EA044975B1 - Использование биологических рнк-остовов с селекцией in vitro для получения эффективных и надежных аптамеров, связывающих малые молекулы, для генетически кодируемых биосенсоров - Google Patents
Использование биологических рнк-остовов с селекцией in vitro для получения эффективных и надежных аптамеров, связывающих малые молекулы, для генетически кодируемых биосенсоров Download PDFInfo
- Publication number
- EA044975B1 EA044975B1 EA201991446 EA044975B1 EA 044975 B1 EA044975 B1 EA 044975B1 EA 201991446 EA201991446 EA 201991446 EA 044975 B1 EA044975 B1 EA 044975B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- rna
- library
- ligand
- oligonucleotide
- junction
- Prior art date
Links
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title description 32
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 title description 20
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 title description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 233
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 185
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 137
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 135
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 108
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 87
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 75
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 64
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 59
- 108020004422 Riboswitch Proteins 0.000 claims description 54
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 37
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 claims description 32
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 claims description 32
- 244000308180 Brassica oleracea var. italica Species 0.000 claims description 32
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 claims description 32
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 21
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 20
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 claims description 16
- LDCYZAJDBXYCGN-VIFPVBQESA-N 5-hydroxy-L-tryptophan Chemical compound C1=C(O)C=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 LDCYZAJDBXYCGN-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 14
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 claims description 14
- -1 5-hydroxyL-tryptophan methylamide Chemical compound 0.000 claims description 11
- 108090001102 Hammerhead ribozyme Proteins 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 10
- LDCYZAJDBXYCGN-UHFFFAOYSA-N oxitriptan Natural products C1=C(O)C=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 LDCYZAJDBXYCGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical group C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 9
- 241000242680 Schistosoma mansoni Species 0.000 claims description 7
- PKFDLKSEZWEFGL-MHARETSRSA-N c-di-GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@@H](O)[C@H](N4C5=C(C(NC(N)=N5)=O)N=C4)O[C@@H]3COP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 PKFDLKSEZWEFGL-MHARETSRSA-N 0.000 claims description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 7
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 6
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 claims description 6
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 5
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 claims description 5
- 101150013480 pbuE gene Proteins 0.000 claims description 5
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 claims description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 claims description 4
- 108091027075 5S-rRNA precursor Proteins 0.000 claims description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 108091028733 RNTP Proteins 0.000 claims description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 90
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 75
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- 239000002585 base Substances 0.000 description 55
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 48
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 38
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 37
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 29
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 27
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 25
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 25
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 25
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 25
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 22
- 230000006870 function Effects 0.000 description 22
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 21
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 20
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 20
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 20
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 19
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 17
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 17
- 238000011161 development Methods 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 16
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 101100043638 Solanum tuberosum SS3 gene Proteins 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 12
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 11
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 10
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 9
- 238000013461 design Methods 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 9
- AWYCLBWNRONMQC-WMZJFQQLSA-N (5Z)-5-[(3,5-difluoro-4-hydroxyphenyl)methylidene]-2-methyl-3-(2,2,2-trifluoroethyl)imidazol-4-one Chemical compound O=C1N(CC(F)(F)F)C(C)=N\C1=C/C1=CC(F)=C(O)C(F)=C1 AWYCLBWNRONMQC-WMZJFQQLSA-N 0.000 description 8
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 8
- 108091008103 RNA aptamers Proteins 0.000 description 8
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 8
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 8
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 8
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 8
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 7
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 6
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 6
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 6
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- ZDDIJYXDUBFLID-YHYXMXQVSA-N (5z)-5-[(3,5-difluoro-4-hydroxyphenyl)methylidene]-2,3-dimethylimidazol-4-one Chemical compound O=C1N(C)C(C)=N\C1=C/C1=CC(F)=C(O)C(F)=C1 ZDDIJYXDUBFLID-YHYXMXQVSA-N 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- KJMRWDHBVCNLTQ-UHFFFAOYSA-N N-methylisatoic anhydride Chemical compound C1=CC=C2C(=O)OC(=O)N(C)C2=C1 KJMRWDHBVCNLTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 229940000681 5-hydroxytryptophan Drugs 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020005093 RNA Precursors Proteins 0.000 description 4
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 235000010299 hexamethylene tetramine Nutrition 0.000 description 4
- 239000004312 hexamethylene tetramine Substances 0.000 description 4
- VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N hexamethylenetetramine Chemical compound C1N(C2)CN3CN1CN2C3 VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 3
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 3
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 3
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 3
- GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N iridium atom Chemical group [Ir] GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 3
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 230000002974 pharmacogenomic effect Effects 0.000 description 3
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 1-methylinosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)N(C)C=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 2
- SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 2-methylpentane-2,4-diol Chemical compound CC(O)CC(C)(C)O SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100039819 Actin, alpha cardiac muscle 1 Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101000959247 Homo sapiens Actin, alpha cardiac muscle 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 2
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 2
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 2
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASARMUCNOOHMLO-WLORSUFZSA-L cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2s)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O ASARMUCNOOHMLO-WLORSUFZSA-L 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 238000002447 crystallographic data Methods 0.000 description 2
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- ZPTBLXKRQACLCR-XVFCMESISA-N dihydrouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)CC1 ZPTBLXKRQACLCR-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229940013640 flavin mononucleotide Drugs 0.000 description 2
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N flavin mononucleotide Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011768 flavin mononucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 2
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229910052741 iridium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 2
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N methyl salicylate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1O OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 2
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 2
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 235000019231 riboflavin-5'-phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N ribothymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- VIYKYVYAKVNDPS-HKGPVOKGSA-N (2s)-2-azanyl-3-[3,4-bis(oxidanyl)phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 VIYKYVYAKVNDPS-HKGPVOKGSA-N 0.000 description 1
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- VAALWQXPFZVPFE-TURQNECASA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-prop-1-enylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C=CC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 VAALWQXPFZVPFE-TURQNECASA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- JHFAEUICJHBVHB-UHFFFAOYSA-N 1h-indol-2-ol Chemical group C1=CC=C2NC(O)=CC2=C1 JHFAEUICJHBVHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZEYUNCYYKKCIX-UMMCILCDSA-N 2-amino-8-chloro-9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3h-purin-6-one Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=C(Cl)N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O KZEYUNCYYKKCIX-UMMCILCDSA-N 0.000 description 1
- GNYDOLMQTIJBOP-UMMCILCDSA-N 2-amino-9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-8-fluoro-3h-purin-6-one Chemical compound FC1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O GNYDOLMQTIJBOP-UMMCILCDSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- SIBMIRVJDKGAIZ-CWUIGSMPSA-N 5-(2-aminopropyl)-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(CC(N)C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SIBMIRVJDKGAIZ-CWUIGSMPSA-N 0.000 description 1
- AGFIRQJZCNVMCW-UAKXSSHOSA-N 5-bromouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 AGFIRQJZCNVMCW-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- LMIQERWZRIFWNZ-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxyindole Chemical group OC1=CC=C2NC=CC2=C1 LMIQERWZRIFWNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XFYAAHZFCLDWQN-AUGUPVTGSA-N 6-(2-aminopropyl)-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC(N)CC1=CC(=O)NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 XFYAAHZFCLDWQN-AUGUPVTGSA-N 0.000 description 1
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASUCSHXLTWZYBA-UMMCILCDSA-N 8-Bromoguanosine Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=C(Br)N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O ASUCSHXLTWZYBA-UMMCILCDSA-N 0.000 description 1
- HDZZVAMISRMYHH-UHFFFAOYSA-N 9beta-Ribofuranosyl-7-deazaadenin Natural products C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O HDZZVAMISRMYHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 1
- 241000059559 Agriotes sordidus Species 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241001233887 Ania Species 0.000 description 1
