unión de los factores al ribosoma; o unión de los factores entre sí. Esta invención provee un agente que inhibe o modula la unión de Upfl p humana a eRF1 o eRF3 o de eRF1 o eRF3 a Upfl p; la unión de ARN; o la unión de los factores al ribosoma; o la unión de los factores entre sí. Esta invención provee un agente que inhibe o modula la unión de Upf3p humana a eRF1 o eRF3, o de eRF1 o eRF3 a Upf3p. Esta invención provee un agente que facilita la unión de Upfl p humana a eRF1 o eRF3; o eRF3 o eRF1 o eRF3 a Upfl p. Esta invención provee un agente que facilita la unión de Upf3p humana a eRF1 o eRF3; o eRF3 o eRF1 o eRF3 a Upf3p; la unión de ARN; o la unión de los factores al ribosoma; o la unión de los factores entre sí. Esta invención provee un agente que modula la unión de Upfl p humana, eRF1 o eRF3 a un ribosoma. Esta invención provee un anticuerpo que se une al complejo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal. Además, el anticuerpo puede estar marcado con un marcador detectable que sea radioactivo, colorimétrico, fluorescente o luminiscente. El anticuerpo marcado puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. En una modalidad, el anticuerpo marcado es un anticuerpo marcado purificado. Los métodos de marcación de anticuerpos son bien conocidos en la técnica. El término "anticuerpo" incluye, a manera de ejemplo, anticuerpos tanto de ocurrencia natural como de ocurrencia no natural. Específicamente, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, y fragmentos de los mismos. Además, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos quiméricos y anticuerpos completamente sintéticos, y fragmentos de los mismos. Dichos anticuerpos incluyen, sin limitación, policlonales, monoclonales, quiméricos, de una sola cadena, fragmentos Fab, y una colección de expresión de Fab. Además, la proteína o anticuerpo pueden incluir un marcador detectable, en donde el marcador es un marcador radioactivo, colorimétrico, fluorescente o luminiscente. Los anticuerpos se pueden marcar para su detección in vitro, por ejemplo, con marcas tales como enzimas, fluoróforos, cromóforos, radioisótopos, colorantes, oro coloidal, partículas de látex y agentes quimioluminiscentes. Alternativamente, los anticuerpos se pueden marcar para su detección in vivo, por ejemplo, con radioisótopos (preferiblemente tecnecio o yodo); reactivos de desplazamiento de resonancia magnética (tales como gadolinio y manganeso); o reactivos radioopacos. Las marcas empleadas más comúnmente para estos estudios son los elementos radioactivos, las enzimas, los agentes químicos que fluorescen cuando se exponen a la luz ultravioleta, y otros. Se conocen varios materiales fluorescentes que se pueden utilizar como marcas. Estos incluyen, por ejemplo, fluoresceína, rodamina, auramina, Rojo de Texas, azul AMCA y Amarillo Lucifer. Un material detector particular es el anticuerpo anti-conejo preparado en cabras y conjugado con fluoresceína mediante un isotiocianato. La proteína también se puede marcar con un elemento radioactivo o con una enzima. La marca radioactiva se puede detectar mediante cualquiera de los procedimientos de conteo actualmente disponibles. El isótopo preferido se puede seleccionar de 3H, 14C, 32P, 35S, 36CI, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125l, 131l y 186Re. Las marcas de enzima son igualmente útiles, y se pueden detectar mediante cualquiera de las técnicas utilizadas actualmente de colorimetría, espectrofotometría, fluoroespectrofotometría, amperometría o gasometría. La enzima se conjuga con la partícula seleccionada mediante reacción con moléculas de puenteo tales como carbodümidas, diisocianatos, glutaraldehído y similares. Se conocen muchas enzimas que se pueden utilizar en estos procedimientos. Las preferidas son peroxidasa, ß-glucuronidasa, ß-D-glucosidasa, ß-D-galactosidasa, ureasa, glucosa oxidasa mas peroxidasa y fosfatasa alcalina. A manera de ejemplo, se hace referencia a las patentes de E.U.A. Nos. 3,654,090; 3,850,752; y 4,016,043, para una descripción de materiales y métodos de marcación alternativos. Anticuerpos y ácidos nucleicos específicos complejos se pueden usar como sondas en métodos para detectar la presencia de un polipéptido complejo (usando un anticuerpo) o un ácido nucleico complejo (usando una sonda de ácido nucleico) en una muestra o tipo específico de célula. En estos métodos, se pone en contacto una sonda del complejo específico de anticuerpo o ácido nucleico con una muestra de un paciente del que se sospecha que tiene un trastorno asociado con un complejo, y se detecta la unión específica de la sonda de anticuerpo o ácido nucleico en la muestra. El nivel del complejo o ácido nucleico presente en la muestra sospechosa, se puede comparar con el nivel en una muestra de control, por ejemplo, una muestra equivalente de un individuo no afectado, para determinar si el paciente tiene un trastorno asociado con el complejo. Los polipéptidos complejos o sus fragmentos se pueden usar también como sondas en métodos de diagnóstico, por ejemplo, para detectar la presencia de anticuerpos específicos de complejo en las muestras. Adicionalmente, se podrían usar anticuerpos específicos de complejo para detectar cofactores novedosos que han formado un complejo con el complejo o un fragmento del mismo. Esta invención provee un método de modulación de actividad de peptidil transferasa durante traducción, que comprende poner en contacto una célula con el complejo en una cantidad efectiva para facilitar la terminación de traducción, modulando con ello la actividad de peptidil transferasa. Esta invención provee un método de modulación de actividad de peptidil transferasa durante traducción, que comprende poner en contacto una célula con el agente, en una cantidad efectiva para suprimir la terminación de traducción sin sentido, por medio de lo cual se modula la actividad de peptidil transferasa. La actividad de peptidil transferasa durante la traducción ocurre durante el inicio, alargamiento, terminación y degradación de ARNm. Esta ¡nvención provee un método de modulación de la eficiencia de terminación de traducción de ARNm en un codón sin sentido y/o de promoción de la degradación de transcritos aberrantes, que comprende poner en contacto una célula con el agente, en una cantidad efectiva para inhibir la unión de Upflp humana a eRF1 o eRF3; o de eRF1 o eRF3 a Upfl p, modulando con ello la eficiencia de terminación de traducción de ARNm en un codón sin sentido y/o promoviendo la degradación de transcritos aberrantes. Esta invención provee un método de modulación de la eficiencia de terminación de traducción de ARNm en un codón sin sentido y/o de promoción de la degradación de transcritos aberrantes, que comprende poner en contacto una célula con un agente que inhibe la actividad ATPasa/helicasa de Upfl p; la actividad GTPasa de eRF1 o eRF3; la unión de ARN; o la unión de ARN con un ribosoma, modulando con ello la eficiencia de terminación de traducción de ARNm en un codón sin sentido y/o promoviendo la degradación de transcritos aberrantes. En una modalidad específica, se pueden seleccionar para prueba agentes que interfieran con la actividad NTPasa tal como actividad ATPasa, GTPasa, actividad helicasa, o configuración de motivo de dedo de zinc. Tales agentes pueden ser fármacos útiles para tratar infecciones virales, ya que muchos retrovirus, particularmente HIV, coronavirus y otros virus de ARN, están asociados con patologías médicas y veterinarias. Proveyendo la identidad de proteínas que modulan los eventos de alteración de marco, un escudriñamiento inicial para buscar los agentes puede incluir una prueba de unión a dichas proteínas. Esta prueba se puede emplear para probar la efectividad de los agentes sobre la actividad las de proteínas asociadas con la alteración de marco de humano, así como también de levadura y otra fuente no humana, incluyendo sin limitación de animales. Por ejemplo, la identificación de agentes que inhiban la ruta de declinación, que estabilicen los transcritos sin sentido o que modulen la eficiencia de terminación de traducción, son importantes para el éxito de la tecnología de ARN de antisentido. Los ARNs de antisentido son transcritos pequeños, difundibles, no traducidos y altamente estructurados que se aparean con ARNs objetivos específicos en regiones de complementariedad, controlando con ello la función o expresión del ARN objetivo. Sin embargo, los intentos por aplicar la tecnología de antisentido han tenido limitado éxito. Parece ser que el factor limitativo es el de lograr concentraciones suficientes del ARN de antisentido en una célula, para inhibir o reducir la expresión del gen objetivo. Es probable que un impedimento para lograr suficiente concentración sea la ruta de declinación, puesto que los transcritos cortos de ARN de antisentido, que no son para codificar un producto génico, probablemente llevarían a una rápida terminación de traducción, si esta ocurriera, y por lo tanto a una rápida degradación y poca abundancia del ARN de antisentido en la célula. De esta manera, los agentes de la invención, que estabilizan los transcritos de ARNm aberrantes, también pueden estabilizar ARNs de antisentido. La presencia, la abundancia relativa o la ausencia del complejo, se determinan mediante la unión del anticuerpo. Los métodos de detección posibles incluyen cromatografía de afinidad, Western blotting, u otras técnicas bien conocidas para la persona con conocimientos medios en la materia. Este enfoque utiliza ácido nucleico de antisentido y ribozimas para bloquear la traducción de un ARNm específico, ya sea encubriendo ese ARNm con un ácido nucleico de antisentido, o cortándolo con una ribozima. Los ácidos nucleicos de antisentido son moléculas de ADN o ARN que son complementarias por lo menos a una porción de una molécula específica de ARNm (véase Marcus-Sekura, 1988, Anal. Biochem. 172:298).

En la célula, hibridan con ese ARNm formando una molécula de doble cadena. La célula no traduce un ARNm en esta forma de doble cadena. Por lo tanto, los ácidos nucleicos de antisentido interfieren con la expresión del ARNm hacia la proteína. Serán particularmente eficientes los oligómeros de aproximadamente quince nucleótidos y las moléculas que hibriden con el codón de iniciación AUG, ya que son fáciles de sintetizar y es probable que posean menos problemas que las moléculas más grandes cuando se les introduce en células de órganos. Los métodos de antisentido se han usado para inhibir in vitro la expresión de muchos genes (Marcus-Sekura, 1988, citado más arriba; Hambor y otros, 1988, J. Exp. Med. 168: 1237). Las ribozimas son moléculas de ARN que poseen la capacidad de cortar específicamente otras moléculas de ARN de una sola cadena, de una manera un poco análoga a las endonucleasas de restricción de ADN. Las ribozimas fueron descubiertas de la observación de que ciertos ARNm's tienen la capacidad de extirpar sus propios intrones. Modificando la secuencia de nucleótidos de estos ARNs, los investigadores han sido capaces de diseñar moléculas que reconocen secuencias específicas de nucleótidos en una molécula de ARN y las cortan (Cech, 1988, J. Am. Med. Assoc. 260:3030). Como son específicos de secuencia, sólo son inactivados ARNm's con secuencias particulares. Los investigadores han identificado dos tipos de ribozimas. El tipo Tetrahymena y el tipo "cabeza de martillo". Las ribozimas de tipo Tetrahymena reconocen secuencias de cuatro bases, mientras que los del tipo "cabeza de martillo" reconocen secuencias de once a dieciocho bases. Mientras más grande sea la secuencia de reconocimiento, será más probable que ocurra exclusivamente en las especies del ARNm objetivo. Por lo tanto, las ribozimas del tipo de cabeza de martillo son preferidos a las ribozimas del tipo Tetrahymena para inactivar una especie particular de ARNm, y las secuencias de reconocimiento de dieciocho bases son preferibles sobre las secuencias de reconocimiento más cortas. Esta ¡nvención provee un método de selección de un fármaco que interviene en la actividad de peptidil transferasa durante traducción, que comprende: (a) poner en contacto células con un fármaco candidato; y (b) probar la modulación del complejo, en donde un fármaco que module el complejo afecta la actividad de peptidil transferasa. Además, el complejo se puede probar para determinar su actividad NTPasa tal como ATPasa, GTPasa, actividad de unión de ARN, factores que se unen al complejo tales como eRF1 y eRF3, pero sin limitarse a estos, factores que se disocian del ribosoma, factores que promueven agregación; y factores que incrementan la terminación de traducción retardando la hidrólisis de péptido. Esta invención provee un método de selección de un fármaco activo que afecta el incremento de terminación de traducción, que comprende: (a) poner en contacto células con un fármaco candidato; y (b) probar la modulación del complejo de proteína; en donde un fármaco que module el complejo de proteína, afecta el incremento de la terminación de traducción.

Esta invención provee un método de selección de un fármaco que afecta el incremento de terminación de traducción, que comprende: (a) incubar el fármaco y el complejo; y (b) medir el efecto sobre la supresión sin sentido, seleccionando con ello un fármaco que afecta el incremento de terminación de traducción. Las pruebas pueden ser pruebas de ARN o NTPasa tal como de ATPasa o GTPasa, que son conocidas para el experto en la materia. Por ejemplo, se puede detectar la presencia, la abundancia relativa, o la ausencia del complejo por medio de unión a un anticuerpo. La Upfl se puede detectar usando el anticuerpo monoclonal de ratón M2 contra el epítope FLAG como se describió previamente (Czaplinski y otros, 1995; Weng y otros, 1996a, b). Se detectó eRF3 como lo describen Didichenko y otros, 1991. Se detectó eRF1 como lo describen Stansfield y otros, 1992. Se puede determinar la actividad ATPasa de Upflp dependiente de ARN, usando 20 ng de Upfl p en presencia de proteínas de fusión GST-RF por medio de una prueba de carbón como la que se describió previamente (Czaplinski y otros, 1995), usando 1 µg/ml de ARN poli(U) con 100 µg/ml de BSA. Los resultados se grafican como pmoles de ^P liberado contra la concentración de la proteína indicada. La unión de ARN se puede determinar como sigue: Se sintetizó un ARN de 32 nt, marcado uniformemente, mediante transcripción SP6 de pGEM5Zf(+) digerido con Sstl como se describió previamente (Czaplinski y otros, 1995). El amortiguador de unión de ARN fue como se describió previamente (Czaplinski y otros, 1995), pero se incluyó BSA 100 µg/ml en todas las reacciones. Las cantidades indicadas de GST-eRF3 (28), se incubaron con 200 ng de Upflp durante 15 minutos a 4°C. Se les agregaron 50 fmoles del substrato de ARN y se incubaron durante 5 minutos. Se les agregó solución de detención, y las reacciones se sometieron a electroforesis en un gel PAGE nativo 4.5% (O.dxTBE, acrilamida:bisacrilamida 30:0.5, con glicerol 5%). Esta invención provee un método de modulación de la eficiencia de terminación de traducción de ARNm y/o de degradación de transcritos aberrantes en una célula; dicho método comprende: (a) proveer una célula que contiene un vector que comprende el ácido nucleico que codifica el complejo; o un antisentido del mismo; (b) sobreexpresar dicho vector de ácido nucleico en dicha célula para producir un complejo sobreexpresado, a fin de interferir la función del complejo o inhibirla. Esta invención provee un método para identificar un estado patológico que involucra un defecto en el complejo de la reivindicación 1 , que comprende: (a) transfectar una célula con un ácido nucleico que codifica el complejo; (b) determinar la proporción del complejo defectuoso en la célula después de la transfección; (c) comparar la proporción dei complejo defectuoso en la célula después de la transfección, con la proporción de complejo defectuoso en la célula antes de la transfección. Como se indicó arriba, la declinación de ARNm mediada por sin sentidos conduce a deficiencias celulares de proteínas esenciales, y por lo tanto a enfermedad. El control alterado de la estabilidad de ARNm's normales puede tener consecuencias comparablemente deplorables. Esta invención provee un método para tratar una enfermedad asociada con la actividad de peptidil transferasa, que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende el complejo de la reivindicación 1 , o los agentes que modulan o estimulan el complejo, y un vehículo o diiuyente farmacéutico, tratando con ello al sujeto. Las mutaciones sin sentido ocasionan aproximadamente 20-40% de las causas individuales de más -de -2-40 ^enferme ad s -hereditarias diferentes (incluyendo fibrosis cística, hemofilia, hipercolesterolemia familiar, retinitis pigmentosa, distrofia muscular de Duchenne, y síndrome de Marfan). Con muchas enfermedades en las cuales se produce sólo uno por ciento de la proteína funcional, los pacientes sufren de serios síntomas de la enfermedad, mientras que el fomento de la expresión a sólo el cinco por ciento de los niveles normales, puede reducir en gran medida la severidad de la enfermedad, o eliminarla. Además, un número notablemente grande de las formas más comunes de cánceres de colon, mama, esofágico, de pulmón, cabeza y cuello, vesícula, se origina de mutaciones de alteración de marco y mutaciones sin sentido en genes reguladores (es decir, p53, BRCA1, BRCA2, etc.). La corrección de mutaciones sin sentido en los genes reguladores para permitir la síntesis de las proteínas respectivas, debe ocasionar la muerte de las células cancerosas.

