BR112019012012A2 - uso de andaimes de rna biológicos com seleção in vitro para gerar aptâmeros de ligação a molécula pequena robustos para biossensores codificáveis geneticamente - Google Patents

Abstract

são aqui proporcionadas bibliotecas de andaimes derivadas de ribocomutação e pequenas ribozimas e seus métodos de uso. os andaimes da invenção rendem aptâmeros que são facilmente identificados e caracterizados em virtude do andaime estrutural. a natureza do andaime predispõe estes rnas para acoplar a domínios de leitura para engenheirar biossensores que funcionam in vitro e in vivo. biossensores, agentes de rna sintéticos e agentes de dna sintéticos e seus métodos de uso são também fornecidos

Description

USO DE ANDAIMES DE RNA BIOLÓGICOS COM SELEÇÃO IN VITRO PARA GERAR APTÂMEROS DE LIGAÇÃO A MOLÉCULA PEQUENA ROBUSTOS PARA BIOSSENSORES CODIFICÁVEIS GENETICAMENTE

PEDIDO RELACIONADO [0001] Este pedido de patente reivindica o beneficio de prioridade do Pedido de patente provisório US 62/432.879, depositado em 12 de dezembro de 2016, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência na sua totalidade para todos os propósitos.

DECLARAÇÃO COM RELAÇÃO A PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADOS PELO GOVERNO FEDERAL [0002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob o número de concessão CMMI CHE1150834 concedido pela National Science Foundation. O governo tem certos direitos na invenção.

FUNDAMENTOS [0003] Os dispositivos de RNA alostérico são cada vez mais vistos como ferramentas importantes capazes de monitorar a evolução das enzimas, otimizar as vias metabólicas modificadas, facilitar a descoberta de novos genes e como reguladores de terapias baseadas em ácidos nucleicos. Um gargalo no desenvolvimento dessas plataformas, no entanto, é a disponibilidade de aptâmeros de RNA de ligação a molécula pequena que funcionam de forma robusta no ambiente celular. Embora os aptâmeros possam ser criados contra praticamente qualquer alvo desejado pela seleção in vitro, muitos desses aptâmeros baseados em RNA não podem ser facilmente integrados em dispositivos ou não funcionam de maneira confiável em um contexto celular. Consequentemente, permanece a necessidade

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 5/154

2/110 de aptâmeros e métodos para desenvolver aptâmeros.

SUMÁRIO [0004] Uma abordagem inovadora é descrita aqui utilizando andaimes derivados de ribocomutadores e pequenas ribozimas. Esta abordagem, aplicada aqui ao 5-hidroxitriptofano em um aspecto exemplar, produz aptâmeros que são facilmente identificados e caracterizados em virtude do andaime estrutural. A natureza do andaime predispõe esses RNAs ao acoplamento a dominios de leitura para projetar dispositivos de ácido nucleico que funcionam in vitro e no contexto celular.

[0005] Em um aspecto, é provida uma biblioteca de oligonucleotideos compreendendo uma pluralidade de oligonucleotideos não idênticos. Os oligonucleotideos individuais da biblioteca compreendem uma primeira sequência compreendendo um dominio de hélice, uma segunda sequência compreendendo um primeiro dominio de hairpin e uma terceira sequência compreendendo um segundo dominio de hairpin, em que o dominio hélice, o primeiro dominio de hairpin e o segundo dominio de hairpin formam uma junção de oligonucleotideos contendo um dominio de ligação ao ligando e em que a biblioteca compreende uma pluralidade de dominios de ligação ao ligando não idênticos.

[0006] Em uma modalidade, cada dominio de hélice é independentemente uma hélice totalmente complementar compreendendo opcionalmente um ou mais nucleotideos desestabilizadores selecionados do grupo que consiste em um par de bases não coincidentes, um par de bases de oscilação G • U e uma protuberância. Em uma modalidade, cada dominio da hélice é uma hélice totalmente complementar.

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 6/154

3/110 [0007] Em uma modalidade, cada primeiro dominio de hairpin compreende independentemente um ou mais nucleotideos desestabilizadores selecionados do grupo que consiste em um par de bases não coincidentes, um par de bases oscilantes G»U e uma protuberância e/ou cada segundo dominio de hairpin independentemente compreende um ou mais nucleotideos desestabilizadores selecionados do grupo que consiste em um par de bases não coincidentes, um par de bases oscilantes G»U e uma protuberância.

[0008] Em uma modalidade, o dominio de hélice tem pelo menos 4 a 10 pares de bases de comprimento ou pelo menos 10 pares de bases de comprimento.

[0009] Em uma modalidade, os oligonucleotideos são oligorribonucleotideos.

[00010] Em uma modalidade, os oligonucleotideos compreendem individualmente uma sequência que tem uma série de sequências ligadas de acordo com a Fórmula I: P1-J1/2-P2-L2-P2'-J2/3-P3L3-P3'-J3/1-P1' (1), em que representa uma ligação, Pl e Pl ' formam a hélice, P2, L2 e P2 ' formam o primeiro hairpin, P3, L3 e P3' formam o segundo hairpin e Jl/2, J2/3 e J3/1 juntos formam a junção de oligonucleotideos. Em uma modalidade, J2/3 compreende um motivo de alça T. Em uma modalidade, o motivo de alça T compreende a sequência UUGAA, opcionalmente, em que a guanosina da alça T forma um par de bases de Watson-Crick com uma citidina em J3/1.

[00011] Em uma modalidade, o dominio da hélice tem uma primeira extremidade e uma segunda extremidade, e a primeira extremidade está próxima à junção do oligonucleotideo e a segunda extremidade está ligada a um módulo de leitura baseado no oligonucleotideo. Em uma modalidade, o módulo de leitura

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 7/154

4/110 baseado em oligonucleotideo é um fluorogênico, por exemplo, um aptâmero de ligação de fluoróforo de Brócolis ou um módulo de leitura baseado em troca, por exemplo, um troca pbuE. Em uma modalidade, o módulo de leitura baseado em oligonucleotideo é um módulo de leitura baseado em oligorribonucleotideo.

[00012] Em uma modalidade, oligonucleotideos individuais têm correspondência de sequência com uma sequência ribocomutador de guanina xpt-pbuX de Bacillus subtilis compreendendo cerca de 23 resíduos de nucleotídeos variáveis dentro da junçãode oligonucleotideos ou oligonucleotideos individuais têm correspondência de sequência com uma sequência de ribocomutador de di-GMP cíclico Vc2 de Vibrio cholera compreendendo cerca de 21 resíduos de nucleotídeos variáveis dentro da junção de oligonucleotideos ou oligonucleotideos individuais têm correspondência de sequência com uma sequência de ribozima de cabeça de martelo de Schistosoma mansoni compreendendo cerca de 21 resíduos de nucleotídeos variáveis dentro da junção de oligonucleotideos.

[00013	] Em uma	modalidade,	a	junção de	oligonucleotideos é
uma junção de N	vias, em que	N	é dois, t	rês, quatro	ou cinco
ou em	que N é do	is ou em que	N	é três ou	em que N é	quatro ou
em que	N é cinco.
[00014	] Em uma	modalidade,	a	biblioteca	compreende	de cerca
de 421	a cerca de	4 membros não	idênticos.

[00015] Em outro aspecto, é provida uma biblioteca de oligonucleotideos compreendendo uma pluralidade de oligonucleotideos não idênticos. Os oligonucleotideos individuais da biblioteca compreendem uma primeira sequência compreendendo um domínio de hélice, uma segunda sequência compreendendo um primeiro domínio de hairpin e uma terceira

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 8/154

5/110 sequência compreendendo um segundo domínio de hairpin, em que o domínio de hélice, o primeiro domínio de hairpin e o segundo domínio de hairpin formam uma junção de oligonucleotídeos contendo um domínio de ligação ao ligando pré-selecionado e em que a biblioteca compreende uma pluralidade de domínios de ligação ao ligando não idênticos.

[00016] Em uma modalidade, cada domínio de hélice é independentemente uma hélice totalmente complementar compreendendo opcionalmente um ou mais nucleotídeos desestabilizadores selecionados do grupo que consiste em um par de bases não coincidentes, um par de bases de oscilação G • U e uma protuberância. Em uma modalidade, cada domínio da hélice é uma hélice totalmente complementar.

[00017] Em uma modalidade, cada primeiro domínio de hairpin compreende independentemente um ou mais nucleotídeos desestabilizadores selecionados do grupo que consiste em um par de bases não coincidentes, um par de bases oscilantes G»U e uma protuberância e/ou cada segundo domínio de hairpin independentemente compreende um ou mais nucleotídeos desestabilizadores selecionados do grupo que consiste em um par de bases não coincidentes, um par de bases oscilantes G»U e uma protuberância.

[00018] Em uma modalidade, o domínio de hélice tem pelo menos 4 a 10 pares de bases de comprimento ou pelo menos 10 pares de bases de comprimento.

[00019] Em uma modalidade, os oligonucleotídeos são oligorribonucleotídeos.

[00020] Em uma modalidade, os oligonucleotídeos individuais compreendem uma sequência que tem uma série de sequências ligadas de acordo com a Fórmula I: P1-J1/2-P2-L2-P2'-J2/3-P3

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 9/154

6/110

L3-P3' - J3/1-P1 ' (I), em que representa uma ligação, Pl e PI ' formam a hélice, P2, L2 e P2 ' formam o primeiro hairpin, P3, L3 e P3' formam o segundo hairpin e Jl/2, J2/3 e J3/1 juntos formam a junção de oligonucleotideos. Em uma modalidade, J2/3 compreende um motivo de alça T. Em uma modalidade, o motivo de alça T compreende a sequência UUGAA, opcionalmente, em que a guanosina da alça T forma um par de bases de Watson-Crick com uma citidina em J3/1.

[00021] Em uma modalidade, o dominio da hélice tem uma primeira extremidade e uma segunda extremidade, e a primeira extremidade está próxima à junção do oligonucleotideo e a segunda extremidade está ligada a um módulo de leitura baseado no oligonucleotideo. Em uma modalidade, o módulo de leitura baseado em oligonucleotideo é um fluorogênico, por exemplo, é um aptâmero de ligação de fluoróforo de Brócolis ou módulo de leitura baseado em troca, por exemplo, um troca pbuE. Em uma modalidade, o módulo de leitura baseado em oligonucleotideo é um módulo de leitura baseado em oligorribonucleotideo.

[00022] Em uma modalidade, oligonucleotideos individuais compreendem sequências com correspondência de sequência com uma sequência ribocomutador de guanina xpt-pbuX de Bacillus subtilis compreendendo cerca de 23 resíduos de nucleotideos variáveis dentro da junção de oligonucleotideos ou oligonucleotideos individuais compreendem sequências com correspondência de sequência com uma sequência de ribocomutador de di-GMP ciclico Vc2 de Vibrio cholera compreendendo cerca de 21 resíduos de nucleotideos variáveis dentro da junção de oligonucleotideos ou oligonucleotideos individuais compreendem sequências com correspondência de sequência com uma sequência de ribozima de cabeça de martelo

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 10/154

7/110 de Schistosoma mansoni compreendendo cerca de 21 resíduos de nucleotídeos variáveis dentro da junção de oligonucleotideos.

[00023] Em uma modalidade, a junção de oligonucleotideos é uma junção de N vias, em que N é dois, três, quatro ou cinco ou em que N é dois ou em que N é três ou em que N é quatro ou em que N é cinco.

[00024] Em uma modalidade, o sítio de ligação ao ligando préselecionado compreende um sítio de ligação para um composto selecionado do grupo que consiste em um aminoácido, um peptídeo, uma nucleobase, um nucleosídeo, um nucletídeo, um íon metálico, um neurotransmissor, um hormônio, um ingrediente farmacêutico ativo e derivados dos mesmos. Em uma modalidade, o sítio de ligação ao ligando pré-selecionado compreende um sítio de ligação para um ligando selecionado do grupo que consiste em um aminoácido, uma nucleobase, um nucleosídeo, um nucleotídeo, um neurotransmissor, um hormônio e derivados dos mesmos. Em uma modalidade, o sítio de ligação ao ligando préselecionado compreende um sítio de ligação para pelo menos um ligando selecionado do grupo que consiste em 5-hidróxi-Ltriptofano, L-triptofano, serotonina e 5-hidróxi-L-triptofanometilamida. Em uma modalidade, o ligando é pelo menos um de 5-hidróxi-L-triptofano ou serotonina.

[00025] Ainda em outro aspecto, é provido um método de seleção de uma pluralidade de oligonucleotideos de ligação ao ligando não idênticos. O método inclui uma etapa de colocar uma biblioteca de oligonucleotideos compreendendo uma pluralidade de oligonucleotideos em contato com um ligando em condições adequadas para ligação ao ligando, em que oligonucleotideos individuais compreendem uma primeira sequência compreendendo um domínio de hélice, uma segunda

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 11/154

8/110 sequência compreendendo um primeiro dominio de hairpin e uma terceira sequência compreendendo um segundo dominio de hairpin, em que o dominio de hélice, o primeiro dominio de hairpin e segundo dominio de hairpin formam uma junção de oligonucleotideos e uma etapa de particionamento da biblioteca de oligonucleotideos em um endereçável espacialmente, tal que a pluralidade de oligonucleotideos de ligação aos ligantes não idênticos seja selecionada, em que os oligonucleotideos que têm a junção de oligonucleotideos compreendem adicionalmente um dominio de ligação ao ligando e em que os dominios de ligação ao ligando da biblioteca de oligonucleotideos compreendem residues de nucleotideos variáveis, é selecionado.

[00026] Em uma modalidade, o método compreende ainda uma etapa compreendendo particionar competitivamente a biblioteca de oligonucleotideos com uma solução de ligando livre entre a etapa de contato e a etapa de separação.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [00027] As características e vantagens anteriores e outras da presente invenção serão mais completamente compreendidas na seguinte descrição detalhada de modalidades ilustrativas tomadas em grupamento com os desenhos anexos. Este arquivo de patente ou de pedido de patente contém pelo menos um desenho executado em cor. Cópias dessa patente ou publicação de pedido de patente com desenhos coloridos serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.

[00028] A figura IA mostra o andaime GR. O andaime GR é derivado do dominio de aptâmero do ribocomutador de guanina de B. subtilis xpt-pbuX. O aptâmero é constituído por três regiões emparelhadas (P) ligadas pelas regiões de junção (J)

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 12/154

9/110 da junção de três vias que contém o sitio de ligação guanina (Gua, magenta) (as linhas tracejadas representam interações diretas de RNA-ligando). Nucleotideos em ciano esboçado são os que foram randomizados para seleção. As voltas terminais de P2 e P3 (L2 e L3, caixa verde) participam de uma interação terciária que organiza o dominio. Abaixo está a estrutura tridimensional do RNA (PDB ID 4FE5) com o mesmo esquema de coloração enfatizando a relação espacial entre o sitio de ligação do ligando e os nucleotideos randomizados.

[00029] A figura 1B mostra o andaime CDG. A estrutura secundária (superior) e terciária (fundo) do andaime CDG derivado do ribocomutador de di-GMP ciclico de Vc2 de V. cholera de dominio do aptâmero (PDB ID 3IWN) . O esquema de marcação e coloração é como descrito na Figura IA.

[00030] A Figura 1C mostra o andaime HH. A estrutura secundária (topo) e terciária (fundo) do andaime HH derivado da ribozima de cabeça de martelo de S. mansoni (PDB ID 3ZP8) . O esquema de marcação e coloração é como descrito na Figura IA.

[00031] A Figura 2A mostra a estrutura quimica do 5-hidróxiL-triptofano.

[00032] A Figura 2B mostra uma representação de árvore filogenética não enraizada da matriz de distância de sequências derivadas do ciclo 7 da seleção GR-SSIII. As sequências são agrupadas em três grupamentos principais, que são coloridos de forma independente. A distância é expressa como a estimativa da probabilidade máxima (MLE) de quantas substituições ocorreram por sitio entre dois nós da árvore (barra mostrada para escala).

[00033] A Figura 2C mostra uma representação de árvore

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 13/154

10/110 filogenética não enraizada da matriz de distância de sequências derivadas do ciclo 7 da seleção GR-GsI. Os quatro grupamentos dos quais as sequências representativas foram analisadas são mostrados em cores independentes (legenda mostrada à direita); região preta representa grupamentos e regiões da árvore não analisados.

[00034] A figura 2D mostra um modelo de covariação de seis grupamentos observados derivados das seleções de GR; as cores são consistentes com as Figuras 2B e 2C. As linhas tracejadas correspondem às regiões do andaime que foram randomizadas e as linhas que ligam L2 e L3 denotam grupamentos em que as sequências foram mantidas que suportariam a interação terciária.

[00035] A Figura 3A mostra o resultado da Acilação seletiva de 2'-Hidroxila analisada por sonda quimica de Extensão do iniciador (SHAPE) de três sequências (5HTP-I, -II e -III) em comparação com o ribocomutador de xpt de guanina nativo. Para maior clareza, as regiões do gel que correspondem à cadeia J2/3 e L3 são mostradas (gel inteiro mostrado na Figura 4a suplementar). Enquanto todos os três RNAs revelam reduções dependentes de ligando na reatividade quimica da cadeia principal do RNA dentro ou adjacente a J2/3, apenas 5HTP-II preserva um ponto crucial de assinatura de reatividade em L3 que é indicativo da formação de sua interação com L2 no ribocomutador de xpt de guanina.

[00036] A Figura 3B é uma quantificação das intensidades diferenciais dependentes de ligando da sonda de SHAPE de 5HTPII na presença e ausência de 5HTP, revelando que a maioria das alterações de reatividade está localizada na junção. O aumento do sinal de L3 sugere o acoplamento entre a ligação do

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 14/154

11/110 ligando na junção e a formação da estrutura terciária.

[00037] A Figura 3C mostra uma análise de calorimétrica de titulação isotérmica (ITC) da ligação de 5HTP ao 5HTP-II com (esquerda) e sem (direita) os cassetes de amplificação 5'- e 3'-, demonstrando que estas regiões não afetam a ligação do ligando.

[00038] A Figura 3D mostra uma estrutura cristalina do aptâmero 5HTP-II no complexo com 5-hidroxitriptofano (magenta). O verde destaca a interação L2-L3 do andaime origem (Figura IA) e o ciano indica os nucleotideos que foram randomizados na biblioteca de RNA de partida.

[00039] A Figura 3E mostra uma sobreposição dos dados de reatividade de SHAPE quantificados no painel (B) na estrutura de cristal enfatizando a relação entre alterações dependentes de ligando na dinâmica da cadeia principal do RNA e da estrutura.

[00040] A Figura 4A mostra a bolsa de ligação de 5HTP no aptâmero 5HTP-II. A bolsa de ligação 5HTP dentro da junção de três vias forma um grupamento de interações de ligações de hidrogênio que engaja cada grupo funcional polar em 5hidroxitriptofano, exceto um átomo de oxigênio no grupo carboxilato que se torna uma amida para imobilizar o composto. Além disso, o complexo é estabilizado empilhando interações entre o anel de hidróxi-indol de 5HTP e as bases de adenina (A48 e A49) em J2/3.

[00041] A Figura 4B mostra a bolsa de ligação de 5HTP no aptâmero 5HTP-II. O núcleo da bolsa de ligação no aptâmero 5HTP-II (verde) é uma alça T que se sobrepõe quase perf eitamente às voltas em T do tRNA^phe (laranja) e ao ribocomutador (ciano) do pirofosfato de tiamina (TPP). Em

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 15/154

12/110 cada um dos três exemplos, o espaço entre duas purinas nas posições T4 e T5 (a numeração Tl-5 indica a posição do nucleotideo dentro do motivo da alça T) permite a intercalação de um anel aromático.

[00042] A Figura 5A mostra que um biossensor baseado em aptâmeros de 5HTP funciona em E. coli. O aptâmero de 5HTP-II do tipo selvagem ativa especificamente a fluorescência do repórter de Brócolis na presença de 5HTP. Em t = 0 minuto, 5HTP 2 mM foi adicionado ao meio.

[00043] A Figura 5B mostra que o aptâmero de 5HTP-II do tipo selvagem não ativa especificamente a fluorescência do repórter de Brócolis na presença de L-triptof ano. Em t = 0 minuto, Ltriptofano 5 mM foi adicionado ao meio.

[00044] A Figura 5C mostra que uma mutação pontual na bolsa de ligação 5HTP do aptâmero de 5HTP-II (A48U) também elimina a fluorescência na presença do fluoróforo. Em t = 0 minuto, 5HTP 2 mM foi adicionado ao meio.

[00045] A Figura 5D mostra traços de célula única de indução de fluorescência para o sensor 5HTP-II-Brócolis do tipo selvagem na presença de 5HTP. Em t = 0 minuto, 5HTP 2 mM foi adicionado ao meio.

[00046] A Figura 5E mostra traços de célula única de indução de fluorescência para o sensor de 5HTP-II-Brócolis do tipo selvagem na presença de L-triptofano. Em t = 0 minuto, Ltriptofano 5 mM foi adicionado ao meio.

[00047] A Figura 5F mostra traços de célula única de indução de fluorescência para a ligação incompetente do construto 5HTP-II A48U na presença de 5HTP. Em t = 0 minuto, 5HTP 2 mM foi adicionado ao meio.

[00048] A Figura 6A mostra a estrutura secundária de um

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 16/154

13/110 ribocomutador 5HTP/serotonina artificial ON baseado no aptâmero 5HTP-IV. O aptâmero 5HTP-IV é encaixado em uma linha tracejada, e os nucleotideos sólidos encaixados correspondem a nucleotideos diretamente envolvidos na formação de estruturas alternativas.

[00049] A Figura 6B mostra reações quantificadas de transcrição de passagem única do ribocomutador demonstrando antiterminação robusta após adição de 5HTP, serotonina ou 5HTP-NHme. As imagens de gel das reações de transcrição são mostradas à direita, exibindo a transição dependente de ligando dos produtos terminados (T) para os de leitura direta (RT). Titulação semelhante com L-triptofano não produziu a transcrição de leitura direta.

[00050] A Figura 7A mostra uma representação de árvore filogenética não enraizada da matriz de distância de sequências derivadas do ciclo 7 da seleção de CDG utilizando a transcriptase inversa Gsl. O grupamento do qual o aptâmero 5HTP foi derivado é destacado em vermelho. A distância é expressa como a estimativa da probabilidade máxima (MLE) de

quantas	substituições	ocorreram por sitio entre dois nós	da
árvore	(barra mostrada	para escala).
[00051]	A Figura 7B	mostra um modelo de	covariação	do
aptâmero 5HTP-VII; a	linha vermelha sólida	corresponde	às
regiões	do bioandaime	que foram randomizadas	e a linha	que
conecta	L2 e P3 denota	a interação terciária.
[00052]	A Figura 7C	mostra uma representação de árvore
filogenética não enraizada da matriz de	distância	de

sequências derivadas do ciclo 7 da seleção de HH utilizando a transcriptase inversa Gsl. O grupamento do qual o aptâmero 5HTP-VIII foi derivado é destacado em púrpura; as regiões

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 17/154

14/110

pretas	representam	grupamentos e	regiões não	analisadas	da
árvore.
[00053]	A Figura	7D	mostra um modelo de	covariação	do
aptâmero 5HTP-VIII;	a	linha púrpura sólida	corresponde	às
regiões	do bioandaime	que foram	randomizadas	e a linha	que
conecta	P2 e L3 denota	a interação	terciária.
[00054]	A Figura	8A	mostra uma	acumulação significativa	de

mutações no bioandaime pelo ciclo 7 da seleção com algumas posições na extremidade 3' atingindo uma frequência de mutação superior a 90% na seleção inicial utilizando Superscript III (Life Technologies). Há também uma forte propensão para o acúmulo de mutações em elementos de sequência fundamentais para a estrutura secundária e terciária (P2 e P3).

[00055] A Figura 8B mostra que o protocolo de seleção modificado usando um intron RT do grupo II desenvolvido (GslIIC) mostra um alívio na quantidade de mutações acumuladas no bioandaime GR, particularmente nas regiões P2 e P3. Isso permite a preservação de elementos estruturais projetados na sequência.

[00056] A Figura 8C mostra as frequências de erro observadas como uma função da posição dos nucleotídeos no ciclo 7 da seleção de CDG/GsI.

[00057] A figura 8D mostra as frequências de erro observadas como uma função da posição dos nucleotídeos no ciclo 7 da selecção HH/GsI.

[00058] A Figura 9A mostra uma análise de SHAPE dos aptâmeros 5HTP-IV, -V e -VI na ausência e presença de 5HTP. Barras para o lado destacam as regiões J2/3 e L3 que demonstram várias proteções dependentes de ligando na junção de três vias e a presença do ponto crucial de reatividade de assinatura no

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 18/154

15/110 diagnóstico L3 da interação L2-L3.