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 description 1
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 229910016523 CuKa Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N Dansyl Chloride Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(Cl)(=O)=O XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108091092512 GIR1 branching ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 108091029499 Group II intron Proteins 0.000 description 1
- 108091080980 Hepatitis delta virus ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 102100024002 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U Human genes 0.000 description 1
- 108010025076 Holoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 101100507335 Homo sapiens HNRNPU gene Proteins 0.000 description 1
- 101000666730 Homo sapiens T-complex protein 1 subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 244000062730 Melissa officinalis Species 0.000 description 1
- 235000010654 Melissa officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000246386 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N N(6)-methyladenosine Chemical compound C1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O VQAYFKKCNSOZKM-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- VQAYFKKCNSOZKM-UHFFFAOYSA-N NSC 29409 Natural products C1=NC=2C(NC)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O VQAYFKKCNSOZKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 208000032236 Predisposition to disease Diseases 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical group C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038410 T-complex protein 1 subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000223892 Tetrahymena Species 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- DCQLZTSRKLWEAB-UHFFFAOYSA-N ac1ndudu Chemical compound O1C(C(C2OCC(C)O)OCC(C)O)C(COCC(C)O)OC2OC(C(C2OCC(C)O)OCC(C)O)C(COCC(C)O)OC2OC(C(C2OCC(C)O)OCC(C)O)C(COCC(C)O)OC2OC(C(C2OCC(C)O)OCC(C)O)C(COCC(C)O)OC2OC(C(OCC(C)O)C2OCC(C)O)C(COCC(O)C)OC2OC(C(C2OCC(C)O)OCC(C)O)C(COCC(C)O)OC2OC2C(OCC(C)O)C(OCC(C)O)C1OC2COCC(C)O DCQLZTSRKLWEAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 1
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 1
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007816 calorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000012707 chemical precursor Substances 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 239000012059 conventional drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007933 dermal patch Substances 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical class [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 239000012893 effector ligand Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 210000003372 endocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 210000003499 exocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010579 first pass effect Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000007421 fluorometric assay Methods 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- MGJURKDLIJVDEO-UHFFFAOYSA-N formaldehyde;hydrate Chemical compound O.O=C MGJURKDLIJVDEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021485 fumed silica Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N fusidic acid Chemical class O[C@@H]([C@@H]12)C[C@H]3\C(=C(/CCC=C(C)C)C(O)=O)[C@@H](OC(C)=O)C[C@]3(C)[C@@]2(C)CC[C@@H]2[C@]1(C)CC[C@@H](O)[C@H]2C IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 101150117187 glmS gene Proteins 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 230000036449 good health Effects 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 108090001052 hairpin ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000010224 hepatic metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- XMGQYMWWDOXHJM-UHFFFAOYSA-N limonene Chemical compound CC(=C)C1CCC(C)=CC1 XMGQYMWWDOXHJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000865 liniment Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 238000010859 live-cell imaging Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000009115 maintenance therapy Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960001047 methyl salicylate Drugs 0.000 description 1
- 125000000250 methylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002324 mouth wash Substances 0.000 description 1
- 229940051866 mouthwash Drugs 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZTLGJPIZUOVDMT-UHFFFAOYSA-N n,n-dichlorotriazin-4-amine Chemical compound ClN(Cl)C1=CC=NN=N1 ZTLGJPIZUOVDMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOOWBQQQJXZGIE-UHFFFAOYSA-N n-ethyl-n-propan-2-ylpropan-2-amine Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C.CCN(C(C)C)C(C)C WOOWBQQQJXZGIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 239000006218 nasal suppository Substances 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001293 nucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000007968 orange flavor Substances 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009116 palliative therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 230000009120 phenotypic response Effects 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000008389 polyethoxylated castor oil Substances 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 102000021127 protein binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091011138 protein binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical group N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical group 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 238000000790 scattering method Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000013515 script Methods 0.000 description 1
- 238000002922 simulated annealing Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 1
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 1
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000013179 statistical model Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- FRGKKTITADJNOE-UHFFFAOYSA-N sulfanyloxyethane Chemical compound CCOS FRGKKTITADJNOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 229960002363 thiamine pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 description 1
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000013715 transcription antitermination Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- HDZZVAMISRMYHH-KCGFPETGSA-N tubercidin Chemical compound C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O HDZZVAMISRMYHH-KCGFPETGSA-N 0.000 description 1
- 239000010981 turquoise Substances 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
Description
Родственная заявка
Изобретение испрашивает преимущество приоритета по предварительной заявке на патент США №
62/432879, поданной 12 декабря 2016 г., содержание которой полностью включено в данное описание посредством ссылки для всех целей.
Заявление относительно федерально спонсированных исследований или разработок
Данное изобретение было сделано при государственной поддержке в рамках гранта № CMMI CHE1150834, присужденного Национальным научным фондом. Правительство имеет определенные права на данное изобретение.
Уровень техники
Приспособления на основе аллостерической РНК все чаще рассматриваются как важные инструменты, способные визуализировать эволюцию ферментов, оптимизировать сконструированные метаболические пути, облегчать обнаружение новых генов и регуляторов терапии на основе нуклеиновых кислот. Однако одним из узких мест в разработке этих платформ является доступность РНК-аптамеров, связывающих малые молекулы, которые эффективно и надежно функционируют в клеточной среде. В то время как аптамеры могут быть созданы против практически любой желаемой мишени путем селекции in vitro, многие из этих аптамеров на основе РНК не могут быть легко интегрированы в приспособления/устройства или не могут надежно функционировать в клеточном контексте. Соответственно, остается потребность в аптамерах и способах разработки аптамеров.
Краткое изложение сущности изобретения
Новый подход описан в данном документе с применением остовов, полученных из рибопереключателей и малых рибозимов. Этот подход, примененный в данном документе к 5-гидрокситриптофану в иллюстративном аспекте, дает аптамеры, которые легко идентифицируются и характеризуются благодаря структурному остову. Природа остова предрасполагает эти РНК для спаривания со считывающими доменами для конструирования устройств на основе нуклеиновых кислот, которые функционируют и in vitro и в клеточном контексте.
В одном аспекте обеспечивается библиотека олигонуклеотидов, содержащая множество неидентичных олигонуклеотидов. Отдельные олигонуклеотиды библиотеки содержат первую последовательность, содержащую спиральный домен, вторую последовательность, содержащую первый шпильковидный домен, и третью последовательность, содержащую второй шпильковидный домен, при этом спиральный домен, первый шпильковидный домен и второй шпильковидный домен образуют стык олигонуклеотидов, содержащий лиганд-связывающий домен, и при этом библиотека содержит множество неидентичных лиганд-связывающих доменов.
В одном варианте осуществления каждый спиральный домен независимо представляет собой полностью комплементарную спираль, необязательно, содержащую один или несколько дестабилизирующих нуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из несовпадающей пары оснований, нестабильной пары оснований G-U и выпуклости. В одном варианте осуществления каждый спиральный домен представляет собой полностью комплементарную спираль.
В одном варианте осуществления каждый первый шпильковидный домен независимо содержит один или несколько дестабилизирующих нуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из несовпадающей пары оснований, нестабильной пары оснований G-U и выпуклости, и/или каждый второй шпильковидный домен, независимо, содержит один или несколько дестабилизирующих нуклеотидов выбранных из группы, состоящей из несовпадающей пары оснований, нестабильной пары оснований G-U и выпуклости.
В одном варианте осуществления спиральный домен имеет длину, по меньшей мере, от 4 до 10 пар оснований или, по меньшей мере, 10 пар оснований.
В одном варианте осуществления указанные олигонуклеотиды представляют собой олигорибонуклеотиды.
В одном варианте осуществления олигонуклеотиды по отдельности содержат последовательность, имеющую ряд соединенных последовательностей в соответствии с формулой I:
Pl-Jl/2-P2-L2-P2'-J2/3-P3-L3-P3'-J3/l-Pl '(I), где - представляет собой связь,
Р1 и Р1' образуют спираль,
Р2, L2 и Р2' образуют первую шпильку,
Р3, L3 и Р3' образуют вторую шпильку, а
J1/2, J2/3 и J3/1 вместе образуют стык олигонуклеотидов.
В одном варианте осуществления J2/3 содержит мотив Т-петли (T-loop motif). В одном варианте осуществления мотив Т-петли содержит последовательность UUGAA, необязательно, при этом гуанозин Т-петли образует Уотсона-Криковскую пару оснований с цитидином в J3/1.
В одном варианте осуществления спиральный домен имеет первый конец и второй конец, и первый конец является проксимальным по отношению к соединению между олигонуклеотидами, а второй конец соединен с модулем считывания на основе олигонуклеотида. В одном варианте осуществления модуль
- 1 044975 считывания на основе олигонуклеотида является флуорогенным, например, аптамер, связывающий флуорофор Broccoli, или является модулем считывания на основе переключателя, например, переключатель pbuE. В одном варианте осуществления модуль считывания на основе олигонуклеотида представляет собой модуль считывания на основе олигорибонуклеотида.
В одном варианте осуществления индивидуальные олигонуклеотиды имеют последовательность, соответствующую последовательности гуанинового рибопереключателя xpt-pbuX Bacillus subtilis, включающей около 23 вариабельных нуклеотидных остатков в пределах участка стыка олигонуклеотидов, или индивидуальные олигонуклеотиды имеют последовательность, соответствующую последовательности рибопереключателя Vc2 циклического di-GMP Vibrio cholera, содержащей около 21 вариабельных нуклеотидных остатков в пределах участка стыка олигонуклеотидов, или индивидуальные олигонуклеотиды имеют последовательность, соответствующую последовательности рибозима хаммерхэд Schistosoma mansoni, содержащей около 21 вариабельных нуклеотидных остатков в пределах участка стыка олигонуклеотидов.