La enfermedad, proteínas, o genes que son el resultado de mutaciones sin sentido o alteración de marco, incluyen, sin limitación, las siguientes: LOCUS DE BETA-HEMOGLOBINA; REGULADOR DE CONDUCTANCIA DE TRANSMEMBRANA DE FIBROSIS QUISTICA; DISTROFIA MUSCULAR DE LOS TIPOS PSEUDOHIPERTROFICA PROGRESIVA, DE DUCHENNE Y DE BECKER; FENILCETONURIA, RECEPTOR DE INSULINA; HEMOFILIA A, POLIPOSIS ADENOMATOSA DEL COLON, HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAR, NEUROFIBROMATOSIS TIPO I, HEMOFILIA B, HIPERLIPOPROTEINEMIA TIPO I, ENFERMEDAD DE TAY-SACHS, CÁNCER DE MAMA TIPO I, HIPERPLASIA ADRENAL, ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND, MUCOPOLISACARIDOSIS TIPO I, ALBINISMO I, ENFERMEDAD DE RIÑON POLIQUISTICO 1 , ANGIOQUERATOMA POR DEFICIENCIA DE ORNITINA AMINOTRANSFERASA, NEOPLASIA ENDOCRINA MÚLTIPLE DIFUSA TIPO 1 , REGIÓN Y DETERMINANTE DEL SEXO, MIEMBRO 1 INTERCAMBIADOR DE ANIÓN DE FAMILIA DE PORTADOR SOLUTO 4, CADENA ALFA-1 DE COLÁGENO TIPO 1 , HIPOXANTINA GUANINAFOSFORRIBOSIL TRANSFERASA 1 , GLUCOCINASA, PROTEINA p53 DE TUMOR, PROTEINA PROTEOLIPIDICA, MIELINA, RECEPTOR DE HORMONA DE CRECIMIENTO, RECEPTOR DE HORMONA LUTEINIZANTE/CORIOGONADOTROPINA; APOLIPOPROTEINA A-l DE LIPOPROTEINA DE ALTA DENSIDAD, GLUCOSA-6-FOSFATO DESHIDROGENASA, DEFICIENCIA DE ORNITINA TRANSCARBAMILASA, HIPERAMONEMIA XERODERMA PIGMENTOSA I, GEN 6 HOMEOTICO DE CAJA APAREADA, SÍNDROME DE VON HIPPEL-LINDAU, INHIBIDOR 2A DE C1NASA DEPENDIENTE DE CICLINA, ESCLEROSIS TUBEROSA 2, TIROSINEMIA, ENFERMEDAD DE NORRIE TIPO 1 , FOSFODIESTERASA 6B, PALMITOIL-PROTEINA TIOESTERASA, APOLIPOPROTEINA B, TIROSINA CINASA DE AGAMAGLOBULINEMIA BRUTON, HIPOPLASIA ADRENAL, FAMILIA 5 DE PORTADOR DE SOLUTO, 5,10-@-METILENTETRAHIDROFOLATO REDUCTASA, TUMOR DE WILMS, RÍÑONES POLIQUISTICOS, FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN 14, FACTOR HEPÁTICO NUCLEAR, MUCOPOLISACARIDOSIS TIPO II, DEFICIENCIA DE PROTEINA C, ENFERMEDAD TROMBÓTICA CONGENITA DEBIDA A NEUROFIBROMATOSIS TIPO II, ADRENOLEUCODISTROFIA, COLÁGENO TIPO Vil ALFA-1 , COLÁGENO TIPO X ALFA-1 , LOCUS 2 DE HEMOGLOBINA-ALFA, ENFERMEDAD Vil DE ALMACENAMIENTO DE GLICÓGENO, INTOLERANCIA A LA FRUCTOSA, CÁNCER DE MAMA 2 DE INICIO TEMPRANO; BRCA2, FUCOSILTRANSFERASA 2, SÍNDROME DE HERMANSKY-PUDLAK, TIROGLOBULINA, RETINOBLASTOMA, SÍNDROME DE WISKOTT-ALDRICH, RODOPSINA, COLÁGENO TIPO XVII, RECEPTOR COLINERGICO, NUCLEOTIDO CÍCLICO DE CANAL DE COMPUERTA, FOTORRECEPTOR, cGMP DE COMPUERTA, POLIPEPTIDO EPSILON NICOTINICO DE RECEPTOR COLINERGICO, GEN 1 ACTIVADOR DE RECOMBINACION, DISPLASIA CAMPOMELICA, INMUNODEFICIENCIA CON IgM INCREMENTADA, PROTOONCOGEN RET; MUCOPOLISACARI DOSIS RET DE TJPO IVA, RECEPTOR DE LEPTINA, ESFEROCITOSIS HEREDITARIA, ARGININA VASOPRESINA, DEFICIENCIA DE APOLIPOPROTEINA C-ll HIPERLIPOPROTEINEMIA TIPO 11 DEBIDA A FIBROSIS CISTICA, ENFERMEDAD DE WILSON, LEPTINA, EDEMA ANGIONEUROTICO, CANAL 5 DE CLORURO, DJSGENE3JS GONADAL, PORFIRIA, AGUDA INTERMITENTE, HEMOGLOBINA, GAMMA A, ENFERMEDAD DE KRABBE, ENFERMEDAD V DE ALMACENAMIENTO DE GLICÓGENO, LEUCODISTROFIA METAC ROM ÁTICA, SÍNDROME DE PLAQUETA GIGANTE INFANTIL TARDJA, RECEPTOR DE VITAMINA O, SARCOGLICANO, DELTA, TWIST, DROSOPHILA, ENFERMEDAD DE ALZHEIMER, OSTEOPETROSIS CON ACIDOSIS TUBULAR RENAL, AMELOGENESIS IMPERFERCTA 1 , TIPO HIPOPLASTICO, DOMINIO POU, CLASE 1 , FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN 1 , DIABETES MEJJJTDS, HOMOLOGO DE ONCOGEN VIRAL DE SARCOMA FELINO DE HARDY-ZUCKERMAN 4 V-KIT AUTOSOMICO DOMINANTE, LOCUS DE HEMOGLOBINA DELTA, ADENINAFOSFORRIBOSIL TRANSFERASA, FOSFATASA Y HOMOLOGO DE TENSINA, HORMONA DE CRECIMIENTO 1 , CATEPSINA K, SÍNDROME WERNER, ENFERMEDAD DE NIEMANN-PICK, RECEPTOR DE LA HORMONA LIBERADORA DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO, CERULOPLASMINA, RECEPTOR DEL FACTOR 3 ESTIMULADOR DE COLONIA, GRANULOCITO, PROTEINA DE M1EL1NA PERIFÉRICA 22, FUCOSIDOSIS, EXOSTOSES MÚLTIPLE TIPO II, ANEMIA DE FANCONI, GRUPO C DE COMPLEMENTACION, ATAXIA- TELANGIECTASIA, CADHERINA 1 , FAMILIA DE PORTADOR SOLUTO 2, MIEMBRO 2, FAMILIA DE UDP GLUCURONOSILTRANSFERASA 1 , A1 , ESCLEROSIS TUBEROSA 1 , LAMININA, GAMMA 2, CISTATINA B, ENFERMEDAD POLICISTICA DE RIÑON 2, PROTEINA MICROSOMAL DE TRANSFERENCIA DE TRIGLICERIDO, 88 KD, DISPLASIA DIASTROFICA, MONOOXIGENASA 3 QUE CONTIENE FLAVINA, ENFERMEDAD DE ALMACENAMIENTO DE GLICÓGENO III, DOMINIO POU, CLASE 3, FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN 4, CITOCROMO P450, SUBFAMILIA IID, PORFIRIA, ERITROPOYETICA CONGENITA, ATPasa, POLIPEPTIDO ALFA DE TRANSPORTACIÓN DE Cu(2+), CÁNCER DE COLON, FAMILIAR, NONPOLIPOSIS TIPO I, FOSFORILASA CINASA, SUBUNIDAD ALFA 1 (MÚSCULO), ELASTINA, REPARACIÓN DE EXTIRPACIÓN DE ENFERMEDAD DE CANAVAN, DEFECTUOSA DE COMPLEMENTACION, EN HÁMSTER CHINO, 5, JANUS CINASA 3, PROTEINA REGULADORA ESTEROIDOGENICA AGUDA, FUCOSILTRANSFERASA 6, GLAUCOMA 1 , ÁNGULO ABIERTO, EXOSTOSIS, MÚLTIPLE, TIPO I, MIOCILINA, AGRANULOCITOSIS GENÉTICA INFANTIL, RECEPTOR DE ERITROPOYETINA, SUPERVIVENCIA DE NEURONA MOTORA 1 , TELOMERICA, HEDGEHOG SÓNICO, HOMOLOGO DE DROSOFILA, DEFICIENCIA DE LECITINACOLESTEROL ACIL TRANSFERASA, SEGREGACIÓN POSTMEIOTICA INCREMENTADA (S. CEREVISIAE)-1 , DEFICIENCIA DE REPARACIÓN DE COMPLEMENTACION CRUZADA DE ROEDOR DE REPARACIÓN DE EXTIRPACIÓN, GRUPO 6, ANTIGENO 1 DE APOPTOSIS DE ENFERMEDAD DE ORINA DE JARABE DE MAPLE, FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN 1 , HEPÁTICO, LIGASA E3A DE PROTEINA UBIQUITINA, TRANSGLUTAMINASA 1 , MIOSINA VIIA, PROTEINA GAP JUNCTION, BETA 1 , 32 KD, FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN 2, HEPÁTICO, PROTEINA 4.2, ERITROCITICA, HORMONA ESTIMULADORA DE TOROIDES, CADENA BETA, SÍNDROME DE TREACHER COLLINS-FRANCESCHETTI 1 , COROIDEREMIA, FIBROBLASTOSIS ENDOCARDIAL 2, ENFERMEDAD DE COWDEN, HORMONA ANTI-MULERIANA, SRY-BOX 10, PROTEINA 1 RELACIONADA CON DEFICIENCIA PTA DE TIROSINASA, FOSFORILASA CINASA, SUBUNIDAD BETA, SERINA/TREDNINA PROTEINA CINASA 11 , FOSFOLPIPASA A2, GRUPO HA, REPARACIÓN DE EXTIRPACIÓN, DEFECTUOSA DE COMPLEMENTACION, EN HÁMSTER CHINO, 3, COLÁGENO DE HIPERPLASIA ADRENAL II, TIPO IV, CADENA ALFA 4, TROMBASTENIA DE GLANZMANN Y PROTEINA ESPECIFICA DE EPITELIO DE PIGMENTO RETINAL NAEGELI, 65 KD, HOMEO BOX A13, CALPAIN, POLIPEPTIDO L3 GRANDE, LAMININA DE XANTINURIA, ALFA 2, CITOCROMO P450, SUBFAMILIA XIX, MUCOPOLISACARIDOSIS TIPO VI, CEROIDE-LIPOFUSCINOSIS, NEURONAL 3, JUVENIL, CITRULINEMIA MIOCLONUS EPILEPSIA DE UNVERRICHT Y LUNDBORG FOSFORILASA CINASA, TESTICULOS/HIGADO, GAMMA 2, FAMILIA DE PORTADOR SOLUTO 3, MIEMBRO 1 , PTERIN-4-ALFA-CARBINOLAMINA DESHIDRATASA, ALBINISMO, OCULAR, TIPO 1 , EPILEPSIA DE DUENDE, BENIGNA NEONATAL, OSTEOPRETOSIS ENFERMEDAD DE HIRSCHPRUNG, ACTIVADOR 1 DE PROTEINA DE RAS p21 RECESIVO AUTOSOMICO, MUCOPOLISACARIDOSIS TIPO VII SÍNDROME DE CHEDIAK-HIGASHI, CANAL DE POTASIO, RECTIFICACIÓN INTERIOR, SUBFAMILIA J, MIEMBRO 1 , PLACOFILINA 1 , ISOFORMA 1B DE ACETIL HIDROLASA DE FACTOR ACTIVADOR DE PLAQUETA, SUBDNJDAD ALFA, PLECTINA 1 , DE CORTA TALLA, TRANSACTIVADOR MHC DE CLASE II, HIPOFOSFATEMIA, RAQUITISMO RESISTENTE A VITAMINA D_, FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN 1 DE HOMEBOX RELACIONADO CON RIEG BICOIDE, DISTROFIA MUSCULAR, CERCO DE MIEMBRO, TJPO 2E, RETINITIS PIGMENTOSA 3, MutS, HOMOLOGO DE E.COLI, 3, SÍNDROME OCULOCEREBRORENAL DE LOWE DEFICIENCIA DE TIROSINA TRANSAMINASA, XANT1SMO NEFRONOFTISIS, JUVENIL FAMILIAR 1 , HETEROTAXIA, VISCERAL, SÍNDROME DE LISENCEFAJJA DE JMILLER-DIEKER X-LIGADA, DEFICIENCIA DE PROPERDINA, 3-@OXOACIDO CoA TRANSFERASA X-LIGADA, DISTROFIA MUSCULAR DE SÍNDROME DE WAARDENBURG-SHAH, CERCO DE MIEMBRO, TIPO 2, SÍNDROME DE ALPORT, DIABETES MELLITUS ENFERMEDAD IV DE ALMACENAMIENTO DE AGLICOGENO AUTOSOMICA RECESIVA, FAMILIA DE PORTADOR SOLUTO TIPO II AUTOSOMICA DOMINANTE 2, MIEMBRO 1 , CISTJNQSIS DE SÍNDROME DE ÚTERO DE MANO-PIE, DE INICIO TEMPRANO O TIPO NEFROPATICA INFANTIL, SÍNDROME DE CRIGLER-NAJJAR FACTOR 1 DE CRECIMIENTO SEMEJANTE A INSULINA, LACTATO DESHIDROGENASA A, SÍNDROME DE STICKLER, TIPO II, AMAUROSIS CONGENITA DE LEBER I ALFA GALACTOSIDASA B, HIPERPLASIA ADRENAL I SÍNDROME DE LI-FRAUMENI, FAMILIA 12 DE PORTADOR SOLUTO, MIEMBRO 1 , SÍNDROME DE KLEIN-WAARDENBURG FACTOR 7 DE BIOGÉNESIS DE PEROXISOMA, GEN 8 HOMEOTICO DE CAJA APAREADA, RETINOSQUISIS, RECEPTOR 2C DE 5-HIDROXITRIPTAMINA, URATO OXIDASA, SÍNDROME DE PEUTZ-JEGHERS PROLAPSO DE VÁLVULA MITRAL, FAMILIAR, MELANOMA, CUTÁNEO MALIGNO,2, FUCOSILTRANSFERASA 1 , PICNODISOSTOSIS, MUCOPOLISACARIDOSIS TIPO IIIB P-GLICOPROTEINA 3, INMUNODEFICIENCIA SEVERA COMBINADA, RETINITIS PIGMENTOSA NEGATIVA DE CÉLULAS B, PROTEINA CINASA S6 RIBOSOMAL, 90 KD, POLIPETIDO 3, SÍNDROME, DEFICIENCIA DE FACTOR X-LIGADO, CONTRA DECAPENTAPLEGICO, HOMOLOGO DE DROSOPHILA, 4, FACTOR PARA COMPLEMENTO, DESHIDROGENASA/DELTA ISOMERASA, TIPO I CONDUCTIVA, CON AQP1 DE FIJACIÓN DE ESTRIBO, PROGRESIVA, FAMILIAR I NTRAHE PÁTICA, MONOFOSFATO DESAMINASA TIPO III, FACTOR 1 DE TRANSCRIPCIÓN DE CAJA HOMEOTICA La ¡nvención provee métodos para seleccionar fármacos que actúan como agentes terapéuticos para tratar enfermedades causadas por mutaciones sin sentido y de alteración de marco. Por medio de pruebas bioquímicas y pruebas in vitro que monitorean la actividad de la unión de ATP, actividad ATPasa, actividad ARN helicasa, unión de GTP, actividad GTPasa, factores de liberación, o unión de ARN al complejo, o de uno con otro (es decir, Upfl p a eRF1 y eRF3, o Upf2 a Upf3p); desarrollando pruebas capaces de cuantificar la actividad del producto del gen humano en la declinación de ARNm y supresión de traducción; se seleccionan compuestos usando las pruebas antes mencionadas. Los experimentos descritos aquí han mostrado que antagonízando/agonisando la actividad del complejo de factores, proteínas del complejo pueden superar los efectos de otra forma letales de las mutaciones sin sentido en genes esenciales, y han establecido la levadura como un sistema modelo para el desarrollo de fármacos con el cual se pueden obtener agentes o compuestos de uso humano. Una "composición de prueba", como se usa aquí, es cualquier composición tal como un gen, una secuencia de ácidos nucleicos, un polipéptido, un fragmento de péptido, o una composición creada usando una colección combinatoria u otro procedimiento combinatorio, cuya capacidad de funcionamiento en cierto alcance se puede probar, o un compuesto que imita la actividad del complejo. Un "cofactor" es cualquier composición (por ejemplo, un polipéptido, un derivado de polipéptido o peptidomimético) capaz de modular el complejo y afectar NMRD o la eficiencia de terminación de traducción. Se incluyen las composiciones que inducen naturalmente NMRD o la eficiencia de terminación de traducción vía el complejo; también se incluyen las composiciones que no inducen naturalmente NRMD (por ejemplo, composiciones artificiales y composiciones naturales que sirven para otros propósitos). El término "agonista" como se usa aquí, significa cualquier composición capaz de incrementar o estimular la eficiencia de terminación de traducción o degradación de ARNm, interaccionando o uniéndose con el complejo o los factores, tales como eRF1 o eRF3, del complejo que interacciona con la Upfl p del complejo. El término "antagonista" como se usa aquí significa cualquier composición capaz de reducir o inhibir la eficiencia de terminación de traducción o degradación de ARNm, interaccionando o uniéndose con el complejo o los factores, tales como eRF1 o eRF3, del complejo que interacciona con la Upflp del complejo. La ¡nvención también provee un método para determinar si un agente o composición de prueba modula el complejo en una célula. El método se puede realizar (i) proveyendo una célula que tenga el complejo; (¡i) poniendo en contacto ia célula con un agente o composición de prueba que, en ausencia del agente o composición de prueba, activa el complejo en la célula; y (iii) detectando un cambio en el complejo de la célula. Al practicar la ¡nvención, la célula se puede poner en contacto con el agente o composición de prueba en forma simultánea o secuencial. Un incremento en el complejo indica que el agente o composición de prueba es un agonista del complejo, mientras que un decremento en el complejo indica que el agente o composición de prueba es un antagonista del complejo. Si se desea, el método arriba descrito para identificar moduladores del compiejo, se puede usar para identificar composiciones, cofactores u otras composiciones dentro de la ruta dei complejo que comprenden el complejo para usar en este aspecto de la invención. Se puede usar cualquier agente o composición como un agente o composición de prueba al practicar la invención; un agente o composición de prueba preferido incluye polipéptidos y agentes o composiciones orgánicas pequeñas. Aunque la homología de secuencia o estructural puede proveer una base para sospechar que un agente o composición de prueba puede modular el complejo en una célula, también los agentes o composiciones de prueba elegidos aleatoriamente son adecuados para usar en la invención. Se pueden usar métodos conocidos en la técnica para generar aleatoriamente un agente o composición (por ejemplo, expresión de polipéptidos a partir de genotecas de ácidos nucleicos) para producir agentes o composiciones de prueba adecuados. Los expertos en la materia reconocerán técnicas alternativas que se pueden usar a la luz de las técnicas particulares que se describen en la presente. La invención también provee un método para detectar cofactores o inhibidores novedosos que se unen al complejo, que comprende poner en contacto una muestra que contiene el complejo con composiciones de prueba, y medir el cambio en el complejo después de la aplicación de la composición de prueba. El complejo de la presente invención es útil en un método de selección para identificar compuestos de prueba novedosos o composiciones de prueba novedosas que afecten el complejo. De esta manera, en otra modalidad, la invención provee un método para seleccionar composiciones de prueba, que comprende incubar componentes que incluyen la composición de prueba con el complejo, bajo condiciones suficientes para permitir la interacción de los componentes, después medir el efecto que tiene la composición de prueba sobre el complejo en una célula de prueba. El efecto observado sobre el complejo y una composición puede ser agonista o antagonista. Esta invención provee un método para identificar un estado patológico que involucra defectos del complejo de proteína, que comprende: (a) transfectar una célula con un ácido nucleico que codifica el complejo de proteína; (b) determinar la proporción del complejo de proteína defectuoso de la célula después de la transfección; (c) comparar ia proporción del complejo de proteína defectuoso de la célula después de la transfección, con la proporción del complejo de proteína defectuoso de la célula antes de la transfección. Se puede usar cualquier técnica de selección conocida en la técnica para seleccionar agentes que afectan la terminación de traducción o una proteína de declinación de ARNm. La presente invención contempla la selección de ligandos de molécula pequeña. El conocimiento de la secuencia primaria de una proteína de terminación de traducción o de declinación de ARNm, y la similitud de esa secuencia con proteínas de función conocida, pueden proveer una guía inicial sobre qué agentes probablemente afectarán la actividad de la proteína. La identificación y selección de tales agentes se facilita adicionalmente determinando las características estructurales de la proteína, por ejemplo, usando cristalografía de rayos X, difracción de neutrones, espectrometría de resonancia magnética nuclear, y otras técnicas para determinación de estructura. Estas técnicas proveen el diseño o identificación racional de agonistas y antagonistas. La selección se puede realizar con células recombinantes que expresan las proteínas, complejos implicados en terminación de traducción o proteína de declinación de ARNm, o alternativamente con la proteína purificada. Por ejemplo, se puede usar como una prueba de selección la capacidad de una proteína marcada para unirse a una molécula en una colección combinatoria, como se describe en las referencias anteriores. Esta invención provee un método de selección de una célula hospedera candidata, por la cantidad de complejo producido por dicha célula en comparación con una célula de control, dicho método comprende: (a) proveer una población clonal de dicha célula hospedera candidata; (b) tratar dicha población clonal de células de tal forma que las proteínas intracelulares estén accesibles a un anticuerpo; (c) poner en contacto dichas proteínas ¡ntracelulares con un anticuerpo que se une específicamente al complejo; y (d) determinar la cantidad relativa de complejo producido por dicha célula hospedera candidata. Esta invención provee un método de inhibición sustancial de la eficiencia de terminación de traducción de ARNm y/o degradación de transcritos aberrantes en una célula, dicho método comprende: (a) proveer una célula que contiene el ADN; (b) sobreexpresar dicho ADN en dicha célula para producir un polipéptido sobreexpresado que se une a Upflp e interfiere con la función de Up l p. Esta invención provee un método de inhibición sustancial de la eficiencia de terminación de traducción de ARNm y/o degradación de transcritos aberrantes en una célula, dicho método comprende: (a) proveer una célula; (b) expresar un transcrito de antisentido del complejo en caníidad suficiente para unirse al complejo. Esta ¡nvención provee un método de inhibición sustancial de terminación de traducción en una célula, dicho método comprende: mutar el complejo que comprende Upfl p, Upf2p, Upf3p, eRF1 y eRF3, de tal manera que esencialmente no se produzca complejo funcional en dicha célula. Esta ¡nvención provee un método para tratar una enfermedad asociada con la eficiencia de terminación de traducción de ARNm y/o con la degradación de transcritos aberrantes, que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene el complejo, la cual se introduce en una célula de un sujeto, y un vehículo o diluyente farmacéutico, por medio de lo cual se trata al sujeto. En una modalidad, la ¡nvención provee un método de tratamiento de un paciente que tiene, o está en riesgo de tener, una etapa temprana de enfermedad como resultado de una deficiencia genética, o un tratamiento clínico, en donde la condición tiene una etiología asociada con un defecto; el método comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una formulación o composición que modula la expresión del complejo, para mejorar el estado del paciente. "Terapéuticamente efectiva" como se usa aquí, se refiere a una cantidad de formulación que es suficiente para mejorar el estado del paciente así tratado. "Mejorar" se refiere a disminuir el efecto nocivo del estado patológico o trastorno en el paciente que recibe la terapia. El sujeto de la invención es preferiblemente un humano, sin embargo, se contempla que cualquier animal puede ser tratado en el método de la presente ¡nvención. El término "modula" significa que incrementa, inhibe, altera o modifica la expresión del complejo, ARNm, ácido nucleico, polipéptido o proteína. Esto tiene obvias implicaciones para ia dirección de fármacos, ya que uno o el otro dominio pueden servir de blanco para el desarrollo de fármacos, por ejemplo, usando las técnicas de colección combinatoria o técnicas de diseño racional de fármacos. En vista de lo anterior, se hace evidente que la presente invención provee varias rutas para afectar la terminación de traducción, que tienen importantes implicaciones para terapia antiviral y para supresión de mutaciones sin sentido patológicas. De esta manera, la presente ¡nvención provee fármacos para usar como compuestos antivirales o para alterar la declinación ribosomal. El término "fármacos" se usa aquí para referirse a compuestos o agentes, tales como un antibiótico o una proteína, que pueden afectar la función del centro de peptidil transferasa durante la iniciación, alargamiento, terminación y degradación de ARNm. Dichos compuestos pueden incrementar o disminuir el ARNm aberrante y la eficiencia de terminación de traducción.