[00059] A Figura 9B mostra uma análise SHAPE de um aptâmero de ligação a 5HTP com andaime CDG. O gel bruto mostra modificações claras dependentes de ligando em Jl/2 e J2/3. O RNA Vc2 parental apresenta uma proteção dependente de ligando em P3 no sitio de acoplamento de tetra-alça, enquanto o aptâmero de 5HTP-VII mostra uma modificação dependente de ligando no lado oposto da hélice. Adicionalmente, nenhum dos RNAs apresenta nenhuma modificação na presença do ligando independentemente.

[00060] A Figura 9C mostra uma análise de SHAPE de um aptâmero de ligação de 5HTP com andaime HH. O gel bruto mostra modificações claras dependentes de ligando em Jl/2 e J2/3. As alterações em J2/3 localizam-se principalmente nas posições 3 e 4 de um motivo de alça T previsto. Além disso, se a estrutura for mantida, a alça Terminal de P3 (L3) que se encaixa em P2 no RNA parental mostra uma proteção dependente do ligando. A integração das bandas como uma função da distância no gel é mostrada à esquerda.

[00061] A Figura 10A mostra o mapa de densidade de elétron de 2F_O-F_C do complexo 5HTP-II/5HTP em torno do modelo contornado em 2σ. Todas as regiões do RNA são bem definidas pela densidade eletrônica, tornando a localização dos residues e da cadeia principal não ambigua. Os nucleotideos cianos foram randomizados na biblioteca de RNA original e ο 5HTP é mostrado em laranja.

[00062] A Figura 10B mostra uma omissão composta da bolsa de ligação do ligando do complexo 5HTP-II/5HTP contornado em 1σ mostrando uma localização de suporte da densidade clara do ligando (5HTP) e iridio hexammina adjacente (IrHex) .

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 19/154

16/110 [00063] A Figura 10C mostra o mapa de densidade de elétron de 2F_O-F_C final da bolsa de ligação de 5HTP do complexo 5HTPII/5HTP contornado em lo.

[00064] A Figura 11A mostra um diagrama R2R derivado da análise de variação de J2/3 do aptâmero 5HTP-VIII do grupamento mais populoso da seleção HH/GsI.

[00065] A Figura 11B mostra uma análise de variação de J2/3 do aptâmero de 5HTP-VIII comparando o padrão de variação de voltas em T encontrado em RNAs biológicos¹ (topo) e o grupamento contendo o aptâmero de 5HTP-VIII.

[00066] A Figura 12 mostra o esquema de construção dos biossensores 5HTP-Brócolis. Os nucleotideos vermelhos na estrutura secundária do Brócolis indicam o quarteto-G que forma a plataforma para DFHBI e os nucleotideos verde indicam as diferenças entre o espinafre e o Brócolis.

[00067] A Figura 13 é um resumo gráfico que mostra o desenho de aptâmeros de andaimes inovadores da invenção.

[00068] A Figura 14A é um esquema da estrutura secundária de biossensores de 5HTP e L-DOPA geneticamente codificados nos quais um aptâmero (ciano) em andaime GR é acoplado a um aptâmero fluorogênico (Brócolis, verde) por meio de um módulo de comunicação (laranja, CM; sequências no fundo) e estabilizado in vivo com o suporte de RNAt (amarelo).

[00069] A Figura 14B e Figura 14C ilustram mapas de calor da fluorescência induzida pelo ligando observado (topo) e brilho do sensor ligado ao ligando em relação a um controle de RNAt/Brócolis (fundo) para uma série de aptâmeros de andaime GR acoplados ao Brócolis com CMs de 2 a 5 pares de bases.

[00070] A Figura 14D e a Figura 14E descrevem mapas de calor do desempenho dos mesmos sensores em E. coli.

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 20/154

17/110 [00071] A Figura 15A e a Figura 15B mostram que o aptâmero 5GR-II de tipo selvagem ativa especificamente a fluorescência do repórter de Brócolis na presença de 5HTP, mas não na presença de L-triptofano.

[00072] A Figura 15C mostra que uma mutação pontual na bolsa de ligação 5HTP do aptâmero de 5GR-II (A48U) também elimina a fluorescência na presença do fluoróforo.

[00073] A Figura 15D, Figura 15E e Figura 15F representam traços de célula única de indução de fluorescência para o sensor de 5GR-II-Brócolis do tipo selvagem na presença de 5HTP, L-triptofano e o construto A48U de 5GR-II incompetente de ligação na presença de 5HTP. Em t = 0 minuto, tanto 5HTP 2 mM quanto L-triptofano 5 mM foram adicionados ao meio.

[00074] A Figura 16A mostra a sobreposição dos RNA ribocomutador parental de guanina de B. subtillis xpt e 5GR-11 sobre todos os átomos da cadeia principal. O ribocomutador de guanina (PDB 4FE5) é mostrado em vermelho e seu ligando, hipoxantina, mostrado em magenta. O aptâmero 5GR-II é mostrado em azul e seu ligando, 5HTP, mostrado em verde.

[00075] A Figura 16B mostra a sobreposição dos dois RNAs usando átomos da cadeia principal apenas em P2 e P3.

[00076] A Figura 16C representa uma visão da sobreposição de dois quádruplos de base que compreendem o núcleo da interação L2-L3, mostrando uma preservação completa das interações individuais de base que estabelecem essa interação terciária.

[00077] A Figura 17A - Figura 17D representa a sequência e a estrutura secundária das bibliotecas iniciais de RNA. A caixa verde destaca a região constante que é usada para iniciação e a caixa amarela destaca o código de barras especifico para cada andaime. Posições de nucleotideos que foram randomizados

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 21/154

18/110 na biblioteca inicial são destacadas em ciano.

[00078] A Figura 17A representa a sequência da biblioteca de RNA do aptâmero ribocomutador de guanina (GR) para a seleção utilizando o Superscript III RT.

[00079] A Figura 17B representa a sequência da biblioteca de RNA de GR utilizada para a seleção utilizando GsI-IIC RT.

[00080] A Figura 17C representa a sequência da biblioteca de aptâmero ribocomutador de GMP di-ciclico (CG) . A Figura 17D representa a sequência da biblioteca de ribozimas de cabeça de martelo (HR).

[00081] A Figura 18A - Figura 18C representa a seleção de aptâmeros de andaime que ligam seletivamente 3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA).

[00082] A Figura 18A representa a estrutura quimica da dopamina (1) e da L-DOPA (2).

[00083] A Figura 18B representa uma representação de árvore filogenética não enraizada da matriz de distância de sequências derivadas do ciclo 7 de uma seleção de GR-GsI-IIC contra L-DOPA. Os quatro grupamentos dos quais as sequências representativas foram incorporadas em biossensores fluorogênicos são mostrados em cores independentes. A região preta representa grupamentos e regiões não analisadas da árvore.

[00084] A Figura 18C representa os modelos de covariação dos quatro grupamentos, com cores consistentes com as do painel (B). Observe que a estrutura DGR-III MFE possui uma estrutura secundária alternativa que, se correta, elimina a interação alça-alça Terciária.

[00085] A Figura 19 representa a análise SHAPE de aptâmeros de ligação 5HTP em andaime com GR. Esta Figura mostra a

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 22/154

19/110 região de sequenciamento completo do gel que foi usada para gerar a Figura 4A.

[00086] A Figura 20 representa a análise SHAPE de aptâmeros de ligação 5HTP com andaime em GR. A imagem completa e inalterada do gel de sequenciamento mostrado na Figura 4A (regiões correspondentes a J2/3 e L3 foram cortadas para produzir a Figura 4A) . A análise SHAPE dos aptâmeros 5GR-IV, -V e -VI está representada na ausência e presença de 5HTP. Barras para o lado destacam as regiões J2/3 e L3 que demonstram várias proteções dependentes de ligando na 3WJ e a presença do ponto crucial de reatividade de assinatura no diagnóstico L3 da interação L2-L3.

[00087] A Figura 21 representa a análise SHAPE de um aptâmero de ligação 5HTP de andaime CG. O gel bruto (inserto) mostra modificações claras dependentes de ligando em Jl/2 e J2/3. O RNA de Vc2 parental apresenta uma proteção dependente de ligando em P3 no sitio de acoplamento de tetra-alça, enquanto o aptâmero de 5CG-I mostra uma modificação dependente de ligando no lado oposto da hélice. Adicionalmente, nenhum dos RNAs apresenta modificações na presença do ligando independentemente. A integração das bandas como uma função da distância no gel é mostrada no fundo. Após a normalização e atribuição, as alterações dependentes do ligando ainda são evidentes (asteriscos coloridos), particularmente em Jl/2.

[00088] A Figura 22 representa a análise SHAPE de um aptâmero de ligação 5HTP de andaime HR. O gel bruto (direita) mostra modificações claras dependentes de ligando em Jl/2 e J2/3. As alterações em J2/3 localizam-se principalmente nas posições 3 e 4 de um motivo de alça T previsto. Além disso, se a estrutura for mantida, a alça Terminal de P3 (L3) que se

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 23/154

20/110 encaixa em P2 no RNA parental mostra proteção dependente do ligando. A integração das bandas como uma função da distância no gel é mostrada à esquerda. Após a normalização e atribuição, as alterações dependentes do ligando ainda são evidentes (asteriscos coloridos) . Observe que não há divagem no fundo no sitio equivalente no RNA de cabeça de martelo parental (asterisco verde superior).

[00089] A Figura 23 representa sensores modificados por engenharia da invenção que foram sintetizados como blocos-G. N representa uma posição na qual a composição de A, C, G e T é aproximadamente 25% cada. Sequências de aptâmeros e sensores de RNA são dadas como suas sequências de DNA equivalentes. Domínios separados dos sensores de Brócolis são codificados por cores para indicar a estrutura de RNAt

(cinza), o aptâmero de Brócolis	de ligação	DFHBI-1T	(amarelo),
o módulo de	comunicação (ciano]	l e o aptâmero	com	andaime GR
(vermelho).
	DESCRIÇÃO	DETALHADA
[00090] Os	meios para gerar	elementos	de	RNA	e/ou DNA
sintéticos	com capacidades	reguladoras	e	de	detecção

inovadoras são fortemente habilitados pela seleção in vitro e o grupo de aptâmeros sintéticos disponíveis é atualmente grande. No entanto, apenas poucos aptâmeros de RNA de ligação a molécula pequena fizeram a transição para biossensores intracelulares eficazes e amplamente utilizados do seu ligando cognato ou outros dispositivos de RNA. Esta discrepância entre a ligação in vitro e a atividade intracelular é problemática, sugerindo que as estratégias de seleção atuais não podem acessar facilmente os aptâmeros de RNA de ligação a moléculas pequenas capazes de funcionar robustamente no

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 24/154

21/110 ambiente celular. Embora as estratégias de seleção in vivo para RNAs ligantes de moléculas pequenas possam ser mais bemsucedidas na geração de aptâmeros aptos a células, essas abordagens não são atualmente amplamente práticas. Assim, as estratégias atuais continuam a depender de um fluxo de trabalho prolongado que incorpora a seleção tradicional in vitro com seleções em tandem e especificas da aplicação para função aprimorada.

[00091] Ao contrário dos aptâmeros sintéticos, os domínios de ligação de moléculas pequenas dos ribocomutadores naturais evoluíram no contexto da célula e incorporam características adicionais que se estendem além do local de ligação do ligando que incluem dobramento de alta fidelidade e uma capacidade de comunicação com chaves reguladoras a jusante para produzir uma resposta detectável. Estes aptâmeros são altamente modulares e robustos, observados em um amplo espectro de espécies bacterianas e interface com diversos domínios reguladores atuando na transcrição, translação, entrelaçamento alternativo e estabilidade do mRNA. Assim, eles são altamente flexíveis com relação aos mecanismos de comunicação com domínios adjacentes ou sequências que provocam um resultado (por exemplo, regulação genética). Estes aptâmeros foram bem sucedidos em aplicações sintéticas e foram usados para validar ferramentas de RNA sintético. Embora tenha havido um esforço substancial para identificar e caracterizar os aptâmeros naturais, eles são inerentemente limitados em sua diversidade e em sua aplicação devido aos grupos endógenos de ligantes efetores que são difíceis de modular.

[00092] Em resposta a estas dificuldades, são fornecidas dobras arquitetônicas recorrentes encontradas em aptâmeros de

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 25/154

22/110

RNA natural e pequenas ribozimas nulceoliticas que podem ser reprogramadas usando seleção in vitro para hospedar um amplo espectro de sítios de ligação a pequenas moléculas, preservando as robustas propriedades arquitetônicas de dobramento e altamente estáveis do genitor e seus métodos de uso. A utilização de bibliotecas de RNA parcialmente estruturadas na seleção de aptâmeros de ligação a pequenas moléculas já foi empregada anteriormente, mas esses grampos e hélices simples não têm o potencial de formar estruturas de ordem superior, como os aptâmeros naturais. A seleção de uma ribozima de RNA ligase de atividade muito modesta por randomização de uma alça Terminal no domínio P456 de ribozima de Tetrahymena demonstrou que é possível obter ribozimas para uma biblioteca estruturada. No entanto, a arquitetura de P456 é grande (160 nucleotídeos) e restrita às subclasses IC1 e IC2 dos introns de autoespaçamento do grupo I. Assim, pode não ser bem adequado como uma plataforma geral para a criação de diversos aptâmeros de ligação de moléculas pequenas que são ativos em um amplo espectro de ambientes celulares.

[00093] Usando andaimes derivados de dois domínios de aptâmeros de ribocomutador diferentes e uma ribozima, foi obtido um grupamento diverso de aptâmeros que se ligam seletivamente a 5-hidroxitriptofano (5HTP) e/ou serotonina (5HT). Embora cada um dos andaimes forneça soluções únicas para reconhecimento, todos eles convergem em afinidades de ligação semelhantes e discriminam contra o L-triptofano quimicamente relacionado. Estes aptâmeros são predispostos pelo andaime estrutural para acoplamento a módulos de leitura fluorogênicos e baseados em troca. Embora as estratégias de triagem sejam atendidas com graus variados de sucesso, a

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 26/154

23/110 diversidade de aptâmeros prontamente alcançada usando essa abordagem permite estratégias mais flexíveis com menos caracterização in vitro exigida para implementar dispositivos práticos de RNA.

[00094] Os dispositivos baseados em RNA são cada vez mais vistos como uma ferramenta potencialmente robusta e previsível na biologia sintética. O RNA possui um grupamento único de características quando comparado a alternativas baseadas em proteínas, incluindo a capacidade de se regularizar em uma estrutura cis, secundária e previsível e um pequeno rastro genético. Entre as habilidades mais procuradas de dispositivos de RNA estão a capacidade de sentir estímulos externos e modular uma resposta genética ou fenotipica na ausência de fatores proteicos adicionais. Esforços têm se concentrado na criação de ribocomutadores sintéticos, aptazimas e sensores de RNA fluorogênico, mas seu potencial ainda não foi totalmente atingido em parte devido à disponibilidade limitada de domínios de detecção de RNA. As composições e métodos providos aqui demonstram surpreendentemente que o uso de ribocomutadores ou ribozimas naturalmente desenvolvidos como andaimes para seleção pode produzir um dominio de detecção robusto capaz de funcionar in vitro e no contexto celular, em par com os melhores aptâmeros artificiais e naturais até o momento.

[00095] Uma força fundamental das composições e métodos aqui descritos é o uso de múltiplos andaimes em seleções paralelas para obter um grupamento de aptâmeros. Embora os aptâmeros derivados de diferentes estruturas tenham afinidades semelhantes para 5HTP e seletividade contra L-triptofano, eles claramente têm características distintas em relação à sua

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 27/154

24/110 capacidade de se comunicar com um dominio de leitura por meio da hélice Pl, uma característica comum a todos os andaimes. Sem estar limitado pela teoria, especula-se que isso se deve à variação na relação espacial entre o ligando e a hélice entre dominios (Pl), uma característica que não pode ser totalmente controlada na seleção. Em ribocomutadores biológicos, o ligando está em contato direto ou induz mudanças conf ormacionais no RNA que envolvem a hélice Pl que liga o aptâmero à chave reguladora a jusante.

[00096] Com um grupamento de aptâmeros, abordagens combinatórias podem ser empregadas para rastrear rapidamente os sensores com as propriedades desejadas, sem a caracterização extensiva do aptâmero ou a otimização do dispositivo. Tipicamente, a seleção tradicional in vitro produz apenas um único aptâmero de ligação de molécula pequena e o desenvolvimento de um dispositivo de RNA requer o rastreamento de muitos módulos de comunicação e sequências adaptadoras enquanto deixa o aptâmero sensorial como um nó fixo. Com a abordagem de seleção de andaimes, um grupamento de aptâmeros distintos pode ser acoplado combinatoriamente a um grupamento de módulos de comunicação e rapidamente rastreado para variantes com a atividade desejada. Desta forma, essa abordagem deve eliminar o principal gargalo no desenvolvimento de dispositivos e sensores de RNA. Notavelmente, enquanto neste estudo apenas os grupamentos mais populosos foram focados em cada seleção para caracterização e projeto de sensores, dentro de cada seleção havia muitos grupamentos contendo sequências alternativas que poderiam enriquecer ainda mais o grupamento inicial de aptâmeros para desenvolver aplicações a jusante.

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 28/154

25/110 [00097] Uma segunda vantagem poderosa desta estratégia de seleção é o dobramento robusto no contexto celular provido pela interação terciária da arquitetura da junção de oligonucleotideos (por exemplo, a junção de três vias) . Cada um desses aptâmeros possui uma dobra que sofreu extensa evolução biológica e, em particular, as interações terciárias distais que organizam o núcleo de junção de três vias são altamente estáveis. Tanto a interação L2-L3 do ribocomutador de purina quanto o receptor de tetra-alça-tetra-alça da cadeia principal de ribocomutador de di-GMP ciclico são capazes de formar estavelmente fora do contexto de outra estrutura de RNA. Isso permite que esses elementos guiem potencialmente a dobra de todos os membros da biblioteca inicial, de tal forma que a grande maioria da população contenha a estrutura secundária e terciária prescrita. O dobramento incorreto é frequentemente um problema significativo para os aptâmeros sintéticos tradicionais, que podem ser muito exacerbados quando o elemento RNA é acoplado ao outro ou colocado no contexto de um RNA maior. Como não há pressão de seleção significativa para o dobramento de alta fidelidade em um protocolo tipico de seleção, prover essas informações na biblioteca de partida pode ser um caminho para RNAs robustos de dobramento.

[00098] Enquanto os andaimes de junção de três vias são aqui exemplificados, a diversidade de ribocomutadores e ribozimas naturais pode fornecer mais matéria-prima para esta abordagem. Dentro da familia de junção de três vias, há uma ampla variedade de sequências que variam a orientação das três hélices, o tamanho das regiões de junção e a natureza da interação terciária distai que pode fornecer estruturas

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 29/154

26/110 superiores para um ligando ou sensor em particular. Além disso, outras dobras podem estar predispostas a ligar uma pequena molécula alvo com base na natureza do ligando cognato. Por exemplo, outra escolha para um andaime para ligar 5HTP é o dominio do aptâmero de ribocomutador da lisina que contém uma junção de cinco vias que abriga o sitio de ligação do ligando e o posiciona adjacente à hélice Pl. Os ligantes maiores podem ser mais facilmente acomodados por andaimes derivados de mononucleotideo de flavina ou de ribocomutador de cobalamina, enquanto os dinucleotideos, tal como NADH podem ser facilmente acomodados por um dos outros aptâmeros de nucleotideos diciclicos. Assim, as abordagens de seleção de andaimes aqui descritas têm o potencial de facilitar o desenvolvimento de ferramentas inovadoras poderosas para monitorar e responder a pequenas moléculas no ambiente celular através de uma ampla faixa de aplicações usando dispositivos de RNA.

[00099] No geral, a nomenclatura utilizada em grupamento com cultura de células e de tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e da quimica de proteina e de ácidos nucleicos e hibridação descritos aqui são as bem conhecidas e vulgarmente utilizadas na técnica. Os métodos e técnicas aqui providos são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e tal como descrito em várias referências gerais e mais especificas que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo, a menos que indicado de outra forma.

[000100] As reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como normalmente realizado na técnica ou como aqui descrito. As nomenclaturas utilizadas em grupamento com, e os

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 30/154

27/110 procedimentos e técnicas laboratoriais de, quimica analítica, quimica orgânica sintética e quimica medicinal e farmacêutica aqui descritas são as bem conhecidas e vulgarmente utilizados na técnica. São utilizadas técnicas padrão para as sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e administração e tratamento de pacientes.

[000101] A menos que definidos de outra forma, os termos científicos e técnicos aqui utilizados têm os significados que são vulgarmente entendidos pelos versados na técnica. Em caso de qualquer ambiguidade latente, as definições aqui fornecidas têm precedência sobre qualquer dicionário ou definição extrinseca. A menos que exigido pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e termos no plural incluem o singular. A utilização de ou significa e/ou a

menos que	indicado de outra	forma.	0	uso	do termo
incluindo'1	', bem como outras formas,	tais	como	inclui e
incluem,	não é limitante.
[000102]	Para que a invenção	possa	ser	mais	facilmente

entendida, certos termos são primeiro definidos.

[000103] Os termos aptâmero e dominio de aptâmero se referem a sequências curtas de fita simples de DNA, RNA ou peptideo que se ligam especificamente a vários alvos moleculares, como pequenas moléculas, proteínas, ácidos nucleicos, células, tecidos e semelhantes com alta especificidade e afinidade. Os aptâmeros são geralmente altamente específicos, de tamanho relativamente pequeno e não imunogênicos. Semelhante aos anticorpos, os aptâmeros interagem com seus alvos reconhecendo uma estrutura tridimensional especifica e são, portanto, também conhecidos como anticorpos químicos. Ao contrário dos anticorpos

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 31/154

28/110 proteicos, os aptâmeros de DNA ou RNA oferecem características químicas e biológicas únicas com base nas suas propriedades de oligonucleotídeos.

[000104] O termo ribocomutador se refere a um elemento comumente encontrado na região 5' não traduzida de mRNAs que exerce seu controle regulador sobre o transcrito de uma maneira cis por ligação direta de um ligando de molécula pequena. O ribocomutador típico contém dois domínios funcionais distintos: um domínio de aptâmero, que adota uma dobra tridimensional compacta para sustentar a bolsa de ligação do ligando; e uma plataforma de expressão, que contém uma chave estrutural secundária que faz interface com o maquinário de transcrição ou translação. A regulação conseguida em virtude de uma região de sobreposição entre estes dois domínios, conhecida como a sequência de troca, cujo emparelhamento direciona a dobra do RNA para uma de duas estruturas mutuamente exclusivas na plataforma de expressão que representam os estados ligado e desligado do mRNA. Em certas modalidades exemplares, um ribocomutador preferido é o ribocomutador de guanina de B. subtilis xpt-pbuX (aqui referido como GR) ou o ribocomutador de di-GMP cíclico de Vc2 de Vibrio cholerae (aqui referido como CDG).

[000105] O termo ribozima se refere a uma molécula de RNA que age como uma enzima e é capaz de catalisar reações bioquímicas específicas, semelhantes à ação de enzimas proteicas. As classes de ribozimas incluem ribozima de ramificação GIR1, ribozima glmS, intron de auto-espaçamento do Grupo I, intron de auto-espaçamento do Grupo II, ribozima de hairpin, ribozima de cabeça de martelo e ribozima HDV. Em certas modalidades exemplares, uma ribozima preferida é a

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 32/154

29/110 ribozima de cabeça de martelo de Schistosoma mansoni (referida aqui como HH).

[000106] Os termos agente de RNA sintético, agente de DNA sintético, biossensor e andaime se referem a dispositivos sensoriais de ácido nucleico aqui descritos que compreendem estruturas estruturais secundárias e terciárias derivadas de aptâmeros que existem na natureza, por exemplo, de ribocomutadores e ribozimas. Um agente de RNA sintético, agente de DNA sintético, biossensor ou estrutura estrutural da invenção inclui um dominio de hélice, primeiro e segundo dominios de hairpin e uma junção de oligonucleotideos que contém um dominio de ligação de ligando. Um biossensor da invenção pode compreender uma junção de N vias, em que N é 2, 3, 4 ou 5.