В одном варианте осуществления участок стыка олигонуклеотидов представляет собой N-членный стык, при этом N равно двум, трем, четырем или пяти, или при этом N равно двум, или при этом N равно трем, или при этом N равно четырем, или при этом N равно пяти.
В одном варианте осуществления указанная библиотека содержит от около 421 до около 423 неидентичных членов.
В другом аспекте предоставлена библиотека олигонуклеотидов, содержащая множество неидентичных олигонуклеотидов. Отдельные олигонуклеотиды указанной библиотеки содержат первую последовательность, содержащую спиральный домен, вторую последовательность, содержащую первый шпильковидный домен, и третью последовательность, содержащую второй шпильковидный домен, причем спиральный домен, первый шпильковидный домен и второй шпильковидный домен образуют стык олигонуклеотидов, содержащий предварительно выбранный лиганд-связывающий домен, и при этом указанная библиотека содержит множество неидентичных лиганд-связывающих доменов.
В одном варианте осуществления каждый спиральный домен независимо представляет собой полностью комплементарную спираль, необязательно, содержащую один или несколько дестабилизирующих нуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из несовпадающей пары оснований, нестабильной пары оснований G-U и выпуклости. В одном варианте осуществления каждый спиральный домен представляет собой полностью комплементарную спираль.
В одном варианте осуществления каждый первый шпильковидный домен независимо содержит один или несколько дестабилизирующих нуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из несовпадающей пары оснований, нестабильной пары оснований G-U и выпуклости, и/или каждый второй шпильковидный домен, независимо, содержит один или несколько дестабилизирующих нуклеотидов выбранных из группы, состоящей из несовпадающей пары оснований, нестабильной пары оснований G-U и выпуклости.
В одном варианте осуществления спиральный домен имеет длину, по меньшей мере, от 4 до 10 пар оснований или, по меньшей мере, 10 пар оснований.
В одном варианте осуществления указанные олигонуклеотиды представляют собой олигорибонуклеотиды.
В одном варианте осуществления индивидуальные олигонуклеотиды содержат последовательность, имеющую ряд связанных последовательностей в соответствии с формулой I:
Pl-Jl/2-P2-L2-P2'-J2/3-P3-L3-P3'-J3/l-Pl ' (I), где - представляет собой связь,
Р1 и Р1' образуют спираль,
Р2, L2 и Р2' образуют первую шпильку,
Р3, L3 и Р3' образуют вторую шпильку, а
J1/2, J2/3 и J3/1 вместе образуют стык олигонуклеотидов.
В одном варианте осуществления J2/3 содержит мотив Т-петли. В одном варианте осуществления мотив Т-петли содержит последовательность UUGAA, необязательно, при этом гуанозин Т-петли образует Уотсон-Криковскую пару оснований с цитидином в J3/1.
В одном варианте осуществления спиральный домен имеет первый конец и второй конец, и первый конец является проксимальным по отношению соединению олигонуклеотида, а второй конец связан с модулем считывания на основе олигонуклеотида. В одном варианте осуществления модуль считывания на основе олигонуклеотида является флуорогенным, например, представляет собой аптамер Broccoli, связывающий флуорофор, или модуль считывания на основе переключателя, например, переключателя pbuE. В одном варианте осуществления модуль считывания на основе олигонуклеотида представляет собой модуль считывания на основе олигорибонуклеотида.
В одном варианте осуществления индивидуальные олигонуклеотиды содержат последовательности, имеющие последовательность, соответствующую последовательности гуанинового рибопереключателя xpt-pbuX Bacillus subtilis, содержащую около 23 вариабельных нуклеотидных остатков в пределах стыка
- 2 044975 олигонуклеотидов, или индивидуальные олигонуклеотиды содержат последовательности, имеющие последовательность, соответствующую Vc2 циклического di-GMP Vibrio cholera, содержащую около 21 вариабельного нуклеотидного остатка в стыке олигонуклеотидов, или индивидуальные олигонуклеотиды включают последовательности, имеющие последовательность, соответствующую последовательности рибозима хаммерхэд Schistosoma mansoni, включающую около 21 вариабельного нуклеотидного остатка в стыке олигонуклеотидов.
В одном варианте осуществления участок стыка олигонуклеотидов представляет собой N-членный стык, при этом N равно двум, трем, четырем или пяти, или при этом N равно двум, или при этом N равно трем, или при этом N равно четырем, или при этом N равно пяти.
В одном варианте осуществления предварительно выбранный лиганд-связывающий сайт содержит сайт связывания для соединения, выбранного из группы, состоящей из аминокислоты, пептида, нуклеинового основания, нуклеозида, нуклеотида, иона металла, нейротрансмиттера, гормона, активного фармацевтического ингредиента и их производных. В одном варианте осуществления предварительно выбранный лиганд-связывающий сайт содержит сайт связывания для лиганда, выбранного из группы, состоящей из аминокислоты, нуклеинового основания, нуклеозида, нуклеотида, нейротрансмиттера, гормона и их производных. В одном варианте осуществления предварительно выбранный лигандсвязывающий сайт содержит сайт связывания, по меньшей мере, для одного лиганда, выбранного из группы, состоящей из 5-гидрокси-Ь-триптофана, L-триптофана, серотонина и 5-гидроксиЩ-триптофанметиламида. В одном варианте осуществления лиганд представляет собой, по меньшей мере, один из 5гидроксиЩ-триптофана или серотонина.
В еще одном аспекте предложен способ селекции множества неидентичных лиганд-связывающих олигонуклеотидов. Указанный способ включает стадию контактирования библиотеки олигонуклеотидов, содержащей множество олигонуклеотидов, с лигандом в условиях, подходящих для связывания лиганда, при этом индивидуальные олигонуклеотиды содержат первую последовательность, содержащую спиральный домен, вторую последовательность, содержащую первый шпильковидный домен, и третью последовательность, содержащую второй шпильковидный домен, при этом спиральный домен, первый шпильковидный домен и второй шпильковидный домен образуют стык олигонуклеотидов, и стадию разделения библиотеки олигонуклеотидов на пространственно адресуемые части, так что выбирается множество неидентичных лиганд-связывающих олигонуклеотидов, при этом олигонуклеотиды, имеющие стык олигонуклеотидов, дополнительно содержат лиганд-связывающий домен, и при этом лигандсвязывающие домены указанной библиотеки олигонуклеотидов содержат вариабельные нуклеотидные остатки.
В одном варианте осуществления способ дополнительно содержит этап, включающий конкурентное разделение библиотеки олигонуклеотидов с помощью раствора свободного лиганда между этапом контактирования и этапом разделения.
Краткое описание графических материалов
Вышеизложенные и другие признаки и преимущества данного изобретения будут более понятны из следующего подробного описания иллюстративных вариантов осуществления в рассмотрении вместе с прилагаемыми графическими материалами. Файл патента или изобретения содержит как минимум одну фигуру, выполненную в цвете. Копии этого патента или публикации изобретения с цветными графическими материалами будут предоставлены соответствующим Ведомством по запросу и после уплаты необходимой пошлины.
На фиг. 1А продемонстрирован GR-остов. GR-остов получен из аптамерного домена гуанинового рибопереключателя xpt-pbuX В. subtilis. Аптамер состоит из трех парных (Р) участков, соединенных соединяющими (J) участками тройного стыка, который содержит сайт связывания гуанина (Gua, пурпурный) (пунктирные линии обозначают прямые взаимодействия РНК-лиганд). Нуклеотиды, выделенные бирюзовым - это те, которые были рандомизированы для селекции. Терминальные петли Р2 и Р3 (L2 и L3, зеленый прямоугольник) участвуют в третичном взаимодействии, которое организует домен. Ниже представлена трехмерная структура РНК (PDB ID 4FE5) с той же схемой окраски, выделяющая пространственную связь между сайтом связывания лиганда и рандомизированными нуклеотидами.
На фиг. 1В продемонстрирован CDG-остов. Вторичная (вверху) и третичная (внизу) структура CDG-остова была получена из домена аптамера рибопереключателя Vc2 циклического di-GMP V. cholera (PDB ID 3IWN). Схема маркировки и окраски такая же, как описанная на фиг. 1А.
На фиг. 1С продемонстрирован НН-остов. Вторичная (вверху) и третичная (внизу) структура ННостова была получена из рибозима хаммерхэд S. mansoni (PDB ID 3ZP8). Схема маркировки и окраски такая же, как описанная на фиг. 1А.
На фиг. 2А продемонстрирована химическая структура 5-гидроксиЩ-триптофана.