Terapia génica y vectores transgénicos En una modalidad, se introducen in vivo en un vector viral: un ácido nucleico que codifica el complejo o factores del complejo; un antisentido o ribozima específico para el complejo, o específico para regiones de los factores de liberación y Upflp. Tales vectores incluyen un virus de ADN atenuado o defectuoso, tales como virus de herpes simple (HSV), virus de papiloma, virus de Epstein Barr (EBV), adenovirus, adenovirus asociado (AAV), y similares. Se prefieren los virus defectuosos, que carecen completamente o casi completamente de genes virales. El virus defectuoso no es infeccioso después de su introducción en una célula. El uso de vectores virales defectuosos permite la administración a las células en un área específica localizada, sin preocuparse de que el vector pueda infectar a otras células. De esta manera, el tejido adiposo puede servir de blanco específico. Los ejemplos de vectores particulares incluyen, sin limitación, un vector de virus de herpes defectuoso 1 (HSV1 ) [Kaplitt y otros, Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991 )], un vector de adenovirus atenuado, tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet y otros U. Clin. Invest. 90:626-630 (1992)], y un vector de adenovírus asociado [Samulski y otros, J. Virol. 61 :3096-3101 (1987); Samulski y otros, J. Virol. 63:3822-3828 (1989)].

En otra modalidad, el gen se puede introducir en un vector retroviral, por ejemplo, como lo describen Anderson y otros, patente de E.U.A. No. 5,399,346; Mann y otros, 1983, CeH 33:153; Temin y otros, patente de E.U.A. No. 4,650,764; Temin y otros, patente de E.U.A. No. 4,980,289; Markowitz y otros, 1988, J. Virol. 62:1120; Temin y otros, patente de E.U.A. No. 5,124,263; publicación de patente internacional No. WO 95/07358, publicada el 16 de marzo de 1995 de Dougherty y otros; y Kuo y otros, 1993, Blood 82:845. La liberación dirigida de genes se describe en la publicación de patente internacional WO 95/28494, publicada en octubre de 1995. Alternativamente, el vector se puede introducir in vivo mediante lipofección. Durante la década pasada, hubo un uso creciente de liposomas para encapsulación y transfección de ácidos nucleicos in vitro. Se pueden usar lípidos catiónicos sintéticos diseñados para limitar las dificultades y peligros encontrados con transfección mediada por liposoma, para preparar liposomas para transfección in vivo de un gen que codifica un marcador [Felgner y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417 (1987); véase Mackev y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031 (1988)]. El uso de lípidos catiónicos puede promover encapsulación de ácidos nucleicos cargados negativamente, y también promover la fusión con membranas celulares cargadas negativamente [Felgner y Ringold, Science 337:387-388 (1989)]. El uso de lipofección para introducir genes exógenos en los órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. La dirección molecular de liposomas a células específicas representa un área de beneficio. Es claro que la dirección de transfección hacia tipos celulares específicos sería particularmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular, tal como páncreas, hígado, riñon y el cerebro. Los lípidos se pueden acoplar químicamente a otras moléculas para propósitos de dirección [véase Mackey y otros, citados arriba]. Se pueden acoplar químicamente a los liposomas péptidos dirigidos, por ejemplo hormonas o neurotransmisores, y proteínas tales como anticuerpos, o moléculas no peptídicas. También es posible introducir el vector in vivo como un plásmido de ADN simple. Los vectores de ADN simple para terapia génica se pueden introducir en las células hospederas deseadas por medio de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato de calcio, usando una pistola de genes o usando un transportador de vector de ADN [véase, por ejemplo, Wu y otros, J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wu y Wu, J. Biol. Chem. 263:14621 -14624 (1988); Hartmut y otros, solicitud de patente Canadiense No. 2,012,31 1 , presentada el 15 de marzo de 1990]. En una modalidad adicional, la presente invención provee coexpresión de un producto de gen que modula la actividad en el centro de peptidil transferasa, y un gen de antisentido o ribozima terapéuticos heterólogos bajo control de la secuencia de reconocimiento específico de ADN, mediante la provisión de un vector de expresión de terapia génica que comprende un gen que codifica para un modulador de un centro de peptidil transferasa (incluyendo, sin limitación, un gen para una proteína mutante de alteración de marco o declinación de ARNm, o un ARN de antisentido o ribozima específicos para el ARNm que codifica tal proteína) con un gen para un ácido nucleico de antisentido o ribozima no relacionado bajo control de expresión coordinada. En una modalidad, se proveen estos elementos sobre vectores separados; alternativamente, estos elementos pueden proveerse en un solo vector de expresión.

Terapia antiviral En otra modalidad, la presente invención provee los medios para tratar infecciones virales, mediante la provisión de agentes que modulan la terminación de traducción y afectando así directamente la replicación viral o el ensamble de partículas virales. La presente invención provee ventajosamente fármacos y métodos para identificar fármacos para su uso en terapia antiviral (o supresión de sin sentidos) de virus que utilizan el mecanismo de alteración de marco ribosomal básico -1 , que incluye cuatro grandes familias de virus de animales y tres grandes familias de virus de plantas. Específicamente, esta ¡nvención provee pruebas para seleccionar agentes, antagonistas/agonistas, que afectan desviaciones de marco que involucran el complejo, y que involucran Upf3p. También, esta invención provee un Upf3 mutante. Por ejemplo, casi todos los retrovirus usan alteración de marco ribosimal -1 , incluyendo lentivirus (virus de inmunodeficiencia) tales como HIV- 1 y HIV-2, SIV, FlV, BIV, virus de Visna, virus de artritis-encefalitis y virus de anemia infecciosa equina; espüimavirus (los virus espumosos), tales como virus espumoso humano y otros virus espumosos de mamífero; los virus linfotróficos de células T, tales como HTLV-1 , HTLV-II, STLVs y BLV; virus de leucosis de aves tales como virus de leucemia y sarcoma de muchas aves, incluyendo aves de corral comerciales; retrovirus tipo B, incluyendo virus de tumor mamario de ratón; y retrovirus tipo D tales como virus de mono Mason-Pfizer y virus de adenocarcinoma pulmonar ovino. Además, muchos coronavirus usan la alteración de marco -1 , incluyendo coronavirus humanos como 229-E, OC43; coronavirus de animales tales como coronavirus de becerro, virus de gastroenteritis transmisible de cerdo, virus de encefalomielitis hemagiutinante de cerdo, y virus de diarrea epidémica de cerdo; coronavirus canino; virus de peritonitis infecciosa de felino y coronavirus entérica de felino; virus de bronquitis infecciosa de gallo y virus de cresta azul de pavo; virus de hepatitis de ratón; coronavirus de rata y coronavirus de conejo. Igualmente está implicado torovirus (un tipo de coronavirus), tal como torovirus humanos asociados con enfermedades entéricas y respiratorias; virus breda de terneras y virus respiratorio de bovino; virus berne de caballos; torovirus porcino; torovirus felino. Otro coronavirus es el arterivirus, que incluye virus de la fiebre hemorrágica de simio, virus de arteritis equina, virus de Lelystad (cerdo), virus VR2332 (cerdo) y virus elevador de lactato deshidrogenasa (roedores). Otros virus de animales son los paramixovirus, tales como de alteración de marco ribosomal humano -1 reportados en sarampión, y astrovirus tales como astrovirus 1 -5 humanos, y astrovirus de bovino, ovino, porcino, canino y de pato. Los virus de plantas que involucran un mecanismo de alteración de marco -1 incluyen tetravirus tales como sobemovirus (por ejemplo, virus del mosaico de frijol del sur, virus de mosaico necrótico de pata de gallo), leuteovirus (por ejemplo, virus enano amarillo de cebada, virus de remolacha amarilla del oeste y virus de rollo de hoja de papa), enamovirus (por ejemplo, virus de mosaico de chícharo) y umbravirus (por ejemplo virus de moteado de zanahoria); tombusvirus tales como tombusvirus (por ejemplo virus de arbusto achaparrado de tomate), carmovirus (por ejemplo virus de moteado de clavel), necrovirus (por ejemplo virus de necrosis de tabaco); diantovirus (por ejemplo, virus de mosaico necrótico de trébol rojo), y machiomovirus (por ejemplo, virus de moteado clorótico de maíz). Además, los totivirus tales como virus L-A y L-BC (levadura) y otros virus de hongos, virus de Giardia lamblia (parásito intestinal), virus de Triconella vaginell (parásito humano), virus de Leishmania brasilliensis (parásito humano) y otros virus de protozoarios, son virus de alteración de marco -1. De acuerdo con la ¡nvención, el componente o componentes de una composición terapéutica de la ¡nvención, se pueden introducir o administrar de forma parenteral, paracanceral, transmucosal, transdérmica, intramuscular, intravenosa, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular o intracraneal.

Los modos de suministro incluyen, sin limitación, ADN simple, proteína, péptido, o dentro de un vector viral, o dentro de un liposoma. En una modalidad, el vector viral es un retrovirus, adenovirus o adenovirus asociado. Como puede apreciar fácilmente una persona con conocimientos medios en la materia, las composiciones y métodos de la presente ¡nvención son particularmente adecuados para el tratamiento de cualquier animal, particularmente un mamífero y más específicamente un humano. Si embargo, de ninguna manera está limitado a animales domésticos como sujetos felinos o caninos, animales de granja como sujetos bovinos, equinos, caprinos, ovinos y porcinos, animales salvajes (en estado silvestre o en parque zoológico), animales de investigación tales como ratones, ratas, conejos, cabras, ovejas, cerdos, perros, gatos, etc., para uso médico veterinario. Como se usa aquí, "composición farmacéutica" significa cantidades terapéuticamente efectivas del complejo con los diluyentes, conservadores, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o vehículos adecuados útiles en terapia SCF. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" como se usa aquí, se refiere a una cantidad que provee un efecto terapéutico para una condición y régimen de administración dados. Dichas composiciones son líquidos o formulaciones liofilizadas o secadas de otra manera, e incluyen diluyentes de diferente contenido de amortiguadores (por ejemplo Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para impedir absorción en superficies, detergentes (por ejemplo Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos biliares), agentes solubilizantes (por ejemplo glicerol, polietilenglicerol), antioxidantes (por ejemplo ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservadores (por ejemplo Thimerosal, alcohol bencílico, parabenos), sustancias de relleno o modificadores de tonicidad (por ejemplo lactosa, manitol), unión covalente de polímeros como polietilenglicol para la proteína, de formación de complejo con iones de metal, o incorporación de material en o sobre preparaciones particuladas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc., o sobre liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilaminares o multilaminares, espíritus de eritrocitos, o esferoplastos. Dichas composiciones afectarán el estado físico, la solubilidad, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de eliminación in vivo de SCF. La elección de las composiciones dependerá de las propiedades físicas y químicas de la proteína que tiene la actividad SCF. Por ejemplo, un producto derivado de una forma unida a membrana de SCF, puede requerir una formulación que contenga detergente. Las composiciones de liberación controlada o sostenida incluyen formulación en depósitos lipófilos (por ejemplo ácidos grasos, ceras, aceites). La invención también abarca composiciones particuladas recubiertas con polímeros (por ejemplo poloxámeros o poloxaminas) y SCF acoplados con antibióticos dirigidos contra receptores específicos de tejido, ligandos o antígenos, o acoplados a ligandos de receptores específicos de tejido. Otras modalidades de las composiciones de la invención incorporan formas particuladas con recubiertas protectoras, inhibidores de proteasa o mejoradores de penetración para varias vías de administración, incluyendo parenteral, pulmonar, nasal y oral. Además, como se usa aquí, el "vehículo farmacéuticamente aceptable" es bien conocido para el experto en la materia e incluye, sin limitación, solución amortiguadora de fosfato 0.01 -0.1 M, preferiblemente 0.05M o solución salina al 0.8%. Adicionalmente, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones. Los ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales como aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo medios salinos y amortiguados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer lactosada o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen proveedores de fluido y nutrientes, proveedores de electrolitos tales como los que se basan en dextrosa de Ringer, y similares. También pueden estar presentes conservadores y otros aditivos tales como por ejemplo antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. La frase "cantidad terapéuticamente efectiva" se usa aquí para referirse a una cantidad suficiente para reducir por lo menos en aproximadamente 15 por ciento, preferiblemente por lo menos 50 por ciento, de preferencia por lo menos 90 por ciento, un déficit clínicamente significativo de la actividad, función y respuesta del hospedero, y es muy preferido aún impedirlo. Alternativamente, una cantidad terapéuticamente efectiva es suficiente para ocasionar el mejoramiento de una condición clínicamente significativa en el hospedero. Como será apreciado por el experto en la materia, la cantidad del compuesto puede variar dependiendo de su actividad específica, y las cantidades adecuadas de dosificación pueden variar aproximadamente de 0.1 a 20, preferiblemente de alrededor de 0.5 a alrededor de 10, y de preferencia de uno a varios miligramos de ingrediente activo por kilogramo de peso corporal del individuo por día, y depende de la vía de administración. En una modalidad, la cantidad está en la escala de 10 picogramos por kg a 20 miligramos por kg. En otra modalidad, la cantidad es de 10 picogramos por kg a 2 miligramos por kg. En otra modalidad, la cantidad es 2-80 microgramos por kilogramo. En otra modalidad, la cantidad es de 5-20 microgramos por kg. El término "dosis unitaria" cuando se usa con referencia a una composición terapéutica de la presente invención, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como una dosificación unitaria para los humanos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el diluyente requerido, es decir, el excipiente o vehículo. En otra modalidad, el compuesto terapéutico se puede administrar en un sistema de liberación controlada. Por ejemplo, el complejo se puede administrar usando infusión intravenosa, una bomba osmótica implantable, un parche transdérmico, liposomas, u otros modos de administración. En una modalidad, se puede usar una bomba (véase Langer, citado arriba; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Enq. 14:201 (1987); Buchwald y otros, Surgen 88:507 (1980); Saudek y otros, N. Enql. J. Med. 321 :574 (1989)). En otra modalidad, se pueden usar materiales poliméricos (véase "Medical Applications of Controlled Reléase" -Aplicaciones médicas de la liberación controlada-, Langer & Wise (eds.), CRC Press, Boca Ratón, Florida (1974); "Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance" -Biodisponibilidad controlada de fármacos; diseño y acción de productos farmacéuticos-, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger y Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); ver también a Levy y otros, Science 228:190 (1985); During y otros, Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard y otros, J. Neurosurq. 71 :105 (1989)). En otra modalidad, se puede colocar un sistema de liberación controlada en la cercanía del blanco terapéutico, esto es, el cerebro, requiriéndose así solo una fracción de ia dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en "Medical Applications of Controlled Reléase", citado arriba, vol. 2, páginas 115-138 (1984)). Preferiblemente, se introduce un dispositivo de liberación controlada en un sujeto en la proximidad del sitio de la activación inmune inapropiada o de un tumor. Se describen otros sistemas de liberación controlada en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)). Como puede ser apreciado fácilmente por una persona con conocimientos medios en la materia, los métodos y las composiciones farmacéuticas de la presente invención son particularmente adecuados para su administración a cualquier animal, particularmente un mamífero, que incluye, sin limitación, animales domésticos tales como sujetos felinos o caninos, animales de granja tales como por ejemplo, sin limitación, sujetos bovinos, equinos, caprinos, ovinos y porcinos, animales salvajes (en zona silvestre o en un parque zoológico), animales de investigación tales como ratones, ratas, conejos, cabras, ovejas, cerdos, perros, gatos, etc., para uso médico veterinario. La presente invención será mejor entendida con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos, que se proveen como ejemplares de la invención.