[000107] Em certas modalidades, um biossensor da invenção compreende uma sequência com uma série de componentes ligados de acordo com a Fórmula I: (I) P1-J1/2-P2-L2-P2'-J2/3-P3-L3P3' - J3/1-, em que - representa uma ligação, Pl e Pl formam a hélice, P2, L2 e P2 formam o primeiro hairpin, P3, L3 e P3 ' formam o segundo hairpin, e Jl/2, J2/3 e J3/1 juntos formam a junção de oligonucleotideos. (Veja, por exemplo, Figura 1.) [000108] Em certas modalidades, um biossensor da invenção compreende um módulo de leitura pelo qual a especificidade e/ou afinidade de um módulo para um ligando pode ser determinada. Uma leitura pode ser visualmente detectável, por exemplo, uma leitura fluorogênica, tal como, por exemplo, Brócolis, ou pode ser uma leitura baseada em ribocomutador ou uma leitura baseada em oligonucleotideos, como aqui descrito adicionalmente.

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 33/154

30/110 [000109] O termo domínio de hélice se refere a dois ou mais polinucleotideos que são mantidos juntos, por exemplo, por ligações de hidrogênio, Hoogsteen ou Hoogsteen invertida, formando assim uma estrutura de hélice dupla ou tripla hélice.

[000110] O termo dominio de hairpin se refere à capacidade de um polinucleotideo de emparelhar com si mesmo de tal modo que a extremidade 5' e a extremidade 3' do polinucleotideo sejam aproximadas uma da outra e estejam ligadas por uma porção não hibridizante do polinucleotideo que forma uma estrutura de alça.

[000111] O termo junção de oligonucleotideos se refere a duas, três, quatro ou cinco regiões de um esqueleto que formam um sitio de ligação do ligando, por exemplo, um sitio de ligação ao Gua. (Veja, por exemplo, Figura 1.) [000112] O termo biblioteca de oligonucleotideos se refere a uma coleção de sequências de oligonucleotideos sintéticas, cada sequência compreendendo um andaime estrutural da invenção, em que cada andaime estrutural inclui pelo menos um dominio de hélice, primeiros e segundos domínios de hairpin e uma junção de oligonucleotideos que contém um dominio de ligação do ligando.

[000113] Em certas modalidades exemplares, são providos ensaios para rastrear ligantes ou compostos de teste que se ligam a um biossensor da invenção. Os compostos de teste da presente invenção podem ser obtidos utilizando qualquer uma das inúmeras abordagens em métodos de bibliotecas combinatórias conhecidas na técnica, incluindo: bibliotecas biológicas; bibliotecas de fase sólida ou fase de solução paralelas espacialmente endereçáveis; métodos de biblioteca sintética que requerem deconvolução; o método de biblioteca

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 34/154

31/110 um leito, um composto; e métodos de biblioteca sintética utilizando seleção por cromatografia de afinidade. A abordagem da biblioteca biológica está limitada a bibliotecas de peptideos, enquanto as outras quatro abordagens são aplicáveis a bibliotecas de compostos de peptideos, de oligômero não peptídeo ou de moléculas pequenas (Lam, KS (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145).

[000114] O termo nucleosídeo se refere a uma molécula com uma base de purina ou pirimidina covalentemente ligada a uma açúcar ribose ou desoxirribose. Os nucleosídeos exemplares incluem adenosina, guanosina, citidina, uridina e timidina. Nucleosídeos exemplares adicionais incluem inosina, 1-metil inosina, pseudouridina, 5, 6-di-hidrouridina, ribotimidina, 2Nmetilguanosina e 2,2N,N-dimetilguanosina (também referidos como nucleosídeos raros) . O termo nucleotídeo se refere a um nucleosídeo que tem um ou mais grupos fosfato ligados em ligações éster à fração de açúcar. Os nucleotídeos exemplares incluem monofosfatos, difosfatos e trifosfatos de nucleosídeos. Os termos polinucleotídeo e molécula de ácido nucleico são aqui utilizados indistintamente e se referem a um polímero de nucleotídeos ligados entre si por uma ligação fosfodiéster entre os átomos de carbono 5' e 3'.

[000115] O termo RNA ou molécula de RNA ou molécula de ácido ribonucleico se refere a um polímero de ribonucleotídeos (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30 ou mais ribonucleotídeos) . O termo DNA ou molécula de DNA ou molécula de ácido desoxirribonucleico se refere a um polímero de desoxirribonucleotídeos. O DNA e o RNA podem ser sintetizados naturalmente (por exemplo, por replicação de DNA ou transcrição de DNA, respectivamente) . O RNA pode ser

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 35/154

32/110 modificado após transcrição. O DNA e o RNA também podem ser quimicamente sintetizados. O DNA e o RNA podem ser de fita simples (isto é, ssRNA e ssDNA, respectivamente) ou de múltiplas fitas (por exemplo, fita dupla, ou seja, dsRNA e dsDNA, respectivamente). mRNA ou RNA mensageiro é RNA de fita simples que especifica a sequência de aminoácidos de uma ou mais cadeias de polipeptideos. Esta informação é transladada durante a sintese de proteínas quando os ribossomos se ligam ao mRNA.

[000116] O termo análogo de nucleotideo ou nucleotideo alterado ou nucleotideo modificado se refere a um nucleotideo não padrão, incluindo ribonucleotideos ou desoxirribonucleotideos que não ocorrem naturalmente. Os análogos de nucleotideos exemplares são modificados em qualquer posição, de modo a alterar certas propriedades quimicas do nucleotideo, mantendo ainda a capacidade do análogo de nucleotideo de desempenhar a sua função pretendida. Exemplos de posições do nucleotideo que podem ser derivadas incluem a posição 5, por exemplo, 5-(2-amino) propiluridina, 5-bromo-uridina, 5-propino-uridina, 5-propenil-uridina, etc; a posição 6, por exemplo, 6- (2-amino) propil-uridina; a posição 8 para adenosina e/ou guanosinas, por exemplo, 8-bromo guanosina, 8-cloro guanosina, 8-fluoroguanosina, etc. Os análogos de nucleotideos incluem também nucleotideos deaza, por exemplo, 7-deaza-adenosina; nucleotideos modificados com O e N (por exemplo, alquilados, por exemplo, N6-metil adenosina, ou como conhecido na técnica); e outros análogos de nucleotideos heterociclicamente modificados, tais como os descritos em Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000, Ago. 10 (4) : 297-310.

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 36/154

33/110 [000117] Os análogos de nucleotídeos também podem compreender modificações na porção de açúcar dos nucleotídeos.

Por exemplo, o grupo 2'OH pode ser substituído por um grupo selecionado de H, OR, R, F, Cl, Br, I, SH, SR, NH₂, NHR, NR₂, COOR ou OR, em que R é alquila, alquenila, alquinila, arila, etc.

substituído ou não substituído.

Outras modificações possíveis incluem as descritas nas Patentes norte-americanas US 5.858.988 e 6.291.438.

[000118] O grupo fosfato do nucleotídeo também pode ser modificado, por exemplo, substituindo um ou mais dos oxigênios do grupo fosfato por enxofre (por exemplo, fosforotioatos) ou fazendo outras substituições que permitam que o nucleotídeo desempenhe sua função pretendida, como descrito em, por exemplo, Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. Abril de 2000 10 (2) : 117-21, Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. outubro de 2000 10 (5) : 333-45, Stein, Nucleic Acid Drug Dev. Outubro de 2001 11 (5) : 317-25, Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. abril de 2001 11 (2): 77-85 e Patente US 5.684.143. Algumas das modificações referenciadas anteriormente (por exemplo, modificações do grupo fosfato) preferivelmente diminuem a taxa de hidrólise de, por exemplo, polinucleotídeos compreendendo os ditos análogos in vivo ou in vitro.

[000119] Em certas modalidades exemplares, pode ser utilizado um marcador detectável para detectar um ou mais oligonucleotídeos e/ou polinucleotídeos aqui descritos. Exemplos de marcadores detectáveis incluem várias porções radioativas, enzimas, grupos prostéticos, marcadores fluorescentes, marcadores luminescentes, marcadores bioluminescentes, partículas metálicas, pares de ligação

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 37/154

34/110 proteina-proteina, pares de ligação proteina-anticorpo e semelhantes. Exemplos de proteínas fluorescentes incluem, mas não se limitam a, proteína fluorescente amarela (YFP) , proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente ciano (CFP), umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila, ficoeritrina e semelhantes. Exemplos de marcadores bioluminescentes incluem, mas não estão limitados a, luciferase (por exemplo, bacteriana, vaga-lume, besouro de clique e semelhantes), luciferina, aequorina e semelhantes. Exemplos de sistemas enzimáticos que têm sinais visualmente detectáveis incluem, mas não se limitam a, galactosidases, glucorinidases, fosfatases, peroxidases, colinesterases e semelhantes. Marcadores identificáveis também incluem

Ί25 35 Ί 4 3 compostos radroatrvos como I, S, C ou H. Marcadores identificáveis estão comercialmente disponíveis de uma variedade de fontes.

[000120] [0045] Os marcadores fluorescentes e a sua ligação aos nucleotídeos e/ou oligonucleotídeos são descritos em muitas revisões, incluindo Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Nona Edição (Molecular Probes, Inc., Eugene, 2002); Keller e Manak, DNA Probes, 2a edição (Stockton Press, Nova Iorque, 1993); Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); e Wetmur, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26: 227-259 (1991). Metodologias particulares aplicáveis à invenção são divulgadas na seguinte amostra de referências: Patentes norte-americanas U.S. 4.757.141, 5.151.507 e 5.091.519. Em um aspecto, um ou mais corantes fluorescentes são utilizados como marcadores

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 38/154

35/110 para sequências alvo marcadas, por exemplo, como divulgado pela Patente norte-americana US 5.188.934 (corantes de 4,7diclorofluoresceina) ; Patente norte-americana US 5.366.860 (corantes de rodamina espectralmente resolvidos); Patente norte-americana US 5.847.162 (corantes de 4, 7diclororodamina) ; Patente norte-americana US 4.318.846 (corantes de fluoresceina substituídos com éter); Patente norte-americana US 5.800.996 (corantes de transferência de

energia);	Lee	et al.;	Patente	norte-americana	US	5.066.580
(corantes	de	xantina);	Patente	norte-americana	US	5.688.648
(corantes	de	transferência de	energia); e semelhantes. A

marcação também pode ser realizada com pontos quânticos, como divulgado nas seguintes patentes e pedidos de patente norteamericanas: Patentes norte-americanas US 6.322.901, 6.576.291, 6.423.551, 6.251.303, 6.319.426, 6.426.513, 6.444.143, 5.990.479, 6.207.392, 2002/0045045 e 2003/0017264. Como aqui utilizado, o termo marcador fluorescente inclui uma porção de sinalização que transmite informação através das propriedades de absorção e/ou emissão fluorescentes de uma ou mais moléculas. Tais propriedades fluorescentes incluem intensidade de fluorescência, tempo de vida de fluorescência, características do espectro de emissão, transferência de energia e semelhantes.

[000121] O termo oligonucleotideo se refere a um polímero curto de nucleotideos e/ou análogos de nucleotideos. O termo análogo de RNA ou análogo de DNA se refere a um polinucleotideo (por exemplo, um polinucleotideo sintetizado quimicamente) com pelo menos um nucleotideo alterado ou modificado em comparação a um DNA ou RNA inalterado ou não modificado, mas que mantém a mesma natureza ou natureza

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 39/154

36/110 semelhante ou funciona como o DNA ou RNA inalterado ou não modificado correspondente. Como discutido anteriormente, os oligonucleotideos podem ser ligados com ligações que resultam em uma taxa mais baixa de hidrólise do análogo de RNA ou DNA em comparação com uma molécula de RNA ou DNA com ligações fosfodiéster. Por exemplo, os nucleotídeos do análogo podem compreender ligações de metilenodiol, etileno diol, oximetiltio, oxietiltio, oxicarbonilóxi, fosforodiamidato, fosforamidato e/ou fosforotioato. Análogos de RNA ou DNA preferidos incluem ribonucleotídeos e/ou desoxirribonucleotídeos modificados com açúcar e/ou cadeia principal. Tais alterações ou modificações podem incluir ainda a adição de material não nucleotídeo, tal como o(s) terminal (is) do RNA ou DNA ou internamente (em um ou mais nucleotideos do RNA ou DNA).

[000122] Tal como aqui utilizado, o termo RNA isolado ou DNA isolado se refere a moléculas de RNA ou DNA que estão substancialmente isentas de outro material celular ou meio de cultura quando produzidas por técnicas recombinantes ou substancialmente isentas de precursores quimicos ou outros quimicos quando quimicamente sintetizadas.

[000123] O termo in vitro tem seu significado reconhecido na técnica, por exemplo, envolvendo reagentes puros ou extratos, por exemplo, extratos de células. O termo in vivo também tem seu significado reconhecido na técnica, por exemplo, envolvendo células vivas, por exemplo, células imortalizadas, células primárias, linhas celulares e/ou células em um organismo.

[000124] Como aqui utilizado, o termo transgene se refere a qualquer molécula de ácido nucleico, a qual é inserida por

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 40/154

37/110 artificio em uma célula e se torna parte do genoma do organismo que se desenvolve a partir da célula. Um transgene como este pode incluir um gene que é parcial ou inteiramente heterólogo (isto é, estranho) ao organismo transgênico ou pode representar um gene homólogo a um gene endógeno do organismo. O termo transgene também significa uma molécula de ácido nucleico que inclui uma ou mais sequências de ácido nucleico selecionadas, por exemplo, DNAs, que codificam um ou mais precursores de RNA, para sere expressa em um organismo transgênico, por exemplo, animal, que é parcial ou totalmente heteróloga, isto é, estranha, ao animal transgênico, ou homóloga a um gene endógeno do animal transgênico, mas que é concebida para ser inserida no genoma do animal em uma localização que difere da do gene natural. Um transgene inclui um ou mais promotores e qualquer outro DNA, tais como introns, necessários para expressão da sequência de ácidos nucleicos selecionada, todos operativamente ligados à sequência selecionada e podem incluir uma sequência potenciadora.

[000125] Um gene envolvido em uma doença ou distúrbio inclui um gene, a expressão ou função normal ou aberrante a qual produz ou causa a doença ou distúrbio ou pelo menos um sintoma da dita doença ou distúrbio.

[000126] Como aqui utilizado, o termo população de amostra se refere a uma população de indivíduos compreendendo um número estatisticamente significativo de indivíduos. Por exemplo, a população da amostra pode compreender 50, 75, 100, 200, 500, 1000 ou mais indivíduos. Em modalidades particulares, a população da amostra pode compreender indivíduos que compartilham pelo menos um fenótipo de doença

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 41/154

38/110 comum (por exemplo, um distúrbio de ganho de função) ou mutação (por exemplo, uma mutação de ganho de função) .

[000127] Como usado aqui, o termo heterozigosidade se refere à fração de indivíduos dentro de uma população que são heterozigotos (por exemplo, contêm dois ou mais alelos diferentes) em um local particular (por exemplo, em um SNP) . A heterozigosidade pode ser calculada para uma população de amostra utilizando métodos que são bem conhecidos pelos versados na técnica.

[000128] A frase examinando a função de um gene em uma célula ou organismo se refere ao exame ou estudo da expressão, atividade, função ou fenótipo decorrente dele.

[000129] Como aqui utilizado, o termo nucleotideo raro se refere a um nucleotideo de ocorrência natural que ocorre com pouca frequência, incluindo desoxirribonucleotideos ou ribonucleotideos que ocorrem naturalmente com pouca

frequência,	por exemplo, um	ribonucleotideo de	ocorrência
natural que	não é guanosina,	adenosina, citosina	ou uridina.
Exemplos de	nucleotideos raros incluem, mas	não	estão
limitados a,	inosina, 1-metil	inosina, pseudouridina,	5,6-di-
hidrouridina,	ribotimidina,	p N-metriguanosrna	e	2'2N,N-
dimetilguanosina.
[000130] 0	termo modificado	por engenharia,	como	em um
precursor de	RNA modificado po	r engenharia ou uma	molécula de

ácido nucleico modificada por engenharia, indica que o precursor ou molécula não é encontrado na natureza, em que toda ou uma porção da sequência de ácido nucleico do precursor ou molécula é criada ou selecionada por um humano. Uma vez criada ou selecionada, a sequência pode ser replicada, transladada, transcrita ou processada por mecanismos dentro de

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 42/154

39/110 uma célula. Assim, um precursor de RNA produzido dentro de uma célula a partir de um transgene que inclui uma molécula de ácido nucleico modificada é um precursor de RNA modificado por engenharia.

[000131] Como usado aqui, o termo força de ligação ou força do par de bases se refere à força da interação entre pares de nucleotideos (ou análogos de nucleotideos) em cadeias opostas de um duplex oligonucleotideo, devido principalmente à ligação de H, interações de van der Waals e semelhantes entre os ditos nucleotideos (ou análogos de nucleotideos).

[000132] Como aqui utilizado, o termo nucleotideo desestabilizador se refere a um primeiro nucleotideo ou análogo de nucleotideo capaz de formar um par de bases com o segundo nucleotideo ou análogo de nucleotideo de tal modo que o par de bases seja de menor resistência de ligação que um par de bases convencional (isto é, par de bases de Watson-Crick). Em certas modalidades, o nucleotideo desestabilizador é capaz de formar um par de bases não correspondentes com o segundo nucleotideo. Em outras modalidades, o nucleotideo desestabilizador é capaz de formar um par de bases oscilante com o segundo nucleotideo. Ainda em outras modalidades, o nucleotideo desestabilizador é capaz de formar um par de bases ambiguo com o segundo nucleotideo. Ainda em outra modalidade, o nucleotideo desestabilizador é capaz de formar uma protuberância, em que o nucleotideo desestabilizador não emparelha com o segundo nucleotideo.

[000133] Como usado aqui, o termo par de bases se refere à interação entre pares de nucleotideos (ou análogos de nucleotideos) em cadeias opostas de um duplex oligonucleotideo, devido principalmente à ligação de H,

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 43/154

40/110 interações de van der Waals e semelhantes entre os ditos nucleotideos (ou análogos de nucleotideos). Como aqui utilizado, o termo força de ligação ou força do par de bases se refere à força do par de bases.

[000134] Como aqui utilizado, o termo par de bases não coincidente se refere a um par de bases consistindo em pares de bases não complementares ou não-Watson-Crick, por exemplo, pares de bases G: C, A: T ou A: U complementares não normais. Como aqui utilizado, o termo par de bases ambíguas (também conhecido como um par de bases não discriminatório) se refere a um par de bases formado por um nucleotideo universal.

[000135] Como aqui utilizado, o termo nucleotideo universal (também conhecido como nucleotideo neutro) inclui os nucleotideos (por exemplo, certos nucleotideos desestabilizadores) que possuem uma base (uma base universal ou base neutra) que não discrimina significativamente entre bases em um polinucleotideo complementar quando se forma um par de bases. Os nucleotideos universais são moléculas predominantemente hidrofóbicas que podem se acumular eficientemente em ácidos nucleicos duplex antiparalelos (por exemplo, DNA ou RNA de fita dupla) devido a interações de empilhamento. As porções de base de nucleotideos universais compreendem tipicamente uma fração heterociclica aromática contendo nitrogênio.

[000136] Como aqui utilizado, os termos complementaridade suficiente ou grau suficiente de complementaridade significam que uma sequência de oligonucleotideos é suficientemente complementar para se ligar a um oligonucleotideo alvo desejado.

[000137] Várias metodologias da presente invenção incluem a

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 44/154

41/110 etapa que envolve a comparação de um valor, nível, recurso, característica, propriedade, etc., a um controle adequado, aqui referido de forma intercambiável como um controle apropriado. Um controle adequado ou controle apropriado é qualquer controle ou padrão conhecido por um versado na técnica útil para propósitos de comparação. Em uma modalidade, um controle adequado ou controle apropriado é um valor, nível, recurso, característica, propriedade, etc., determinado antes da realização de uma metodologia, como aqui descrito. Por exemplo, uma taxa de transcrição, nível de mRNA, taxa de tradução, nível de proteína, atividade biológica, característica ou propriedade celular, genótipo, fenótipo, etc. podem ser determinados antes da introdução de um agente de RNA ou DNA sintético da invenção em uma célula ou organismo. Em outra modalidade, um controle adequado ou controle apropriado é um valor, nível, recurso, característica, propriedade, etc. determinado em uma célula ou organismo, por exemplo, um controle ou célula ou organismo normal, exibindo, por exemplo, traços normais. Ainda em outra modalidade, um controle adequado ou controle apropriado é um valor, nível, recurso, característica, propriedade, etc. predefinidos.

[000138] Os agentes sintéticos de RNA ou DNA da invenção podem ser introduzidos diretamente na célula (isto é, intracelularmente) ou introduzidos extracelularmente em uma cavidade, espaço intersticial, na circulação de um organismo, introduzidos oralmente ou podem ser introduzidos banhando uma célula ou organismo em uma solução contendo o ácido nucleico. Circulação vascular ou extravascular, o sistema sanguíneo ou linfático e o líquido cefalorraquidiano são locais onde o

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 45/154

42/110 agente sintético de RNA ou DNA pode ser introduzido.

[000139] Os agentes sintéticos de RNA ou DNA da invenção podem ser introduzidos utilizando métodos de distribuição de ácido nucleico conhecidos na técnica, incluindo a injeção de uma solução contendo o ácido nucleico, bombardeamento por partículas cobertas pelo agente RNA, encharcando a célula ou organismo em uma solução do agente de RNA ou eletroporação de membranas celulares na presença do agente RNA. Podem ser utilizados outros métodos conhecidos na técnica para a introdução de ácidos nucleicos em células, tais como transporte de carreador mediado por lipídeos, transporte mediado quimicamente e transfecção de lipossomas catiônicos, tal como fosfato de cálcio e semelhantes. O agente sintético de RNA ou DNA pode ser introduzido juntamente com outros componentes que realizam uma ou mais das seguintes atividades: aumentar a absorção de ácido nucleico pela célula ou, de outro modo, aumentar a inibição do gene alvo.

[000140] Os métodos físicos de introdução de ácidos nucleicos incluem injeção de uma solução contendo o biossensor, bombardeamento por partículas cobertas pelo biossensor, encharcamento da célula ou organismo em uma solução do biossensor ou eletroporação das membranas celulares na presença do biossensor. Um construto viral empacotado em uma partícula viral conseguiría tanto a introdução eficiente de um construto de expressão na célula quanto a transcrição de RNA codificado pelo construto de expressão. Podem ser utilizados outros métodos conhecidos na técnica para a introdução de ácidos nucleicos em células, tais como transporte de carreador mediado por lipídeos, transporte mediado quimicamente, tal como fosfato de cálcio e semelhantes. Assim, o RNA pode ser

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 46/154

43/110 introduzido juntamente com componentes que realizam uma ou mais das seguintes atividades: aumentam a captação de RNA pela célula, inibem o emparelhamento de fitas simples, estabilizam as fitas simples ou aumentam a inibição do gene alvo.

[000141] O agente sintético de RNA ou DNA pode ser introduzido diretamente na célula (isto é, intracelularmente) ou introduzido extracelularmente em uma cavidade, espaço intersticial, na circulação de um organismo, introduzido oralmente ou pode ser introduzido banhando uma célula ou organismo em uma solução contendo o RNA ou DNA. Circulação vascular ou extravascular, o sistema sanguíneo ou linfático e o fluido cerebroespinhal são sítios onde o RNA ou DNA podem ser introduzidos.

[000142] Uma célula alvo pode ser da linha germinal ou somática, totipotente ou pluripotente, divisória ou não divisória, parenquimal ou epitelial, imortalizada ou transformada ou semelhante. A célula pode ser uma célulatronco ou uma célula diferenciada. Tipos de células que são diferenciadas incluem adipócitos, fibroblastos, miócitos, cardiomiócitos, endotélio, neurônios, glia, células sanguíneas, megacariócitos, linfócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastócitos, leucócitos, granulócitos, queratinócitos, condrócitos, osteoblastos, osteoclastos, hepatócitos e células das glândulas endócrinas ou exócrinas.

[000143] O agente sintético de RNA ou DNA pode ser introduzido em uma quantidade que permita a distribuição de pelo menos uma cópia por célula. Doses mais elevadas (por exemplo, pelo menos 5, 10, 100, 500 ou 1.000 cópias por célula) de material podem produzir uma inibição mais eficaz;

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 47/154

44/110 doses menores também podem ser úteis para aplicações especificas.

[000144] Em um aspecto exemplar, a eficácia de um biossensor da invenção é testada com relação à sua capacidade de modular especificamente a transcrição, translação, espaçamento alternativo e/ou estabilidade de mRNA de um alvo em uma célula. As células podem ser transfectadas com um ou mais biossensores aqui descritos. A redução seletiva no DNA alvo, RNA alvo (por exemplo, mRNA) e/ou proteina alvo é medida. A redução do DNA, RNA ou proteina alvo pode ser comparada com os niveis de DNA, RNA ou proteina alvo na ausência de um biossensor ou na presença de um biossensor que não tenha como alvo o DNA, RNA ou proteina. DNA, RNA ou proteina introduzidos exogenamente podem ser analisados para fins de comparação. Quando se utilizam células neuronals, que são reconhecidamente resistentes às técnicas de transfecção convencionais, pode ser desejável introduzir biossensores por absorção passiva.