На фиг. 2В продемонстрировано представление в виде неукорененного филогенетического дерева матрикса расстояний последовательностей, полученных в 7 раунде селекции GR-SSIII. Последовательности сгруппированы в три основных кластера, которые независимо окрашены. Расстояние выражается как оценка максимального правдоподобия (MLE - maximum likelihood estimate) того, сколько замен произошло на каждый сайт между двумя узлами дерева (отрезок продемонстрирован для масштаба).
- 3 044975
На фиг. 2С продемонстрировано представление в виде неукорененного филогенетического дерева матрикса расстояний последовательностей, полученных из 7 раунда селекции GR-Gsl. Четыре кластера, из которых были проанализированы репрезентативные последовательности, продемонстрированы независимыми цветами (условные обозначения продемонстрированы справа); черная область представляет собой неанализированные кластеры и участки дерева.
На фиг. 2D продемонстрирована ковариационная модель шести наблюдаемых кластеров, полученных из селекции GR; цвета соответствуют фиг. 2В и 2С. Пунктирные линии соответствуют участкам остова, которые были рандомизированы, а линии, соединяющие L2 и L3, обозначают кластеры, в которых поддерживаются последовательности, которые будут поддерживать третичное взаимодействие.
На фиг. 3А продемонстрирован результат селективного 2'-гидроксил ацилирования проанализированного удлинением праймера (SHAPE - Selective 2'-Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension) химического зондирования трех последовательностей (5НТР-1, -II и -III) по сравнению с нативным xptryаниновым рибопереключателем. Для ясности продемонстрированы участки геля, соответствующие цепи J2/3 и L3 (весь гель продемонстрирован на дополнительной фиг. 4а). В то время как все три РНК обнаруживают лиганд-зависимое снижение химической реактивности остова РНК внутри или рядом с J2/3, только 5HTP-II сохраняет характерную точку реактивности в L3, что указывает на формирование его взаимодействия с L2 в xptry-аниновом рибопереключателе.
На фиг. 3В приведено количественное измерение лиганд-зависимых дифференциальных интенсивностей зондирования SHAPE 5HTP-II в присутствии и в отсутствие 5НТР, которое демонстрирует, что большинство изменений реактивности локализованы на стыке. Усиление сигнала L3 предполагает связь между связыванием лиганда в стыке и образованием третичной структуры.
На фиг. 3С продемонстрирован калориметрический анализ изотермического титрования (ITC - isothermal titration calorimetric assay) связывания 5НТР с 5HTP-II с (слева) и без (справа) 5'- и 3'амплификационных кассет, демонстрирующий, что эти участки не влияют на связывание лиганда.
На фиг. 3D продемонстрирована кристаллическая структура аптамера 5HTP-II в комплексе с 5гидрокситриптофаном (пурпурный). Зеленый цвет обозначает взаимодействие L2-L3 родительского остова (фиг. 1А), а голубой - нуклеотиды, которые были рандомизированы в исходной библиотеке РНК.
На фиг. 3Е продемонстрировано наложение количественных данных SHAPE о реактивности на панели(В)на кристаллическую структуру, что подчеркивает взаимосвязь между лиганд-зависимыми изменениями в динамике РНК-остова и указанной структуры.
Фиг. 4А демонстрирует связывающий карман 5НТР в аптамере 5HTP-II. 5НТР-связывающий карман в тройном стыке образует набор водородных связей, которые взаимодействуют с каждой полярной функциональной группой в 5-гидрокситриптофане, за исключением одного атома кислорода в карбоксилатной группе, который становится амидом для иммобилизации соединения. Кроме того, комплекс стабилизируется путем суммирования взаимодействий между гидроксииндольным кольцом 5НТР и адениновыми основаниями (А48 и А49) в J2/3.
На фиг. 4В продемонстрирован карман связывания 5НТР в аптамере 5HTP-II. Ядро связывающего кармана в аптамере 5HTP-II (зеленый) представляет собой Т-петлю, которая почти идеально накладывается на Т-петли из тРНКPhe (оранжевый) и тиаминопирофосфатным (ТРР) рибопереключателем (голубой). В каждом из трех примеров пространство между двумя пуринами в положениях Т4 и Т5 (нумерация Т1-5 указывает положение нуклеотида в мотиве Т-петли) обеспечивает интеркаляцию ароматического кольца.
На фиг. 5А продемонстрировано, что биосенсор на основе аптамера 5НТР функционирует в Е.coli. 5HTP-II аптамер дикого типа специфически активирует флуоресценцию репортера Broccoli в присутствии 5НТР. При t=0 мин в среду добавляли 2 мМ 5НТР.
На фиг. 5В продемонстрировано, что аптамер 5HTP-II дикого типа специфически не активирует флуоресценцию репортера Broccoli в присутствии L-триптофана. В t=0 мин к среде добавляли 5 мМ Lтриптофан.
На фиг. 5С продемонстрировано, что одиночная точечная мутация в 5НТР-связывающем кармане аптамера 5HTP-II (A48U) также устраняет флуоресценцию в присутствии флуорофора. При t=0 мин в среду добавляли 2 мМ 5НТР.
На фиг. 5D продемонстрированы сигналы индукции флуоресценции отдельных клеток для сенсора 5HTP-II-Broccoli дикого типа в присутствии 5НТР. При t=0 мин в среду добавляли 2 мМ 5НТР.
На фиг. 5Е продемонстрированы сигналы индукции флуоресценции отдельных клеток для сенсора 5HTP-II-Broccoli дикого типа в присутствии L-триптофана. В t=0 мин к среде добавляли 5 мМ Lтриптофан.
На фиг. 5F продемонстрированы сигналы индукции флуоресценции отдельных клеток для связывающей некомпетентной конструкции 5HTP-II A48U в присутствии 5НТР. При t=0 мин в среду добавляли 2 мМ 5НТР.
На фиг. 6А продемонстрирована вторичная структура искусственного рибопереключателя 5НТР/серотонина ВКЛ на основе аптамера 5HTP-IV. Аптамер 5HTP-IV помечен пунктирной линией, а нуклеотиды в сплошных прямоугольниках соответствуют нуклеотидам, непосредственно участвующим в
- 4 044975 формировании альтернативной структуры.
На фиг. 6В продемонстрировано количественное измерение однократной реакции транскрипции рибопереключателя демонстрирующее эффективную надежную антитерминацию при добавлении 5НТР, серотонина, или 5HTP-NHme. Изображения гелей реакций транскрипции продемонстрированы справа и они отображают лиганд-зависимый переход от терминированых (Т) к прочитанным (П) продуктам. Подобное титрование с L-триптофаном не давало прочитанной транскрипции.
Фиг. 7А демонстрирует представление в виде неукорененного филогенетического дерева матрикса расстояний последовательностей, полученных из 7 раунда селекции CDG с использованием обратной транскриптазы GsI. Кластер, из которого был получен аптамер 5НТР, выделен красным цветом. Расстояние выражается как оценка максимального правдоподобия (MLE) того, сколько замен произошло на каждый сайт между двумя узлами дерева (отрезок продемонстрирован для масштаба).
На фиг. 7В продемонстрирована ковариационная модель аптамера 5HTP-VII; сплошная красная линия соответствует рандомизированным участкам биоостова, а линия, соединяющая L2 и Р3, обозначает третичное взаимодействие.
На фиг. 7С продемонстрировано представление в виде неукорененного филогенетического дерева матрикса расстояний последовательностей, полученных из 7 раунда селекции НН с использованием обратной транскриптазы GsI. Кластер, из которого был получен аптамер 5HTP-VIII, выделен фиолетовым; черные участки представляют неанализированные кластеры и участки дерева.
На фиг. 7D продемонстрирована ковариационная модель аптамера 5HTP-VIII; сплошная фиолетовая линия соответствует участкам биоостова, которые были рандомизированы, а линия, соединяющая Р2 и L3, обозначает третичное взаимодействие.
На фиг. 8А продемонстрировано значительное накопление мутаций в биоостове к 7 раунду селекции, при этом некоторые позиции на 3'-конце достигают частоты мутаций более 90% при первоначальной селекции с использованием Superscript III (Life Technologies). Существует также сильная склонность к накоплению мутаций в элементах последовательности, критичных для вторичной и третичной структуры (Р2 и Р3).
На фиг. 8В продемонстрирован модифицированный протокол селекции с использованием разработанного интрона RT группы II (GsI-IIC), который демонстрирует уменьшение количества накопленных мутаций в биоостове GR, особенно в областях Р2 и Р3. Это позволяет сохранить конструктивные элементы, спроектированные в последовательности.
На фиг. 8С продемонстрированы наблюдаемые частоты ошибок как функция от положения нуклеотидов в раунде 7 селекции CDG/GsI.
Фиг. 8D демонстрирует наблюдаемые частоты ошибок как функцию от положения нуклеотидов в раунде 7 селекции HH/GsI.