SECCIÓN EXPERIMENTAL EJEMPLO 1 Incremento de terminación de traducción y degradación de ARNm's aberrantes La ruta de declinación de ARNm mediada por sin sentidos es un ejemplo de una ruta de vigilancia conservada evolutivamente que libera a la célula de transcritos que contienen mutaciones sin sentido. El producto del gen UPF1 es un componente necesario del complejo de vigilancia putativo que reconoce y degrada ARNm's aberrantes. Los resultados presentados aquí demuestran que las formas de levadura y humanas de la Upfl p interaccionan con los factores eucarióticos de terminación de traducción eRF1 y eRF3. Consistentemente con la interacción de Upfl p y los eRFs, la Upfl p se encuentra en los agregados semejantes a prion que contienen eRF1 y eRF3 observados en cepas de levadura [Pßr1 . Estos resultados indican que la interacción de Upfl p con los factores de liberación de peptidilo, es un evento clave en el ensamble del complejo de vigilancia putativo que incrementa los monitores de terminación de traducción si la terminación ha ocurrido prematuramente, y promueve la degradación de transcritos aberrantes.

MATERIALES Y MÉTODOS Métodos generales de levadura: Se preparó medio de levadura como se describió previamente (Rose y otros, 1990). Se realizaron transformaciones de levadura por el método de acetato de litio (Scheistl y Geitz, 1989). El aislamiento de ARN, el blotting y la hibridación fueron como se describió previamente (Weng y otros, 1996a, Hagan y otros, 1995).

Plásmidos: Se crearon plásmidos YCp y YEp RENTCHI4-2 ligando un fragmento SStl-Asp718 de 4.5 kb de pMET25CHIMERA (Perlick y otros, 1996) alojando el gen quimérico bajo el promotor MET25, en YCplac22 y YEplad 12 (Ferguson y otros, 1981 ), respectivamente. Se describió previamente a YCpFLAGUPFI y YEpFLAGUPFI (Weng y otros, 1996a). Los plásmidos de fusión GST-RF, pGEX2T, pGEX2T-SUP35 y pGEX2T-SUP45, se describieron previamente (Paushkin y otros, 1997b).

Preparación de complejos de fusión glutatión-Sepharose-RF: Se desarrolló la cepa BL21 (DE3)pLysS transformada con pGEX2T, pGEX2T-SUP35 o pGEX2T-SUP45 (Paushkin y otros, 1997b) a 24°C en LB con 50 µg/ml de ampicilina y 30 µg/ml de cloranfenicol hasta DO6oo = 0.6. Se agregó IPTG 0.3 mM, y las células se desarrollaron durante la noche. Las células se recogieron y se lavaron una vez con TBST frío (Tris 50 mM pH7.4, NaCI 150 mM, TritonX-100 0.1 %) con PMSF 0.5 mM. Las células se resuspendieron en 50 µl de TBST con PMSF 0.5mM por ml de cultivo, y se usaron por sonicación. Se agregó TritonX-100 hasta una concentración final de 1 %, y los usados se mezclaron 20 minutos a 4°C. Se removieron los restos celulares por centrifugación a 30,000xg durante 30 minutos. Se agregaron 80 µl de una suspensión de glutatión-sepharose (Pharmacia) equilibrada en TBST, por ml de extracto, y se incubó a 4°C con agitación durante 30 minutos. Se recolectaron los glóbulos de sepharose a 500xg durante 3 minutos, se lavó por 3 minutos con TBST suplementado con NaCI hasta 500 mM, y se recolectó como antes para un total de 2 veces. Los complejos de sepharose-proteína se lavaron entonces y se recolectaron como antes con IBTB (TRis-HCI 25 mM pH 7.5, KCl 50 mM, MgCI2 10 mM, glicerol 2%, TritonX-100 0.1 %, BSA 100 µg/ml) para un total de 2 veces, y se resuspendió en IBTB para producir una relación 2:1 de amortiguador a volumen de glóbulo empaquetado. Un µl de los complejos GST-RF contenía típicamente 0.9 µg de GST-eRF1 o 1.5 µg GST-eRF3, mientras que los complejos de GST contenían típicamente 4.5 µg de GST por µl de resina.

Preparación de extractos citoplásmicos: Se desarrollaron células BJ3505 (MAT pep4::HIS3prb-?l.6R HIS3 lys2-208 trp1-? 10ura3-52gal2can1) hasta una DO60o = 1 -0, y se lavaron en 5 ml de amortiguador IB frío (IBTB sin BSA) con PMSF 0.5mM. Las células se volvieron a hacer pella y se suspendieron en 1.3 ml de IB frío con PMSF 0.5 mM e inhibidores de proteasa (Pl, 1 µg/ml de Leupeptina, Aprotinina y pepstatina A) por gramo de peso de célula. Se agregó un volumen aproximadamente igual de glóbulos de vidrio y se efectuó lisis mediante agitación con vórtice 6 veces por 20 segundos, enfriando 1 minuto sobre hielo entre cada vórtice. Se removió el Usado y los glóbulos se lavaron 2 veces con un volumen igual de IB con PMSF 0.5 mM y 1 µg/ml de Leupeptina, Aprotinina y pepstatina A. Se combinaron los lavados con el lisado y los restos celulares se removieron por centrifugación a 30,000xg durante 20 min.

Preparación de cepas [PSXjupfl? : Se suprimió UPF1 de la cepa 7G-H66 [PSI*] (MATa ade2-1 SUQ5 trp1-289 Ieu2-3, 112 ura3-52[PSI \) como se describió (Cui y otros, 1995). La supresión se confirmó mediante análisis Southern blot. Para curar el determinante [PS/4], se desarrolló 7G-H66 up ? en medio conteniendo GuHCI 3 mM (Ter-Avanesyan y otros, 1994). El rompimiento de UPF1 originó la supresión de ade2-1, que se usó para monitorear el fenotipo supresor de [PSI*], por lo tanto se identificó el estatus ¡psí] de clonas obtenidas después de desarrollo sobre medio GuHCI, en cruzas con la cepa probadora 1A-H19 ¡psr] (MATcc ade2-1 Iys2-1 his3-11, 15 Ieu2-3.112 SUQ5 [psfj) (Ter-Avanesyan y otros, 1994). El fenotipo supresor del alelo upfl? es un rasgo recesivo, mientras que el determinante [PSI*] es dominante. Por lo tanto, el fenotipo no supresor de los diploides indicó el estado \psP¡ de las clonas. Después, los aislados [PSI*] y [ps?] de la cepa 7G-H66 upfl? se transformaron con el plásmido de base centromérica YCplac22FLAGUPF1 (Weng y otros, 1996a, Weng y otros, 1996b).

Preparación de usados para cocentrifuqación de agregado fPSI+1: Se desarrollaron células 7G-H66 upfl? transformadas con YCplac22 o YCpFLAGUPFI en medio carente de triptofano hasta DO6oo = 1 -5, se lavaron con agua y se usaron mezclando con glóbulos de vidrio en solución amortiguadora A (Tris-HCl 25 mM pH7.5, KCl 50 mM, MgCI2 10 mM, EDTA 1 mM, glicerol 2%) conteniendo PMSF 1 mM y Pl (2 µg/ml de aprotinina, 1 µg/ml pepstatina A, 0.5 µg/ml leupeptina, 2.5 µg/ml antipaina, 0.5 µg/ml TLCK, 0.5 µg/ml TPCK, 0.1 mM benzamidina, y 0.1 mM de metabisulfito de sodio). Los usados se centrifugaron a 15,000xg por 20 minutos, después se trataron con ARNasa (400 µg/ml) para romper los polirribosomas. Después los extractos se sometieron a centrifugación a través de una almohadilla de sacarosa como se describió previamente (Paushkin y otros, 1997b). Los ribosomas migran principalmente a la fracción de sacarosa, y como eRF1 , eRF3 y Upfl p están asociados al ribosoma, todos ellos están presentes en esta fracción en extractos [psi~].

Preparación de proteínas de fusión GST-RF purificadas: Se prepararon extractos de cultivos de 400 ml de la cepa BL21 (DE3)pLysS transformado con pGEX2T, pGEX2T-SUP35 o pGEX2T-SUP45 como se describió arriba para la preparación de complejos de fusión GST-RF. Se agregaron 800 µl de una suspensión al 50% de glutatión-Sepharose y se incubaron mezclando 30 minutos. Se recolectaron los glóbulos de sacarosa y se lavaron 2 veces durante 3 minutos con TBST suplementado con NaCi hasta 500 mM, y se recolectaron por centrifugación a 500xg por 3 minutos. Después, se lavaron los glóbulos de sepharose en TBST y se recogieron para un total de 2 veces. Las proteínas de fusión de GST se eluyeron resuspendiendo los glóbulos de sepharose lavados en amortiguador de elución de glutatión 400 µl (Tris-HCl 10 mM pH8.0, glutatión 1 mM) e incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación. Se recolectaron los glóbulos de sepharose y se removió el sobrenadante. Se repitió la elución como antes para un total de 3 veces, y se combinaron las fracciones de elución. Se determinó la concentración de proteínas mediante la prueba de Bradford.

Inmunodetección de Upfl . eRF1 v eRF3: Se detectó Upfl usando el anticuerpo monoclonal de ratón M2 contra el epítope FLAG como se describió previamente (Czaplinski y otros, 1995, Weng y otros, 1996a,b). Se detectó eRF3 como lo describen Didichenko y otros, 1991. Se detectó eRF1 como lo describen Stansfield y otros, 1992.

Pruebas de ATPasa: Se determinó actividad ATPasa dependiente de ARN de Upfl p usando 20 ng de Upflp en presencia de proteínas de fusión GST-RF por medio de una prueba de carbón como se describió previamente (Czaplinski y otros, 1995), usando 1 µg/ml de ARN poli(U) con BSA 100 µg/ml. Los resultados se grafican como pmoles de 32P liberado contra la concentración de la proteína indicada.

Prueba de unión de ARN: Por medio de transcripción de SP6 de pGEM5Zf(+) digerido con Sstl, se sintetizó un ARN de 32 nt marcado uniformemente como se describió previamente (Czaplinski y otros, 1995). El amortiguador de unión de ARN fue como el que se describió previamente (Czaplinski y otros, 1995), con la excepción de que se incluyeron en todas las reacciones 100 µg/ml de BSA. Las cantidades indicadas de GST-eRF3 (28) se incubaron con 200 ng de Upfl p durante 15 minutos a 4°C. Se agregaron 50 fmoles del substrato de ARN y se incubó durante 5 minutos. Se agregó solución de detención, y las reacciones se sometieron a electroforesis en un gel de PAGE natural 4.5% (O.dxTBE, acrilamida:bisacrilamida 30:0.5, con glicerol 5%).

RESULTADOS La Upfl interacciona con los factores de liberación de peptidilo eRF1 v eRF3: La Upfl p modula la terminación de traducción ¡nteraccionando con los factores de liberación de peptidilo eRF1 y eRF3. Los eRF1 y eRF3 fueron expresados individualmente en E. coli como proteínas de fusión de glutation-S-transferasa (GST) y se purificaron usando glóbulos de glutatión-sepharose. Las proteínas de fusión GST-RF (factor de liberación) purificadas asociadas con los glóbulos de glutatión-sepharose, se agregaron a un extracto citopiásmico de levadura conteniendo una Upflp marcada con epítope FLAG Czaplinski y otros, 1995, Weng y otros, 1996a, b). Después de incubación, las GST-RFs y proteínas asociadas se purificaron por cromatografía de afinidad y se sometieron a SDS-PAGE. Se realizó inmunoblotting y se probó la presencia de la Upfl p usando un anticuerpo contra el epítope FLAG. El anticuerpo anti-FLAG reconoció solamente la Upfl p de 109 kD en extractos citoplásmicos de células transformadas con plásmido que expresa la FLAG- Upflp (figura 1A, comparar carril 2 con el carril 1 ). Este análisis también demostró que la Upflp se purificó asociadamente de manera específica con eRF1 (figura 1A, carril 5) o eRF3 (figura 1A, carril 4). La Upfl p no se purificó asociadamente con proteína GST que rio estaba fusionada a otra proteína (figura 1A, carril 3), ni a una proteína GST-JIP en la cual se usó una proteína interaccionante Jak2 fusionada a GST para monitorear la especificidad de la reacción. También se monitoreó la interacción de Upfl p purificada con eRF1 o eRF3. Se ha descrito previamente la purificación para Upfl p marcada con epítope (FLAG-Upfl p) (Czaplinski y otros, 1995). La FLAG-Upfl p purificada se incubó con las proteínas de fusión GST-RF en presencia de concentraciones crecientes de sal, y se monitorearon las interacciones de estas proteínas según se describió arriba. Los resultados demostraron que la FLAG-Upflp purificada ¡nteraccionó ya sea con eRF1 o con eRF3 (figura 1 B, carriles 8-12, eRF1 , y carriles 3-7, eRF3). El complejo Upfl p-eRF3 fue menos sensible a concentraciones crecientes de sal que el complejo Upf1-eRF1 (figura 1 B). Las interacciones fueron específicas, ya que la Upfl p purificada no interacciona con la proteína GST (figura 1 B, carril 2), ni con GST-JIP. Se mostró que la interacción de Upfl p con eRF1 o eRF3 es dependiente de la dosis.

La Upflp está asociada con los agregados de eRF3 en cepas fPS/ : Los resultados bioquímicos demostraron que la Upfl p puede incrementar la terminación de traducción en un codón sin sentido interaccionando con los factores de liberación de peptidilo e incrementando su actividad. Resultados recientes han mostrado que el fenotipo supresor de sin sentidos observado en las cepas que llevan el determinante citoplásmicamente heredado [PS/*], es una consecuencia de un estado conformacional alternativo específico de proteína del eRF3 de levadura (Sup35p). En un estado [PSI*], eRF3 forma agregados de alto peso molecular, o una fibra semejante a amiloide que inhiben la actividad de eRF3, conduciendo a mayor lectura completa de ios codones de terminación de traducción por parte de los ribosomas (Wickner, 1994; Paushkin y otros, 1997a, Patino y otros, 1996; Glover y otros, 1997). También se sugirió que esta conformación alternativa específica de eRF3 es capaz de autopropagación por medio de un mecanismo autocatalítico, análogo a la de los priones de mamífero (Paushkin y otros, 1997a, Glover y otros, 1997, Wickner, 1994). Así, el estado conformacional alternativo de proteína de eRF3, y no una mutación en el gen SUP35, permite la autopropagación del fenotipo [PSI*]. El eRF1 de levadura (Sup45p) interacciona con eRF3, y también se encontró en los agregados presentes en células [PSI*] (Paushkin y otros, 1997b).

Se razonó que debido a la interacción de Upfl p con eRF1 y eRF3, la Upfl p puede estar asociada con los agregados de eRF3 en células [PSI*]. Para probar esta posibilidad, se monitoreó la presencia de la Upfl p en los agregados de eRF3 y eRF1 encontrados en células [PSI*]. Resultados previos demostraron que los agregados eRF1/eRF3 sedimentan a través de una almohadilla de sacarosa en extractos preparados de células [PSI*]. Se prepararon extractos citoplásmicos de células isogénicas [PSf] y ¡ps?] y se centrifugaron a través de una almohadilla de sacarosa, y se monitoreó la presencia de Upfl p, eRF1 y eRF3 en diferentes fracciones mediante análisis de Western blotting. Los resultados demostraron que Upfl p, eRF1 y eRF3 estaban presentes en la fracción de pella en extractos de células [PSI*], pero no se encontraron en la fracción de pella en un extracto ¡psr\ (figura 2, comparar los carriles 3 y 6). Este resultado aporta evidencia de que Upfl p interacciona con los factores de terminación de traducción en células de levadura. eRF3 y ARN compiten por la interacción con Upfl p: Se prepararon mezclas de reacción conteniendo FLAG-Upfl p purificada y GST-eRF1 o GST-eRF3 purificados y conteniendo GTP o ARN poli(U). Después de incubación, los complejos de fusión sepharose-GST-RF se lavaron con el mismo amortiguador conteniendo GTP o ARN poli(U). Las proteínas ligadas remanentes se sometieron a SDS-PAGE seguido por inmunoblotting usando anticuerpo contra el epítope FLAG. Los resultados demostraron que la interacción entre Upflp y eRF3 no fue afectada por GTP (figura 3A, comparar los carriles 3 y 4). Un experimento similar mostró que ATP no afecta la interacción entre eRF3 y Upflp (figura 3A, comparar los carriles 3 y 5). Aunque el ARN poli(U) no afecta la interacción Upf1 p-eRF1 (figura 3B), la interacción Upf1 p-eRF3 fue reducida dramáticamente en las reacciones que contenían ARN poli(U) (figura 3A, comparar los carriles 3 y 6). Los resultados descritos arriba indican que ARN y eRF3 compiten por la unión a Upfl p. Se monitoreó el efecto de eRF3 sobre ia capacidad de Upfl p a formar complejo con ARN. Se prepararon mezclas de reacción conteniendo Upflp y ARN, con o sin concentraciones crecientes de eRF3, y se monitoreó la formación del complejo Upf1p:ARN por medio de una prueba de desplazamiento de gel de ARN (Czaplinski y otros, 1995, Weng y otros, 1996a,b, Weng y otros, 1998). Aunque se formaron complejos Upfl p-ARN en ausencia de eRF3 (figura 3C, carril 2), las concentraciones crecientes de eRF3 en las mezclas de reacción redujeron la cantidad del complejo Upflp-ARN formado (figura 3C, carriles 4-8). La inhibición fue específica para eRF3, ya que la proteína GST no tuvo efecto sobre la formación del complejo Upfl p-ARN (figura 3C, carril 9). Los complejos eRF3-ARN no se formaron (figura 3C, carril 3), indicando que los complejos observados se debían a la unión de la Upfl p. Tomados juntos, estos resultados sugieren que ARN y eRF3 se unen competitivamente a Upfl p. Además, se incubó Flag-Upfl p purificada, con ARN poli(U), en presencia o ausencia de ATP. Después de la incubación, se agregó GST- eRF3 a las mezclas de reacción, y se monitoreó la interacción Upf1-eRF3 mediante análisis de inmunoblotting, como arriba. Los resultados demostraron que cuando estaba presente en la mezcla de reacción tanto poli(U) como ATP, la Upfl p interaccionó con eRF3 con la misma afinidad que en reacciones carentes de ARN poli(U) (figura 4A, carriles 6, 8 y 10). Experimentos de control demostraron que el ATP no impidió la asociación de Upfl p con eRF3 (figura 4A, carril 4), y ARN poli(U) inhibió completamente la interacción (figura 4A, carriles 5, 7 y 9). Estos resultados son consistentes con la noción de que la unión de ATP a Upfl p incrementa funcionalmente la interacción de Upfl con eRF3, impidiendo la unión de ARNs competidores.