[000145] Tratamento ou tratar, como usado aqui, definido como a aplicação ou administração de um agente terapêutico (por exemplo, um agente de RNA ou DNA sintético) a um paciente ou aplicação ou administração de um agente terapêutico a um tecido isolado ou linha celular de um paciente que tem a doença ou distúrbio, um sintoma de doença ou distúrbio ou uma predisposição para uma doença ou distúrbio, com a finalidade de curar, sarar, aliviar, atenuar, alterar, remediar, amenizar, melhorar ou afetar a doença ou distúrbio, os sintomas da doença ou distúrbio ou a predisposição para a doença.

[000146] Em um aspecto, a invenção fornece um método para

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 48/154

45/110 prevenir em um indivíduo uma doença ou distúrbio administrando ao indivíduo um agente terapêutico (por exemplo, um agente sintético de RNA ou DNA ou vetor ou transgene que codifica o mesmo). Os indivíduos em risco para a doença podem ser identificados, por exemplo, por qualquer um ou uma combinação de diagnóstico ou prognóstico. A administração de um agente profilático pode ocorrer antes da manifestação dos sintomas característicos da doença ou distúrbio, de tal modo que a doença ou distúrbio seja prevenida ou, alternativamente, retardada na sua progressão.

[000147] Outro aspecto da invenção se refere a métodos que tratam os indivíduos terapeuticamente, isto é, alteram o início dos sintomas de uma doença ou distúrbio. Em uma modalidade exemplar, o método modulador da invenção envolve o colocar uma célula que expressa desordem em contato com um agente terapêutico (por exemplo, um agente de RNA ou DNA sintético ou vetor ou transgene que codifica o mesmo) que é específico para uma ou mais sequências alvo, de maneira tal que a interação específica da sequência com a sequência do alvo seja obtida. Estes métodos podem ser realizados in vitro (por exemplo, cultivando a célula com o agente) ou, alternativamente, in vivo (por exemplo, administrando o agente a um indivíduo).

[000148] No que diz respeito aos métodos profiláticos e terapêuticos de tratamento, tais tratamentos podem ser especificamente adaptados ou modificados, com base nos conhecimentos obtidos no campo da farmacogenômica. Farmacogenômica, como aqui utilizado, se refere à aplicação de tecnologias genômicas, tais como sequenciamento de genes, genética estatística e análise de expressão genética a

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 49/154

46/110 fármacos em desenvolvimento clinico e no mercado. Mais especificamente, o termo se refere ao estudo de como os genes de um paciente determinam sua resposta a um medicamento (por exemplo, o fenótipo de resposta ao medicamento do paciente ou o genótipo de resposta ao medicamento). Assim, outro aspecto da invenção provê métodos para adaptar o tratamento profilático ou terapêutico de um indivíduo com as moléculas de genes alvo da presente invenção ou moduladores de genes alvo de acordo com o genótipo de resposta a fármacos do indivíduo. A farmacogenômica permite que um médico ou clinico visem tratamentos profiláticos ou terapêuticos para pacientes que mais se beneficiarão com o tratamento e para evitar o tratamento de pacientes que experimentam efeitos colaterais tóxicos relacionados ao fármaco.

[000149] Agentes terapêuticos podem ser testados em um modelo animal apropriado. Por exemplo, um agente de RNA ou DNA sintético (ou vetor de expressão ou transgene que codifica o mesmo) como aqui descrito pode ser utilizado em um modelo animal para determinar a eficácia, toxicidade ou efeitos secundários do tratamento com o dito agente. Alternativamente, um agente terapêutico pode ser utilizado em um modelo animal para determinar o mecanismo de ação de tal agente. Por exemplo, pode ser utilizado um agente em um modelo animal para determinar a eficácia, toxicidade ou efeitos colaterais do tratamento com tal agente. Alternativamente, pode ser utilizado um agente em um modelo animal para determinar o mecanismo de ação de tal agente.

[000150] Uma composição farmacêutica contendo um agente de RNA ou DNA sintético da invenção pode ser administrada a qualquer paciente diagnosticado como tendo ou em risco de

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 50/154

47/110 desenvolver um distúrbio. Em uma modalidade, o paciente é diagnosticado como tendo um distúrbio e o paciente está em geral com boa saúde. Por exemplo, o paciente não é doente terminal e o paciente provavelmente viverá pelo menos 2, 3, 5 ou mais anos após o diagnóstico. O paciente pode ser tratado imediatamente após o diagnóstico ou o tratamento pode ser adiado até que o paciente esteja experimentando mais sintomas debilitantes. Em outra modalidade, o paciente não atingiu um estágio avançado da doença.

[000151] Um agente de RNA ou DNA sintético pode ser administrado a uma dose unitária inferior a cerca de 1,4 mg por kg de peso corporal ou inferior a 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 ou 0,00001 mg por kg de peso corporal e menos de 200 nmol de agente de RNA (por exemplo, cerca de 4,4 xlO¹⁶ cópias) por kg de peso corporal ou inferior a 1.500, 750, 300, 150, 75, 15, 7,5, 1,5, 0,75, 0,15, 0,075, 0,015, 0,0075, 0,0015, 0,00075, 0,00015 nmol de um agente sintético de RNA ou DNA por kg de peso corporal. A dose unitária, por exemplo, pode ser administrada por injeção (por exemplo, intravenosa ou intramuscular, intratecal ou diretamente no cérebro), uma dose inalada ou uma aplicação tópica. As dosagens particularmente preferidas são inferiores a 2, 1 ou 0,1 mg/kg de peso corporal.

[000152] A administração de um agente sintético de RNA ou DNA diretamente a um órgão pode estar em uma dosagem na ordem de cerca de 0, 00001 mg a cerca de 3 mg por órgão, ou preferivelmente cerca de 0,0001 a 0,001 mg por órgão, cerca de 0,03 a 3,0 mg por órgão, 0,1 a 3,0 mg por olho ou cerca de 0,3 a 3,0 mg por órgão. A dosagem pode ser uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir um distúrbio. Em uma modalidade, a

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 51/154

48/110 dose unitária é administrada com menos frequência que uma vez por dia, por exemplo, menos do que a cada 2, 4, 8 ou 30 dias. Em outra modalidade, a dose unitária não é administrada com uma frequência (por exemplo, não uma frequência regular). Por exemplo, a dose unitária pode ser administrada uma única vez. Em uma modalidade, a dose eficaz é administrada com outras modalidades terapêuticas tradicionais.

[000153] Em uma modalidade, um indivíduo é administrado com uma dose inicial e uma ou mais doses de manutenção de um agente sintético de RNA ou DNA. A dose ou doses de manutenção são geralmente inferiores à dose inicial, por exemplo, metade da dose inicial. Um regime de manutenção pode incluir tratar o indivíduo com uma dose ou doses variando de 0,01 pg a 1,4 mg/kg de peso corporal por dia, por exemplo, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, ou 0, 00001 mg por kg de peso corporal por dia. As doses de manutenção são preferivelmente administradas não mais que uma vez a cada 5, 10 ou 30 dias. Além disso, o regime de tratamento pode durar um periodo de tempo que variará dependendo da natureza da doença particular, da sua gravidade e do estado geral do paciente. Em modalidades preferidas, a dosagem pode ser administrada não mais que uma vez por dia, por exemplo, não mais que uma vez por 24, 36, 48 ou mais horas, por exemplo, não mais de uma vez a cada 5 ou 8 dias. Após o tratamento, o paciente pode ser monitorado quanto a alterações em sua condição e para aliviar os sintomas do estado da doença. A dosagem do composto pode ser aumentada no caso de o paciente não responder significativamente aos niveis atuais de dosagem ou a dose poder ser diminuída se for observado um alivio dos sintomas do estado de doença, se o estado de doença tiver sido reduzido ou se efeitos colaterais

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 52/154

49/110 indesejados forem observados.

[000154] A dose eficaz pode ser administrada em uma dose única ou em duas ou mais doses, conforme desejado ou considerado apropriado nas circunstâncias específicas. Se desejar facilitar infusões repetidas ou frequentes, o implante de um dispositivo de liberação, por exemplo, uma bomba, stent semipermanente (por exemplo, intravenoso, intraperitoneal, intracisternal ou intracapsular) , ou reservatório, pode ser aconselhável. Em uma modalidade, uma composição farmacêutica inclui uma pluralidade de espécies de agentes de RNA ou DNA sintéticos. Em outra modalidade, a espécie de agente de RNA ou DNA sintético possui sequências que não são sobrepostas e não adjacentes a outra espécie em relação a uma sequência alvo que ocorre naturalmente. Em outra modalidade, a pluralidade de uma espécie de agente de RNA ou DNA sintético é específica para diferentes alvos que ocorrem naturalmente. Em outra modalidade, a pluralidade de uma espécies de agente de RNA ou DNA sintético visa duas ou mais sequências alvo (por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais sequências alvo).

[000155] Após tratamento bem sucedido, pode ser desejável que o paciente seja submetido a terapia de manutenção para prevenir a recorrência do estado da doença, em que o composto da invenção é administrado em doses de manutenção, variando de 0,01 pg a 100 g por kg de peso corporal (veja Patente norteamericana US 6.107.094).

[000156] A concentração da composição de um agente de RNA ou DNA sintético é uma quantidade suficiente para ser eficaz no tratamento ou prevenção de um distúrbio ou para regular uma condição fisiológica em seres humanos. A concentração ou quantidade de um agente sintético de RNA ou DNA administrado

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 53/154

50/110 dependerá dos parâmetros determinados para o agente e do método de administração, por exemplo, nasal, bucal ou pulmonar. Por exemplo, as formulações nasais tendem a exigir concentrações muito mais baixas de alguns ingredientes para evitar a irritação ou a queima das vias nasais. Às vezes é desejável diluir uma formulação oral até 10 a 100 vezes, de modo a prover uma formulação nasal adequada.

[000157] Certos fatores podem influenciar a dosagem necessária para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo mas não limitado a, gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos anteriores, estado geral de saúde e/ou idade do indivíduo e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente sintético de RNA ou DNA pode incluir um único tratamento ou, preferivelmente, pode incluir uma série de tratamentos. Também será compreendido que a dosagem eficaz de um agente de RNA ou DNA sintético para tratamento pode aumentar ou diminuir ao longo de um tratamento particular. As alterações na dosagem podem resultar e se tornar evidentes a partir dos resultados dos ensaios de diagnóstico, como aqui descrito. Por exemplo, o indivíduo pode ser monitorado após a administração de uma composição sintética de agente de RNA ou DNA. Com base na informação da monitorização, pode ser administrada uma quantidade adicional da composição sintética do agente de RNA ou DNA.

[000158] A dosagem depende da gravidade e capacidade de resposta do estado de doença a ser tratado, com o curso do tratamento durando de vários dias a vários meses ou até que uma cura seja garantida ou seja obtida uma diminuição do estado de doença. Os esquemas de dosagem ideais podem ser

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 54/154

51/110 calculados a partir de medições do acúmulo de fármaco no corpo do paciente. Os versados podem facilmente determinar dosagens, metodologias de dosagem e taxas de repetição ideais. As dosagens ideais podem variar dependendo da potência relativa dos compostos individuais e podem geralmente ser estimadas com base nas EC50s consideradas eficazes em modelos animais in vitro e in vivo.

[000159] A invenção se refere à utilização dos agentes descritos anteriormente para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos como descrito anteriormente. Consequentemente, os moduladores (por exemplo, agentes sintéticos de RNA ou DNA) da presente invenção podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração. Tais composições compreendem tipicamente a modulação de ácido nucleico, proteína, anticorpo ou composto modulador e um carreador farmaceuticamente aceitável. Como aqui utilizado, a linguagem carreador farmaceuticamente aceitável pretende incluir qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção e semelhantes, compatíveis com a administração farmacêutica. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecida na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, a sua utilização nas composições é contemplada. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.

[000160] Uma composição farmacêutica da invenção é formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem administração

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 55/154

52/110 parenteral, por exemplo, intravenosa (IV), intradérmica, subcutânea (SC ou SQ), intraperitoneal, intramuscular, oral (por exemplo, inalação), transdérmica (tópica) e transmucosa. Soluções ou suspensões usadas para aplicação parenteral, intradérmica ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril, como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como álcool benzilico ou metil parabenos; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, como o ácido etilenodiaminotetracético; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade, tal como cloreto de sódio ou dextrose, o pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tal como ácido cloridrico ou hidróxido de sódio. A preparação parenteral pode ser incluída em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas feitos de vidro ou de plástico.

[000161] As composições farmacêuticas adequadas para utilização injetável incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Para administração intravenosa, os carreadores adequados incluem soro fisiológico, água bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida até o ponto em que exista uma fácil utilização da seringa. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 56/154

53/110 bactérias e fungos. O carreador pode ser solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol liquido e semelhantes), e misturas apropriadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido em caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser garantida por diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis, tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[000162] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação do composto ativo na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados anteriormente, como requerido, seguido de esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas ao incorporar o ativo composto em um veiculo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir dos enumerados anteriormente. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais de preparação são de secagem a vácuo e secagem por congelamento, que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 57/154

54/110 previamente filtrada estéril da mesma.

[000163] As composições orais incluem geralmente um diluente inerte ou um carreador comestível. Eles podem ser incluídos em cápsulas de gelatina ou comprimidos na forma de comprimidos. Para fins de administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes e utilizado na forma de comprimidos, trociscos ou cápsulas. Composições orais também podem ser preparadas usando um fluido transportador para uso como um enxaguatório bucal, no qual o composto no fluido transportador é aplicado por via oral e lavado e expectorado ou engolido. Agentes de ligação farmaceuticamente compatíveis, e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, trociscos e semelhantes podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes ou compostos de natureza semelhante: um ligando, tal como celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; um excipiente, tal como amido ou lactose, um agente desintegrante, tal como ácido algico, Primogel ou amido de milho; um lubrificante, tal como estearato de magnésio ou Estirotes; um deslizante, tal como dióxido de silício coloidal; um agente edulcorante, tal como sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante, tal como hortelã-pimenta, salicilato de metil ou aromatizante de laranja.

[000164] Para administração por inalação, os compostos são distribuídos na forma de um jato de aerossol de um recipiente ou distribuidor pressurizado que contém um propulsor adequado, por exemplo, um gás, tal como dióxido de carbono ou um nebulizador.

[000165] A administração sistêmica também pode ser por via

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 58/154

55/110 transmucosa ou transdérmica. Para administração transmucosa ou transdérmica, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são utilizados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, para administração transmucosal, detergentes, sais biliares e derivados de ácido fusidico. A administração transmucosa pode ser realizada através do uso de sprays nasais ou supositórios. Para administração transdérmica, os compostos ativos são formulados em unguentos, pomadas, géis ou cremes, como é geralmente conhecido na técnica.

[000166] Os compostos também podem ser preparados na forma de supositórios (por exemplo, com bases de supositório convencionais, como manteiga de cacau e outros glicerideos) ou enemas de retenção para administração retal.

[000167] O agente de RNA ou DNA sintético também pode ser administrado por transfecção ou infecção utilizando métodos conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados aos métodos descritos em McCaffrey et al. (2002), Nature, 418 (6893), 38-9 (hydrodynamic transfection); Xia et al. (2002), Nature Biotechnol., 20 (10), 1006-10 (viral-mediated delivery); ou Putnam (1996), Am. J. Health Syst. Pharm. 53 (2), 151-160, errata em Am. J. Health Syst. Pharm. 53 (3), 325 (1996).

[000168] O agente de RNA ou DNA sintético também pode ser administrado por qualquer método adequado para administração de agentes de ácido nucleico, tal como uma vacina de DNA. Estes métodos incluem pistolas de genes, bioinjetores e emplastros de pele, bem como métodos sem agulha, tal como a tecnologia de vacina de DNA de microparticulas revelada na Patente norte-americana US 6.194.389 e a vacinação

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 59/154

56/110 transdérmica sem agulhas de mamífero com vacina em forma de pó como divulgado na Patente norte-americana US 6.168.587. Adicionalmente, a administração intranasal é possível, como descrito, inter alia, por Hamajima et al. (1998), Clin. Immunol. Immunopathol. 88 (2), 205-10. Lipossomas (por exemplo, como descrito na Patente norte-americana US 6.472.375) e microencapsulação também pode ser usada. Sistemas de distribuição de micropartícuias alvo biodegradáveis também podem ser usados (por exemplo, como descrito na Patente norte-americana US 6.471.996).

[000169] Em uma modalidade, os compostos ativos são preparados com carreadores que protegerão o composto contra a rápida eliminação do corpo, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de distribuição microencapsulados. Podem ser usados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Os métodos para a preparação de tais formulações serão evidentes para os versados na técnica. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente na Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. As suspensões lipossômicas (incluindo lipossomas direcionados para células infectadas com anticorpos monoclonais para antígenos virais) também podem ser utilizadas como carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos dos versados na técnica, por exemplo, como descrito na Patente norte-americana US 4.522.811.

[000170] É especialmente vantajoso formular composições orais ou parenterais na forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 60/154

57/110 de dosagem, como aqui usado, se refere a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada do composto terapêutico calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêutico requerido. A especificação para as formas de unidade de dosagem da invenção são ditadas por e diretamente dependentes das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico específico a ser alcançado e das limitações inerentes na técnica da composição, tal como um composto ativo para o tratamento de indivíduos.

[000171] A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) . A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50/ED50. Compostos que exibem altos índices terapêuticos são preferidos. Embora compostos que apresentam efeitos colaterais tóxicos possam ser usados, devese tomar cuidado para projetar um sistema de distribuição que almeje tais compostos ao local do tecido afetado a fim de minimizar possíveis danos às células não infectadas e, assim, reduzir os efeitos colaterais.

[000172] Os dados obtidos de ensaios da cultura de células e estudos em animais podem ser utilizados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem de tais compostos encontra-se preferivelmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem o ED50 com pouca ou

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 61/154

58/110 nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e a via de administração utilizada. Para qualquer composto utilizado no método da invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir um intervalo de concentração no plasma circulante que inclua a EC50 (isto é, a concentração do composto de teste que atinge uma resposta meio-máxima) conforme determinado em cultura de células. Tal informação pode ser usada para determinar com maior precisão as doses úteis em seres humanos. Os niveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia liquida de alto desempenho.

[000173] As composições farmacêuticas podem ser incluídas em um recipiente, embalagem ou distribuidor, juntamente com instruções opcionais para administração.

[000174] Como aqui definido, uma quantidade terapeuticamente eficaz de agente de RNA ou DNA sintético (isto é, uma dosagem eficaz) depende do agente sintético de RNA ou DNA selecionado. Por exemplo, podem ser administradas quantidades de dose única na faixa de aproximadamente 1 pg a 1.000 mg; em algumas modalidades, 10, 30, 100 ou 1.000 pg podem ser administrados. Em algumas modalidades, podem ser administrados 1 a 5 g das composições. As composições podem ser administradas uma de uma ou mais vezes por dia a uma ou mais vezes por semana; incluindo uma vez a cada dois dias. Versados entenderão que certos fatores podem influenciar a dosagem e periodicidade necessárias para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo mas não limitado a, gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos anteriores, estado geral de saúde e/ou idade do

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 62/154

59/110 indivíduo e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente sintético de RNA ou DNA pode incluir um único tratamento ou, preferivelmente, pode incluir uma série de tratamentos.

[000175] As moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser inseridas em construtos de expressão, por exemplo, vetores virais, vetores retrovirais, cassetes de expressão ou vetores virais de plasmídeo, por exemplo, utilizando métodos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados aos descritos em Xia et al. , (2002), Supra. Os construtos de expressão podem ser administrados a um indivíduo, por exemplo, por inalação, oralmente, injeção intravenosa, administração local (ver Patente norte-americana US 5.328.470) ou por injeção estereotática (ver, por exemplo, Chen et al. (1994),

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91, 3054-3057) . A preparação farmacêutica do vetor de distribuição pode incluir o vetor em um diluente aceitável ou pode compreender uma matriz de liberação lenta na qual o veículo de distribuição está incluído. Alternativamente, quando o vetor de distribuição completo pode ser produzido intacto a partir de células recombinantes, por exemplo, vetores retrovirais, a preparação farmacêutica pode incluir uma ou mais células que produzem o sistema de distribuição de genes.

[000176] A via de distribuição pode ser dependente da desordem do paciente. Em certas modalidades exemplares, pode ser administrado a um indivíduo um agente de RNA ou DNA sintético da invenção por administração IV ou SC. Além de um agente de RNA ou DNA sintético da invenção, pode ser administrada ao doente uma segunda terapia, por exemplo, uma

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 63/154

60/110 terapia paliativa e/ou terapia especifica da doença. A terapia secundária pode ser, por exemplo, sintomática (por

exemplo,	para	aliviar os sintomas)]	, protetora	(por exemplo,
para retardar	ou	interromper a progressão da	doença)	ou
restauradora	(por	exemplo, para	reverter	o	processo	da
doença) .
[000177]	Em	geral	, um agente de	RNA ou	DNA	sintético	da
invenção	pode	ser	administrado por	qualquer	método adequado.
Como aqui	utilizado, a distribuição	tópica	pode	referir-se	à
aplicação	direta	de um agente de	RNA ou	DNA	sintético	a

qualquer superfície do corpo, incluindo o olho, uma membrana mucosa, superficies de uma cavidade do corpo ou qualquer superfície interna. As formulações para administração tópica podem incluir emplastros transdérmicos, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, pulverizadores e líquidos. Os carreadores, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e semelhantes farmacêuticos convencionais podem ser necessários ou desejáveis. A administração tópica também pode ser utilizada como um meio para distribuir seletivamente o agente de RNA ou DNA sintético na epiderme ou derme de um indivíduo ou em estratos específicos do mesmo, ou em um tecido subj acente.

[000178] As composições para administração intratecal ou intraventricular podem incluir soluções aquosas estéreis que também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados. As composições para administração intratecal ou intraventricular preferivelmente não incluem um reagente de transfecção ou uma fração lipofilica adicional além de, por exemplo, a fração lipofilica ligada ao agente de RNA ou DNA sintético.

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 64/154

61/110 [000179] As formulações para administração parenteral podem incluir soluções aquosas estéreis que também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados. A injeção intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, ligado a um reservatório. Para uso intravenoso, a concentração total de solutos deve ser controlada para tornar a preparação isotônica.

[000180] Um agente de RNA ou DNA sintético da invenção pode ser administrado a um indivíduo por administração pulmonar. As composições de distribuição pulmonar podem ser administradas por inalação de uma dispersão de modo a que a composição dentro da dispersão possa atingir o pulmão onde pode ser prontamente absorvida através da região alveolar diretamente na circulação sanguínea. A distribuição pulmonar pode ser eficaz tanto para a distribuição sistêmica quanto para a distribuição localizada para tratar doenças dos pulmões.

[000181] A distribuição pulmonar pode ser conseguida por diferentes abordagens, incluindo o uso de formulações baseadas em nebulização, aerossolizadas, micelulares e em pó. A distribuição pode ser conseguida com nebulizadores líquidos, inaladores à base de aerossol e dispositivos de dispersão de pó seco. Dispositivos de dose medida são preferidos. Um dos benefícios da utilização de um atomizador ou inalador é que o potencial de contaminação é minimizado, porque os dispositivos são autocontidos. Os dispositivos de dispersão de pó seco, por exemplo, administram fármacos que podem ser prontamente formulados como pós secos. Uma composição de agente de RNA ou DNA sintético pode ser estavelmente armazenada como pós liofilizados ou secos por pulverização por si próprio ou em

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 65/154

62/110 combinação com carreadores de pó adequados. A administração de uma composição para inalação pode ser mediada por um elemento de temporização de dosagem que pode incluir um temporizador, um contador de doses, dispositivo de medição de tempo ou um indicador de tempo que, quando incorporado no dispositivo, permite o rastreamento da dose, monitorização de conformidade e/ou desencademento da dose a um doente durante a administração do medicamento em aerossol.

[000182] Os tipos de excipientes farmacêuticos que são úteis como carreadores incluem estabilizadores, tal como albumina de soro humano (HSA), agentes de volume, tais como hidratos de carbono, aminoácidos e polipeptideos; ajustadores ou tampões de pH; sais, tal como cloreto de sódio; e semelhantes. Estes carreadores podem estar em uma forma cristalina ou amorfa ou podem ser uma mistura dos dois.