На фиг. 9А продемонстрирован анализ SHAPE аптамеров 5HTP-IV, -V и -VI в отсутствие и в присутствии 5НТР. Столбцы сбоку выделяют участки J2/3 и L3, демонстрирующие различные лигандзависимые защиты в тройном стыке и наличие горячей точки характерной реактивности в L3, что является признаком взаимодействия L2-L3.
На фиг. 9В продемонстрирован анализ SHAPE связывающего 5НТР аптамера, с CDG-остовом. Необработанный гель демонстрирует явные лиганд-зависимые модификации в J1/2 и J2/3. Родительская Vc2 РНК демонстрирует лиганд-зависимую защиту в Р3 в месте докинга тетра-петли, в то время как аптамер 5HTP-VII демонстрирует лиганд-зависимую модификацию на противоположной стороне спирали. Кроме того, ни одна из РНК не демонстрирует каких-либо модификаций в присутствии несоответствующего лиганда.
На фиг. 9С продемонстрирован анализ SHAPE связывающего 5НТР аптамера с НН-остовом. Необработанный гель демонстрирует явные лиганд-зависимые модификации в J1/2 и J2/3. Изменения в J2/3 локализуются главным образом в положениях 3 и 4 предсказанного мотива Т-петли. Кроме того, если структура сохраняется, концевая петля Р3 (L3), которая совершает докинг к Р2 в родительской РНК, демонстрирует лиганд-зависимую защиту. Интеграция полос как функция от расстояния вниз по гелю продемонстрирована слева.
На фиг. 10А продемонстрирована карта электронной плотности 2Fo-Fc комплекса 5HTP-II/5HTP вокруг модели, очерченой на 2σ. Все участки РНК четко определяются по электронной плотности, что делает размещение остатков и основной цепи однозначным. Голубые нуклеотиды были рандомизированы в исходной РНК-библиотеке, а 5НТР продемонстрирован оранжевым.
На фиг. 10В продемонстрировано комплексное удаление связывающего лиганд кармана комплекса 5HTP-II/5HTP, очерченного на 1σ, демонстрирующее ясное расположение в зависимости от плотности лиганда (5НТР) и соседнего гексамина иридия (IrHex).
На фиг. 10С продемонстрирована окончательная карта электронной плотности 2Fo-Fc связывающего кармана 5НТР комплекса 5HTP-II/5HTP очерченная на 1σ.
На фиг. 11А продемонстрирована диаграмма R2R, полученная из вариационного анализа J2/3 апта- 5 044975 мера 5HTP-VIII наиболее густонаселенного кластера селекции HH/GsI.
На фиг. 11В продемонстрирован вариационный анализ J2/3 аптамера 5HTP-VIII, сравнивающий характер вариации Т-петель, обнаруженных в биологических РНК1 (вверху), и кластера, содержащего аптамер 5HTP-VIII.
Фиг. 12 демонстрирует схему построения биосенсоров 5HTP-Broccoli. Красные нуклеотиды во вторичной структуре Broccoli обозначают G-квартет, который формирует платформу для DFHBI, а зеленые нуклеотиды обозначают различия между Spinach и Broccoli.
Фиг. 13 представляет собой графическое резюме, демонстрирующее конструкцию новых аптамеров остова по данному изобретению.
Фиг. 14А представляет собой схему вторичной структуры генетически кодируемых биосенсоров 5НТР и L-DOPA в которой аптамер с GR-остовом (голубой) связан с флуорогенным аптамером (Broccoli, зеленый) через коммуникационный модуль (оранжевый, СМ; последовательности снизу) и стабилизированный in vivo с помощью тРНК-остова (желтый).
На фигурах 14В и 14С продемонстрированы карты интенсивности наблюдаемой лигандиндуцированной флуоресценции (вверху) и яркости лиганд-связанного сенсора относительно контроля тРНК/Broccoli (внизу) для серии аптамеров с GR-остовами, соединенных с Broccoli с помощью СМ, имеющих от 2 до 5 пар оснований.
Фиг. 14D и 14Е изображают карты интенсивности производительности тех же сенсоров в Е.coli.
На фиг. 15А и 15В продемонстрировано, что аптамер 5GR-II дикого типа специфически активирует флуоресценцию репортера Broccoli в присутствии 5НТР, но не в присутствии L-триптофана.
Фиг. 15С демонстрирует, что одиночная точечная мутация в 5НТР-связывающем кармане аптамера 5GR-II (A48U) также устраняет флуоресценцию в присутствии флуорофора.
На фиг. 15D, 15Е и 15F продемонстрированы сигналы индукции флуоресценции отдельных клеток для сенсора 5GR-II-Broccoli дикого типа в присутствии 5НТР, L-триптофана и непригодной для связывания конструкции 5GR-II A48U в присутствии 5НТР. При t=0 мин в среду добавляли 2 мМ 5НТР или 5 мМ L-триптофана.
На фиг. 16А продемонстрировано наложение родительского гуанинового рибопереключателя xpt В. subtillis и 5GR-11 РНК на все атомы остова. Гуаниновый рибопереключатель (PDB 4FE5) продемонстрирован красным, а его лиганд гипоксантин-пурпурным. Аптамер 5GR-II продемонстрирован синим цветом, а его лиганд 5НТР-зеленым.
На фиг. 16В продемонстрировано наложение двух РНК с использованием атомов остова только в Р2 и Р3.
Фиг. 16С демонстрирует вид наложения двух базовых квадруполей составляющих ядро взаимодействия L2-L3, что демонстрирует полное сохранение отдельных взаимодействий оснований, которые устанавливают это третичное взаимодействие.
Фиг. 17A-17D демонстрируют последовательность и вторичную структуру исходных библиотек РНК. Зеленое поле выделяет постоянную область, которая используется для прайминга, а желтое поле выделяет штрих-код, специфичный для каждого остова. Положения нуклеотидов, которые были рандомизированы в исходной библиотеке, выделены голубым цветом.
Фиг. 17А демонстрирует последовательность библиотеки РНК аптамера гуанинового рибопереключателя (GR) для селекции с использованием ОТ Superscript III.
Фиг. 17В демонстрирует последовательность РНК библиотеки GR, использованной для селекции с использованием ОТ GsI-IIC.
Фиг. 17С демонстрирует последовательность библиотеки аптамера рибосвича дициклического GMP (CG).
Фиг. 17D демонстрирует последовательность библиотеки рибозима хаммерхэд (HR-hammerhead ribozyme).
Фиг. 18А-18С демонстрирует селекция аптамеров с остовом, которые селективно связываются 3,4дигидроксифенилаланином (L-ДОФА).
Фиг. 18А демонстрирует химическую структуру дофамина (1) и L-DOPA (2).
На фиг. 18В продемонстрировано представление в виде неукорененного филогенетического дерева матрикса расстояний последовательностей, полученных из раунда 7 селекции GR-GsI-IIC против LDOPA. Четыре кластера, из которых репрезентативные последовательности были включены в флуорогенные биосенсоры, продемонстрированы независимыми цветами. Черная область представляет собой неанализированные кластеры и участки указанного дерева.
На фиг. 18С продемонстрированы ковариационные модели четырех кластеров, цвета которых соответствуют цветам панели (В). Обратите внимание, что структура MFE DGR-III имеет альтернативную вторичную структуру, которая, если она правильная, устраняет третичное взаимодействие петля-петля.
Фиг. 19 демонстрирует SHAPE-анализ 5НТР-связывающих аптамеров с GR-остовом. На этой фигуре продемонстрирован полный участок сиквенирования геля, который был использован для создания фиг. 4А.
На фиг. 20 продемонстрирован SHAPE-анализ 5НТР-связывающих аптамеров с GR-остовом. Пол- 6 044975 ное и неизмененное демонстрирование геля для сиквенирования показано на фиг. 4А (участки, соответствующие J2/3 и L3, были обрезаны для получения фиг. 4А). Анализ SHAPE формы аптамеров 5GR-IV, V и -VI представлен в отсутствие и в присутствии 5НТР. Отрезки сбоку выделяют участки J2/3 и L3, демонстрирующие различные лиганд-зависимые защиты в 3WJ и наличие активной точки характерной реактивности в L3, что является признаком взаимодействия L2-L3.
На фиг. 21 продемонстрирован SHAPE-анализ 5НТР-связывающего аптамера с СН-остовом. Необработанный гель (вставка) демонстрирует явные лиганд-зависимые модификации в J1/2 и J2/3. Родительская РНК Vc2 демонстрирует лиганд-зависимую защиту в Р3 в тетра-петлевом месте докинга, в то время как аптамер 5CG-I демонстрирует лиганд-зависимую модификацию на противоположной стороне спирали. Дополнительно, ни одна из РНК не демонстрирует модификаций в присутствии несоответствующего лиганда. Интеграция полос как функция от расстояния вниз по гелю продемонстрирована внизу. После нормализации и назначения лиганд-зависимые изменения все еще очевидны (цветные звездочки), особенно в J1/2.