La forma K436A de la Upfl p demuestra interacciones alteradas con los factores de liberación de terminación de traducción: Después se determinó si una mutación en el gen UPF1, que inactivo sus actividades de renovación de ARNm y terminación de traducción, afectó la capacidad de la Upfl p para interaccionar con los factores de liberación de terminación de traducción. Resultados previos habían mostrado que cepas que alojan mutaciones en el residuo de lisina conservado en la posición 436 de la Upfl p (K436) dan como resultado la estabilización de ARNm's que contienen sin sentidos y un fenotipo de supresión de sin sentidos (Weng y otros, 1996a). Usando una forma purificada de K436A de la Upfl p (Weng y otros, 1996a, 1998), se cuestionó si esta mutación afecta la capacidad de la Upfl p para interaccionar con el eRF1. Se prepararon mezclas de reacción conteniendo la forma K436A de Upfl p, GST-eRF1 y varias concentraciones de KCl, y se monitoreó su interacción como se describió arriba. Los resultados demostraron que la mutación de K436A redujo dramáticamente la interacción de Upf1 ?436A con eRF1 , por lo menos 4 a 6 veces con respecto a la interacción de Upfl de tipo silvestre con eRF1 (figura 4B, comparar los carriles 3 y4 con los carriles 7 y 8). Se monitoreó la capacidad de la Upfl p K436A para interaccionar con eRF3. Se preparó una mezcla de reacción conteniendo la Upfl p K436A y GST-eRF3 y se monitoreó la interacción Upf1 p-eRF3 como se describió arriba. El resultado demostró que la forma mutante de Upfl p fue capaz de ¡nteraccionar con eRF3, con una afinidad equivalente a la Upfl p de tipo silvestre (figura 4C, carril 3). La mutación K436A afectó ia capacidad de la Upfl p para interaccionar preferentemente con eRF3 contra ARN cuando está presente ATP en la mezcla de reacción. Se ha mostrado que la mutación K436A reduce la afinidad de la Upfl p por ATP (Weng y otros, 1996a, 1998). Sin embargo, aunque la forma K436A de la Upfl p es aún capaz de unirse a ARN, a diferencia de la Upfl p de tipo silvestre, el ATP es incapaz de disociar el complejo ARN:Upf1 pK436A (Weng y otros, 1996a, 1998). Por lo tanto, se monitoreó la capacidad de la Upf1 p?436A para ¡nteraccionar con eRF3 en presencia de ATP y ARN. Se prepararon mezclas de reacción conteniendo la Upfl p mutante y, ya sea ATP o ARN poli(U), o ATP y ARN poli(U), y se monitoreó la interacción de la Upfl p con eRF3 como se describió arriba. Los resultados demostraron que, de manera análoga a la Upflp de tipo silvestre, el ARN poli(U) impidió la interacción de Upf1 p«436A con eRF3 (figura 4C, carril 4). Sin embargo, a diferencia de la Upfl p de tipo silvestre, el ATP fue incapaz de restaurar la interacción de Upf1 p?436A con eRF3 en presencia de ARN poli(U) (figura 4C, carril 5). Este resultado indica que la Upf1 p 436A no favorecerá el complejo Upf1 p-eRF3 sobre el complejo Upfl p-ARN cuando está presente ATP en la reacción. Tomados juntos, estos resultados sugieren que las cepas que alojan el alelo K436A up , que ya no degrada ARNm's aberrantes y exhibe un fenotipo de supresión de sin sentidos, demuestran interacciones alteradas con los factores de liberación de terminación de traducción. Las interacciones alteradas Upf1 p«436A:eRF observadas en las reacciones in vitro se correlacionan bien con la declinación in vivo de ARNm y los fenotipos de supresión de sin sentidos de este alelo mutante upfl .

ERF1 y eRF3 inhiben la actividad ATPasa de Upfl p: Los datos genéticos y bioquímicos indicaron que no se requería la actividad ATPasa/helicasa para incrementar la terminación de traducción, pero era necesaria para degradar transcritos que contienen sin sentidos (Weng y otros, 1996a, b; Weng y otros, 1997). En base a estos resultados, se predijo que la interacción de la Upfl p con los eRFs inhibe su actividad ATPasa/helicasa, permitiendo así a la Upfl p incrementar la terminación de traducción. Por lo tanto, se examinó si la interacción de Upfl p con eRF1 o eRF3 afectaría la actividad ATPasa ARN dependiente de Upfl p. Se prepararon mezclas de reacción conteniendo ?32P-ATP radiomarcado y 1) Upflp, 2) Upflp y ARN, 3) Upflp, ARN y GST, 4) Upfl p, ARN y GST-eRF1 o 5) Upfl p, ARN y GST-eRF3. Se monitoreó la actividad ATPasa en estas reacciones usando una prueba de carbón como se describió previamente (Czaplinski y otros, 1995, Weng y otros, 1996a, Weng y otros, 1996b). Los resultados demostraron que las reacciones que contenían solo Upflp no tenían actividad ATPasa detectable, mientras que las reacciones que contenían Upflp y ARN poli(U) demostraron actividad ATPasa máxima. La adición de eRF1 o eRF3 inhibió la actividad ATPasa dependiente de ARN de la Upflp de una manera dependiente de la dosis (figura 5, GST-eRF1 y GST-eRF3). La adición de la proteína GST a las mezclas de reacción no tuvo efecto sobre la actividad ATPasa dependiente de ARN de la Upflp (figura 5, GST). Ni eRF1 ni eRF3 mostraron alguna actividad ATPasa intrínseca ni estimularon la actividad ATPasa de Upfl p en reacciones carentes de ARN. La inhibición de la actividad de ATPasa de Upflp por parte de eRF1, no fue simplemente una consecuencia de la inhibición de su actividad de unión de ARN, puesto que eRF1 no inhibe esta función de Upflp. Tomados juntos, estos resultados demuestran que la actividad ATPasa de la Upfl p puede ser modulada por su interacción con factores de terminación de traducción.

El alelo UPF1 de levadura/humano funciona para modular la terminación de traducción: Se determinó si el homólogo humano de Upfl p de levadura, denominado rentl o hupfl , también modulaba la terminación de traducción y la renovación de ARNm, sugiriendo una función conservada para esta proteína a lo largo de la evolución. Se monitoreó rentl /hupfl en células de levadura (Perlick y otros, 1996). Por lo tanto, se cuestionó si la expresión de un gen híbrido UPF1 de levadura/humano impediría la supresión de sin sentidos en una cepa upfí? y promovería declinación de transcritos aberrantes. Aunque los extremos terminales amino y carboxilo de la Upfl p humana y de levadura son divergentes, el rentl /hupfl contiene la región rica en cisteína/histidina y los motivos helicasa encontrados en el gen UPF1 de levadura, y exhibe 60% de identidad y 90% se similitud sobre esta región (Perlick y otros, 1996, Applequist y otros, 1997). La construcción híbrida usada en estos experimentos consistió de los dominios conservados de la proteína humana emparedada entre los extremos N y C del gen UPF1 de levadura (Perlick y otros, 1996). Se mostró previamente que este gen híbrido complementa una cepa upfl? en una prueba de alosupresión de alteración de marco (Perlick y otros, 1996). Se cuestionó inicialmente si la expresión del gen híbrido funcionaría para impedir la supresión de sin sentidos. Para probar esta posibilidad, se transformó una cepa upfl? que alojaba alelos sin sentido leu2-2 y tyr7-1, con plásmidos que alojaban: el vector solo, 2) el gen UPF1 de levadura tipo silvestre, o 3) el gen híbrido de levadura/humano de un promotor MET25 insertado en un centrómero (YCpRENT1 CHI4-2) o un plásmido de alta copia (YEpRENT1 CHI4-2). Se omitió metionina del medio para aumentar la expresión del gen híbrido (Perlick y otros, 1996). Se monitoreó la supresión de los alelos sin sentido leu2-2 y tyr7-1 plaqueando las células sobre medio -trp -met -leu -tyr. Como un control, estas células se plaquearon sobre medio -trp -met. Los resultados demostraron que las células upfl? que alojaban el vector crecieron en ambos tipos de medios (figura 6A), indicando supresión de estos alelos sin sentido. Las células que alojaban el gen UPF1 de levadura fueron incapaces de crecer sobre medio -trp -met -leu -tyr, demostrando que la presencia del gen UPF1 de levadura impidió la supresión de estos alelos sin sentido (figura 6A). De igual manera, la expresión del gen UPFD1 híbrido de levadura/humano, impidió el crecimiento de estas células sobre medio -trp -met -leu -tyr, demostrando la capacidad de esta proteína para sustituir la Upfl p de levadura para impedir la supresión de los alelos leu2-2 y tyr7-1 (figura 6A). El gen híbrido funcionó mejor cuando se expresó de un plásmido de copia múltiple (figura 6A). La expresión de la proteína quimérica no tuvo efecto sobre el crecimiento normal de ia célula, ya que las células que alojaban estos plásmidos crecieron tan bien como el tipo silvestre sobre el medio -trp -met (figura 6A). El gen UPF1 de levadura/humano promueve declinación de transcritos que contienen sin sentidos en células de levadura. Para probar esto, se determinó la abundancia de los transcritos que contenían los sin sentidos tyr7-1 y leu2-2 en una cepa upfl? que alojaba el plásmido vector, el gen UPF1 de levadura o el alelo UPF1 híbrido humano/de levadura en un plásmido de alta copia. Se aislaron ARNs totales de estas células y se analizaron las abundancias de los transcritos tyr7 y Ieu2 mediante análisis blotting de ARN, sondeando los blots con sondas de ADN radiomarcado que codificaban los genes TYR7 y LEU2 (Weng y otros, 1996a, Weng y otros, 1996b). Los resultados demostraron que los ARNm's de leu2-2 y tyr7-1 estuvieron bajos en abundancia en una célula UPF1+, pero abundantes en una cepa upñ? y una up ? que contenía el alelo híbrido de levadura/humano (figura 6B). De igual manera, el precursor CYH2, que es un substrato endógeno para NMD (He y otros, 1993), fue abundante en las células que expresan el alelo híbrido de levadura/humano, mientras que los niveles de ARNm de CYH2 fueron similares en las 3 cepas (figura 6B). Tomados juntos, estos resultados indican que el producto del gen híbrido UPF1 de levadura/humano, funciona en la terminación de traducción, pero no activa la ruta NMD en células de levadura.

La Upfl p humana interacciona con los factores de liberación de peptidilo eRF1 y eRF3: Los resultados descritos arriba demuestran que el homólogo humano del gen UPF1 puede funcionar también para modular la actividad de terminación de traducción de los factores de liberación de peptidilo. Por lo tanto, se cuestionó si el rentl /hupfl de longitud completa interaccionaría con eRF1 y eRF3. Para probar esta posibilidad, se sintetizó proteína rent1/hupf1 radiomarcada en un sistema de transcripción/traducción acoplado in vitro. La síntesis in vitro del rent1/hupf1 produjo una banda de aproximadamente 130 kD (figura 7, carril 1), consistente con ei tamaño reportado de rentl /hupfl (Applequist y otros, 1997). También se sintetizó la proteína luciferasa como se describió arriba, y se usó como una proteína de control para la especificidad de la interacción. La síntesis de la proteína luciferasa produjo una proteína de 68 kD (figura 7 carril 5). Se incubaron la rentl /hupfl o la proteína luciferasa con GST, GST-eRF1 o GST-eRF3, como se describió arriba, y se monitorearon las interacciones de rentl /hupfl o luciferasa con estas proteínas por medio de SDS-PAGE, seguido por autorradiografía. Los resultados demostraron que la rentl /hupfl interaccionó tanto con GST-eRF1 como con GST-eRF3 (figura 7, carriles 3 y 4). La interacción fue específica, puesto que rentl /hupfl no formó un complejo con proteína GST (figura 7, carril 2). Además, la proteína luciferasa sintetizada in vitro no ¡nteraccionó con GST, GST-eRF1 ni GST-eRF3 (figura 7, carriles 6-8). Además, ARN poli(U) impidió la interacción de la hupfl /rentl con eRF3. Tomados juntos, estos resultados indican que la rentl /hupfl también interacciona con los factores de liberación de peptidilo eRF1 y eRF3 y la Upfl p en el complejo de vigilancia, y que modula la terminación de traducción.

DISCUSIÓN Resultados previos indicaron que la Upfl p es una proteína multifuncional implicada en el incremento de la terminación de traducción en codones sin sentido y que promueve la declinación de transcritos que contienen sin sentidos (Weng y otros, 1996a,b; Weng y otros, 1998). Los resultados presentados aquí comienzan a elucidar cómo funciona la Upfl p en el incremento de la terminación de traducción. Se demostró que la forma tanto humana como de levadura de la Upfl p afecta la terminación de traducción, interaccionando con los factores de liberación de peptidilo eRF1 y eRF3 y modulando su actividad (figura 1 ). Estos resultados fueron verificados demostrando que la Upfl p fue observada también como parte de los agregados o fibras del factor de liberación de peptidilo observados en células de levadura [PSI*], y una forma mutante de Upfl p tenía interacciones alteradas con estos factores de liberación. La interacción de la Upfl p con los factores de liberación de peptidilo sugiere que la Upfl p incrementa la actividad de estos factores: El hallazgo de que la Upfl p está asociada también con los agregados de eRF3 encontrados en células [PS/4], es consistente con esta proteína interaccionando con los factores de liberación de terminación de traducción in vivo (figura 2). Este resultado sugiere que una porción de la Upfl p que es utilizada normalmente por la célula para incrementar la terminación de traducción, está agotada de la reserva celular en células de levadura [PSI+]. En la actualidad, no se conoce el efecto de la remoción de esta porción de la Upfl p sobre NMD. Los resultados presentados aquí identifican a Upfl p como un componente de los complejos [PS/4], y desempeña una función en la formación o mantenimiento de agregados.

No ha sido completamente elucidado el mecanismo preciso de cómo eRF1 y eRF3 promueven la terminación cuando el sitio A del ribosoma está ocupado por un codón de terminación (revisado en Buckingham y otros, 1997). Una sugerencia es que eRF1 puede imitar estructuralmente un tronco de un ARNt mientras que eRF3 puede imitar la función de EF-1 a (Didichenko y otros, 1991 ). La interacción de estas dos proteínas en el sitio ribosomal A promueve corte del péptido asociado con el ARNt en el sitio P (Zhouravleva y otros, 1995). Hay varios pasos en el proceso de terminación, en los cuales se podría contemplar que la interacción de los factores de liberación con Upfl p incrementa su eficiencia de terminación de traducción. Estos incluyen: 1 ) el incremento de la eficiencia en donde los eRFs compiten con ARNt's cognados cercanos e interaccionan productivamente con el ribosoma para promover la terminación, 2) la eficiencia de los eRFs para promover hidrólisis de peptidilo, 3) o el aumento de reciclado de los eRFs para que haya una reserva libre más grande de estos factores que pueden promover la terminación.

La función de la Upfl p en el incremento de terminación de traducción puede ser conservada durante de la evolución: Se ha aislado recientemente el homólogo humano del gen UPF1 de levadura (Perlick y otros, 1996; Applequist y otros, 1996). Aunque el gen humano contenía dominios terminales amino y carboxilo que no estaban presentes en el gen UPF1 de levadura, el gen humano contenía la región rica en cisteína-histidina y los motivos de helicasa encontrados en el homólogo de levadura (Perlick y otros, 1996; Applequist y otros, 1997). Además, la expresión de un híbrido de levadura/humano de los genes UPF1, funcionó en una prueba de supresión de alteración de marco cuando se expresó en una cepa upfl? (Perlick y otros, 1996). Los resultados presentados aquí demuestran que, análogo a la Upfl p, la expresión del alelo UPF1 de levadura/humano impidió el fenotipo de supresión de sin sentido observado en una cepa upfl? que alojaba los alelos leu2-2 y tyr7-1 que contenían sin sentidos (figura 6). Aunque el híbrido de levadura/humano fue capaz de complementar el fenotipo de terminación de traducción de la Upflp de levadura, no promovió una rápida declinación de ARNm's que contenían sin sentidos (figura 6). Además, consistente con una función en la terminación de traducción, la proteína rent1/hupf1 humana también interaccionó con los factores de terminación de traducción eRF1 y eRF3 (figura 6). Estos resultados, así como la localización predominantemente citoplásmica de Upflp de levadura y rentl/hupfl (revisado por Jacobson y Peltz, 1996; véase Applequist y otros, 1996), son consistentes con una función de esta proteína en la modulación de la terminación de traducción. Tomados juntos, estos resultados sugieren que probablemente la función de la Upflp en la terminación de traducción, es conservada a lo largo de la evolución.

La interacción con los factores de liberación modula las actividades bioquímicas de la Upfl : Los resultados demuestran que la interacción de Upfl p con los factores de liberación, inhibió su actividad ATPasa e impidió que Upfl p se uniera a ARN (figuras 3 y 5). Estos resultados son consistentes con los resultados bioquímicos y genéticos previos que demostraban que se requerían las actividades ATPasa/helicasa y de unión de ARN de la Upfl p para promover NMD, pero eran dispensables para su actividad de terminación de traducción (Weng y otros, 1996a,b; Weng y otros, 1998). También se mostró que ARN y eRF3 compiten por la unión a Upfl p (figura 3). Este resultado sugiere que los factores que reducen la afinidad de Upfl p por ARN favorecerían consecuentemente la unión a los factores de liberación. Se demostró previamente que la unión de ATP a Upfl p reduce su afinidad por ARN (Weng y otros, 1996a, 1998). Los resultados mostrados aquí demostraron que el ATP ocasiona que la Upfl p favorezca la interacción con eRF3 sobre ARN (figura 4C, figura 8A). En base a estos resultados, el ATP es un cofactor de la Upfl p que le permite permutar entre sus actividades de terminación de traducción y NMD. Los resultados de los análisis genéticos y bioquímicos de la Upfl p son consistentes con esta hipótesis (Weng y otros, 1996a,b; 1998). Por ejemplo, una forma mutante de la Upfl p que carecía de actividad ATPasa, pero no obstante se unía a ATP, fue funcional todavía para impedir la terminación de traducción (Weng y otros, 1996a, 1998). Significativamente, la unión de ATP a esta forma mutante de la Upfl p todavía moduló su afinidad de unión a ARN (Weng y otros, 1998). Además, una Upf1 p?436A mutante, cuya actividad de unión no pudo ser modulada por ATP, no funcionó para incrementar la terminación de traducción en un codón sin sentido (Weng y otros, 1996a, Weng y otros, 1998). Esta Upf1 pK436A también demostró una interacción dramáticamente reducida con eRF1 (figura 4B), y no interaccionó con eRF3 en presencia de ARN y ATP (figura 4C). En base al modelo descrito arriba, el evento de terminación es un punto clave en el ensamble del complejo de vigilancia y conduce a mayor terminación de traducción y degradación de transcritos que contienen sin sentidos. La terminación de traducción puede ser también un evento importante en la regulación de la estabilidad o eficiencia de traducción de los transcritos de tipo silvestre. Las regiones 3' no traducidas de muchos transcritos codifican elementos reguladores que modulan la eficiencia y/o estabilidad de traducción de sus ARNm's respectivos (revisado por Ross, 1995; Jacobson y Peltz, 1996; Jacobson, 1996; Caponigro y otros, 1995; Wickens y otros, 1997). Es concebible que el evento de terminación sea también la guía para el ensamble de complejos que subsecuentemente interaccionan con los elementos en la 3'-UTR que modulan su estabilidad y/o eficiencia de traducción. De manera interesante, una subunidad de la fosfatasa 2A de proteína (PP2A) es el factor de terminación de traducción eRF1 (Andjelkovic y otros, 1996). Es posible que una función de eRF1 sea la de poner la fosfatasa PP2A en el ribosoma en el evento de terminación. Entonces la PP2A puede ser colocada en el sitio apropiado para modular la actividad de factores que regulan la eficiencia o estabilidad de traducción de ios transcritos dados. De forma interesante, este escenario es muy similar a la forma en la que se percibe la ruta NMD. La premisa básica para el tipo silvestre y NMD, es que la terminación es un evento limitativo de velocidad que detiene el ribosoma y señaliza el ensamble de complejos que regulan eventos subsecuentes en el lapso de vida de un transcrito dado. Es interesante que, aunque la función de PP2A en la traducción no se investigado, se ha visto que mutaciones en el gen SAL6 que codifica una fosfatasa, promueven la supresión de mutaciones sin sentido (Vincent y otros, 1994). Evidentemente, se requiere experimentación adicional para probar esta hipótesis.