[000183] Agentes de volume que são particularmente valiosos incluem carboidratos, polipeptideos, aminoácidos compatíveis ou combinações dos mesmos. Carboidratos adequados incluem monossacarídeos, tais como galactose, D-manose, sorbose e semelhantes; dissacarídeos, tais como lactose, trealose e semelhantes; ciclodextrinas, tais como 2-hidroxipropil-[3ciclodextrina; e polissacarídeos, tais como rafinose, maltodextrinas, dextranos e semelhantes; alditóis, tais como manitol, xilitol e semelhantes. Um grupo preferido de carboidratos inclui lactose, trealose, maltodextrinas de rafinose e manitol. Polipeptideos adequados incluem aspartame. Os aminoácidos incluem alanina e glicina, sendo a glicina a preferida.

[000184] Os ajustadores ou tampões de pH adequados incluem sais orgânicos preparados de ácidos e bases orgânicos, tais

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 66/154

63/110 como citrato de sódio, ascorbato de sódio e semelhantes; citrato de sódio é preferido.

[000185] Um agente de RNA ou DNA sintético da invenção pode ser distribuído por administração oral e nasal. Por exemplo, os fármacos administrados através destas membranas têm um rápido início de ação, proporcionam níveis plasmáticos terapêuticos, evitam o efeito de primeira passagem do metabolismo hepático e evitam a exposição do fármaco ao ambiente gastrointestinal hostil (GI). Outras vantagens incluem o fácil acesso aos locais da membrana, de maneira que o fármaco possa ser aplicado, localizado e removido facilmente. Em uma modalidade, um agente de RNA ou DNA sintético administrado por distribuição oral ou nasal foi modificado para ser capaz de atravessar a barreira hematoencefálica.

[000186] Em uma modalidade, doses unitárias ou doses medidas de uma composição que incluem agentes de RNA ou DNA sintéticos são dispensados por um dispositivo implantado. O dispositivo pode incluir um sensor que monitora um parâmetro dentro de um indivíduo. Por exemplo, o dispositivo pode incluir uma bomba, tal como uma bomba osmótica e, opcionalmente, componentes eletrônicos associados.

[000187] Um agente de RNA ou DNA sintético pode ser empacotado em um capsídeo natural viral ou em um capsídeo artificial produzido quimicamente ou enzimaticamente ou estrutura derivada dele.

[000188] Em certos outros aspectos, a invenção provê kits que incluem um recipiente adequado contendo uma formulação farmacêutica de um agente de RNA ou DNA sintético. Em certas modalidades, os componentes individuais da formulação

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 67/154

64/110 farmacêutica podem ser fornecidos em um recipiente. Alternativamente, pode ser desejável prover os componentes da formulação farmacêutica separadamente em dois ou mais recipientes, por exemplo, um recipiente para uma preparação de agente de RNA ou DNA sintético e pelo menos outro para um composto carreador. O kit pode ser empacotado em várias configurações diferentes, como um ou mais recipientes em uma única caixa. Os diferentes componentes podem ser combinados, por exemplo, de acordo com as instruções fornecidas com o kit. Os componentes podem ser combinados de acordo com um método aqui descrito, por exemplo, para preparar e administrar uma composição farmacêutica. O kit também pode incluir um dispositivo de distribuição.

[000189] Será evidente para os versados na técnica que outras modificações e adaptações adequadas dos métodos aqui descritos podem ser feitas utilizando equivalentes adequados sem se afastar do âmbito das modalidades aqui divulgadas. Tendo agora descrito certas modalidades em detalhes, a mesma será mais claramente compreendida pela referência aos seguintes exemplos, que estão incluídos para fins de ilustração apenas e não se destinam a ser limitantes.

[000190] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora os métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais adequados são descritos a seguir. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas por

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 68/154

65/110 referência em suas totalidades. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, servirá de base para controle. Além do mais, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitantes.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Bibliotecas de seleção de andaimes com informações de RNAs biológicos [000191] O exame de RNAs biológicos pequenos com empacotamento multi-hélice (isto é, dobramento terciário) indicou duas arquiteturas recorrentes que podem ser considerados andaimes privilegiados. O primeiro é o pseudo-nó tipo H, que é amplamente encontrado em RNAs biológicos, incluindo pequenos elementos de deslocamento de quadros ribossômicos em mRNAs virais e aptâmeros naturais e sintéticos. No entanto, do ponto de vista do projeto, essa dobra pode ser difícil de projetar. A outra é a junção de três vias (3WJ) suportada por uma interação terciária remota que organiza o arranjo helicoidal ao redor da junção. Esta dobra é mais adequada para o projeto de dispositivos de RNA que incorporam aptâmeros, uma vez que posiciona um elemento helicoidal concebível (designado por hélice Pl) próximo do local de ligação ao ligando, tipicamente alojado na junção.

[000192] Dentro do grupo de dobra de junção de três vias, há uma grande seleção de candidatos potenciais que podem ser usados para montar um andaime uma biblioteca inicial de sequências para seleção in vitro. Três são exemplificados aqui: o domínio do aptâmero do ribossomo de guanina xpt-pbuX de B. subtilis (aqui referido como GR), o domínio de aptâmero do ribocomutador de di-GMP cíclico de Vc2 de Vibrio

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 69/154

66/110 cholerae (aqui referido como CDG) e a ribozima de cabeça de martelo de Schistosoma mansoni (referida aqui como HH) (Figura 1) . Em cada um desses andaimes de RNA parental, a junção hospeda a atividade biológica chave proximal à hélice Pl que pode servir como ponte estrutural secundária para um domínio de leitura.

[000193] As bibliotecas de partida foram projetadas para preservar a estrutura geral secundária e terciária do andaime, ao mesmo tempo em que randomizam um número suficiente de nucleotídeos na junção para garantir a diversidade de grupamentos adequada de tal forma que os vencedores emergem. Todos os nucleotídeos nas cadeias de junção da junção foram randomizados (populações iguais dos quatro nucleotídeos em cada posição) , bem como pelo menos um par de bases em cada hélice proximal à junção (Figura 1) . Para o andaime GR, este produziu uma biblioteca inicial de 23 posições de nucleotídeos randomizados, que equivale a um tamanho de biblioteca de cerca de 7x10 sequencras (4 sequencras) ; o CDG e o HH contem níveis semelhantes de diversidade (21 posições de nucleotídeos randomizadas, equivalendo a um tamanho de biblioteca de cerca de 4x10 sequencras; 4 sequencras) . Este numero de sequências é teoricamente totalmente representado no grupamento inicial de RNA com redundância de pelo menos cinco vezes. Embora esta seja uma diversidade substancialmente menor que a que é recomendada para uma seleção típica, novos aptâmeros foram obtidos de grupamentos de partida com amostragem ainda mais limitada do espaço de sequência.

[000194] Os três andaimes foram integrados em um cassete de biblioteca com características de projeto específicas. A hélice Pl de cada andaime contendo as bases iniciais e

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 70/154

67/110 terminal das sequências de andaimes foi substituída em todas as bibliotecas por cassetes de amplificação estruturada contendo hélice projetados com base nos desenvolvidos para Acilação seletiva de 2'-Hidroxila analisada por sonda quimica da Extensão do Iniciador (SHAPE) da estrutura do RNA (Figura 17) . Isso garante que as regiões constantes necessárias para a replicação sejam estruturadas e menos prováveis de serem incorporadas ao aptâmero selecionado. Para minimizar ainda mais o potencial para as regiões constantes participarem na formação do local de ligação ao ligando, a hélice Pl foi prolongada para pelo menos dez pares de bases. As sequências completas de moldes de DNA que codificam as bibliotecas de partida iniciais são dadas na Tabela 1 e na Figura 23.

Tabela 1. Sequências de oligonucleotideos e moldes.

Oligonucleotideo	Sequência
Seleção in vitro
Molde a da biblioteca GR/SSIII	GCGCGCGAATTCTAATACGACTCACTATAGGACTTCG GTCCAAGCTAATGCACTCNNNNNNNCGCGTGGATATG GCACGCANNNNNNNNNNGGGCACCGTAAATGTCCNNN NNNGGGTGCATTAGCAAAATCGGGCTTCGGTCCGGTT C
Molde da biblioteca GR/GsI	GCGCGCGAATTCTAATACGACTCACTATAGGACTTCG GTCCTTGGATAGGACTCNNNNNNNCGCGTGGATATGG CACGCANNNNNNNNNNGGGCACCGTAAATGTCCNNNN NNGGGTCCTATCCCCAATCGGGCTTCGGTCCGGTTC
Molde da biblioteca CDG/GsI	GCGCGCGAATTCTAATACGACTCACTATAGGACTTCG GTCCTTGGATAGGACANNNNNNNNNCAAACCATTCGA AAGAGTGGGACGNNNNNCCTCCGGCCTAAACCGAAAG GTAGGTAGCGGGGNNNNNNNTGTCCTATCCCCAATCG

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 71/154

68/110

	GGCTTCGGTCCGGTTC
Molde da biblioteca HH/GsI	GCGCGCGAATTCTAATACGACTCACTATAGGACTTCG GTCCTTGGATAGGAGCNNNNTGGTATCCAATGAAAAT GTACTACCANNNNNNNNNNCCCAAATAGGNNNNNNNG CTCCTATCCCCAATCGGGCTTCGGTCCGGTTC
Iniciador de anexação ao sítio T7	GCGCGCGAATTCTAATACGACTCACTATAGGACTTCG GTCCAAGCTAATGCACTC
Iniciador de RT-PCR	GAACCGGACCGAAGCCCG
Sequenciamento de alto rendimento
Iniciador de sequenciamento reverso de HTS, GR/SSIII	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGTGTAGCCTA GTCAGTCAGCCGAACCGGACCGAAGCCCG
Iniciador de sequenciamento reverso HTS, GR/GsI	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAACGATAA GTCAGTCAGCCGAACCGGACCGAAGCCCG
Iniciador de sequenciamento reverso de HTS, CDG/GsI	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACCAGGTGTA GTCAGTCAGCCGAACCGGACCGAAGCCCG
Iniciador de sequenciamento reverso HTS, HH/GsI	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTGTACGGATTA GTCAGTCAGCCGAACCGGACCGAAGCCCG
Iniciador de sequenciamento de avanço	AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATGGTAA TTGTGCGCGCGAATTCTAATACGACTCACTATAG
Iniciador de RT	AGTCAGTCAGCCGAACCGGACCGAAGCCCG
Iniciador de indexação	CGGGCTTCGGTCCGGTTCGGCTGACTGACT

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 72/154

69/110

Cristalização
5HTP-II	GGACACTCTGATGATCGCGTGGATATGGCACGCATTG AATTGTTGGACACCGTAAATGTCCTAACACGTGTCCA
Calorimetria de titulação isotérmica
Aptâmerob de 5HTP-I	GGAGCTAATGCACTCTTAACGCCGCGTGGATATGCAC GCAACCGTGAATCGGGCACCGTAAATTCCGTAAGTGG GTGCATTAGC
Aptâmero de 5HTP-II	GGCACTCTGATGATCGCGTGGATATGGCACGCATTGA ATTGTTGGACACCGTAAATGTCCTAACACGGGTGCC
AptÂmero de 5HTP-III	GGAGCTAATGCACTCCCATTTTCCGTGGATATGGCAC GCTACCGATGTTGGGACCGTAATGTCCATTACGGGTG CATTAGC
Aptâmero de 5HTP-IV	GGATAGGACTCTCTGGTTCGCGTAGATATGGCACGCA ATTGAAGAATGGGCACCGTAAATGTCTGTAGACGGGT CCTATCC
AptÂmero de 5HTP-V	GGATAGGACTCATTCGGCCGCGTGGATATGGCACGCA GGAGATGTGTGGACACCGTAAATGTCCGTAGGCGGGT CCTATCC
Aptâmero de 5HTP-VI	GGATAGGACTCAACATCTCGCGTGGATATGGCACGCA GACTTCCAGTGGGCACCGTAAATGTCCGTAGACGGGT CCTATCC
Aptâmero de 5HTP-VII	GGATAGGACATGTAATCTCCAAACCATTCGAAAGAGT GGGACGCTAGACCTCCGGCCTAAACCGAAAGGTAGGT AGCGGGGCTAGGTATGTCCTATCC
Aptâmero de 5HTP- VIII	GGATAGGAGCTGTTTGGTATCCAATGAAAATGTACTA CCAACTTGAATCTCCCAAATAGGCTAGGTAGCTCCTA TCC
Sonda química SHAPE
5HTP-I, SHAPE	GGACTTCGGTCCAAGCTAATGCACTCTTAACGCCGCG

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 73/154

70/110

	TGGATATGCACGCAACCGTGAATCGGGCACCGTAAAT TCCGTAAGTGGGTGCATTAGCAATCGATCCGGTTCGC CGGATCCAAATCGGGCTTCGGTCCGGTTC
5HTP-II, SHAPE	GGACTTCGGTCCAAGCTAATGCACTCTGATGATCGCG TGGATATGGCACGCATTGAATTGTTGGACACCGTAAA TGTCCTAACACGGGTGCATTAGCAATCGATCCGGTTC GCCGGATCCAAATCGGGCTTCGGTCCGGTTC
5HTP-III, SHAPE	GGACTTCGGTCCAAGCTAATGCACTCCCATTTTCCGT GGATATGGCACGCTACCGATGTTGGGACCGTAATGTC CATTACGGGTGCATTAGCAAAATCGATCCGGTTCGCC GGATCCAAATCGGGCTTCGGTCCGGTTC
5HTP-IV, SHAPE	GGACTTCGGTCCTTGGATAGGACTCTCTGGTTCGCGT AGATATGGCACGCAATTGAAGAATGGGCACCGTAAAT GTCTGTAGACGGGTCCTATCCAATCGGGCTTCGGTCC GGTTC
5HTP-V, SHAPE	GGACTTCGGTCCTTGGATAGGACTCATTCGGCCGCGT GGATATGGCACGCAGGAGATGTGTGGACACCGTAAAT GTCCGTAGGCGGGTCCTATCCAATCGGGCTTCGGTCC GGTTC
5HTP-VI, SHAPE	GGACTTCGGTCCTTGGATAGGACTCAACATCTCGCGT GGATATGGCACGCAGACTTCCAGTGGGCACCGTAAAT GTCCGTAGACGGGTCCTATCCAATCGGGCTTCGGTCC GGTTC
5HTP-VII, SHAPE	GGACTTCGGTCCTTGGATAGGACATGTAATCTCCAAA CCATTCGAAAGAGTGGGACGCTAGACCTCCGGCCTAA ACCGAAAGGTAGGTAGCGGGGCTAGGTATGTCCTATC CAATCGGGCTTCGGTCCGGTTC
5HTP-VIII, SHAPE	GGACTTCGGTCCTTGGATAGGAGCTGTTTGGTATCCA AT GAAAAT G TAC TAC CAAC T T GAAT C T C C CAAATAGG

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 74/154

71/110

	CTAGGTAGCTCCTATCCAATCGGGCTTCGGTCCGGTT C
Sensores de Brócolis
5HTP-II/A-Brócolis	GGACGGAGACGGTCGGGTCATATGATGATCGCGTGGA TATGGCACGCATTGAATTGTTGGACACCGTAAATGTC CTAACAATATTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCGTCC
5HTP-II/U-Brócolis	GGACGGAGACGGTCGGGTCTATAGATGATCGCGTGGA TATGGCACGCATTGAATTGTTGGACACCGTAAATGTC CTAACATATATCGAGTAGAGTGTGGGCTCCGTCC
5HTP-IV/A-Brócolis	GGACGGAGACGGTCGGGTCATATTCTGGTTCGCGTAG ATATGGCACGCAATTGAAGAATGGGCACCGTAAATGT CTGTAGACATATTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCGTCC
5HTP-IV/U-Brócolis	GGACGGAGACGGTCGGGTCTATATCTGGTTCGCGTAG ATATGGCACGCAATTGAAGAATGGGCACCGTAAATGT CTGTAGACTATATCGAGTAGAGTGTGGGCTCCGTCC
5HTP-VII/A-Brócolis	GGACGGAGACGGTCGGGTCATATATATTCGATGTAAT C T C CAAAC CAT T C GAAAGAG TGGGACGCTAGACCTCC GGCCTAAACCGAAAGGTAGGTAGCGGGGCTAGGTAGT AGAGTGTGGGCTCCGTCC
5HTP-VII/U-Brócolis	GGACGGAGACGGTCGGGTCTATATGTAATCTCCAAAC CATTCGAAAGAGTGGGACGCTAGACCTCCGGCCTAAA CCGAAAGGTAGGTAGCGGGGCTAGGTATATATCGAGT AGAGTGTGGGCTCCGTCC
5HTP-VIII/A-Brócolis	GGACGGAGACGGTCGGGTCATATTGTTTGGTATCCAA TGAAAATGTACTACCAACTTGAATCTCCCAAATAGGC TAGGTAATATTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCGTCC
5HTP-VIII/U-Brócolis	GGACGGAGACGGTCGGGTCTATATGTTTGGTATCCAA TGAAAATGTACTACCAACTTGAATCTCCCAAATAGGC TAGGTATATATCGAGTAGAGTGTGGGCTCCGTCC

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 75/154

72/110

Transcrição de passagem única in vitro
ribocomutador de 5HTP-IV/pbuE	AATATTGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTAT AATGTGTGGAATTAAATAGCTATTATCAGGATTTTTC TGGTTCGCGTAGATATGGCACGCAATTGAAGAATGGG CACCGTAAATGTCTGTAGACAAAATCCTGATTACAAA ATTTGTTTATGACATTTTTTGTAATCAGGATTTTTTT AT T TAT CAAAACAT T TAAGTAAAGGAGT T T GT TAT G

a N representa uma posição na qual a composição de A, C, G e T é aproximadamente 25% cada.

^b sequências de aptâmeros e sensores de RNA são dadas como suas sequências de DNA equivalentes.

[000195] Um outro problema que complicou a seleção de andaimes foi a baixa fidelidade das transcriptases reversas virais (RTs) . A engenharia do MMLV RT para melhorar a termoestabilidade e a capacidade de processamento para criar as versões mais usadas dessa enzima diminuiu sua já baixa fidelidade. A incorporação incorreta ou deleçao de nucleotídeos em sequências conservadas do andaime perturba prontamente interações terciárias que estabilizam a dobra global. Os RNAs que carecem de estrutura são amplificados mais eficientemente pela RT, o que pode introduzir um viés significativo durante a etapa de replicação de cada rodada de seleção, o que em parte provavelmente leva ao fenômeno da tirania de pequenos motivos observado na seleção. Para abordar isso, uma RT recentemente caracterizada derivada de um intron do grupo II móvel do termófilo de Geobacillus stearothermophilus (GsI-IIC-MRF ou Gsl) que retém atividade até 70 °C (em função de 55 °C para SSIII) e tem inerentemente maior fidelidade que RTs derivadas de MMLV foi adotada. Para comparação, a seleção de andaime GR foi realizada com uma RT

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 76/154

73/110 derivada de MMLV (Superscript III ou SSIII) junto com Gsl.

Exemplo 2: Seleção utilizando andaimes contra 5HTP produz muitos aptâmeros potenciais [000196] O alvo para a seleção foio 5-hidróxi-L-triptofano (5HTP; Figura 2A), o precursor biossintético imediato da serotonina, que foi imobilizado em uma matriz sólida por meio de seu grupo carboxilato. Sete rodadas de seleção com cada biblioteca foram realizadas, com contra-seleções contra Ltriptofano e procedimentos de lavagem cada vez mais rigorosos em rodadas posteriores. Na seleção de SSIII, foi adotado um protocolo SELEX convencional em que a coluna de afinidade foi extensivamente lavada em ciclos iniciais antes da eluição competitiva para remover os RNA não ligantes. A eluição competitiva foi inicialmente observada na quarta rodada e atingiu um pico > 50% do RNA total de entrada na sexta rodada. As seleções Gsl utilizaram um protocolo menos rigoroso que o geralmente recomendado, em que aproximadamente os 10% finais do RNA total deixado na coluna sob eluição competitiva foram recolhidos para amplificação nos quatro ciclos iniciais para preservar a diversidade de sequências no grupamento antes de aumentar a severidade da lavagem. Detalhes das seleções são dados nos Exemplos 6 a 8 e Tabela 2.

Tabela 2: Condições de seleção por ciclo

Rodada	[RNA] pmol	Lavagens*	Observação
Seleção SS-III
1	1.000	3	Seleção sepharose	contrária	contra	AcO-
2	400	6	Seleção sepharose	contrária	contra	AcO-

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 77/154

74/110

3	400	10
4	400	10
5	100	10
6	100	10	Seleção contrária de 30 segundos com L-triptofano 100 mM
7	100	10	Seleção contrária de 30 segundos com L-triptofano 100 mM
Seleções com gel
1	1.000	3	Seleção contrária contra AcO- sepharose
2	400	3	Seleção contrária contra AcO- sepharose
3	400	5
4	400	5
5	400	10
6	200	6	Seleção contrária de 30 segundos com L-triptofano 100 mM
7	200	10	Seleção contrária de 30 segundos com L-triptofano 100 mM

	*	Cada lavagem constituiu 3	volumes de coluna	de
tampão
[000197]	Ao	preservar a diversidade de	sequências e minimizar
os eventos	estocásticos iniciais,	uma combinação	de

sequenciamento de nova geração (NGS) e análise de bioinformática a jusante foi usada para revelar aptâmeros em potencial e elucidar os principais recursos da seleção. Para cada seleção, >200.000 leituras foram obtidas para o RNA da rodada final e as sequências resultantes foram agrupadas e as

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 78/154

75/110 árvores de máxima verossimilhança geradas. A comparação das seleções SSIII e Gsl usando o andaime do GR revelou várias caracteristicas importantes.

[000198] Uma matriz de distância da seleção de GR/SSIII mostrou claramente apenas alguns grupamentos isolados e dentro de cada grupamento as sequências têm um alto grau de afinidade interna (Figura 2B) . A maioria (> 80%) das sequências se agrupa em três familias distintas relacionadas à sequência, referidas como 5HTP-I, -II e -III (Figura 2D) , com o agrupamento restante em populações pequenas que são difíceis de interpretar. Isso é típico de um SELEX tradicional, no qual isolados únicos são frequentemente identificados e mutagênese e seleção adicionais são necessárias para obter informações de covariância. Ao contrário, a seleção de GR/GsI produziu grupamentos mais diversificados, com maior amostragem de sequências que povoam regiões entre grupamentos principais (Figuras 2C e 2D) . As seleções de CDG e HH com Gsl são semelhantemente diversas em seu espaço de sequência com muitos aptâmeros em potencial (Figura 7). Embora as abordagens de seleção tradicionais frequentemente dependam da seleção excessiva para facilitar a localização de um aptâmero com informações limitadas de sequência, a preservação da diversidade de vencedores e a análise de sequência pelo NGS permitiram uma análise mais completa dos padrões de conservação e covariância, auxiliando na determinação de sequências consensuais de aptâmeros. Resultados semelhantes foram observados na seleção de L-DOPA com andaime GR (Figura 18) . Um subgrupamento de 250 sequências de cada um dos aglomerados que produziram aptâmeros de 5HTP validados é descrito adicionalmente neste documento.

[000199] Inesperadamente, além da diversidade de sequências limitada da seleção de SSIII, observou-se um acúmulo pesado de

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 79/154

76/110 deleções e mutações pontuais, de tal modo que nenhuma sequência que retém a identidade completa das regiões constantes do andaime fosse recuperada na alça final. Dois dos grupamentos, 5HTP-I e 5HTP-III (Figura 2D), possuem deleções em L2 ou L3 do andaime essencial para a formação da interação alça-alça dos ribocomutadores de purina. Além disso, os membros de 5HTP-III contêm várias deleções pontuais adquiridas durante a seleção, o que gera o potencial para uma estrutura secundária drasticamente alternativa. A análise de energia livre minima (MFE) e de coavariação desta sequência sugere uma estrutura secundária consistente com a sequência consenso do aptâmero de L-triptofano (um aptâmero que compreende uma junção de duas vias; Majerfeld & Yarus, Nucleic Acids Research, 2005, 33, 5482-5493), sugerindo ainda que o andaime não foi mantido na familia 5HTP-III. Ο 5HTP-II é o único grupamento principal que mantém os requisitos de sequência necessários para a estrutura terciária projetada na biblioteca e é a única sequência abundante compartilhada entre as seleções SSIII e Gsl. Ao contrário da seleção que utiliza SSIII, as seleções Gsl exibiram baixas quantidades de mutações que se acumulam na região constante do andaime, indicando uma manutenção robusta do andaime (Figura 8).