На фиг. 22 продемонстрирован SHAPE-анализ 5НТР-связывающего аптамера с HR-остовом. Необработанный гель (справа) демонстрирует явные лиганд-зависимые модификации в J1/2 и J2/3. Изменения в J2/3 локализуются главным образом в положениях 3 и 4 предсказанного мотива Т-петли. Кроме того, если структура была сохранена, концевая петля Р3 (L3), которая присоединяется к Р2 в родительской РНК, демонстрирует лиганд-зависимую защиту. Интеграция полос как функция от расстояния вниз по гелю продемонстрирована слева. После нормализации и назначения лиганд-зависимые изменения все еще очевидны (цветные звездочки). Обратите внимание, что нет фонового расщепления на эквивалентном сайте в родительской РНК хаммерхэд (верхняя зеленая звездочка).
На фиг. 23 продемонстрированы сконструированные сенсоры по данному изобретению, которые были синтезированы как G-блоки. N обозначает положение, в котором А, С, G и Т находятся с вероятностью около 25% каждый. Последовательности РНК-аптамера и сенсора приведены в виде их эквивалентных последовательностей ДНК. Отдельные домены сенсоров Broccoli имеют цветовую кодировку для обозначения тРНК-остова (серый), связывающего DFHBI-1T аптамера Broccoli (желтый), коммуникационного модуля (голубой) и аптамера с GR-остовом (красный).
Подробное описание сущности изобретения
Средства для генерации синтетических элементов РНК и/или ДНК с новыми регуляторными и сенсорными способностями в значительной степени возможны благодаря селекции in vitro, и пул доступных синтетических аптамеров в настоящее время велик. Однако только несколько низкомолекулярных РНКаптамеров трансформировались в эффективные и широко используемые внутриклеточные биосенсоры их когнатного лиганда или другие РНК-устройства. Это несоответствие между связыванием in vitro и внутриклеточной активностью является проблемой, что предполагает, что современные стратегии селекции не могут легко привести к РНК-аптамерам, связывающим малые молекулы, способные надежно функционировать в среде клетки. Хотя стратегии селекции in vivo для РНК, связывающих малые молекулы, могут быть более успешными для создания клеточно-приспособленных аптамеров, эти подходы в настоящее время не являются широко практичными. Таким образом, современные стратегии попрежнему основаны на длительном рабочем процессе, включающем традиционную селекцию in vitro с тандемной, специфичной для применения селекцией для улучшенной функции.
В отличие от синтетических аптамеров, домены, связывающие малые молекулы, природных рибопереключателей развивались в контексте клетки и включают в себя дополнительные особенности, выходящие за пределы сайта связывания лиганда, которые включают в себя свертывание с высокой точностью и способность коммуникации с нижестоящими регуляторными переключателями для получения обнаруживаемого результата. Эти аптамеры являются высоко модульными и устойчивыми, наблюдаются в широком спектре видов бактерий и взаимодействуют с различными регуляторными доменами, действующими на транскрипцию, трансляцию, альтернативный сплайсинг и стабильность мРНК. Таким образом, они очень гибки в отношении механизмов коммуникации со смежными доменами или последовательностями, которые вызывают какой-то результат (например, регуляция гена). Эти аптамеры были успешными в синтетических применениях и были использованы для проверки синтетических РНК инструментов. Хотя были предприняты значительные усилия по идентификации и характеристике природных аптамеров, они по своей природе ограничены по своему разнообразию и применению из-за эндогенных пулов эффекторного лиганда, которые трудно модулировать.
В ответ на эти трудности в данном документе представлены повторяющиеся архитектурные свертывания, обнаруженные в природных РНК-аптамерах и малых нуклеолитических рибозимах, которые можно перепрограммировать с помощью селекции in vitro для размещения широкого спектра сайтов связывания малых молекул, сохраняя при этом надежное свертывание и очень стабильные архитектурные свойства исходной молекулы и их способы использования. Ранее использовалось применение частично структурированных библиотек РНК для селекции аптамеров, связывающих малые молекулы, но эти простые шпильки и спирали не способны образовывать структуру более высокого порядка, похожую на природные аптамеры. Селекция рибозима РНК-лигазы с очень скромной активностью путем рандомизации концевой петли в домене рибозима Р456 Tetrahymena продемонстрировала, что можно получить ри- 7 044975 бозимы из библиотеки с остовами. Однако архитектура Р456 является большой (160 нуклеотидов) и ограниченной подклассами IC1 и IC2 самосплайсинговых интронов группы I. Таким образом, он может не подходить в качестве общей платформы для получения разнообразных аптамеров, связывающих малые молекулы, которые активны в широком спектре клеток.
Используя остовы, происходящие из двух разных доменов аптамеров рибопереключателей и рибозима, был получен разнообразный набор аптамеров, которые избирательно связывают 5гидрокситриптофан (5НТР) и/или серотонин (5НТ). В то время как каждый из остовов обеспечивает уникальные решения для распознавания, все они сходны по похожей аффинности связывания и дискриминации против химически родственного L-триптофана. Эти аптамеры имеют предрасположенность благодаря и структурному остову для соединения с флуорохромом и основанными на переключателях модулями считывания. Хотя стратегии скрининга достигаются с разной степенью успеха, разнообразие аптамеров, легко достижимое с помощью этого подхода, позволяет применять более гибкие стратегии, требующие меньшей характеризации in vitro, для реализации практических пригодных устройств на основе РНК.
Устройства на основе РНК все чаще рассматриваются как потенциально надежный и предсказуемый инструмент в синтетической биологии. РНК обладает уникальным набором функций по сравнению с альтернативами на основе белка, включая способность регулировать в цис-положении, предсказуемую вторичную структуру и небольшой генетический след. Среди наиболее востребованных способностей РНК-устройств - способность воспринимать внешние раздражители и модулировать генетический или фенотипический ответ в отсутствие дополнительных белковых факторов. Усилия были сосредоточены на создании синтетических рибопереключателей, аптазимов и флуорогенных РНК-сенсоров, однако их потенциал еще не полностью реализован отчасти из-за ограниченной доступности основанных на РНК сенсорных доменов. Композиции и способы, представленные в данном документе, неожиданно демонстрируют, что использование рибопереключателей или рибозимов естественного происхождения в качестве остовов для селекции может давать эффективный и надежный сенсорный домен, способный функционировать как in vitro, таки в клеточном контексте, наравне с лучшими на сегодняшний день искусственными и природными аптамерами.
Основным преимуществом композиций и способов, описанных в данном документе, является использование множества остовов в параллельных выборках для получения набора аптамеров. Хотя аптамеры, полученные из разных остовов, имеют сходное сродство к 5НТР и селективность по отношению к L-триптофану, они явно имеют отличные характеристики в отношении их способности коммуникации с доменом считывания через спираль Р1, что является общей характеристикой для всех остовов. Не будучи связанными теорией, предполагается, что это связано с изменением пространственных отношений между лигандом и междоменной спиралью (Р1), признаком, который нельзя полностью контролировать при селекции. У биологических рибопереключателей лиганд либо находится в прямом контакте, либо вызывает конформационные изменения в РНК, которые включают спираль Р1, которая связывает аптамер с нижестоящим регуляторным переключателем.
С набором аптамеров можно использовать комбинаторные подходы для быстрого скрининга на сенсоры с желаемыми свойствами без экстенсивной характеризации аптамеров или оптимизации устройств. Как правило, традиционная селекция in vitro дает только один аптамер, связывающий малую молекулу, а разработка РНК-устройства требует скрининга многих коммуникационных модулей и адаптерных последовательностей, с сохранением сенсорного аптамера в качестве фиксированного узла. При подходе к селекции с использованием остовов набор различных аптамеров может быть комбинаторно соединен с набором коммуникационных модулей и быстро проверен на наличие вариантов с желаемой активностью. Таким образом, этот подход должен устранить ключевое узкое место в разработке устройств и сенсоров на основе РНК. Примечательно, что, хотя это исследование фокусировалось только на самых густозаселенных кластерах при каждой селекции для характеризации и конструирования сенсора, в каждой селекции было много кластеров, содержащих альтернативные последовательности, которые могли бы дополнительно обогатить первоначальный пул аптамеров для разработки исходящих применений.