EJEMPLO 2 La proteína Upf3 es un componente del complejo de vigilancia que monitorea la traducción y la renovación de ARNm y afecta el mantenimiento viral La ruta de declinación de ARNm mediada por sin sentidos (NMD) funciona para degradar ARNm's aberrantes que contienen codones de terminación prematura de traducción. En Saccharomyces cerevisiae, se han identificado las proteínas Upflp, Upf2p y Upf3p como factores de acción-fraps implicados en esta ruta. Resultados recientes han demostrado que las proteínas Upf pueden estar implicadas también en el mantenimiento de la fidelidad de varios aspectos del proceso de traducción. Se ha visto que ciertas mutaciones en el gen UPF1 afectan la eficiencia de terminación de traducción en codones sin sentido y/o el proceso de alteración de marco ribosomal programada -1 usada por los virus para controlar su expresión genética. La alteración de eficiencias de alteración de marco programadas puede afectar el ensamble del virus, conduciendo a títulos virales reducidos o a la eliminación del virus. Aquí se demuestra que la proteína Upf3 funciona para regular la eficiencia de la alteración de marco programada -1. Una cepa upf3? demuestra mayor eficiencia de alteración de marco ribosomal programada -1 , lo cual ocasiona pérdida de la capacidad para mantener el virus M-i. Además, la cepa upf3? es más sensible al antibiótico paromomicina que las células de tipo silvestre, y la eficiencia de alteración de marco aumenta en una cepa upf3? en presencia de este fármaco. Además, Upf3p es epistática para Upfl p y Upf2p. En base a estas observaciones, y al hecho de que el alelo mof4-1 del gen UPF1 también afecta la eficiencia de NMD y de la alteración de marco ribosomal programada -1 , se demostró que las proteínas Upfp son parte de un complejo de vigilancia que funciona para monitorear la fidelidad de traducción y la renovación de ARNm.

MATERIALES Y MÉTODOS Materiales, cepas, plásmidos, medios y métodos generales: Se obtuvieron enzimas de restricción de Boehringer Mannheim, New England Biolabs y BRL. Se obtuvieron nucleótidos radioactivos de NEN o Amersham. Las cepas de levadura isogénicas usadas en este estudio se enlistan en el cuadro 1 . Se usó E. coli DH5a para ampliar ADN de plásmído. Los plásmidos pF8 y pT125 se describieron previamente (Dinman, J.D., Icho T. y Wickner R.B. (1991 )), y se muestran en la figura 7. El plásmido pmof4BE que lleva el alelo mof4-1 en un vector YCplac33, fue como se describió (Cui Y, K.W. Hagan, S. Zhang y Peltz S.W. (1995)). Se preparó medio de levadura como se describió (Rose M.D., Winston F. Y Hieter P. (1990)). Se realizaron transformaciones de levadura con el método de acetato de litio (Schiestl R.H. y Gietz R.D. (1989)). Las citoducciones de L-A y Mi en cepas rho-o fueron como se describió previamente (Dinman J.D., y Wickner R.B. (1992)) usando las cepas 3164 y 3165 (Dinman J.D. y Wickner R.B. (1994); Dinman J.D. y Wickner R.B. (1992)) como donadores de citoducción. Las pruebas de ß-galactosidasa (ß-gal) siguieron los protocolos normales (Guárante L. (1983)).

Clonación de UPF3: La estrategia usada para clonar el gen UPF3 fue la misma usada para clonar UPF2 (Cui Y., K.W. Hagan, s. Zhang, y Peltz, S.W. (1995)).

Subclonación subsecuente reveló que un fragmento de 2.1 kb de Asp718-Bgl II fue suficiente para complementar mutaciones upf3, y el análisis de secuencia de esta clona mostró que fue idéntica a la secuencia de UPF3 reportada previamente (Lee B.S. y Culbertson M.R. (1995)).

Pruebas de células asesinas, pruebas de alteración de marco y extracción y análisis de ácidos nucleicos totales: La prueba de asesino se llevó a cabo como se describió previamente (Dinman J.D. y Wickner R.B. (1992)) por sembrado de colonias en placas por duplicado sobre placas 4.7MB recién sembradas con un césped de 5x47 células indicadoras asesinas (0.5 ml de una suspensión a 1 unidad de densidad óptica a 550 nm por ml por placa). Después de 2 días a 20°C, se observó la actividad asesina como una zona de inhibición de crecimiento alrededor de las colonias asesinas. Para cuantificar la pérdida de actividad asesina, las colonias que se habían identificado como asesinas+ se volvieron a estriar para colonias individuales y se determinó el por ciento de colonias asesinas". Se determinaron las eficiencias de desviaciones de marco -1 como se describió previamente (Cui Y., Dinman J.D. y Peltz S.W. (1996); Dinman J.D., Ruiz-Echevarria, M.J. Czaplinki K. y Peltz S.W. (1997b)) usando los plásmidos de control de marco 0- (pTI25) y reportero -1. Se extrajeron ácidos nucleicos totales (TNA) de células como se describió previamente (Dinmam J.D. y Wikner R.B. (1994); Dinman J.D. y Wickner R.B. (1992)). Se separaron iguales cantidades de TNA a través de geles de agarosa al 1 % y se visualizó con bromuro de etidio. Se desnaturalizó TNA en los geles a 45° durante 30 minutos en formamida 50%, formaldehído 9.25%, 1x TAE, los geles se lavaron con agua y los ácidos nucleicos se transfirieron a nitrocelulosa. La extracción de ARNm's fue como se describió previamente (Cui Y, Dinman J.D. y Peltz S.W. (1996)). Se monitoreó la abundancia de ARN de L-A y Mi cadena (+) como se describió (28). La abundancia de ARN del ARNm reportero de alteración de marco -1 de lacZ y de ARNsn de U3, se determinó mediante pruebas de protección de ribonucleasa, esencialmente como se describió (Sambrook).

Preparación de sondas radioactivas: Para las pruebas de protección de ribonucleasa, se marcaron sondas de ARN con [a-32P]UTP. Para monitorear la abundancia de ARNm de lacZ, se digirió un plásmido derivado de pGEM conteniendo el gen LacZ, con Hincll, y se transcribió in vitro con ARN polimerasa T7. Para monitorear la abundancia del transcrito U3, pGEM-U3, un plásmido derivado de pGEM, se cortó con Sspl y se transcribió in vitro con ARN polimerasa T3. Se hicieron sondas de ARN de L-A y M-\ de cadena (+) como se describió previamente usando transcritos de ARN polimerasa T3 marcada con [a-32P]CTP (28).

RESULTADOS Una cepa upf3? demuestra una mayor eficiencia de alteración de marco ribosomal programada -1 : El mof4-1 es un alelo único del gen UPF1 que aumenta específicamente la eficiencia de alteración de marco ribosomal programada -1 y promueve pérdida del virus satélite M-i. Sin embargo, una cepa upfl? no muestra estos fenotipos. Otros factores del complejo de vigilancia putativo, incluyendo las proteínas Upf2 o Upf3, también afectan la alteración de marco ribosomal programada -1. Por lo tanto, se investigaron cepas isogénicas que alojaban supresiones de los genes UPF que demostraran mayores eficiencias de alteración de marco ribosomal. Se han descrito previamente métodos para medir in vivo las eficiencias de alteración de marco ribosomal programada (Cui Y, Dinman J.D. y Peltz S.W. (1996); Dinman J.D. Icho T. y Wickner R.B. (1991 ); Dinman J.D., Ruiz-Echevarria M.J., Czaplinki K. y Peltz S.W. (1997b)). Se usó una serie de plásmidos reporteros de lacZ en los cuales la transcripción se maneja desde el promotor PGK1 de levadura y termina en el sitio de poliadenilación de PGK1. Un codón de iniciación de traducción es seguido por un sitio de clonación múltiple, seguido por el gen lacz de E. coli. El plásmido pT125 sirve como el control de marco 0, ya que el lacz está en el marco 0 con respecto al sitio de iniciación de traducción (figura 8). En el plásmido pF8, se clona una señal de alteración de marco ribosomal programada -1 derivada de L-A en el poliadaptador, y el gen lacZ está en el marco -1 con respecto al sitio de iniciación de traducción (figura 8). Por lo tanto, en esta construcción, el gen lacZ será traducido solo si el ribosoma desvía el marco en la dirección -1. El plásmido reportero de alteración de marco +1 , pJD104 (figura 8), contiene el gen lacZ insertado en 3' de una señal de alteración de marco ribosomal programada +1 derivada del elemento retrotransportable Ty1 de la levadura. En esta construcción, el gen lacZ será traducido solo si el ribosoma desvía el marco en dirección +1. La eficiencia de la alteración de marco ribosomal -1 se calcula determinando la relación de las actividades de ß-gal medidas en las células que alojan el plásmido reportero de la alteración de marco -1 , pF8, y las células que alojan el plásmido de control de marco 0, pT125, y multiplicando por 100%. De igual manera, se calcula la eficiencia de alteración de marco ribosomal +1 en base a las relaciones de ß-gal de pJD104 y pT125. Estos experimentos se realizaron en cepas isogénicas de levadura alojando supresiones de diferentes genes UPF, para evitar diferencias específicas de cepa (cuadro 1 ).

CUADRÓ 1 Cepas usadas en este estudio Cepa Genotipo Referencia HFY1200 MATa ade2-1 his3-11, 15 ieu2-3, 112 He y otros, trp 1-1 ura3-1 can 1-100 UPF1 NMD2 1997 UPF3 HFY870 MATa ade2-1 his3-11, 15 leu2-3, 112 He y otros, trp1-1 ura3-1 canl-100 upf1::HIS3 1997 NMD2 UPF3 HFY1300 MATa ade2-1 his3-11, 15 leu2-3, 112 He y otros, trp1-1 ura3-1 can1-100 UPF1 nm2:: 1997 HIS3 UPF3 HFY861 MATa ade2-1 his3-11, 15 Ieu2-3, 112 He y otros, trp1-1 ura3-1 can1-100 UPF1 NMD2 1997 upf3::HIS3 HFY3000 MATa ade2-1 his3-11, 15 leu2-3, 112 He y otros, trp 1-1 ura3- 1 can 1-100 upfl ::URA3 1997 nmd2::HIS3 UPF3 HFY872 MATa ade2-1 his3-11, 15 leu2-3, 112 He y otros, trp1-1 ura3-1 can1-100 up -1::URA3 1997 NMD2upf3::HIS3 HFY874 MATa ade2-1 his3-11, 15 leu2-3, 112 He y otros, trp1-1 ura3-1 canl-100 UPF1 nmd2:: 1997 URA3 upf3::HIS3 HFY883 MATa ade2-1 his3-11, 15 leu2-3, 112 He y otros, trp1-1 ura3-1 can1-100 upf1::LEU2 1997 nmd2::URA3 upf3::HIS3 HYF870mo MA Ta ade2-1 his3-11, 15 leu2-3, 112 Este f4 trp 1-1 ura3-1 can1-100 upf1::HIS3 estudio NMD2 UPF3 pmof4BE CUADRO 1 (Continuación) Cepa Genotipo Referencia HFY872mo MATa ade2-1 his3-11, 15 leu2-3, 112 Este Í4 trp 1-1 ura3- 1 can 1-100 upfl - 1 :: estudio URA3 NMD2 upf3::HIS3 pmof4BE 3164 MATa kar1-1 arg1L-AHN M1 rC Dinman y Wickner, 1992 3165 MATa kar1-1 argl thr(1,x) L-AHN Dinman y M1 C Wickner, 1994 5X47 MATa/MATa his1/+trp/+ura3/+KK Dinman y Wickner, 1992 Los resultados de estos experimentos demostraron que los niveles de actividad de ß-gai, y por lo tanto la aparente eficiencia de alteración de marco ribosomal programada -1 , fueron ligeramente mayores en las cepas upfl? y upf2?, 1.8 y 1.5 veces, respectivamente, que en las células de tipo silvestre (cuadro 2). Como se describirá más adelante, el pequeño incremento de alteración de marco programada -1 no fue suficiente para promover pérdida del virus M-\. En contraste, la eficiencia de alteración de marco ribosomal programada -1 en células upf3?, fue 3.4 veces superior que en las células de tipo silvestre (cuadro 2) y fue suficiente para promover pérdida del virus Mi (véase más adelante). Este resultado sugiere que, análogo a la cepa mof4-1, una cepa upf3? demuestra un nivel incrementado de alteración de marco ribosomal programada -1.

CUADRO 2 Alteración de marco ribosomal proqramada -1 v mantenimiento de virus Mi de cepas gue alojan una supresión sencilla de un gen UPF Cepa % de Alteración de Mantenimiento (Genotipo) marco ribosomal -1a de asesinas UPF* 2.5 + (HFY1200) upfl? 4.5 + (HFY870) upf2? 3.9 + (HFY1300) upf3? 8.4 (HFY861 ) a La eficiencia de alteración de marco ribosomal -1 (%) se determinó por la relación entre actividad B-galactosidasa en una cepa que aloja el plásmido reportero de alteración de marco ribosomal -1 y la actividad en la misma cepa alojando el plásmido de control de marco 0. b Se introdujeron L-AHN y Mi en las cepas mediante citoducción, y se analizó el mantenimiento (+) o pérdida (-) de ARNds de Mi mediante la prueba de placa de células asesinas y análisis Northern blot como se describe en la sección de materiales y métodos.

De manera interesante, ninguna de las cepas mutantes demostró un aumento dramático de la eficiencia aparente de alteración de marco ribosomal programada +1 , medida por los niveles de actividad de ß- galactosidasa. Tomados juntos, estos resultados indican que la cepa upf3? altera específicamente la alteración de marco ribosomal -1.

La abundancia del transcrito reportero de alteración de marco es equivalente en las cepas upf? Los transcritos de reportero de alteración de marco -1 usados en estas pruebas, tienen regiones cortas de codificación de proteína 5' de la alteración de marco, seguidas por secuencias que codifican para una proteína reportera y que está fuera de marco con el sitio de iniciación de traducción de marco de lectura abierto 5'. Los cambios aparentes en eficiencias de alteración de marco ribosomal podrían originarse de cambios en la abundancia de ARNm reportero de alteración de marco de LacZ que la maquinaria de traducción puede reconocer como un ARNm que contiene sin sentidos. La supresión de los genes UPF conduciría a la estabilización del transcrito de reportero de alteración de marco -1 , dando como resultado mayor síntesis de la proteína reportera de ß-gal. Para resolver si una cepa upf3? acumula el transcrito reportero a un grado mayor que las cepas upfl? y upf2?, se determinó la abundancia del ARNm reportero de alteración de marco -1 lacZ mediante análisis de protección de ARNasa. Como un control de carga, se determinó la abundancia de ARNsn de U3. La cuantificación de las bandas híbridas reveló que las abundancias de ARNm reportero de alteración de marco de lacZ, normalizadas a los ARNsn de U3, fueron equivalentes en las cepas isógenas de tipo silvestre, upfl?, upf2? y upf3? (figura 9). Por lo tanto, estos resultados indican que la mayor eficiencia de alteración de marco ribosomal programada -1 observada en una upf3?, en comparación con las cepas upfl? o upf2?, no fue una consecuencia de la estabilización del transcrito reportero a un mayor grado que en las otras cepas de upf?. El modesto incremento de la abundancia del ARNm de LacZ -1 no podría explicar el incremento de cuatro veces en la producción de la proteína reportera ß-gal observada en la cepa upf3?. Por lo tanto, una upf3 también muestra un fenotipo mof, ya que aumenta la eficiencia de alteración de marco ribosomal -1 independientemente de su capacidad para estabilizar ARNm's sin sentido.

El virus asesino M^ no es mantenido en una cepa upf3?: El cambio de la eficiencia de la alteración de marco ribosomal -1 altera la relación de proteínas Gag a Gag-pol disponibles para ensamble de la partícula viral, interfiriendo consecuentemente con la propagación viral (Cui Y., Dinman J.D. y Peltz S.W. (1996); Dinman J.D. y Wickner R.B. (1994); Dinman J.D. y Wickner R.B. (1992); Dinman J.D., Ruiz-Echevarria, M.J. Czaplinski K. y Peltz S.W. (1997b)). Los virus L-A y Mi se introdujeron mediante citoducción en cepas isogénicas de tipo silvestre UPF*, upfl?, upf2? y upf3?, y estas células se desarrollaron y se sembraron en placa por duplicado sobre un césped de células sensibles a la toxina asesina. Las células que mantienen el virus Mi secretan la toxina asesina creando un anillo de inhibición de crecimiento, mientras que las células que han perdido Mi no muestran esta inhibición de crecimiento (Cui Y., Dinman J.D. y Peltz S.W. (1996); Dinman J.D. y Wickner R.B. (1992); Dinman J.D. , Ruiz-Echevarria, M.J. Czaplinski K. y Peltz S.W. (1997b)). Los resultados de esta prueba demuestran que las cepas de tipo silvestre, upfl? y upf2?, mantienen el fenotipo asesino, mientras que la cepa upf3? pierde la capacidad para mantener el fenotipo asesino (figura 10A, cuadro 2). Consistentemente con resultados previos, las células que alojan el alelo mof4-1, tampoco pudieron mantener el fenotipo asesino (Cui Y., Dinman J.D. y Peltz S.W. (1996)). Para determinar si la falta del fenotipo asesino fue una consecuencia de un defecto de mantenimiento de virus en lugar de interferencia con la producción de la toxina asesina, se extrajeron ácidos nucleicos totales de una colonia de cada una de las cepas UPF*, upfl? , upf2? y upf3?, y se separaron cantidades iguales de ácidos nucleicos en un gel de agarosa no desnaturalizante. Los ARNs se transfirieron a nitrocelulosa y se hibridaron con sondas específicas de ARN de L-A y M-\ marcadas con [a-3 P]CTP. Los resultados se muestran en la figura 10B. Consistentemente con la pérdida del fenotipo asesino, el ARNds de 1 .8 kb de i estuvo ausente en las células mof4-1 y upf3?, pero estuvo presente en los mutantes upfl y upf2 y las cepas de tipo silvestre. Estos resultados apoyan la hipótesis de que la supresión del gen UPF3 altera la eficiencia de la alteración de marco ribosomal -1 , interfiriendo con la propagación del virus satélite Mi.