[000200] Para identificar sequências com alto potencial de aptâmero, os dez grupamentos mais populosos de cada grupo foram alinhados individualmente, estruturas de MFE previstas e modelos de covariação gerados. Isso permitiu uma visão rica em informações das principais sequências de consenso apresentadas pelas seleções. Uma vez que o experimento GR/SSIII foi altamente superselecionado, a sequência mais abundante de cada um dos três principais grupamentos foi escolhida para validação adicional. Para as seleções de Gsl, as sequências dominantes de um ou mais grupamentos cuja estrutura MFE consensual era consistente com o andaime genitor

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 80/154

77/110 foram selecionadas.

Exemplo 3: Os grupamentos mais populosos preservam a arquitetura do andaime e ligam ο 5HTP com alta seletividade [000201] O andaime estrutural facilita muito a validação das características estruturais e de interação dos aptâmeros resultantes. A sonda química da estrutura do RNA usando anidrido N-metilisatoico (NMIA), uma técnica conhecida como SHAPE, revela se aa arquiteturaa secundária e terciária dos andaimes parentais foram preservadas, bem como mudanças estruturais dependentes de ligantes no aptâmero. Na seleção de GR/SSIII, os aptâmeros 5HTP-I e 5HTP-II têm alterações localizadas nos padrões de reatividade da NMIA na presença de ligando nos elementos de junção de três vias, consistente com este ser o local de ligação ao ligando (Figura 3A, Figura 19). Ο 5HTP-III, contudo, mostra alterações fora de J2/3 nas regiões constantes, consistentes com a estrutura prevista e o sítio de ligação L-Trp de um aptâmero de triptofano descrito anteriormente (Majerfeld & Yarus). A preservação do andaime GR foi avaliada utilizando uma única assinatura de reatividade de NMIA independente de ligando, em L3 que está presente apenas quando interage com L2 (Stoddard et al., RNA, 2008, 14, 675-684) . 5HTP-II é a única sequência dos três grupamentos da seleção SSIII que apresenta esse recurso. Por outro lado, todas as sequências testadas da seleção GR/GsI possuem essa assinatura de estrutura terciária (Figuras 9A e 20) . Estes dados indicam fortemente que a seleção GR/SSIII rendeu três aptâmeros distintos, com apenas 5HTP-II preservando o andaime estrutural, enquanto a seleção GR/GsI produziu várias soluções mantendo o andaime. Enquanto as assinaturas dependentes de 5HTP para os isolados GR/GsI são mais fracas que as de 5HTP-II e o aptâmero parental, a quantificação revela que elas se localizam na junção de

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 81/154

78/110 maneira análoga (Figura 3B) . A caracterização SHAPE das seleções de CDG/GsI e HH/GsI mostra mudanças dependentes de ligando para as novas classes de aptâmeros e um padrão geral de reatividade semelhante ao do andaime parental (Figuras 9B, 9C, 21 e 22).

[000202] A afinidade e seletividade destes aptâmeros para 5HTP e um grupamento de compostos quimicamente semelhantes foi avaliada por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). É importante notar que, para todos os aptâmeros testados, as sequências de cassete 5 'e 3' não foram necessárias para a ligação de 5HTP, indicando o projeto bem sucedido de sequências neutras (Figura 3C) . Várias tendências emergiram dessa análise. Primeiro, ambos os aptâmeros que não preservam o andaime origem (5HTP-I, -III) não discriminam entre 5HTP e L-triptofano (Tabela 3) , um requisito crucial para aplicações baseadas em células. Em segundo lugar, a maioria dos aptâmeros que preservam o andaime junção de três vias tem maiores afinidades para ο 5HTP que os aptâmeros com andaimes quebrados e todos discriminam fortemente contra o L-triptofano. Isto indica que a arquitetura do andaime é importante para criar uma bolsa de ligação seletiva enquanto mantém afinidades comparáveis a outros aptâmeros sintéticos e naturais que se ligam a aminoácidos. 5HTP-I e 5HTP-III mostram forte discriminação entre 5HTP e serotonina, implicando que os átomos da cadeia principal são reconhecidos diretamente. Ao contrário, muitos dos aptâmeros que preservam o andaime ligam 7V-metil-5-hidróxi-L-triptofanomida com 2 a 4 vezes mais afinidade que 5HTP. Além disso, eles ligam a serotonina, o produto de descarboxilação de 5HTP, sugerindo uma menor exigência para os átomos da cadeia principal na ligação (Tabela 3) . Assim, alguns desses aptâmeros podem ser sensores extraordinários de serotonina. O mais impressionante das seleções Gsl é que os aptâmeros dominantes de cada seleção, apesar de possuírem

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 82/154

79/110 diferentes arquiteturas de andaime, convergiram em afinidades de ligação e perfis de seletividade altamente semelhantes, revelando que as junções de três vias são uma dobra robusta para hospedar compartimentos de ligação 5HTP. Em grupamento, estes dados mostram que distintas junções de oligonucleotideos, tais como variantes arquitetônicas de junção de três vias, são capazes de encontrar soluções robustas para o reconhecimento de 5HTP.

Tabela 3. Afinidade de aptâmeros para 5HTP e compostos relacionados

Seleção	sequência	5HTP KD, pMa	L-Trp KD, μΜ	Serotonina KD, μΜ	Me-5HTP KD, μΜ
GR/SSIII	5HTP-I	33 ± 1	41 ± 1	>1.000	—
	5HTP-II	3,9 ± 0,1	280 ± 30	38 ± 8	26 ± 9
	5HTP-III	38 ± 14	20 ± 5	>1.000	—
GR/GsI	5HTP-IV	8,8 ± 1,5	520 ± 90	4,7 ± 0,3	1,3 ± 0,1
	5HTP-V	11 ± 1	170 ± 10	16 ± 4	6,6 ± 0,4
	5HTP-VI	60 ± 15	N. D.b	16 ± 2	25 ± 8
CDG/GsI	5HTP-VII	9,3 ± 0,3	N. D.	1,2 ± 0,1	2,1 ± 0,4
HH/GsI	5HTP-VIII	7,3 ± 2,8	N. D.	1,2 ± 0,2	2,5 ± 0,5

^a Todas as medições feitas a 25 °C em tampão contendo

MgCl₂ 10 mM.

^b Não detectável.

Exemplo 4: Análise estrutural do aptâmero 5GR-II revela que um motivo de RNA recorrente é utilizado para ligação a 5HTP [000203] Para demonstrar ainda que a estratégia de seleção do andaime aqui descrita preservou a dobra do RNA parental e para elucidar como o RNA pode reconhecer 5HTP, a estrutura de 5HTPII complexada com 5HTP foi determinada a uma resolução de 2,0

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 83/154

80/110

 (Figura 3D, mapas de densidade elétrica representativos são mostrados na Figura 10 e as estatísticas cristalográficas são apresentadas na Tabela 4) . Esta estrutura globalmente se sobrepõe ao aptâmero ribocomutador de xtp guanina parental com um r.m.s.d. de 6,5  em todos os átomos da cadeia principal nos residues 19 a 77, com as principais fontes de desvio produzidas por um ângulo diferente para Pl em relação à bolsa de ligação e à junção variada região (Figuras 16A-C). Dentro da interação terciária L2-L3, o padrão de interações base-base e geometria da cadeia principal é quase idêntico entre os dois RNAs (r.m.s.d. 0,96  sobre todos os átomos nos residues 3139, 61-67). Assim, o andaime GR permaneceu intacto, tanto global quanto localmente, durante o processo de seleção.

Tabela 4. Dados cristalográficos e estatísticas de refinamento.

	RNA de 5HTP-II/5HTP
Coleta de dados
Grupo de espaço	C121
Dimensões celulares
a, b, c (Â)	127,55, 26, 59, 63,37
α, β, Y (°)	90, 106,32, 90
Resolução (Â)	19, 95 - 2,00 (2,07 - 2,00) *
-^sym OU -Rmerge	0, 084 (0, 191)
I /σΐ	11,2 (5,4)
Completude (%)	96, 2 (73, 8)
Redundância	4,34 (3, 65)
Refinamento

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 84/154

81/110

Resolução (À)	18,33 - 2,00 (2,07 - 2,00)
N° de reflexões únicas	13,725
&E tÚRtrabalho/Rlivre	21,7/25, 8 (20,1/26, 0)
No. de átomos
RNA	1513
Ligando/íon	16/90
Água	112
Fatores B (média)
RNA	29, 5
Ligando/íon	16,2/35
Água	23,5
Desvios r.m.s.
Comprimentos de ligação (À)	0,007
Ângulos de ligação (°)	1,308

* Os valores entre parênteses são para o invólucro de resolução mais alta.

[000204] A bolsa de ligação ao ligando 5HTP-II reside na junção de três vias que possui uma estrutura local radicalmente diferente do RNA original. Os contatos de ligantes diretos são mediados principalmente por nucleotideos em J2/3 usando um módulo estrutural de RNA comum, a alça T (Figura 4A) . Os primeiros cinco nucleotideos de J2/3 formam uma estrutura canônica de alça T que se sobrepõe quase perf eitamente a uma alça T de tRNA^phe (r.m.s.d. 0,49 Â para resíduos da cadeia principal). A estabilização da posição 3

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 85/154

82/110 na alça T do tRNA por emparelhamento de Watson-Crick de longo alcance com a alça D é critico para a atividade. Ο 5HTP-II possui uma interação semelhante entre G47 da alça T e C75 do J3/1. A alça T de 5HTP-II hospeda 5HTP empilhados entre as posições 4 e 5 de uma maneira ortóloga à forma como a alça T de tRNA abriga uma purina intercalante da alça D e também é semelhante para o reconhecimento do pirofosfato de tiamina (TPP) por seu ribocomutador (Figura 4B) . Enquanto a alça T é diretamente responsável pelo reconhecimento do ligando, os nucleotideos de todas as três regiões aleatórias estão envolvidos na estrutura local auxiliando na formação de uma junção compacta que estabiliza a alça T. Dado um grupamento tão complexo de interações suportando a alça T, é improvável que a alça T isolada se ligue a 5HTP.

[000205] A estrutura cristalina de 5HTP-II fornece informações adicionais sobre o reconhecimento de 5HTP pelos outros aptâmeros de andaimes. O grupamento mais abundante na seleção de GR/GsI, 5HTP-IV, também contém a assinatura UUGAA da alça T. O motivo, no entanto, é 3'-deslocado por um único nucleotideo, provavelmente levando a uma orientação alternativa dentro da junção de três vias, como sugerido por significativas diferenças de sequência em Jl/2 e J3/1 entre 5HTP-II e 5HTP-IV. Na seleção de HH, a sequência mais abundante do grupamento mais populoso (5HTP-VIII) também contém a sequência UUGAA conservada da alça T em J2/3. A análise de variação de sequência desta região do aptâmero de 5HTP-VIII revela um padrão de conservação compatível com o das voltas em T biológicas com apenas ligeiros desvios (Figura 11) . Isto sugere que o motivo de alça T pode ser um módulo robusto para o reconhecimento de pequenos compostos planares

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 86/154

83/110 por RNA. Embora não exista uma alça T claramente identificável em RNAs da seleção de CDG, os parâmetros de ligação quase perfeitamente correspondem aos das outras duas seleções, sugerindo um modo de reconhecimento semelhante.

Exemplo 5: Aptâmeros de andaimes podem ser prontamente incorporados em dispositivos sensoriais robustos de pequenas moléculas [000206] Com técnicas de seleção de andaimes que se mostraram capazes de criar aptâmeros de RNA bem dobrados, altamente estruturados e específicos, sua capacidade de produzir biossensores funcionais de RNA sintético foi testada. Para criar estes dispositivos, uma estratégia de ligação de um aptâmero de ligação de molécula pequena a um módulo de ligação de fluoróforo através de um elemento helicoidal curtofoi utilizada. O aptâmero candidato principal de cada biblioteca foi acoplado ao aptâmero de ligação do fluoróforo de Brócolis com duas variantes helicoidais (os módulos de comunicação são referidos como A e U, Figura 12) ligando os dois aptâmeros. Isto resultou em um grupamento de RNAs capaze de detectar 5HTP e/ou serotonina em várias ordens de magnitude in vitro com faixas dinâmicas de fluorescência de saida variáveis (Tabela 5 e Tabela 6) . Muitos destes sensores, quando na presença de ligantes, são capazes de produzir niveis de fluorescência iguais ou superiores aos do aptâmero de Brócolis não conjugado sozinho em condições idênticas. Inerente a este sistema está uma F_so aparente reduzida (definida como a concentração de ligando necessária para induzir uma resposta fluorescente de metade do máximo) em relação ao K_D do aptâmero isolado, conforme monitorado pela fluorescência de Brócolis. No entanto, vários aptâmeros de andaimes mostram apenas uma

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 87/154

84/110 diferença de ~ 10 vezes entre seus K_D e F_so. No geral, isso se compara favoravelmente aos exemplos de dominios de aptâmeros de ribocomutador naturais na literatura cujas diferenças em K_D e F₅o podem se aproximar de 1.000 vezes, uma característica importante a ser considerada quando a sensibilidade ou a toxicidade do ligando é um fator limitante na aplicação de ribocomutador.

Tabela 5. Desempenho in vitro de sensores de

5HTP/serotonina baseados em Brócolis

	ligador/1 igando	A /5HTPa	A/5HT	U/5HTP	U/5HT
aptâmero		F50, μΜ	F50, μΜ	Fso, μΜ	Fso, μΜ
5HTP-II	190 ± 30	N. D.b	180 ± 20	N. D.
5HTP-IV	N. D.	190 ± 70	240 ± 20	52 ± 4
5HTP-VIII	N. D.	790 ± 190	590 ± 90	260 ± 50

^a Todas as medições feitas a 25 °C em tampão contendo

MgC12 5 mM.

^b Não detectável.

Tabela 6: Desempenho dos sensores 5HTP-Brócolis Dobra F_max

Sensor Ligando [MgCUJ , mM Indução³ (% Brócolis)¹³ Fso^c, μΜ

5HTP-II/A	5HTP	1	3,5	18,5
		3	6, 3	71
		5	7,3	122	190 ± 30
		10	6	168

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 88/154

85/110

	20	4, 1	180
	5ΗΤ	1	1,3	6, 9
		3	3, 1	34, 6
		5	3,7	62,7
		10	3, 9	108
		20	3	134
5HTP-II/U	5ΗΤΡ	1	1, 9	21,1
		3	3, 1	72,2
		5	3,3	105
		10	3,3	130
		20	3,2	135
	5ΗΤ	1	0,4	4,7
		3	0,8	18,2
		5	1, 1	33,2
		10	1,3	52, 6
		20	1, 6	66, 4
5HTP-IV/A	5ΗΤΡ	1	1,2	2,7
		3	1,3	2, 9
		5	1,4	3, 1
		10	1,7	3, 8
		20	2	4,3
	5ΗΤ	1	1,0	2,4
		3	1,3	2,75
		5	1,4	3,2
		10	1,8	4
		20	2,2	4,7
5HTP-IV/A	5ΗΤΡ	1	2,5	8,5
		3	6	37,1
		5	8,2	71,2
		10	8,2	111

180 ± 20

190 ± 70

240 ± 20

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 89/154

86/110

		20	6, 1	126
	5HT	1	5, 1	17,2
		3	8,8	54,1
		5	9	78, 1	52 ± 4
		10	7,2	98,3
		20	5, 1	105
5HTP-VIII/A	5HTP	1	1, 1	3,7
		3	1,8	7
		5	2,4	10,4
		10	3,7	18
		20	5, 1	26, 9
	5HT	1	1,5	5
		3	4,4	17,7
		5	7,2	31,4	790 ± 190
		10	10, 9	53,3
		20	13	69, 5
5HTP-VIII/U	5HTP	1	1, 6	12,3
		3	2,5	43,3
		5	2,8	69, 7	590 ± 90
		10	3, 1	109
		20	3	126
	5HT	1	3, 8	30
		3	5,5	93,4
		5	4,8	116	260 ± 50
		10	3,7	131
		20	3,2	136
a	Definido como	(flúores	cência no	ligando de

saturação/fluorescência na ausência de ligando); sombreamento cinza indica sensores que mostraram um desempenho forte.

Definido como (fluorescência máxima do

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 90/154

87/110 sensor/fluorescência isolada do aptâmero de Brócolis) * 100.

^c Definido como a concentração de ligando necessária para induzir a metade da resposta de fluorescência máxima.

[000207] Dos dispositivos anteriores, ο 5HTP-II (A) é capaz de detectar especificamente 5HTP em E. coli. Este sensor codificado geneticamente produziu uma rápida indução de fluorescência após a adição de 5HTP 2 mM para o crescimento de E. coli em um meio definido quimicamente rico (10 minuto), com aproximadamente 80% de bactérias apresentando uma resposta observável em 20 minuto (Figura 5). O sinal de fluorescência foi completamente dependente do dispositivo de RNA que se liga a 5HTP. Nenhum ganho de sinal foi observado quando o Ltriptofano foi incluído no meio ou quando o sensor continha uma mutação pontual (A48U) no módulo da alça T que reduziu a ligação do ligando ao aptâmero isolado (dados não mostrados). Além disso, o aumento na fluorescência relativa na presença de 5HTP foi comparável aos sensores de dinucleotídeos cíclicos robustos baseados em domínios de aptâmeros de ribocomutador naturais em células vivas. É importante ressaltar que essas observações estão em contraste com as alegações de que os aptâmeros não naturais reduziram o desempenho intracelular em comparação com os aptâmeros naturais no contexto dos sensores fluorométricos (You, PNAS (2015) 112: 21, E2756-2765).

[000208] Os aptâmeros 5HTP em andaimes selecionados de também foram acoplados a chaves secundárias modulares projetadas por engenharia derivadas de plataformas naturais de expressão de ribocomutador para gerar elementos reguladores de genes. Utilizando uma estratégia de acoplamento em que a hélice Pl do aptâmero e plataforma de expressão é acoplada diretamente, um regulador proficiente de transcrição dependente de ligando foi

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 91/154

88/110 projetado pela fusão do sensor 5HTP-IV e da plataforma de comutação LIGADO do pbuE(Figura 6A) . O elemento de RNA resultante é capaz de ativar a leitura transcricional in vitro com um perfil de especificidade idêntico ao dominio do aptâmero em isolamento e possui uma faixa dinâmica consistente com os ribocomutadores naturais (Figura 6B) ; Surpreendentemente, L-Trp é completamente incapaz de permitir a transcrição de leitura direta. Novamente, a discrepância entre K_D e T50 não foi insignificante (6 vezes para serotonina, 22 vezes para 5HTP), mas refletiu tendências observadas para ribocomutadores naturais em que propriedades termodinâmicas do aptâmero nem sempre ditam sua capacidade de se comunicar com uma sequência de adaptador.

Exemplo 6: Aptâmeros de andaimes de acordo com modalidades exemplares [000209] O aptâmero de Brócolis foi acoplado a um andaime tRNA para estabilizar o biossensor para aplicações baseadas em células. Quatro diferentes aptâmeros de 5HTP de andaime GR foram acoplados a quatro módulos de comunicação de diferentes comprimentos (dois a cinco pares de bases A-U e U-A; Figura 14A) e cada biossensor resultante testado quanto à capacidade de fluorescer de um modo dependente de ligando. Cada sensor foi avaliado quanto à sua alteração da dobra dependente de ligando na fluorescência e brilho máximo em relação ao aptâmero de Brócolis isolado tanto in vitro (Figura 14B; Tabelas 7 e 8) quanto em E. coli (Figura 14D; Tabelas 9 e 10) . Para permitir a triagem rápida de candidatos in vitro, os biossensores foram transcritos e utilizados diretamente no ensaio fluorométrico sem posterior purificação. Estes dados revelam que três aptâmeros (5GR-II, -TV e -V) produziram

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 92/154

89/110 sensores que podem detectar 5HTP e/ou serotonina tanto in vitro quanto no contexto celular, com 5GR-II demonstrando o melhor desempenho em relação ao aumento da dobra combinada em fluorescência e brilho máximo.

[000210] Para demonstrar ainda mais o potencial de aptâmeros de andaimes, utilizou-se imagiologia de células vivas para visualizar a captação de 5HTP por E. coli utilizando o biossensor 5GR-II/CM-4. A imagiologia de fluorescência de células individuais revelou uma indução rápida de fluorescência após a adição de 5HTP 2 mM em E. coli crescendo em um meio definido quimicamente rico, com aproximadamente 80% de bactérias apresentando uma resposta observável em 20 minuto (Figuras 15A, D) . O sinal de fluorescência foi completamente dependente do 5HTP de ligação ao dispositivo de RNA; nenhum ganho de sinal detectável foi observado quando o L-triptofano foi incluído no meio (Figuras 15B, E) ou quando o sensor continha uma mutação pontual (A48U) no módulo da alça T que reduziu a ligação do ligando ao aptâmero isolado (Figuras 15C, F) . O aumento observado na fluorescência relativa na presença de 5HTP foi comparável aos sensores de dinucleotídeos cíclicos robustos baseados em domínios de aptâmeros de ribocomutador naturais em células vivas. Estes resultados contrastam com as reivindicações anteriores de que os aptâmeros sintéticos reduziram o desempenho intracelular em comparação com os aptâmeros naturais e é mostrado aqui que múltiplos aptâmeros sintéticos são capazes de funcionar dentro de E. coli no contexto de um RNA fluorogênico alostérico.

[000211] Os biossensores de 5HTP anteriores foram projetados com conhecimento de análise bioquímica e biofísica de aptâmeros selecionados. No entanto, um fluxo de trabalho

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 93/154

90/110 ideal para o rápido desenvolvimento de biossensores seria capaz de usar informações derivadas apenas da análise computacional da seleção para projetar RNAs candidatos. Para demonstrar que os aptâmeros de andaimes incorporam principies de projeto que permitem a engenharia de biossensores na ausência de caracterização experimental, a estratégia do biossensor anterior foi empregada para quatro aptâmeros derivados da seleção de L-DOPA. Nenhum desses aptâmeros foi validado de nenhuma forma antes de sua incorporação em sensores fluorogênicos alostéricos. A triagem dos biossensores resultantes com L-DOPA e dopamina in vitro (Figura 14C; Tabelas 7 e 8) e em E. coli (Figura 14E; Tabelas 9 e 10) revelou dois aptâmeros (DG-I e DG-II) que funcionam em ambos os contextos.

Tabela 7. Indução da dobra in vitro de aptâmeros com andaime GR fluorogênicos

aptâmero	ligando	C^-2	CM-3	C»-4	CM-5
5GR-ÍI	5HTPa	3,5 ± 0.1”	5.1 ± 0.2	2.5 ± 0.1	1.2 ±0.1
5GR-1V	5HTP	14 ± 1	3.5 ±0.7	4.1 ±0.2	2.7 ± 0.2
5GR-V	5HTP	13 ± 1	11 ± 1	í x v.A'	1.8 ±0.1
5GR-VI	5HTP	0 9 ± 0.1	1.2 ±0.1	0.9 ± 0.1	1.1 ±0.1
5GR-I!	Serotonina	1.5 ± 0.1	3.7 ± 0.1	1.8 ±0.1	1.1 ±0.1
5GR-1V	Serotonina	16 ± 1	5.5 ± 1.1	4.2 ± 0.2	3.2 ± 0 2
5GR-V	Serotonina	11 ± 1	8.9 ± 0.8	7.3 ± 0.6	1.3 ±0.2
5GR-V!	Serotonina	0.7 ± 0.1	1.4 ±0.2	0.8 ± 0.1	1.1 ±0.1
DGR-1	3,4-DHF	2.4 ± 0.2	6.4 ± 0.6	2.3 ± 0.2	1.5 ±0.1
DGR-H	3t4-DHF	2.3 ± 0.4	3.8 ± 0.8	1.2 ±0.1	1.1 ±0.1
DGR4IÍ	3.4-DHF	1.3 ± 0.1	1.4 ±0.1	1.6 ± 0.1	1.1 ±0.2
DGR-1V	3,4-DHF	1.9 ± 0.1	1.7 ±0.1	4.3 ± 0.2	1.3 ±0.1
DGR-1	Dopamina	3.5 ± 0.5	7.9 ± 0.9	2.5 ± 0.2	1.5 ±0.1
DGR-1 í	Dopamina	4.6 ± 0.8	4.2 ± 1.1	1.3 ±0.1	1.1 ±0.1
DGR4II	Dopamina	1.2 ± 0.1	1.4 ±0.1	1.7 ±0.1	1.0 ±0.1
DGR-1V	Dopamina	2 5 ± 0.1	2.0 ±0.1	8.0 ± 0.3	1.3 ±0.1

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 94/154

91/110 ^a Concentração de ligando é de 2 mM.