Вторым сильным преимуществом этой стратегии селекции является надежное свертывание в клеточном контексте, обеспечиваемое третичным взаимодействием архитектуры олигонуклеотидного стыка (например, тройного стыка). Каждый из этих аптамеров имеет свертывание, которое претерпело обширную биологическую эволюцию, и, в частности, дистальные третичные взаимодействия, которые организуют ядро тройного стыка, являются высокостабильными. Как L2-L3-взаимодействие пуринового рибопереключателя, так и четырехпетлевой-четырехпетлевой рецептор рибопереключателя циклического diGMP, способны стабильно формироваться вне контекста другой РНК структуры. Это позволяет этим элементам потенциально управлять свертыванием всех членов начальной библиотеки, таким образом, что подавляющее большинство популяции библиотеки содержит предписанную вторичную и третичную структуру. Неверное свертывание часто представляет собой серьезную проблему для традиционных синтетических аптамеров, которая может быть значительно усугублена, когда РНК элемент связан с другим или помещен в контекст более крупной РНК. Поскольку в типичном протоколе селекции нет значитель- 8 044975 ного давления селекции для высококачественного свертывания, предоставление этой информации в исходной библиотеке может стать путем к эффективным и надежным свертывающимся РНК.
В то время как в этом примере представлены остовы с тройным стыком, разнообразие природных рибопереключателей и рибозимов может обеспечить дополнительное сырье для этого подхода. В пределах семейства с тройным стыком имеется широкий ряд последовательностей, в которых изменяется ориентация трех спиралей, размер участков стыка и характер дистального третичного взаимодействия, что может обеспечить превосходные остовы для конкретного лиганда или сенсора. Кроме того, другие свертывания могут быть предрасположены к связыванию целевой малой молекулы в зависимости от природы когнатного лиганда. Например, другим выбором для остова, связывающего 5НТР, является аптамерный домен лизинового рибосвича, который содержит пятерной стык, в котором находится сайт связывания лиганда, размещенный рядом со спиралью Р1. Более крупные лиганды могут быть легче приняты остовами, происходящими от флавинмононуклеотидного или кобаламинового рибопереключателя, тогда как динуклеотиды, такие как NADH, могут быть легко приняты одним из других аптамеров дициклических нуклеотидов. Таким образом, описанные в данном документе подходы селекции с использованием остова имеют потенциал для облегчения разработки новых мощных инструментов для мониторинга и реагирования на малые молекулы в среде клетки в широком диапазоне применений с использованием устройств на основе РНК.
Как правило, номенклатура, используемая в связи с клеточной и тканевой культурой, молекулярной биологией, иммунологией, микробиологией, генетикой, химией и гибридизацией белков и нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, является хорошо известной и широко используемой в данной области. Способы и методики, предоставленные в данном документе, обычно выполняются в соответствии с обычными способами, хорошо известными в данной области техники, и как описано в различных общих и более конкретных ссылках, которые цитируются и обсуждаются в данном описании, если не указано иное.
Ферментативные реакции и методы очистки выполняются в соответствии со спецификациями производителя, как это обычно делается в данной области техники или как описано в данном документе. Номенклатура, используемая в связи с описанными в данном документе лабораторными процедурами и методами аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, хорошо известна и широко используется в данной области. Стандартные методы используются для химического синтеза, химического анализа, фармацевтической подготовки, приготовления и доставки, а также для лечения пациентов.
Если не указано иное, научные и технические термины, используемые в данном документе, имеют значения, которые обычно понимают специалисты в данной области техники. В случае любой скрытой неоднозначности определения, представленные в данном документе, имеют преимущество над любым словарным или внешним определением. Если иное не требуется в контексте, термины в единственном числе включают множественное число, а термины во множественном числе включают единственное число. Использование или означает и/или, если не указано иное. Использование термина включающий, а также других форм, таких как включает и включенный, не является ограничивающим.
Чтобы изобретение было легче понять, определенные термины сначала устанавливаются.
Термины аптамер и домен аптамера относятся к коротким одноцепочечным последовательностям ДНК, РНК или пептидов, которые специфически связываются с различными молекулярными мишенями, такими как малые молекулы, белки, нуклеиновые кислоты, клетки, ткани и тому подобное, с высокой специфичностью и аффинностью. Аптамеры, как правило, являются высокоспецифичными, относительно небольшими по размеру и неиммуногенными. Подобно антителам, аптамеры взаимодействуют со своими мишенями, распознавая специфическую трехмерную структуру, и поэтому их также называют химическими антителами. В отличие от белковых антител, ДНК или РНК-аптамеры обладают уникальными химическими и биологическими характеристиками, основанными на их олигонуклеотидных свойствах.
Термин рибопереключатель относится к элементу, обычно обнаруживаемому в 5'нетранслируемом участке мРНК, который осуществляет регуляторный контроль над конкретным транскриптом в цис-режиме путем непосредственного связывания низкомолекулярного лиганда. Типичный рибопереключатель содержит два различных функциональных домена: домен аптамера, который принимает компактную трехмерную структуру для создания остова для кармана связывания лиганда; и платформу экспрессии, которая содержит вторичный структурный переключатель, который взаимодействует с транскрипционным или трансляционным механизмом. Регуляция достигается за счет участка перекрытия между этими двумя доменами, известного как последовательность переключения, чье спаривание направляет свертывание РНК в одну из двух взаимоисключающих структур на платформе экспрессии, которые представляют состояния включенной или выключенной мРНК. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления предпочтительным является гуаниновый рибопереключатель xpt-pbuX В. subtilis (называемый в данном документе GR) или рибопереключатель Vc2 циклического di-GMP Vibrio cholerae (называемый в данном документе CDG).
Термин рибозим относится к молекуле РНК, которая действует как фермент и способна катализи- 9 044975 ровать определенные биохимические реакции, аналогичные действию белковых ферментов. Классы рибозимов включают в себя GIR1-разветвляющий рибозим, glmS-рибозим, самосплайсирующийся интрон группы I, самосплайсирующийся интрон группы II, шпильковидный рибозим, хаммерхэд рибозим и рибозим HDV. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления предпочтительным рибозимом является рибозим хаммерхэд Schistosoma mansoni (называемый в данном документе HH).
Термины синтетический РНК-агент, синтетический ДНК-агент, биосенсор и остов относятся к сенсорным устройствам на основе нуклеиновых кислот, описанным в данном документе, которые включают вторичные и третичные структурные остовы, полученные из аптамеров, которые существуют в природе, например, из рибопереключателей и рибозимов, Синтетический РНК-агент, синтетический ДНК-агент, биосенсор или структурный остов по данному изобретению включают в себя спиральный домен, первый и второй шпильковидные домены и стык олигонуклеотидов, который содержит лиганд-связывающий домен. Биосенсор по данному изобретению может содержать N-членный стык, при этом N равно 2, 3, 4 или 5.
В определенных вариантах осуществления биосенсор по данному изобретению содержит последовательность, имеющую ряд связанных компонентов в соответствии с формулой I:
Pl-Jl/2-P2-L2-P2’-J2/3-P3-L3-P3’- J3/1- (I), где- представляет собой связь,
Р1 и Р1' образуют спираль,
Р2, L2 и Р2' образуют первую шпильку,
Р3, L3 и Р3' образуют вторую шпильку, а
J1/2, J2/3 и J3/1 вместе образуют стык олигонуклеотидов. (см., например, фиг. 1).
В определенных вариантах осуществления биосенсор по данному изобретению содержит модуль считывания, с помощью которого можно определять специфичность и/или сродство модуля к лиганду. Считывание может быть визуально детектируемым, например, флуорогенное считывание, такое как, например, Broccoli, или может быть считыванием на основе рибопереключателя или считыванием на основе олигонуклеотида, как описано далее в данном документе.
Термин спиральный домен относится к двум или более полинуклеотидам, которые удерживаются вместе, например, водородными связями, связями Хугстина или обратными связями Хугстина, образуя, таким образом, структуру двойной спирали или тройной спирали.
Термин шпильковидный домен относится к способности полинуклеотида образовывать пару с самим собой, так что 5' конец и 3' конец полинуклеотида приближаются друг к другу и соединены негибридизующейся частью полинуклеотида, которая образует петлевую структуру.
Термин стык олигонуклеотидов относится к двум, трем, четырем или пяти участкам остова, которые образуют сайт связывания лиганда, например сайт связывания Gua (см., например, фиг. 1).
Термин библиотека олигонуклеотидов относится к совокупности синтетических олигонуклеотидных последовательностей, каждая из которых содержит структурный остов по данному изобретению, при этом каждый структурный остов включает в себя, по меньшей мере, спиральный домен, первый и второй шпильковидные домены и стык олигонуклеотидов, который содержит лиганд-связывающий домен.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления предлагаются анализы для скрининга лигандов или тестируемых соединений, которые связываются с биосенсором по данному изобретению. Тестируемые соединения по данному изобретению могут быть получены с использованием любого из многочисленных подходов в способах комбинаторных библиотек, известных в данной области, включая биологические библиотеки; пространственно адресуемые параллельные библиотеки твердой фазы или растворимой фазы; методы синтетической библиотеки, требующие деконволюции; метод библиотеки одна гранула - одно соединение; и методы синтетических библиотек с использованием аффинной хроматографии. Подход с биологической библиотекой ограничен пептидными библиотеками, тогда как другие четыре подхода применимы к пептидным, непептидным олигомерным или низкомолекулярным библиотекам соединений (Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145).