La cepa upf3? muestra mayor sensibilidad a paromomicina: Las cepas que alojan mutaciones que disminuyen fidelidad de traducción son hipersensibles al antibiótico aminoglicósido paromomicina, un fármaco que se considera que aumenta la frecuencia de lectura fallida en levadura. Resultados previos demostraron que las células que alojan el alelo mof4-1 del gen UPF1, que aumenta la eficiencia de alteración de marco ribosomal -1 , también mostraron mayor sensibilidad a la paromomicina que la cepa isogénica de tipo silvestre. Se determinó si una cepa upf3? también mostraba mayor sensibilidad a este antibiótico. La sensibilidad a paromomicina se monitoreó en cepas de tipo silvestre y upf3? colocando un disco conteniendo 1 mg de paromomicina sobre un césped de células y determinando ia zona de inhibición de crecimiento alrededor del disco (figura 1 1 ). Los resultados demuestran que, análogamente a la cepa mof4-1, una cepa upf3? fue más sensible a paromomicina que la cepa ¡sogénica de tipo silvestre. Ninguna de las dos cepas upfl? y upf2? mostraron hipersensibilidad a la paromomicina. El efecto de paromomicina sobre la alteración de marco ribosomal -1 fue analizado adicionalmente mediante una prueba de ß-galactosidasa usando los plásmidos pF8 (construcción de reportero de alteración de marco -1 ) o pT125 (control de marco cero) en cepas isogénicas de tipo silvestre y upf3?. Las células se desarrollaron en medio líquido en presencia de diferentes concentraciones del fármaco y se determinó la actividad de ß-galactosidasa, normalizando el número de células usadas en la prueba. La actividad de ß-galactosidasa de células upf3? que llevan pF8 (construcción de reportero de alteración de marco -1 ), aumentó continuamente con concentraciones crecientes de paromomicina. Sin embargo, la actividad de ß-galactosidasa no fue afectada en células de tipo silvestre conteniendo pF8 ni en ninguna de las cepas que llevan pT125 (construcción de control de marco cero). Tomados juntos, estos resultados indican que la paromomicina puede aumentar el efecto que tiene la supresión del gen UPF3 sobre la eficiencia de alteración de marco ribosomal -1.

Los fenotipos de mayor alteración de marco programada -1 y defecto de mantenimiento de virus asesino de las cepas upf3? y upf3? mof4-1 son equivalentes: Los resultados descritos arriba indican que una cepa upf3 tiene fenotipos similares a las células mof4-1. Puesto que el alelo mof4-1 del gen UPF1, mas no la supresión del gen UPF1, afectó la alteración de marco ribosomal programada -1 y el mantenimiento de M-i, los autores de la presente sugirieron que la mof4-1 podría alterar la función de la Upf3p. De esta manera, una cepa upf3? mof4-1 tendría los mismos fenotipos de asesino y alteración de marco programada -1 que la cepa upf3?. Se monitorearon los fenotipos de eficiencia de alteración de marco ribosomal programada -1 y mantenimiento de virus en cepas isogénicas mof4-1, upf3?, y mof4-1 upf3? como se describió arriba. Los resultados de este experimento se resumen en el cuadro 3. Las eficiencias de alteración de marco ribosomal -1 programadas observadas en las cepas mof4-1, upf3?, y mof4-1 upf3?, fueron equivalentes. Además, todas estas cepas carecían del fenotipo asesino (cuadro 3). Estos resultados sugieren que el alelo mof4-1 del gen UPF1 altera la alteración de marco ribosomal programada -1 modulando la actividad de la Upf3p.

Los fenotipos de alteración de marco programada y de asesino de un alelo upf3? son independientes de los otros alelos upf? Se examinaron las relaciones epistáticas entre upfl?, upf2? y upf3?, con respecto a eficiencias de alteración de marco ribosomal -1 y mantenimiento de asesino. Se monitorearon los fenotipos de alteración de marco ribosomal programada -1 y de asesino como se describe arriba en las cepas isogénicas UPF*, upfl? upf2?, upfl? upf3?, upf2? upf3? y upfl? upf2? upf3?. Los resultados de estos experimentos se muestran en el cuadro 3. Todas las cepas que alojan el upf3? tenían mayores eficiencias de alteración de marco ribosomal -1 , equivalente a la supresión de alojamiento del gen UPF3 solo, independientemente del estado de los genes UPF1 o UPF2 (cuadro 3). Por el contrario, las cepas upfl? UPF3+, upf2? UPF3* y upfl? upf2? UPF3* no mostraron un incremento en eficiencias de alteración de marco -1 programadas suficiente para promover pérdida del fenotipo de asesino (cuadros 2 y 3). Tomados juntos, estos resultados indican que la Upf3p actúa hacia el extremo 3' de Upfl p y Upf2p.

DISCUSIÓN Las proteínas Upf son parte del complejo de vigilancia que monitorea tanto renovación de ARNm como traducción. La ruta NMD es un ejemplo de un mecanismo que la célula ha evolucionado para deshacerse de transcritos que contienen sin sentidos aberrantes que, cuando son traducidos, pueden producir péptidos anómalos que pueden interferir dominantemente con las funciones celulares normales (Jacobson A. y Peltz S.W., 1996; Ruiz-Echevarria, M.J., K. Czaplinski y Peltz S.W., (1996); Weng Y., M.J. Ruiz-Echevarria, S. Zhang, Y. Cui, K. Czaplinski, J. Dinman y S.W. Pletz, (1997); He F., Peltz S.W., Donahue J.L., Rosbasch M. Y Jacobson A. (1993); Pulak R. y Anderson P., (1993)). De manera interesante, la manifestación clínica y la severidad de varias enfermedades genéticas humanas que son una consecuencia de mutaciones sin sentido, pueden aumentar bajo condiciones en las cuales se estabiliza el transcrito que contiene los sin sentidos (Hall G.W. y Thein S. (1994); Dietz H.C, I. Mclntosh, L.Y. Sakai, G.M. Corson, S.C. Chalberg, R.E. Pyeritz y Francomano C.A. (1993); Dietz H.C., U. Franke, H. Furthmayr, C.A. Francomano, A. De Paepe, R. Devereux, F. Ramírez, y Pyeritz R.E. (1995)). El hecho de que cada organismo eucariótico estudiado hasta ahora haya mantenido la ruta de NMD, así como la conservación en células humanas de por lo menos un factor implicado en este proceso (Perlick H.A., Medghalchi S.M., Spencer F.A., Kendzior R. J. Jr. Y Dietz H.C. 81996); Applequist S.E., Selg M., Román C, y Jack H. (1997)), sugiere que ia presión para eliminar ARNm's anómalos es suficiente para mantener este proceso a lo largo de la evolución. Resultados recientes indican que los factores implicados en la ruta NMD desempeñan funciones adicionales en la modulación de varios aspectos del proceso de traducción. Estudios genéticos de la Upfl p, sugieren que esta es una proteína multifuncional la que actúa en NMD y en modulación del proceso de terminación de traducción (Weng Y., K. Czaplinski y Peltz S.W. (1996a); Weng Y., K. Czaplinki y Peltz S.W. (1996b)). Evidencia bioquímica más reciente indica que la Upfl p interacciona con los factores de liberación de terminación de traducción eRF1 y eRF3. No es sorprendente la función de la Upfl p en la modulación de terminación de traducción, ya que la ruta NMD funciona monitoreando si la terminación de traducción ha ocurrido aberrantemente, y después degradando el ARNm anómalo. El alelo mof4-1 del gen UPF1 muestra un incremento en eficiencia de alteración de marco ribosomal programada -1 y es incapaz de mantener el virus asesino Mi (Cui Y., Dinman J.D. y Peltz S.W. (1996)). Además, los mutantes mof2-1 manifiestan mayor eficiencia ribosomal programada -1 (Cui Y., Dinman J.D.D., Goss Kinzy T. y Peitz S.W. (1997)). El mutante mof2-1 es alélico para el gen SUI1 (Cui Y., Dinman J.D.D., Goss Kinzy T. y Peltz S.W. (1997)), que mostró previamente que desempeñaba una función en la selección del sitio de comienzo de iniciación de traducción. De forma interesante, las cepas mutantes mof2-1 también mostraron acumulación de sin sentidos. Estos resultados sugieren que el complejo de vigilancia, que incluye factores implicados en NMD, puede estar implicado también en el monitoreo de otros pasos en el proceso de traducción. Los resultados presentados aquí, indican que la Upf3p, además de su función en NMD, es parte del complejo de vigilancia putativo implicado en el mantenimiento del marco de lectura de traducción apropiado. Los resultados también sugieren que el efecto del alelo mof4-1 de la Upflp en alteración de marco ribosomal -1 ocurre muy probablemente a través de modulación de las interacciones de la Upf3p con el aparato de traducción. La Upf3p es el factor clave que liga al complejo de Upfp con la alteración de marco ribosomal programada -1 . El monitoreo de los perfiles de alteración de marco ribosomal programada y mantenimiento de virus Mi de las células que alojan supresiones de los genes UPF1, UPF2 o UPF3, demostraron que una cepa upf3? afectó la eficiencia de alteración de marco programada -1 y ei mantenimiento de virus (cuadro 2 y 3). La alteración de marco ribosomal programada -1 incrementada en una cepa upf3?, no es una consecuencia de la estabilización del transcrito reportero a un mayor grado que el observado en las cepas upfl? o upf2? (figura 9). Consistentemente con esto, la eficiencia de alteración de marco ribosomal -1 en células upf3? fue elevada en respuesta a dosis crecientes de paromomicina, un fármaco que se sabe que afecta la fidelidad de traducción. La observación de que el alelo mof4-1 del gen UPF1, mas no un alelo de upfl?, afecta la alteración de marco ribosomal programada -1 y el mantenimiento de asesino, sugirió que Upfl p no influye directamente en el mantenimiento del marco de lectura de traducción. La noción de que la Upf3p es la componente central del complejo Upfp que modula alteración de marco programada, está apoyada por la observación de que una cepa mof4-1 upf3? tiene los mismos fenotipos de alteración de marco ribosomal programada -1 y de asesino que una cepa mof4-1 (cuadro 2). Los resultados presentados aquí indican que la Upf3p tiene una función para asegurar el mantenimiento apropiado del marco de lectura de traducción. La función de la Upf3p en este proceso parece ser genéticamente epistático para las Upf p y Upf2p, puesto que los fenotipos de alteración de marco programada -1 y mantenimiento de asesino de una upf3? se observan en las cepas upfl? y upf2? (cuadro 3). Aunque la función bioquímica precisa de la Upf3p en este proceso no es conocida, los resultados presentados aquí demuestran que las Upfp's pueden tener distintas funciones que pueden afectar aspectos diferentes de los procesos de traducción y renovación de ARNm. De manera importante, estos resultados también pueden tener implicaciones prácticas, ya que muchos virus de importancia clínica, veterinaria y agrícola utilizan alteración de marco (revisado por Brierley I. (1995); Dinman J.D.D., Ruiz-Echevarria, M.J. y Peltz S.W. (1997)). De esta manera, la alteración de marco ribosomal programada sirve como un blanco único para agentes antivirales, y la identificación y caracterización de los factores implicados en este proceso ayudará a desarrollar pruebas para identificar estos compuestos (Dinman J.D.D., Ruiz-Echevarria, M.J. y Peltz S.W. (1997)).

CUADRO 3 Alteración de i marco ribosomal programada -1 y mantenimiento de virus Mi de cepas gue alojan mutaciones múltiples de genes UPF Genotipo % de Alteración de Mantenimiento (Cepa) marco ribosomal a de asesino UPF* 2.5 + (HFY1200) upf3? 8.4 (HFY861 ) mof4-1 7.0 (HFY870mof4) mof4-1 upf3? 8.0 (HFY872mof4) upfl? upf2? 3.2 + (HFY3000) upf 1 ? upf3? 7.2 (HFY872) upf2? upf3? 9.2 (HFY874) upfl? upf2? upf3? 8.0 (HFY3000) a La eficiencia de alteración de marco ribosomal programada -1 y el mantenimiento de virus Mi, se determinaron como se describe en la leyenda del cuadro 2.

Como se describió arriba, las mutaciones en los genes UPF pueden ocasionar fenotipos alterados de terminación de traducción, mayor alteración de marco programada y estabilización de transcritos que contienen sin sentidos (Weng Y., K. Czaplinski y Peltz S.W. (1996a); Weng Y., K. Czapiinki y Peltz S.W. (1996b); Cui Y., Dinman J.D. y Peltz S.W. (1996); revisado en Ruiz-Echevarria, M.J., K. Czaplinki y Peltz S.W. (1996); Weng Y., M.J. Ruiz-Echevarria, S. Zhang, Y. Cui, K. Czaplinki, J, Dinman y S.W. Peltz (1997)). Así, aunque al principio se pensaba que los productos de estos genes estaban implicados únicamente en degradación de ARNm's aberrantes, el cuadro emergente indica que los factores implicados en esta ruta desempeñan funciones múltiples en varios aspectos de traducción (incluyendo traducción, alargamiento y terminación) y renovación de ARNm (Weng Y., K. Czaplinski y Peltz S.W. (1996a); Weng Y., K. Czaplinski y Peltz S.W. (1996b); Cui Y., Dinman J.D. y Peltz S.W. (1996)). Esto demuestra que el complejo de Upfp es parte de un complejo de vigilancia, funciona como un "punto de revisión de traducción". Análogamente a los puntos de revisión de control del ciclo celular, los genes UPF no son esenciales, pero aseguran que los procesos en los que están implicados ocurran con una alta fidelidad. En ausencia de estos factores, se deja proceder menos exactamente un subgrupo de procesos de traducción y renovación de ARNm. Un ribosoma en pausa puede ser un evento clave que promueve el ensamble del complejo Upfp, que subsecuentemente puede monitorear estos procesos. Tanto la alteración de marco programada como la terminación de traducción implican una pausa ribosomal (Wolin S.L. y Walter P. (1988); Tu C, Tzeng, T.H. y Bruenn J.A. (1992); revisado en Tate W.P. y Brown C.M. (1992)). Los resultados muestran que la interacción de los factores de liberación de terminación de traducción eRF1 y eRF3, con un ribosoma en pausa que contiene un codón de terminación en el sitio A, ayuda a promover el ensamble del complejo Upfp. Los resultados muestran que la interacción del complejo Upfp con los factores de liberación, conduce a mayor terminación de traducción y degradación subsecuente de transcritos que contienen sin sentidos. En el caso de alteración de marco ribosomal programada -1 , el pseudonudo de ARN después del sitio resbaladizo, promueve la pausa ribosomal (Tu C, Tzeng T.H y Bruenn J.A. (1992); Somogyi P., Jenner A.J., Brieley I.A., y Inglis S.C. (1993)). El ribosoma en pausa también puede impulsar el ensamble del complejo de vigilancia. Este complejo, o un subgrupo de las proteínas Upf, puede ayudar al ribosoma a mantener el marco de lectura de traducción apropiado. En ausencia de estos factores, el ribosoma es mas propenso a resbalar y cambiar el marco de lectura.

REFERENCIAS Altamura, N., Groudinsky, O., Dujardin, G. y Slonimski, P.P. (1992), "NAM7 nuclear gene encodes a novel member of a family of helicases with a Z1-6n-ligand motif and is involved in mitochondrial functions in Saccharomyces cerevisiae". J. Mol. Biol. 224, 575-587. Andjelkovic, N., Zolnierowicz, S., Van Hoof, C, Goris, J., y Hemmings, B.A. (1996), "The catalytic subunit of protein phosphatase 2A associates with the translation termination factor e RF1 ". EMBO J. 15, 7156-67. Applequist, S.E., Selg., M., Román C, y Jack, H.M. (1997), "Cloning and characterization of HUPF1 , a human homologue of the Saccharomyces cerevisiae nonsense mRNA-reducing UPF1 protein". Nucleic Acids Res 25, 814-821. Atkin A.L., Altamura, N. Leeds, P., y Culbertson, M.R. (1995), "The majority of yeast UPF1 co-localizes with polyribosomes in the cytoplasm". Mol. Biol. Cell 6, 611-625. Atkin A.L., Schenkman, L.R., Eastham, M., Dahlseid, J.N., Lelivelt, M.J., Culbertson, M.R. (1997), "Relationship between yeast polyribosomes and Upf proteins required for nonsense mediated mRNA decay". J. Biol. Chem. 272, 22163-22172. Beelman, CA y Parker, R. (1995) "mRNA degradation in eukaryotes". Cell 81 , 179-183.

Belgrader, P, Cheng, J. y Maquat, L.E. (1993), "Evidence to implícate translation by ribosomes in the mechanism by which nonsense codons reduce the nuclear level of human triosephosphate isomerase mRNA". Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA. 90: 482-486. Brierley, I. (1995) J. Gen Virol. 76, 1885-1892. Buckingham, R., Grentzmann, G., y Kisselev, I. (1997), "Polypeptide chain reléase factors". Mol. Microbiol. 24, 449-456. Caponigro, G. y Parker, R, (1996), "Mechanisms and control of mRNA turvoner in Saccharomyces cerevisiae". Microbiol. Rev. 60,233-249. Cui, Y., Hagan, K.W., Zhang S., y Peltz, S.W. (1995), "Identification and characterization of genes that are required for the accelerated degradation of mRNAs containing a premature translational termination codon". Genes & Dev. 9, 423-436. Cui, Y., Dinman, J.D.D., Goss Kinzy, T. y Peltz, S.W. (1997), "The mof2/Suil protein ¡s a general monitor of translational accuracy". Mol. Cell. Biol., en prensa. Cui, Y., Dinman, J.D., y Peltz, S.W. (1996), "mof4-1 is an alíele of the UPF1/IFS2 gene which affects both mRNA tumover and -1 ribosomal frameshifting efficiency". EMBQ J. 15,5726-5736. Czaplinski, K., Weng, Y., Hagan, K.W. y Peltz, S.W. (1995), "Purification and characterization of the Upfl p: a factor involved in translation and mRNA degradation". RNA 1 , 610-623.

Didichenko, S.A., Ter-Avanesya, M.D., y Smirnov, V.N. (1991 ), "EF-1 a-like ribosome-bound protein of yeast Saccharomyces cerevisiae". Eur. J. Biochem. 198, 705-71 1. Dietz, H.C., I. Mclntosh, L.Y. Sakai, G.M. Corson, S.C. Chalberg, R.E. Pyeritz, y Francomano, C.A. (1993), "Four novel FBN1 mutations: significance for mutant transcript level and EGF-like domain calcium binding in the pathogenesis of Margan syndrome". Genomics 17, 469-475. Dietz, H.C., Franke, H. Furthmayr, C.A. Francomano, A. De Paepe, R. Devereux, F. Ramírez, y Pyeritz, R.E. (1995), "The question of heterogeneity in Marran syndrome". Nature Genetics 9,228-231 . Dinman, J.D. y Wickner, R.B. (1994), "Translational maintenance of frame: mutants of Saccharomyces cerevisiae with altered -1 ribosomal frameshifting efficiencies". Genetics 136, 75-86. Dinman, J.D. y Wickner, R.B. (1992), "Ribosomal frameshifting efficiency and gag/gag-pol ratio are critical for yeast M1 double-stranded RNA virus propagation". J. Virol. 66, 3669-3676. Dinman, J.D., Icho, T., y Wickner, R.B. (1992), "A -1 ribosomal frameshífting in a double-stranded RNA virus of yeast forms a Gag-pol fusión protein". Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88, 174-178. Dinman, J.D., Ruiz-Echevarria, M.J., Czaplinski, K. y Peltz, S.W. (1997b), "Peptidyl-transferase ¡nhibitors have antiviral properties by altering programmed -1 ribosomal frameshifting efficiencies: development of model systems". Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94, 6606-661 1.