^b Indução da dobra (FI) é calculada como (fluorescência total, + ligando)/(fluorescência total, ligando).

O erro é relatado como o erro padrão da média para três experimentos independentes.

Tabela 8. Brilho in vitro de aptâmeros com andaime GR fluorogênicos em relação ao Brócolis parental

aptâmero	ligando	CM-2	CM-3	CM-4	CM-5
5GR-H	5HTP-	54 ± 10	75 ± 14	89 ± 16	97 ± 20
5GR-ÍV	5HTP	5.9 ± '1.4	0.4 ±0 1	10 ± 2	19±4
5GR-V	5HTP	13 ±3	3.4 ± 0 5	5.7 ± 1.3	5.5 ± 1.0
5GR-VI	5HTP	1.0 ± 0.1	12 ±2	14 ± 3	43 ±8
*’ Serotonina	22 ± 3	54 ±9	63 ±9	8-8 ±17
sGR-lV Serotonina	7± 2	0.6 ± 0.1	11 ± 3	23 ±5
5GR-V Serotonina	11 ±2	2.7 ± 0.2	5.2 ± 1.3	3.8 ±0.5
5GR-VI Serotonina	0.8 ± 0.1	13 ±1	12 ± 3	45 ±9
DGR4	3,4-DHF	0.5 ± 0.1	8.9 ± 0.7	6.7 ±1.1	22 ± 4
DGR-H	3,4-DHF	1.3 ± 0.7	11 ±4	4.7 ± 1.1	17 ± 1
DGR-lll	3,4-DHF	3.3 ± 0.2	25 ±4	15 ± 2	61 ± 11
DGR-iV	3,4-DHF	11 ± 3	47 ± 8	35 ± 5	78 ±10
DksR-i Dopamina	0.8 ± 0.1	12 ±1	7.7 ± 1.6	25 ± 6
DGR-H Dopamina	2.6 ± 1.3	12 ±4	5.1 ± 1.0	19±2
DGR-Hf Dopamina	3.1 ± 0.2	25 ±4	16 ± 2	56 ± 11
DGR-IV uopamina	15 ±4	53 ± 9	56 ± 11	76 ±9

^a Concentração de ligando do aptâmero é de 2 mM.

^b percentual de brilho é calculado como (sensor de fluorescência total, + ligando)/(fluorescência total Brócolis, + ligando) . O erro é relatado como o erro padrão da média para três experimentos independentes.

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 95/154

92/110

Tabela 9. Indução da dobra in vivo de aptâmeros com andaime GR fluorogênicos

aptâmero	ligando	CM-2	CM-3	CM-4	CM-5
5GR-H	SHIP3	0.9 ±0.1	2.6 ± 0.3	5.3 ± 0.2	3.1 ±0.45
5GR4V	SHIP	1.0 ± 0.2	1.7 ±0.7	1.4 ± 0.15	1.9 ± 0.55
5GR-V	5HTP	1. 2 ± 0.2	1.4 ± 0.2	1.6 ±02	0.9 ± 0.1
5GR-VI	5HTP	0.9 ±0.1	1.1 ±0.1	1.1 ±0.1	1.4 ±0.1
5GR-ÍÍ	Serotonina	1.0 ±0.1	1.8 ± .1	3.0 ± 0.4	2.5 ± 0.3
5GR-IV	Serotonina	1.0 ±0.1	0.9 ± 0.1	2.6 ± 0.7	6.9 ± 1.2
SGR-V	Serotonina	1.1 ±0.1	1.7 ± 0.4	1.8 ± 0.2	0.7 ±0.1
5GR-VI	Serotonina	1.0 ± 0.2	1.6 ±0.1	1.8 ± 0.1	1.9 ±0.2
DGR-Í	Dopamina	0./ ±0.1	0.9 ± 0.3	1.6 ± 0.6	2.7 ± 0.5
DGR-II	Dopamina	0.6 ± 0.1	1.0 ±0.4	3.1 ± 0.8	2.9 ± 0.5
DGR-íli	Dopamina	0.6 ±0.1	0.4 ± 0.2	0.7 ± 0.1	0.8 ± 0.1
DGR-ÍV		1.7±0.9	0.7 ± 0.2	1.3 ±0 1	0.9 ± 0.5

^a Concentração de ligando é de 2 mM.

^b Indução da dobra (FI) é calculada como (fluorescência total, + ligando)/(fluorescência total, ligando) . O erro é relatado como o erro padrão da média para três experimentos independentes.

Tabela 10. Brilho in vivo de aptâmeros com andaime GR fluorogênicos em relação ao Brócolis parental

aptâmero	ligando	CM-2	CM-3	CM-4	CM-5
5GR-0	5HTP3	0.4 ±0.1	2 ± 0.3	20 ± 2	27 ±2
5GR-ÍV	5HTP	0.4 ±0.1	0.7 ± 0.4	0.7 ± 0.2	0.9 ± 0.3
5GR-V	5HTP	0.5 ±0.1	0.4 ± 0.1	0.8 ± 0.1	0.8 ± 0.1
5GR-VÍ	5HTP	0.4 ±0.1	0.7 ± 0.1	0.6 ± 0.1	7 ± 0.4
5GR-H	Serotonina	0.4 ± 0.1	2.2 ± 0.1	15 ±2	25 ±6
5GR-IV	Serotonina	0.5 ± 0.1	0.4 ±0.1	1.5 ±0.3	4.8 ± 0.3
5GR-V	Serotonina	0.7 ± 0.1	0.6 ±0.1	1.0 ±0.2	0.8 ± 0.1
5GR-VI	Sei ulul III Id	0.4 ± 0.1	1.3 ± 0.1	1.1 ± 0.3	9.7 ± 0.3
DGR-I	Dopamina	0.7 ± 0.1	0.3 ± 0.1	0.8 ± 0.5	2±1
DGR-H	Dopamina	0.4 ± 0.1	0.7 ± 0.3	3± 1	3±2
DGR-HI	Dopamina	0.5 ±0.1	0.2 ± 0.1	0.6 ±0.1	3±1
DGR-1V	Dopamina	0.4 ± 0.1	0.4 ± 0.2	1 ± 0.3	3±2

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 96/154

93/110 ^a Concentração de ligando é de 2 mM.

^b percentual de brilho é calculado como (sensor de fluorescência total, + ligando)/(fluorescência total Brócolis, + ligando) . O erro é relatado como o erro padrão da média para três experimentos independentes.

Exemplo 7: Discussão [000212] Dispositivos baseados em RNA estão progredindo no sentido de se tornar uma ferramenta robusta em biologia sintética, impulsionada por um grupamento único de caracteristicas quando comparado a alternativas baseadas em proteínas, incluindo a capacidade de se regular em estrutura secundária previsível e uma pequena pegada genética. Esforços têm se concentrado na criação de ribocomutadores sintéticos, aptazimas e sensores de RNA fluorogênico, mas seu potencial ainda não foi totalmente desenvolvido em parte significativa devido à disponibilidade limitada de receptores de moléculas pequenas que funcionam no contexto de tais dispositivos. No trabalho aqui apresentado, foi projetada uma estratégia que explora a arquitetura estrutural secundária e terciária de ribocomutadores e ribozimas naturalmente desenvolvidos para bolsas de ligação de moléculas pequenas de andaime criadas por seleção in vitro. Importante, usando nenhuma informação além da obtida do sequenciamento de alto rendimento da rodada final de seleção, aptâmeros selecionados para L-DOPA usando esta abordagem foram acoplados a um módulo de aptâmeros fluorogênicos para produzir biossensores geneticamente codificáveis que funcionam no contexto celular.

[000213] Uma força fundamental dos métodos e composições aqui descritos é o uso de múltiplos andaimes em seleções paralelas para obter um grupamento de aptâmeros. Isto difere

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 97/154

94/110 significativamente das seleções tradicionais conhecidas na técnica em que o mesmo subgrupamento de soluções é reprodutivelmente gerado a partir de um grupamento aleatório simples que limita significativamente a diversidade e desenvolvimento de sensores. Embora os aptâmeros derivados de diferentes estruturas tenham afinidades semelhantes para 5HTP e seletividade contra L-triptofano, eles claramente têm características distintas em relação à sua capacidade de se comunicar com um domínio de leitura por meio da hélice Pl, uma característica comum a todos os andaimes. Em ribocomutadores biológicos, o ligando está em contato direto ou induz mudanças conf ormacionais no RNA que envolvem a hélice Pl que liga o aptâmero à chave reguladora a jusante. Sem pretender ser limitado pela teoria científica, há uma hipótese de que diferenças no desempenho do sensor através de diferentes aptâmeros são, em parte, devido à variação na relação espacial entre o ligando e a hélice entre domínios (Pl), uma característica que não pode ser totalmente controlada na seleção. No entanto, ao contrário das seleções profundas, a abordagem de seleção com andaimes apresentada aqui tende fortemente as seleções em direção a uma orientação favorável de ligando/Pl restringindo a possível posição do ligando.

[000214] Com um grupamento de aptâmeros, abordagens combinatórias podem ser empregadas para rastrear rapidamente sensores sem uma extensiva caracterização de aptâmeros ou otimização de dispositivos, como tipificado pelo desenvolvimento do sensor de dopamina (Figura 19) . O desenvolvimento de um dispositivo de RNA a partir de aptâmeros derivados de seleções profundas requer uma caracterização completa, juntamente com um amplo rastreamento dos módulos de

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 98/154

95/110 comunicação, deixando o aptâmero sensorial como um nó fixo e inalterável, devido à falta de diversidade. Com os métodos de seleção e composições de estrutura de andaimes aqui descritos, um grupamento de aptâmeros distintos pode ser acoplado combinatoriamente a um grupamento de módulos de comunicação e rapidamente rastreado para variantes com a atividade desejada, como demonstrado com a seleção de L-DOPA. Deste modo, os métodos e composições aqui providos devem facilitar o desenvolvimento prático de dispositivos e sensores de RNA, facilitando um gargalo fundamental no seu desenvolvimento. Notavelmente, enquanto neste estudo apenas os grupamentos mais populosos foram focados em cada seleção para caracterização e/ou projeto de sensores, dentro de cada seleção há muitos grupamentos contendo sequências alternativas que poderiam enriquecer ainda mais o grupamento inicial de aptâmeros para desenvolver aplicações a jusante.

[000215] Uma segunda vantagem poderosa dos métodos de seleção e composições aqui descritas é o potencial de dobra robusta no contexto celular provido pela interação terciária da arquitetura da junção de três vias. Cada um desses aptâmeros possui uma dobra que sofreu extensa evolução biológica. Além disso, as interações terciárias distais que organizam o núcleo de junção de três vias podem ser altamente estáveis. Tanto a interação L2-L3 do ribocomutador de purina quanto o receptor de tetra-alça-tetra-alça da cadeia principal de ribocomutador de di-GMP ciclico são capazes de formar estavelmente fora do contexto de outra estrutura de RNA. Ao contrário, a interação de longo alcance que organiza a ribozima de cabeça de martelo S. mansoni é dinâmica, o que é outro aspecto da diversidade em relação aos andaimes escolhidos. A presença de estrutura

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 99/154

96/110 secundária e terciária robusta no suporte permite que esses elementos guiem potencialmente a dobra de todos os membros da biblioteca inicial. Ao contrário, o dobramento incorreto do RNA durante a seleção e/ou a presença de múltiplas estruturas de MFE nos aptâmeros finais é frequentemente um problema significativo para a seleção profunda tradicional. Como não há pressão de seleção significativa para o dobramento de alta fidelidade em um protocolo tipico de seleção, prover essas informações na biblioteca de partida pode ser um caminho para RNAs de dobramento robusto.

[000216] Enquanto andaimes de junção de três vias foram escolhidos como o foco deste estudo, a diversidade de ribocomutadores e ribozimas naturais pode fornecer mais matéria-prima para esta abordagem. Dentro da familia de junção de três vias, há uma ampla variedade de sequências que variam a orientação das três hélices, o tamanho das regiões de junção e a natureza da interação terciária distai que pode fornecer estruturas superiores para um ligando ou sensor em particular. Além disso, outras dobras podem estar predispostas a ligar uma pequena molécula alvo com base na natureza do ligando cognato. Por exemplo, outra escolha lógica para um andaime se ligar a 5HTP é o dominio do aptâmero de ribocomutador de lisina. Os ligantes maiores podem ser mais facilmente reconhecidos por andaimes derivados de mononucleotideo de flavina ou de ribocomutador de cobalamina, enquanto os dinucleotideos, tal como NADH podem ser facilmente acomodados por um dos aptâmeros de nucleotideos di-ciclicos. Uma vez que foi descoberto que os aptâmeros de RNA naturais reconhecem moléculas pequenas quimicamente diversas, explorar suas arquiteturas para a seleção de novos aptâmeros tem o

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 100/154

97/110 potencial de facilitar o desenvolvimento de poderosas ferramentas inovadoras para monitorar e responder a pequenas moléculas no ambiente celular em uma ampla faixa de aplicações.

Exemplo 8: Construção da biblioteca [000217] Para cada andaime, os nucleotideos dentro de um invólucro de 8 Â envolvendo o sitio de ligação do ligando ou sitio ativo do RNA genitor foram identificados a partir de sua estrutura cristalina (GR, PDB ID 4FE5; CDG, PDB ID 3IWN; HH, PDB ID 3ZD5). As posições correspondentes foram randomizadas em um ultrâmero de DNA que abrangeu todo o dominio do aptâmero com sequências flanqueadoras conservadas para transcrição e amplificação reversa (Integrated DNA Technologies; as sequências de todos os ácidos nucleicos utilizados neste estudo são apresentadas na Tabela 1) . O ssDNA foram convertidos em modelos de dsDNA para transcrição utilizando — Ί 2 condrções de PCR Taq padrão nas quars for utrlrzado ~ 2x10 mol de DNA (correspondendo a ~ 10 sequencras rndrvrduars) em cada 100 pL de reação de PCR e amplificado durante 15 ciclos com o sitio T7 anexado e iniciadores de RT-PCR.

Aproxrmadamente 1x10 sequencras foram transcrrtas em 12,5 mL de reação de transcrição contendo 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 25 mM DTT, 2 mM espermidina, 0,01% Triton X-100, 4 mM cada rNTP pH 8,0, 0,08 unidades de fosfatase inorgânica (Sigma-Aldrich, pó liofilizado) e 0,25 mg/mL de RNA-polimerase de T7 e incubados a 37 °C durante 4 horas. As amostras de transcrição foram então precipitadas em etanol a 75% a -20 °C, sedimentadas e reconstituias em uma solução de 300 pL de formamida, 3 mL de ureia 8 M e 300 pL de EDTA 0,5 M, pH 8,0.

O RNA de comprimento total foi purificado com um gel de

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 101/154

98/110 acrilamida: bisacrilamida a 29: 1 a 8%, desnaturante. 0 RNA de produto foi excisado do gel após visualização por sombreamento por UV e eluido em NaOAc 0,3 M a pH 5,0 antes da troca e armazenamento em 0,5 x TE.

Exemplo 9: Sintese da matriz da coluna de afinidade de 5HTP [000218] Para as colunas derivatizadas, 3 mL de volume de leito de EAH Sepharose 4B (GE Healthcare) foram desidratados com dimetilformamida (DMF). 10 pmols de Fmoc-5-hidróxi-Ltriptofano e 10 pmols de hexafluorofosfato de benzotriazol-1il-oxitripirrolidinofosfônio (PyBOP) foram dissolvidos em 1 mL de DMF e adicionados à coluna desidratada com 20 pmols de N, N-di-isopropiletilamina (DIPEA) e incubados com agitação durante 2 horas à temperatura ambiente. A matriz da coluna foi então drenada e lavada extensivamente com DMF. As aminas sefarose não reagidas foram acetiladas adicionando 1 mmole de anidrido acético e 1 mmole de DIPEA em aproximadamente 1 mL de DMF e misturadas temperatura ambiente durante 1 hora. A coluna foi drenada da mistura de acetilação e lavada com DMF antes da desproteção de Fmoc usando 20% v/v de piperidina/DMF. A concentração de aminoácidos na coluna foi determinada medindo a concentração de Fmoc nas frações de desprotecção (A₃₀i nm = 8.000 M^_1 cm^-1) . Este método gerou aproximadamente 0,5 a 1 mM de aminoácido desprotegido por mL de resina. Para a seleção do contador, a EAH Sepharose foi preparada exatamente da mesma forma, excetopela omissão da etapa de acoplamento do ligando, resultando na Sepharose acetilada.

Exemplo 10: Seleção in vitro [000219] Para a seleção de andaime GR utilizando a

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 102/154

99/110 transcriptase inversa Superscript III (GR/SSIII), 350 pL de sepharose acetilada foram equilibrados em tampão de seleção (Na-HEPES 10 mM, pH 7,0, NaCl 250 mM, KC1 50 mM, MgCl₂ 10 mM, 0,1 mg/mL de tRNA) e 1 nmol de RNA da biblioteca em 350 pL de tampão de seleção foram incubados a temperatura ambiente durante 30 minuto com agitação. A solução aplicada foi removida e a matriz da coluna lavada uma vez com 350 pL de tampão de seleção. O fluxo reunido e a lavagem (total de 750 pL) foram adicionados à coluna de sepharose 4B derivatizada com 5HTP pré-equilibrada e incubados durante 45 minutos. A coluna foi então drenada e lavada três vezes com tampão de seleção antes da eluição com 10 mM de 5HTP em tampão de seleção (duas incubações de 1 hora em 350 pL; em um total de 700 pL de volume eluido). As frações eluidas foram então concentradas para 50pL em um filtro de 0,5 mL Ultracel lOkD MWCO (Millipore) e precipitadas com etanol em acetato de sódio a 0,3 M (pH 5,0), 5pg de glicogênio e levadas a uma concentração final de 75% de etanol antes do armazenamento em -70 °C durante 30 minuto. Detalhes das condições de cada ciclo são fornecidos na Tabela 2.

[000220] Para converter o RNA competitivo eluido em uma nova população de RNA, as frações de eluição foram precipitadas com etanol, sedimentadas a 13.000 x g a 4 °C, decantadas e secas sob vácuo. O sedimento seco foi reconstituído com 0,7 mM cada dNTP, 7 pM de iniciador de RT-PCR e levado a um volume total de 14 pL antes de aquecer a 65 °C durante 5 minutos e incubação em gelo durante 10 minuto. A solução foi então trazida para Ix tampão de primeira fita Superscript III (5x: 250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KC1, 15 mM MgCl₂) com 5 mM DTT e 200 unidades Superscript III (Life Technologies) em um total

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 103/154

100/110 volume de 20 pL antes de uma extensão de 15 minutos a 54 °C. Toda a solução de transcrição reversa de 20 pL foi amplificada por PCR em urn volume total de 500 pL utilizando condições de DNA-polimerase Taq padrão. O grupamento amplificado foi então transcrito pela adição de 100 pL da reação de PCR a uma reação de transcrição de 1 mL contendo 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 25 mM DTT, 2 mM espermidina, 0,01% Triton X-100, 4 mM cada rNTP pH 8,0, 0,08 unidades de fosfatase inorgânica e 0,25 mg/mL de polimerase de RNA de T7 e incubadas a 37 durante 2 horas. Uma

Q O reação de transcrrção de 100 pL para RNA marcado com P for realizada sob condições semelhantes com a exceção de que os rNTPs foram reduzidos para 2 mM para UTP, CTP e GTP enquanto o ATP foi reduzido para 200pM e ~ 100 pCi de ³²P-ATP. As amostras de transcrição foram purificadas em gel como descrito anteriormente, com as condições de carga de gel dimensionadas em conformidade.

[000221] As seleções utilizando a transcriptase reversa Gsl foram realizadas como descrito anteriormente com as seguintes alterações. O tampão para seleção continha uma concentração reduzida de magnésio e cátions monovalentes mais relevantes f isiologicamente: Na-HEPES 25 mM, pH 7,0, KC1 150 mM, NaCl 50 mM, MgC12 3 mM) . A transcriptase reversa GsI-IIC-MRF foi usada no lugar de Superscript III. A transcriptase reversa de GslTIC MRF foi expressa em E. coli e purificada como descrito (Mohr et al., RNA, 2013, 19, 958-970) . O sedimento de RNA precipitado foi colocado em dNTPs 1,25 mM e iniciador de RTPCR 20pM antes da desnaturação a 65°C, recozimento a 4 °C e equilibrio a 60 °C. A solução foi então levada até lx condições de tampão GsI-IIC-MRF (NaCl 10 mM, MgCU 1 mM, TrisCi 20 mM, pH 7,5, DTT 1 mM) em 20 pL de volume total e adicionou

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 104/154

101/110 se enzima suficiente para extensão a 60 °C. PCR foi realizada como descrito anteriormente.

Exemplo 11: Sequenciamento de alto rendimento e análise de bioinformática [000222] PCR padrão foi conduzida para anexar as sequências de hibridação Illumina necessárias para o recozimento da célula de fluxo. Cada biblioteca foi amplificada com o iniciador de sequenciamento direta e um único iniciador inverso contendo um código de barras de 12 nucleotideos diferenciador (as sequências são apresentadas na Tabela 1) . As amostras foram sequenciadas usando um kit de reagentes v3 para 150 ciclos em um MiSeq (Illumina) com iniciadores de leitura e indexação personalizados.

[000223] As sequências resultantes foram desmultiplexadas, cortadas e filtradas com qualidade usando transcrições do QIIME (Caporaso et al. , Nat. Methods, 2010, 7, 335-336). Toda a informação da sequência fora do tronco PI foi cortada e apenas sequências contendo uma pontuação Phred > 20 para cada nucleotideo foram usadas na análise. Os arquivos de formato fasta resultantes para cada biblioteca foram então submetidos ao agrupamento por USEARCH (Edgar, Bioinformática, 26, 24602461), que gerou sequências de sementes que foram agrupadas em 90% de identidade; quaisquer grupos contendo uma única sequência foram descartados. Os dez grupamentos mais populosos foram então mapeados de volta ao seu arquivo de sequência original e 250 sequências individuais foram aleatoriamente tomadas como uma amostra representativa de cada grupamento para análise posterior. As sequências em cada grupamento foram alinhadas usando MUSCLE (Edgar, NAR, 2004, 32, 1792-1797) e o alinhamento resultante foi analisado usando

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 105/154

102/110

CMfinder (Yao et al., Bioinformatics, 2006, 22, 445-452). R2R (Weinberg & Breaker, BMC Bioinformática, 2011, 12, 3) foi executado em suas configurações padrão para gerar figuras da conservação de sequências mapeadas na estrutura secundária de energia livre minima (MFE).

Exemplo 12: Sonda química NMIA [000224] O RNA foi preparado como descrito anteriormente (Edwards et al. , Methods Mol. Biol., 2009, 535, 135-163) . Os cassetes de estrutura que flanqueiam as extremidades 5'e 3' do RNA foram adicionadas para facilitar a transcrição reversa e a modificação de NMIA foi realizada usando os protocolos estabelecidos (Wilkinson et al. , Nat. Protoc., 2006, 1, 16101616) a 25 °C. O RNA foi sondado a 100 nM em Na-HEPES 100 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM e MgCU 6 mM. A concentração de ligando foi de 500 μΜ onde indicado. As imagens de gel foram analisadas pelo SAFA (Das et al. , RNA, 2005, 11, 344-354) e ImageJ (NIH).

Exemplo 13: Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) [000225] Todos os RNAs testados foram trocados para o tampão de seleção SSIII (Na-HEPES 10 mM, pH 7,0, NaCl 250 mM; KC1 50 mM; MgC12 10 mM) e lavados três vezes em um filtro MWCO de 10 kD (EMD Millipore) . O ligando foi trazido de um sólido seco diretamente para o tampão de ligação e a concentração foi estabelecida em um NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) utilizando um coeficiente de extinção a 275 nm de 8.000 mol^-1 cm^-1 para a parte 5-hidróxi-indol. O RNA foi diluído para entre 50 a 100 μΜ e o ligando foi titulado em aproximadamente 10 vezes a concentração de RNA. As titulações foram

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 106/154

103/110 realizadas a 25 °C usando um microcalorimetro MicroCai 1TC200 (GE Healthcare) utilizando protocolos estabelecidos (Gilbert e Batey, Methods Mol. Biol., 2009, 540, 97-114). Os dados foram analisados e o ajuste foi realizado com o pacote de software Origin 5.0 (Origin Laboratories).