Dinman, J.D.D., Ruiz-Echevarria, M.J. y Peltz, S.W. (1997), "Translating oíd drugs into new treatments:ribosomal frameshift as a target for antiviral agents". Tibtech en prensa. Farabaugh, P.J. (1995), "Post-Transcriptional regulation by Ty retrotransposon of Saccharomyces cerevisiae". J. Bíol. Chem. 270, 10361-10364. Ferguson, J.J., Groppe, J.C. y Reed, S.l. (1981 ), "Construction and characterizatíon of three yeast-Escherichia coli shuttle vectors designed for rapid subcloning of yeast genes on small DNA fragments". Gene 16, 191-197. Frolova, L., Le Goff, X., Rasmussen, H.H., Cheperegin, S., Drugeon, G., Kress, M., Arman, I., Haenni, A.L., Celís, L.E., Philippe, M., Justesen, J., y Kisselev, L. (1994), "A highly conserved eukaryotic protein family possessing properties of a polypeptide chain reléase factor". Nature 372,701-703. Frolova, L., Le Goff X., Zhouravleva, G., Davydova, E., Philippe, M. y Kisselev, L. (1996), "Eukaryotic polypeptide chain reléase factor eRF3 is an eRF1 - and ribosome-dependent guanosine triphosphatase". RNA 4, 334-341. Glover J.R. , Kowal, A.S., Schirmer, E.C., Patino, M.M., Liu J.J. y Lindquíst S. (1997), "Self-seeded fibers formed by sup35, the protein determinant of {PSI+}, a heritable prionlike factor of S. Cerevisíae". Cell 89, Gottesman S., R. Wickner, y M.r. Maurizi. (1997), "Protein quality control: triage by chaperones and proteases". Genes & Dev. 11 , 815-823. Gozalbo, D., y Honmann, S. (1990), "Nonsense suppressors partially revert the decrease of the mRNA levéis of a nonsense mutant alíele ¡n yeast". Curr. Genetics 17, 77-79. Guarente, L. (1983), "Yeast promoters and LacZ fusions designed to study expression of cloned genes in yeast". Methods ¡n enzymol. 101 , 181-191. Hagan, K.W., Ruiz-Echevarria, M.J., Quan, Y. Y Peltz S.W. 81995), "Characterization of cis-acting sequences and decay intermediates ¡nvolved in nonsense-metiated mRNA tumover". Mol. Cell. Biol. 15, 809-823. Hall, G.W., y Thein, S. (1994), "Nonsense-codons mutations in the internal exon of the B-globin gene are not associated with a reduction in B-mRNA accumulations: A mechanism for the phenotype of dominant B-thalassemia". Blood 83, 2031-2037. Hayashi, S.-l., y Murakami, Y. (1995), "Rapid and regulated degradation of omithine decarboxylase". Biochem. J. 306, 1-10. He, F., Brown, A.H., y Jacobson, A. (1997), "Upflp, Nmd2p, and Upf3p are interacting components of the yeast nonsense-mediated mRNA decay pathway". Mol. Cell. Biol. 17, 1580-94. He, F. Y Jacobson A. (1995), "Identification of a novel component of the nonsense-mediated mRNA decay pathway using an interacting protein screen". Genes & Dev. 9, 437-454.

He, F., Peltz, S.W., Donahue, J.L., Rosbash, M., y Jacobson, A. (1993), "Stabilization and ribosome association of unsplíced pre-mRNAs in a yeast upfl -mutant". Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 90, 7034-7038. Howard, M., Frizzell R.A. y Bedwell D.M. (1996), "Aminoglycoside antibiotics restore CFTR function by overcoming premature stop mutations". Nature Med. 2, 467-9. Jacobson, A. (1996), "Poly (A) metabolism and translation: the closed loop model". En Translational control (eds. Hershey, J.W.B. Mathews, M.B. y Sonenberg N.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview NY-451-480. Jacobson, A. y Peltz, S.W. (1996), "Interrelationships of the pathways of mRNA decay and translation in eukaryotic cells". Ann. Rev. Biochem. 65. 693-739. Koonin, E.V. (1992), "A new group of putative RNA helicases". TIBS 17, 495-497. Lee, B.S., y Culbertson, M.R. (1995), "Identification of an additional gene required for eukaryotic nonsense mRNA turnover", Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92. 10354-10358. Leeds, P., Peltz, S.W., Jacobson, A. y Culbertson, M.R. (1991), "Gene products that promote mRNA turnover in Saccharomyces cerevisiae". Mol. Cell. Biol. 12,2165-2177.

Long, R. M., Elliot, D. J., Stutz, F., Rosbash, M., y Singer, R.H. (1995), "Spatial consequences of detective processing of specific yeast mRNAs revealed by fluorescent in situ hybridization". RNA 1 , 1071-1078. Losson R., y Lacroute, F. (1979), "Interference of nonsense mutations with eukaryotic messenger RNA stability". Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76, 5134-7. Maquat, L.E. (1995), "When cells stop making sense: effeets of nonsense codons on RNA metabolism in vertébrate cells". RNA 1 , 453-465. McKusick, V.A.; (con la ayuda de Francomano, C.A., Antonarakis, S.E., y Pearson, P.L. (1994), "Mendelian inheritance in man : a catalog of human genes and genetic disorders". Johns Hopkins University Press. Baltimore MD. (Sitio Web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/). Muhlrad D. Y Parker, R. (1994), "Premature translational termination triggers mRNA decapping". Nature 370,578-581. Patino, M.M., Liu, J.J., Glover J.R. y Lindquist, I. (1996), "Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast". Science 273, 622-626. Paushkin S.V., Kushnirov, V.V., Smirnov, V.N. y Ter-Avanesyan, M.D. (1996), "Propagation of the yeast prion-like {PSI+} determinants mediaated by oligomerization of the Sup35-encoded poiypeptide chain-release factor". EMBO J. 15,317-3134.

Paushkin S.V., Kushnirov, V.V., Smirnov, V.N. y Ter-Avanesyan, M.D. (1997a). "In Vitro propagation of the prion-like state of yeast Sup35 protein". Science 277, 381-383. Paushkin S.V., Kushnirov, V.V., Smirnov, V.N. y Ter-Avanesyan, M.D. (1997b). "Interaction between yeast Sup45p(eRF1 ) and Sup35p(eRF3) polypeptide chain reléase factors: Implications for prion-dependet regulation". Mol. Cell. Biol. 17, 2798-2805. Peltz, S.W., Brown, A.H. y Jacobson, A. (1993), "mRNA destabilization triggered by premature translational termination depends on three mRNA sequence elements and at least one trans-acting factor". Genes & Dev. 7, 1737-1754. Peltz, S.W., Trotta, C, Freng, H., Brown, A.H., Donahue, J.L., Welch, E.W. y Jacobson, A. (1993a), "Identification of the cis-acting sequences and trans-acting factors ¡nvolved in nonsense-mediated mRNA decay". En Protein Synthesis and Tarqeting in Yeast (Eds. M. Tuite, J. McCarthy, A.

Brown, y F. Sherman), Springer-Verlag H71 : 1 -10. Peltz, S.W., Feng, H., Welch, E.W. y Jacobson, A. (1994), "Nonsense-mediated mRNA decay ¡n yeast". En Proqress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. Vol 47. Pp. 271 -298. Academic press, New " York. Perlick, H.A., Medghalchi, S.M., Spencer, F.A., Kendzior, R.J. Jr. Y Dietz, H.C. (1996), "Mammalian orthologues of a yeast regulator of nonsense-transcript stability". Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93, 10928-10932.

Pulak, R. Y Anderson, P. (1993), "mRNA surveillance by the Caenorhabditis elegans smg genes". Genes & Dev. 7, 1885-1897. Rose, M.D., Winston, D.F. y Hieter, P. (1990), "Methods in Yeast Genetics". Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Ross, J. (1995), "mRNA stabiiity ¡n mammalian cells". Microbiol.

Rev. 59, 423-450. Ruiz-Echevarria, M.J., K. Czaplinski, y S.W. Peltz. (1996), "Making sense of nonsense in yeast". TIBS 21 , 433-438. Ruiz-Echevarria, M.J., González, C.l. y Peltz. S.W. (1998), "identifying the right stop: Determining how the surveillance complex recognizes y degrades an aberrant mRNA". EMBO J. 17, 575-589. Ruiz-Echevarria, M.J., y Peltz. S.W. (1996). "Utilízing the GCN4 leader región to investígate the role of the sequence determinants in nonsense-mediated mRNA decay". EMBO J. 15, 2810-2819. Scheistl, R.H. y Geitz, R.D. (1989), "Hígh efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier". Curr. Genetics 16: 339-346.40. Somogyi, P., Jenner, A.J., Brierley, I.A. y Inglis, S.C. (1993), "Ribosomal pausing during translation of an RNA pseudoknot". Mol. Cell. Biol. 13, 6931-6940. Stansfield, I., Grant, C.M., Akhmaloka, y Tuite, M.F. (1992), "Ribosomal asscociation of the yeast SAL4(SUP45) gene product: implications for ¡ts role in traslation fidelity and termination". Mol. Microbiol 6, 3469-3478.

Stansfield, I., Jones, K.M., Kushnirov, V.V., Dagakesamanskaya, A.R., Poznyakov, A.I., Paushkin, S.V., Nierras, C.R., Cox, B.S., Ter-Avanesyan, M.D. y Tuite, M.F. (1995), "The products of the SUP45(Erf1 ) AND sup35 genes interact to medíate translation termínation in Saccharomyces cerevisiae". EMBO J. 14, 4365-4373. Suzuki, C.K., Rep, M., van Dijil, J.M., Suda, K., Grivell, L.A. y Schatz, G. (1997), "ATP-dependent proteases that also chaperone protein biogénesis". TIBS 22, 118-123. Tarun, S.Z., Wells, S.E., Deardorff, J.A. y Sachs, A.B. (1997), "Translation initiation factor elF4G mediates in vítro poly(A) tail-dependent translation". Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 94, 9046-9051. Ter-Avanesan, M.D., Dagkesamanskaya, A.R., Kushnírov, V.V. y Smirnov, V.N. (1994), "The SUP35 omnipotent suppresor is ¡nvolved in the maintenance of the non-Mendelian determínant {PSI} ¡n the yeast Saccharomyces cerevísiae". Genetics 137, 671-676. Tu, C, Tzeng, T.-H. y Bruenn, J.A. (1992), "Ribosomal movement impeded at a pseudoknot required for ribosomal frameshifting". Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 8636-8640. Tate, W.P. y Brown, C.M. (1992), "Translation termination: "Stop" for protein synthesis of "Pause" for regulation of gene expression". Biochemistry 31 , 2443-2450.

Weng, Y., Czaplinski, K. Y Peltz, S.W. (1996a), "Genetic and biochemical characterization of the mútations in the ATPase and helicase regions of Upfl Protein". Mol. Cell. Biol. 16, 5477-5490. Weng, Y., Czaplinski, K. Y Peltz, S.W., (1996b), "Identification and characterization of mutations in the UPF1 gene that affect nonsense suppression and the formation of the Upf protein complex, but not mRNA turnover". Mol. Cell. Biol. 16. 5491-5506. Weng, Y., Czaplinski, K. Y Peltz, S.W. (1998), "ATP is a cofactor of the Upfl protein that modulates it translation termination and RNA binding activities". RNA 4, 205-214. Weng, y., Ruiz Echevarría, M.J., Zhang, S., Cui, Y., Czaplinski, k., Dinman J.D. y Peltz, S.W. (1997), "Characterization of the nonsense -mediated mRNA decay pathway and its effect on modulating translation termination and programmed frameshifting". En mRNA Metabolism and Post-transcriptional Gene Requlation. Modern Cell Biology 17, 241 -263. Wíckens, M., Anderson, P. y Jackson, R.J. (1997), "Life and death in the cytoplasm: messages from the 3' end. Curr. Opin". Genet & Dev. 7, 220-32. Wickner, R.B. (1994), "[URE3] as an altered URE2 protein: evídence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae". Science 264, 566-569. Wolin, S.L. y Walter, P. (1988), "Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotíc mRNA". EMBO J. 7, 3559-3569.

Zhang, J. Y Maquat, L.E. (1997), "Evidence that translation reinitiation abrogates nonsense-mediated mRNA decay in mammalian cells". EMBO J. 16, 826-833. Zhang, S., Ruiz-Echevarria, M.J., Quan Y., y Peltz S.W. (1995), "Identification and characterization of a sequence motif involved in nonsense-mediated mRNA decay". Mol. Cell. Biol. 15, 2231-2244. Zhang, S., Welch, E.W., Hagan, K.W., Brown, A.H., Peltz, S.W., y Jacobson, A. (1995), "Polysome associated mRNAs are substrates for the nonsense mediated mRNA decay pathway ¡n Saccharomyces cerevisiae". RNA 3, 234-244. Zhouravleva, G, Frolova, L., LeGoff, X., LeGuellec, R., Inge Vechtomov, S., Kisselev, L., y Phillippe, M. (1995), "Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain reléase factors, eRF1 and eRF3". EMBO J. 14, 4065-4072.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un complejo multiproteínico aislado caracterizado porque comprende una proteína Upfl p humana, un factor de liberación de peptidilo eucariótico 1 (eRF1 ) y un factor de liberación de peptidilo eucariótico 3 (eRF3), en donde dicho complejo es efectivo para modular la actividad de peptidil transferasa durante traducción. 2.- El complejo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende Upf3p y/o Upf2p humanas. 3.- Un anticuerpo caracterizado porque se une al complejo que se reclama en la reivindicación 1. 4.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque es un anticuerpo monoclonal o policlonal. 5.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque tiene una marca. 6.- Un agente que se une al complejo caracterizado porque se reclama en las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque inhibe la actividad ATPasa de Upfl p; la actividad GTPasa de eRF1 o eRF3; la unión de ARN; la unión de eRF1 ; la unión de eRF3; o la unión del complejo o los factores del mismo a un ribosoma. 7.- Un agente caracterizado porque inhibe o modula la unión de Upfl p humana a eRF1 o eRF3; o de eRF1 o eRF3 a Upfl p. 8.- Un agente caracterizado porque inhibe o modula la unión de Upf3p humana a eRF1 o eRF3; o de eRF1 o eRF3 a Upf3p. 9.- Un agente caracterizado porque facilita la unión de Upfl p humana a eRF1 o eRF3; o de eRF3 o eRF1 o eRF3 a Upfl p. 10.- Un agente caracterizado porque facilita la unión de Upf3p humana a eRF1 o eRF3; o de eRF3 o eRF1 o eRF3 a Upf3p. 1 1 .- Un agente caracterizadoque modula la unión de Upfl p humana, eRF1 o eRF3, a un ribosoma. 12.- El agente de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque tiene una marca o marcador. 13.- El agente de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque es una molécula de antisentido o una ribozima. 14.- El uso del complejo como el que se reclama en la reivindicación 1 , para prepar un medicamento para modular la actividad de peptidil transferasa durante la traducción, en donde dicho medicamento se provee para facilitar la terminación de la traducción, por medio de lo cual modula la actividad de peptidii transferasa. 15.- El uso del agente como el que se reclama en la reivindicación 6, para prepar un medicamento para modular la actividad de peptidil transferasa durante la traducción, en donde dicho medicamento se provee para suprimir la terminación de traducción sin sentido, por medio de lo cual modula la actividad de peptidil transferasa. 16.- El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde la actividad de peptidil transferasa durante la traducción comprende iniciación, alargamiento, terminación y degradación de ARNm. 17.- El uso del agente como el que se reclama en la reivindicación 6, para prepar un medicamento para modular la eficiencia de terminación de traducción de ARNm en un codón sin sentido y/o para promover la degradación de transcritos aberrantes, en donde dicho medicamento se provee para inhibir la unión de Upfl p humana a eRF1 o eRF3; o de eRF1 o eRF3 a Upfl p, por medio de lo cual modula la eficiencia de terminación de traducción de ARNm en un codón sin sentido y/o promueve la degradación de transcritos aberrantes. 18.- El uso de un agente como el que se reclama en la reivindicación 6, para preparar un medicamento para modular la eficiencia de terminación de traducción de ARNm en un codón sin sentido y/o para promover la degradación de transcritos aberrantes, en donde dicho medicamento inhibe la actividad ATPasa/helicasa de Upfl p; la actividad GTPasa de eRF1 o eRF3; o la unión de ARN a un ribosoma, por medio de lo cual modula la eficiencia de terminación de traducción de ARNm en un codón sin sentido y/o promueve la degradación de transcritos aberrantes. 19.- Un método para seleccionar un fármaco que afecta la actividad de peptidil transferasa durante la traducción, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto células con un fármaco candidato; y (b) probar la modulación del complejo como el que se reclama en las reivindicaciones 1 o 2; en donde un fármaco que modula el complejo como el que reclama en la reivindicación 1 , afecta la actividad peptidil transferasa. 20.- Un método para seleccionar un fármaco activo que afecta el incremento de terminación de traducción, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto células con un fármaco candidato; y (b) probar la modulación del complejo de proteína que se reclama en las reivindicaciones 1 o 2; en donde un fármaco que modula el complejo de proteína como el que se reclama en la reivindicación 1 , afecta el incremento de terminación de traducción. 21 .- Un método para seleccionar un fármaco que afecta el incremento de terminación de traducción, caracterizado porque comprende: (a) incubar el fármaco y el complejo; y (b) medir el efecto sobre la supresión de sin sentidos, por medio de lo cual se selecciona un fármaco que afecta el incremento en la terminación de traducción. 22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque ia prueba es una prueba de ARN o una prueba de ATPasa. 23.- Un método para seleccionar un fármaco que inhibe la interacción entre Upfl p y eRF1 o eRF2, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto células con un fármaco candidato; y (b) probar la modulación del complejo como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde un fármaco que modula la unión de Upfl p a eRF1 o eRF2; o la unión de eRF1 o eRF2 a Upfl p, afecta el incremento de terminación de traducción. 24.- El uso de una célula que contiene un vector que comprende el ácido nucleico que codifica para el complejo que se reclama en las reivindicaciones 1 o 2; o un antisentido del mismo, para preparar una composición para modular la eficiencia de terminación de traducción de ARNm y/o la degradación de transcritos aberrantes en una célula, en donde la sobreexpresión de dicho vector en dicha célula produce un complejo sobreexpresado a fin de interferir con la función del complejo. 25.- Un método para identificar un estado patológico que implica un defecto en el complejo como el que se reclama en la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende: (a) transfectar una célula con un ácido nucleico que codifica para el complejo como el que se reclama en la reivindicación 1 ; (b) determinar la proporción del complejo defectuoso en la célula después de la transfección; (c) comparar la proporción del complejo defectuoso en la célula después de la transfección con la proporción de complejo defectuoso en la célula antes de la transfección. 26.- El uso del complejo como el que se reclama en la reivindicación 1 , o del agente como el que se reclama en la reivindicación 6, y un vehículo o diluyente farmacéutico, para preparar un medicamento para tratar una enfermedad asociada con la actividad de peptidil transferasa. 27.- El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde la enfermedad se origina de una mutación sin sentido o de alteración de marco. 28.- El uso de conformidad con la reivindicación 27, en donde la enfermedad es ß-talasemia, ß-globina, distrofia muscular de Duchenne/Becker, hemofilia A, hemofilia B, enfermedad de Von Willebrand, osteogénesis imperfecta (Ol), cáncer de mama, cáncer de ovario, tumor de Wilms, enfermedad de Hirschsprung, fibrosis quística, cálculos en riñon, hipercolesterolemia familiar (FH), retinitis pigmentosa o neurofibromatosis, retinoblastoma, ATM, enfermedad de Costmann. \ *