Exemplo 14: Determinação da estrutura do complexo 5HTP-II/5HTP [000226] O RNA para cristalização foi preparado como previamente descrito (Edwards et al. , Methods Mol. Biol., 2009, 535, 135-163) . O RNA foi concentrado em um filtro Amicon Ultra 15 10k MWCO (EMD Millipore, Inc.) e trocado em 0,5x de tampão T.E. Os cristais de qualidade de difração foram obtidos misturando 2 pL de complexo RNA: ligando (1: 1) e 3,5 pL de licor-mãe (8 a 14% de 2-metil-2,4-pentanodiol, cacodilato de sódio 40 mM pH 5,5, MgCU 4 mM, NaCl 12mM, KC1 80 mM e hexamina de cobalto 4 a 9 mM), micro-semeando e incubando a 22 °C durante 1 a 3 dias. Os cristais não precisaram de crioproteção adicional e foram congelados em nitrogênio liquido antes da coleta de dados. Os dados foram coletados com um sistema de placas de imagem Rigaku R-Axis IV usando radiação CuKa (1,5418 Â) a 100 K, e foi indexado e escalonado usando D * TREK (Pflugrath, Acta Crystallogr. D Biol.

Crystallogr. , 1999, 55, 1718-1725). Os dados sobre um derivado de átomo pesado gerados através da substituição de hexamina de cobalto por hexamina de iridic 1 a 11 mM também foram coletados na fonte de raios-x de origem. As fases foram determinadas usando o método de substituição isomorfa única com espalhamento anômalo (SIRAS). AutoSol (Adams et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2010, 66, 213-221) foi utilizado para encontrar 12 átomos de iridio que foram depois

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 107/154

104/110 utilizados para calcular as fases. O mapa de densidade experimental resultante apresentou características não ambiguas da cadeia principal e hélices de RNA e foi usado para construir o modelo.

[000227] O modelo inicial foi construído iterativamente sem o ligando em Coot (Emsley & Cowtan, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. , 2004, 60, 2126-2132) entre rodadas de refinamento em PHENIX (Adams et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2010, 66, 213-221) . O modelo de RNA foi trazido através de várias rodadas de refinamento e recozimento simulado antes de 5HTP ser construído no modelo. Neste ponto de construção, havia uma densidade clara do ligando na bolsa de ligação que permitia a colocação e a orientação seguras do ligando. A colocação do ligando e das bases foi validada por um mapa de omissão do composto (Figura 10B) . A colocação de água foi automatizada nas rodadas finais de refinamento após a colocação do ligando com base no tamanho do pico no mapa de diferença de F₀-F_c. O modelo resultante teve boa geometria conforme julgado usando MolProbity (Chen et al. , 2010, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2010, 66, 213-221) e estatísticas do modelo final (Rtrabaiho θ Riivre são 21,9% e 26,2%, respectivamente) . Todos os dados cristalográficos e estatísticas do modelo são apresentados na Tabela 4.

Exemplo 15: Ensaios com sensores de Brócolis in vitro [000228] O RNA foi preparado como descrito anteriormente, com lavagens adicionais com 0,5x de tampão T.E. em um AmCO Ultra (Millipore) 10k MWCO para minimizar o transporte de ions metálicos. Todos os sensores de RNA foram ensaiados em concentrações de 0,5μΜ de RNA e 10μΜ (Z) -4- (3, 5-difiúor-4í. 1.1. o r o x .1. .o e n z .1. j. r o e /^; o) — r, 2 — o .1. me L .1. j. — r H—r m _i. d a z o j. — o í 4 H) — on a

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 108/154

105/110 (DFHBI ) em um tampão contendo Tris-HCl 80 mM, pH 7,4, KC1 150 mM e NaCl 50 mM. O tampão, ligando, magnésio (concentrações dadas na Tabela 6) e DFHBI foram misturados antes da adição de RNA e todas as reações foram incubadas naturalmente durante 30 minuto a temperatura ambiente. A fluorescência de DFHBI foi medida colocando 200 pL de volume de reação em uma placa de fluorescência preta de fundo plano de 96 poços Greiner (Thermo Scientific) e lendo em um leitor de placas Tecan Infinite M200 PRO. As amostras foram excitadas a 460 nm e a emissão de fluorescência foi medida como o sinal médio entre 506 e 510 nm. A concentração de ligando para induzir uma resposta de fluorescência máxima ao meio foi determinada por ajuste da fluorescência observada como uma função da concentração de ligando para um modelo de dois estados.

[000229] Os sensores projetados foram sintetizados como blocos G (sequências de sensores dados na Figura 23; Tecnologias Integradas de DNA) e clonados entre os sitios Xbal e BlpI em pET30b usando técnicas de clonagem molecular padrão. Todos os plasmideos resultantes foram verificados na sequência. Para as reações de transcrição de RNA polimerase de T7, foi gerado um molde de DNA por PCR utilizando iniciadores externos 1 pM (5': GGCCGTAATACGACTCACTATAGGAGCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCAG, 3': TGGCGCCCGAACAGGGACTTGAACCCTGGA) utilizando uma reação de PCR padrão. Os modelos foram adicionados diretamente a uma reação de transcrição in vitro (ver anteriormente) e a sintese de RNA foi prosseguiu naturalmente durante 2 horas a 37 °C. O RNA da reação de transcrição anterior foi utilizado diretamente em ensaios sem purificação adicional.

[000230] A atividade de cada sensor foi monitorada em uma reação de 100 pL contendo 50 pL de reação de transcrição in

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 109/154

106/110 vitro, 10 pL de lOx tampão de estudo (lx: 50 mM K-HEPES, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 150 mM KC1, 50 mM NaCl), 30 μΜ DFHBI-1T e ligando 2 mM (para reações positivas com ligando). As reações foram incubadas a temperatura ambiente durante 30 minuto e a fluorescência DFHBI foi medida colocando 90 pL de volume de reação em uma placa de fluorescência preta de fundo plano de 96 poços Greiner (Thermo Scientific) e lendo em um leitor de placas Tecan Infinite M200 PRO. As amostras foram excitadas a 460 nm e a emissão de fluorescência foi medida como o sinal médio entre 506 e 510 nm. Para todos os experimentos, foi realizado um controle positivo de um aptâmero de Brócolis com andaime tRNA na presença e ausência de ligando, que também foi utilizado como uma referência para o brilho relativo. A indução por dobramento foi calculada dividindo os valores de fluorescência para a reação de DFHBI-1T mais ligando pelo valor de fluorescência para a condição DFHBI-1T somente. Todos os experimentos foram realizados em triplicata e dados quantificados foram reportados com o erro padrão da média (s.e.m.)

Exemplo 16: Ensaios com sensores de Brócolis in vitro [000231] As células E. coli One Shot® BL21 Star (DE3) (Thermo Fisher) foram transformadas com um plasmideo derivado de pET30b contendo urn sensor sob controle indutivel, plaqueadas em ágar LB suplementado com 50 pg/mL de canamicina e incubadas a 37 °C durante aproximadamente 16 horas Colônias individuais foram colhidas e cultivadas durante a noite (aproximadamente 16 horas) em 5 mL de LB suplementado com 50 pg/mL de canamicina para permitir que a cultura atingisse a saturação. Para experimentos de rastreio, 5 pL da cultura saturada durante a noite foram adicionados a 5 mL de LB suplementado

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 110/154

107/110 com 50 pg/mL de canamicina e cresceu para a fase mid-log (OD600 aproximadamente 0,4 a 0,6) a 37 °C. Para induzir a expressão do aptâmero de Brócolis sozinho ou dos construtos de fusão de aptâmero de Brócolis/ribocomutador, o IPTG foi adicionado a uma concentração final de 1 mM em cada cultura, que foram então cultivadas durante mais 2 horas a 37 °C. As células foram então sedimentadas por centrifugação e lavadas uma vez com 5 mL de IX de sais M9 suplementados com MgSCg a uma concentração final de 5 mM e canamicina a uma concentração final de 50 pg/mL. Após a lavagem, as células foram sedimentadas por centrifugação, ressuspensas em 250 pL do meio M9 anterior e divididas em duas alíquotas de 100 pL. Na metade das alíquotas, o DFHBI-1T foi adicionado a uma concentração final de 50 pM em um volume final de 110 pL. Na outra metade das alíquotas, DFHBI-1T foi adicionado a uma concentração final de 50 pM e o ligando (5HTP, 5HP ou dopamina) foi adicionado a uma concentração final de 1 mM em um volume final de 110 pL. As células foram então incubadas a °C durante 30 minuto para permitir a captação de cada composto. Após a incubação de 30 minuto, 100 pL de cada alíquota foram pipetados para uma microplaca Greiner de 96 poços e congelados em gelo por 30 minuto. Para medições de fluorescência, o DFHBI-1T foi monitorado a um comprimento de onda de excitação de 472 nm e um comprimento de onda de emissão de 520 nm. Os dados quantificados representam os valores médios de fluorescência ± erro padrão da média (s.e.m.) de três replicatas biológicas, que foram corrigidas em termos de fundo utilizando um controle de vetor vazio pET30b. A indução por dobramento foi calculada dividindo os valores médios de fluorescência das células expostas ao

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 111/154

108/110 ligando pela fluorescência média das células sem ligando.

Exemplo 17: Imagiologia de fluorescência intracelular de 5HTP [000232] O DNA e as culturas foram preparados como descrito (Paige et al., Science, 2012, 335, 1194) . Resumidamente, a sequência de fusão de tRNA/Brócolis foi clonada em pET30b entre os sitios Xbal e BlpI a jusante de um promotor T7 indutivel. O plasmideo verificado na sequência foi transformado em células STAR BL21 (DE3) (Invitrogen) e as colônias individuais cresceram durante a noite em caldo Luria (LB) suplementado com 50 pg/mL de canamicina. A cultura de um dia para o outro foi utilizada para inocular o meio LB/canamicina fresco a uma diluição de 1: 1000 e a cultura cresceu a 37 °C até uma OD₆oo = 0,4 a 0,6 antes da indução com IPTG 1 mM e crescimento a 37 °C durante 2 a 4 horas. 200 pL da cultura resultante foram centrifugados, decantados e ressuspensos em 2 mL de meio de sais M9 minimo suplementado com 50 pg/mL de canamicina, MgSO4 5 mM e IPTG 1 mM. 200 pL da cultura ressuspensa foram transferidos para placas de fundo de vidro revestidas com poli-D-lisina de 96 poços (MatTek) e incubadas a 37 °C durante uma hora. O meio foi então removido e os poços lavados com meio M9/canamicina/IPTG 1 mM antes da adição de 200 pL de meio M9, 1 mM IPTG e DFHBI-1T 400 pM (Lucerna). As imagens de fluorescência viva foram tiradas com um Andor iXon3 897 EMCCD usando uma objetiva de óleo 60x, um filtro de excitação 472/30, espelho dicroico 490 (passagem longa) e filtro de emissão 520/40 em um microscópio Nikon Ti-E e analisados com FIJI (Schindelin et al., Nat. Methods, 2012, 9, 676-682).

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 112/154

109/110

Exemplo 18: Ensaios de transcrição in vitro de passagem única [000233] Os moldes de dsDNA foram transcritos como descrito anteriormente (Trausch et al. , Structure, 2011, 19, 14131423). Resumidamente, 50 ng de molde de DNA foram incubados a 37 °C durante 10 minuto em 12,5 pL de tampão de transcrição 2x (Tris-HCl 140 mM, pH 8,0, NaCI 140 mM, EDTA 0,2 mM, βMercaptoetanol 28 mM e 70 mg/mL de BSA), 2,5 pL de MgCL 50 mM, 100 a 200 pCi de ³²P-ATPe 0,25 unidades de holoenzima o 7 0 da RNA polimerase de E. coli (Epicenter Biotechnologies) por reação foram trazidos para 23 pL. As reações equilibradas foram então iniciadas com a adição de 7,5 pL de tampão de reação (165 pM de cada rNTP, 0,2 mg/mL de heparina e a concentração de ligando desejada) e incubadas durante 15 minutos a 37 °C antes de serem eliminadas com ureia 8 M. As reações foram então separadas em um PAGE desnaturante a 8%, secas e expostas em uma tela de imagem de fósforo. A quantificação dos géis, em seguida, foi realizada em ImageJ (NIH) e os dados se encaixam em um modelo de dois estados.

Códigos de adesão [000234] Coordenadas e fatores de estrutura foram depositados no RSCB Protein Data Bank sob o código de acesso 4ZAQ.

Incorporação por referência [000235] Os conteúdos de todas as referências (incluindo referências bibliográficas, patentes publicadas, pedidos de patente publicados e pedidos de patentes copendentes) citados ao longo deste pedido são aqui expressamente incorporados por referência na sua totalidade. Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados são concedidos ao significado vulgarmente conhecido pelos versados

Petição 870190073856, de 01/08/2019, pág. 113/154

110/110 na técnica.

Equivalentes [000236] Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar com uso de não mais que experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades aqui providas. Tais equivalentes são abrangidos pelas seguintes reivindicações.

Claims (2)

1. BIBLIOTECA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de oligonucleotideos não idênticos, em que os oligonucleotideos

individuais a) compreendem: compreendendo um dominio de uma primeira sequência hélice; b) uma segunda sequência compreendendo um primeiro dominio hairpin; e c) uma terceira sequência compreendendo um segundo

dominio hairpin;

em que o dominio de hélice, o primeiro dominio hairpin e o segundo dominio hairpin formam uma junção de oligonucleotideos contendo um dominio de ligação ao ligando, e em que a biblioteca compreende uma pluralidade de domínios de ligação ao ligando não idênticos.

2. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada dominio de hélice é, independentemente, uma hélice totalmente complementar que compreende, opcionalmente, um ou mais nucleotideos desestabilizadores selecionados do grupo que consiste em um par de bases incompatíveis, um par de bases wobble G*U e um bulge.

3. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada dominio de hélice é uma hélice totalmente complementar.

4. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada primeiro dominio hairpin compreende, independentemente, um ou mais nucleotideos desestabilizadores selecionados do grupo que

Petição 870190054154, de 12/06/2019, pág. 23/34

2/11 consiste em um par de bases incompatíveis, um par de bases wobble G»U e um bulge.

5. Biblioteca de oligonucleotídeos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que cada segundo domínio hairpin compreende, independentemente, um ou mais nucleotídeos desestabilizadores selecionados do grupo que consiste em um par de bases incompatíveis, um par de bases wobble G»U e um bulge.

6. Biblioteca de oligonucleotídeos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio de hélice é de pelo menos 4 a 10 pares de bases de comprimento.

7. Biblioteca de oligonucleotídeos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio de hélice é de pelo menos 10 pares de bases de comprimento.

8. Biblioteca de oligonucleotídeos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os oligonucleotídeos são oligorribonucleotídeos.

9. Biblioteca de oligonucleotídeos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os oligonucleotídeos compreendem individualmente uma sequência tendo uma série de sequências ligadas de acordo com a Fórmula I:

P1-J1/2-P2-L2-P2'-J2/3-P3-L3-P3' -J3/1-P1' (I) em que

- representa uma ligação;

Pl e Pl' formam a hélice;

P2, L2 e P2' formam o primeiro hairpin;

P3, L3 e P3' formam o segundo hairpin; e

Jl/2, J2/3 e J3/1 em conjunto, formam a junção de

Petição 870190054154, de 12/06/2019, pág. 24/34

3/11 oligonucleotideos .

10. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que J2/3 compreende um motivo T-loop. 11. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com

a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o motivo Tloop compreende a sequência UUGAA.

12. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a guanosina do T-loop forma um par de bases de Watson-Crick com uma citidina em J3/1.

13. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dominio de hélice tem uma primeira extremidade e uma segunda extremidade e a primeira extremidade é proximal à junção de oligonucleotideos e a segunda extremidade está ligada a um módulo de leitura à base de oligonucleotideos.

14. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o módulo de leitura à base de oligonucleotideos é um módulo de leitura à base de comutação fluorogênico.

15. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o módulo fluorogênico é um aptâmero ligação a fluoróforo de Broccoli.

16. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o módulo à base de comutação é uma comutação pbuE.

17. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o módulo de leitura à base de oligonucleotideos é um módulo de leitura à

Petição 870190054154, de 12/06/2019, pág. 25/34

4/11 base de oligorribonucleotideo.

18. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os oligonucleotideos individuais têm correspondência de sequência para uma sequência de ribocomutação de guanina xpt-pbuX de Bacillus subtilis compreendendo cerca de 23 resíduos de nucleotídeos variáveis dentro da junção de oligonucleotideos.

19. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os oligonucleotideos individuais têm correspondência de sequência para uma sequência de ribocomutação de di-GMP cíclica Vc2 de Vibrio cholera compreendendo cerca de 21 resíduos de nucleotídeos variáveis dentro da junção de oligonucleotideos.

20. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os oligonucleotideos individuais têm correspondência de sequência para uma sequência de ribozima cabeça de martelo de Schistosoma mansoni compreendendo cerca de 21 resíduos de nucleotídeos variáveis dentro da junção de oligonucleotideos.

21. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a junção de oligonucleotideos é uma junção de N vias, em que N é de dois, três, quatro ou cinco.

22. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a junção de oligonucleotideos é uma junção de N vias, em que N é de dois.

23. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a junção de oligonucleotideos é uma junção de N vias, em que N é de três.

24. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com

Petição 870190054154, de 12/06/2019, pág. 26/34

5/11 a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a junção de oligonucleotídeos é uma junção de N vias, em que N é de quatro.

25. Biblioteca de oligonucleotídeos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a junção de oligonucleotídeos é uma junção de N vias, em que N é de cinco.

26. Biblioteca de oligonucleotídeos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a biblioteca compreende de cerca de 4 a cerca de 4 membros não rdentrcos.

27. BIBLIOTECA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de oligonucleotídeos não idênticos, em que os oligonucleotídeos individuais compreendem:

a) uma primeira sequência compreendendo um dominio de hélice;

b) uma segunda sequência compreendendo um primeiro dominio hairpin; e

c) uma terceira sequência compreendendo um segundo dominio hairpin;

em que o dominio de hélice, o primeiro dominio hairpin e o segundo dominio hairpin formam uma junção de oligonucleotídeos contendo um dominio de ligação ao ligando pré-selecionado, e em que a biblioteca compreende uma pluralidade de domínios de ligação ao ligando não idênticos.

28. Biblioteca de oligonucleotídeos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que cada dominio de hélice é, independentemente, uma hélice totalmente complementar que compreende, opcionalmente, um ou mais nucleotídeos desestabilizadores selecionados do grupo que

Petição 870190054154, de 12/06/2019, pág. 27/34

6/11

consiste em um par de bases incompatíveis, um par de bases wobble G»U e um bulge. 29. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que cada

dominio de hélice é uma hélice totalmente complementar.

30. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que cada primeiro dominio hairpin compreende, independentemente, um ou mais nucleotideos desestabilizadores selecionados do grupo que

consiste em um par de bases incompatíveis, um par de bases wobble G»U e um bulge. 31. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que cada

segundo dominio hairpin compreende, independentemente, um ou mais nucleotideos desestabilizadores selecionados do grupo que consiste em um par de bases incompatíveis, um par de bases wobble G»U e um bulge.

32. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que o dominio de hélice é de pelo menos 4 a 10 pares de bases de comprimento.

33. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que o dominio de hélice é de pelo menos 10 pares de bases de comprimento.

34. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que os oligonucleotideos são oligorribonucleotideos.

35. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que os oligonucleotideos individuais compreendem uma sequência que

Petição 870190054154, de 12/06/2019, pág. 28/34

7/11 tem uma série de sequências ligadas de acordo com a Fórmula I:

P1-J1/2-P2-L2-P2'-J2/3-P3-L3-P3' -J3/1-P1' (I) em que

- representa uma ligação;

PI e PI' formam a hélice;

P2, L2 e P2' formam o primeiro hairpin;

P3, L3 e P3' formam o segundo hairpin; e

Jl/2, J2/3 e J3/1 juntos formam a junção de oligonucleotideos.

36. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que J2/3 compreende um motivo T-loop.

37. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que o motivo Tloop compreende a sequência UUGAA.

38. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a guanosina do T-loop forma um par de bases de Watson-Crick com uma citidina em J3/1.

39. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que o dominio de hélice tem uma primeira extremidade e uma segunda extremidade e a primeira extremidade é proximal à junção de oligonucleotideos e a segunda extremidade está ligada a um módulo de leitura à base de oligonucleotideos.

40. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que o módulo de leitura à base de oligonucleotideos é um módulo de leitura fluorogênico ou à base de comutação.

Petição 870190054154, de 12/06/2019, pág. 29/34

8/11

41. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que o módulo fluorogênico é um aptâmero ligação fluoróforo de Broccoli.

42. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que o módulo à base de comutação é uma comutação pbuE.

43. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que o módulo de leitura à base de oligonucleotideos é um módulo de leitura à base de oligorribonucleotideo.

44. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de os oligonucleotideos individuais têm correspondência de sequência para uma sequência de ribocomutação de guanina xpt-pbuX de Bacillus subtilis compreendendo cerca de 23 resíduos de nucleotideos variáveis dentro da junção de oligonucleotideos.

45. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que os oligonucleotideos individuais têm correspondência de sequência para uma sequência de ribocomutação de di-GMP ciclica Vc2 de Vibrio cholera compreendendo cerca de 21 resíduos de nucleotideos variáveis dentro da junção de oligonucleotideos.

46. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que os oligonucleotideos individuais têm correspondência de sequência para uma sequência de ribozima cabeça de martelo de Schistosoma mansoni compreendendo cerca de 21 resíduos de nucleotideos variáveis dentro da junção de oligonucleotideos.

47. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a junção de

Petição 870190054154, de 12/06/2019, pág. 30/34

9/11 oligonucleotideos é uma junção de N vias, em que N é de dois, três, quatro ou cinco.

48. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a junção de oligonucleotideos é uma junção de N vias, em que N é de dois.

49. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a junção de oligonucleotideos é uma junção de N vias, em que N é de três.

50. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a junção de oligonucleotideos é uma junção de N vias, em que N é de quatro.

51. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a junção de oligonucleotideos é uma junção de N vias, em que N é de cinco.

52. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que o sitio de ligação ao ligando pré-selecionado compreende um sitio de ligação para um composto selecionado do grupo que consiste em um aminoácido, um peptideo, uma nucleobase, um nucleosídeo, um nucleotídeo, um íon de metal, um neurotransmissor, um hormônio, um ingrediente farmacêutico ativo e derivados dos mesmos.

53. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação ao ligando pré-selecionado compreende um sítio de ligação para um ligando selecionado do grupo que consiste em um aminoácido, uma nucleobase, um nucleosídeo, um nucleotídeo, um neurotransmissor, um hormônio e derivados dos mesmos.

54. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com

Petição 870190054154, de 12/06/2019, pág. 31/34

10/11 a reivindicação 53, caracterizada pelo fato de que o sitio de ligação ao ligando pré-selecionado compreende um sítio de ligação para um ligando selecionado do grupo que consiste em um nucleotídeo, um neurotransmissor, um hormônio e derivados dos mesmos.

55. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação ao ligando pré-selecionado compreende um sítio de ligação para pelo menos um ligando selecionado do grupo consistindo em 5-hidroxi-L-triptofano, L-triptofano, serotonina e 5-hidroxi-L-triptofano-metilamida.

56. Biblioteca de oligonucleotideos, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o ligando é pelo menos um de 5-hidroxi-L-triptofano ou serotonina.

57. MÉTODO PARA SELECIONAR UMA PLURALIDADE DE OLIGONUCLEOTÍDEOS DE LIGAÇÃO AO LIGANDO NÃO IDÊNTICOS, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

1) contatar uma biblioteca de oligonucleotideos compreendendo uma pluralidade de oligonucleotideos com um ligando sob condições adequadas para ligação ao ligando, em que oligonucleotideos individuais compreendem:

a) uma primeira sequência compreendendo um domínio de hélice;

b) uma segunda sequência compreendendo um primeiro domínio hairpin; e

c) uma terceira sequência compreendendo um segundo domínio hairpin;

em que o domínio de hélice, primeiro domínio hairpin e segundo domínio hairpin formam uma junção de oligonucleotideos; e

Petição 870190054154, de 12/06/2019, pág. 32/34

11/11

2) particionar a biblioteca de oligonucleotídeos em uma endereçável espacialmente, de modo que a pluralidade de oligonucleotídeos de ligação ao ligando não idênticos seja selecionada, em que os oligonucleotídeos tendo a junção de oligonucleotídeos compreendem ainda um domínio de ligação ao ligando e em que os domínios de ligação ao ligando da biblioteca de oligonucleotídeos compreendem resíduos de nucleotídeos variáveis, é selecionado.

58 . Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda uma etapa la) entre a etapa D e a etapa 2) , a etapa la) compreendendo particionar competitivamente a biblioteca de

oligonucleotídeos com uma solução de ligando livre.