Термин нуклеозид относится к молекуле, имеющей пуриновое или пиримидиновое основание, ковалентно связанное с рибозой или дезоксирибозным сахаром. Типичные нуклеозиды включают аденозин, гуанозин, цитидин, уридин и тимидин. Дополнительные иллюстративные нуклеозиды включают инозин, 1-метилинозин, псевдоуридин, 5,6-дигидроуридин, риботимидин, 2N-метилгуанозин и 2,2N,Nдиметилгуанозин (также называемые редкими нуклеозидами). Термин нуклеотид относится к нуклеозиду, имеющему одну или несколько фосфатных групп, связанных в сложноэфирных связях с сахарным фрагментом. Типичные нуклеотиды включают нуклеозидмонофосфаты, дифосфаты и трифосфаты. Термины полинуклеотид и молекула нуклеиновой кислоты используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к полимеру нуклеотидов, соединенных вместе фосфодиэфирной связью между 5' и 3' атомами углерода.
Термин РНК или молекула РНК или молекула рибонуклеиновой кислоты относится к полимеру рибонуклеотидов (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или более рибонуклеотидов). Термин ДНК
- 10 044975 или молекула ДНК или молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты относится к полимеру дезоксирибонуклеотидов. ДНК и РНК могут быть синтезированы естественным путем (например, путем репликации ДНК или транскрипции ДНК соответственно). РНК может быть посттранскрипционно модифицированной. ДНК и РНК также могут быть химически синтезированы. ДНК и РНК могут быть одноцепочечными (то есть оцРНК и оцДНК соответственно) или многоцепочечными (например, двухцепочечными, то есть дцРНК и дцДНК, соответственно). мРНК или матричная РНК - это одноцепочечная РНК, которая определяет аминокислотную последовательность одной или нескольких полипептидных цепей. Эта информация транслируется во время синтеза белка, когда рибосомы связываются с мРНК.
Термин аналог нуклеотида или измененный нуклеотид или модифицированный нуклеотид относится к нестандартному нуклеотиду, включая не встречающиеся в природе рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. Типичные аналоги нуклеотидов модифицированы в любом положении, чтобы изменять определенные химические свойства нуклеотида, но при этом сохраняют способность аналога нуклеотида выполнять свою намеченную функцию. Примеры положений нуклеотида, которые могут быть дериватизированы, включают положение 5, например 5-(2-амино) пропилуридин, 5-бромуридин, 5пропин-уридин, 5-пропенил-уридин и т. д.; положение 6, например 6-(2-амино) пропилуридин; положение 8 для аденозина и/или гуанозина, например, 8-бромгуанозина, 8-хлоргуанозина, 8-фторгуанозина и т. д. Аналоги нуклеотидов также включают деаза-нуклеотиды, например 7-деаза-аденозин; О- и Nмодифицированные (например, алкилированные, например, N6-метиладенозин или другие известные в данной области) нуклеотиды; и другие гетероциклически модифицированные аналоги нуклеотидов, такие как те, которые описаны в Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10 (4): 297-310.
Аналоги нуклеотидов могут также содержать модификации сахарной части нуклеотидов. Например, 2'ОН-группа может быть заменена группой, выбранной из Н, OR, R, F, Cl, Br, I, SH, SR, NH2, NHR, NR2, COOR или OR, при этом R представляет собой замещенный или незамещенный C1-C6 алкил, алкенил, алкинил, арил и др. Другие возможные модификации включают те, которые описаны в патентах США. №№ 5858988 и 6291438.
Фосфатная группа нуклеотида также может быть модифицирована, например, путем замены одного или нескольких атомов кислорода фосфатной группы серой (например, фосфоротиоатами) или путем осуществления других замен, которые позволяют нуклеотиду выполнять его намеченную функцию, такую как описано, например, Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10(2):117-21, Rusckowski et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10(5):333-45, Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11(5): 317-25, Vorobjev et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11(2):77-85, и патенте США № 5684143. Некоторые из указанных выше модификаций (например, модификации фосфатных групп) предпочтительно снижают скорость гидролиза, например, полинуклеотидов, содержащих указанные аналоги in vivo или in vitro.
В некоторых иллюстративных вариантах осуществления метка пригодная для обнаружения может использоваться для обнаружения одного или нескольких олигонуклеотидов и/или полинуклеотидов, описанных в данном документе. Примеры маркеров пригодных для обнаружения включают различные радиоактивные фрагменты, ферменты, простетические группы, флуоресцентные маркеры, люминесцентные маркеры, биолюминесцентные маркеры, металлические частицы, пары белок-связывающий белок, пары белок-антитело и тому подобное. Примеры флуоресцентных белков включают, но не ограничиваются ими, желтый флуоресцентный белок (YFP), зеленый флуоресцентный белок (GFP), голубой флуоресцентный белок (CFP), умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламин, флуоресцеин, дансилхлорид, фикоэритрин и тому подобное. Примеры биолюминесцентных маркеров включают, но не ограничиваются ими, люциферазу (например, бактериальную, светлячка, жука-щелкуна и тому подобное), люциферин, экворин и тому подобное. Примеры ферментных систем, имеющих визуально детектируемые сигналы, включают, но не ограничиваются ими, галактозидазы, глюкоринидазы, фосфатазы, пероксидазы, холинэстеразы и тому подобное. Идентифицируемые маркеры также включают радиоактивные соединения, такие как 125I, 35S, 14C или 3Н. Идентифицируемые маркеры коммерчески доступны из различных источников.
Флуоресцентные метки и их прикрепление к нуклеотидам и/или олигонуклеотидам описаны во многих обзорах, включая Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Ninth Edition (Molecular Probes, Inc., Eugene, 2002); Keller and Manak, DNA Probes, 2nd Edition (Stockton Press, New York, 1993); Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); and Wetmur, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26:227-259 (1991). Конкретные методологии, применимые к данному изобретению, раскрыты в следующем наборе ссылок: патенты США № 4757141, 5151507 и 5091519. В одном аспекте один или несколько флуоресцентных красителей используются в качестве меток для меченых последовательностей-мишеней, например, как описано в патенте США № 5188934 (4,7-дихлорфлуоресцеиновые красители); патенте США 5366860 (спектрально разрешимые родаминовые красители); патенте США № 5847162 (4,7-дихлорородаминовые красители); патенте США № 4318846 (эфиро-замещенные флуоресцеиновые красители); патенте США № 5800996 (красители с переносом энергии); Lee et al.: патенте США № 5066580 (ксантиновые красители); патенте США № 5688648 (красители с переносом энергии); и тому подобном. Мечение также может быть выпол- 11 044975 нено с помощью квантовых точек, как раскрыто в следующих патентах и патентных публикациях: патенты США № 6322901, 6576291, 6423551, 6251303, 6319426, 6426513, 6444143, 5990479, 6207392, 2002/0045045 и 2003/0017264. Используемый в данном документе термин флуоресцентная метка включает сигнальный фрагмент, который передает информацию через свойства флуоресцентного поглощения и/или излучения одной или нескольких молекул. Такие флуоресцентные свойства включают интенсивность флуоресценции, время жизни флуоресценции, характеристики спектра излучения, перенос энергии и тому подобное.
Термин олигонуклеотид относится к короткому полимеру нуклеотидов и/или аналогов нуклеотидов. Термин аналог РНК или аналог ДНК относится к полинуклеотиду (например, химически синтезированному полинуклеотиду), имеющему, по меньшей мере, один измененный или модифицированный нуклеотид по сравнению с соответствующей неизмененной или немодифицированной ДНК или РНК, но сохраняющим такую же или сходную природу или функцию как соответствующие неизмененные или немодифицированные ДНК или РНК. Как обсуждалось выше, олигонуклеотиды могут быть связаны связями, которые приводят к более низкой скорости гидролиза аналогов РНК или ДНК по сравнению с молекулой РНК или ДНК с фосфодиэфирными связями. Например, нуклеотиды аналога могут включать метилендиоловые, этилендиоловые, оксиметилтио, оксиэтилтио, оксикарбонилокси, фосфородиамидатные, фосфороамидатные и/или фосфоротиоатные связи. Предпочтительные аналоги РНК или ДНК включают рибонуклеотиды и/или дезоксирибонуклеотиды, модифицированные по сахару и/или остову. Такие изменения или модификации могут, кроме того, включать добавление ненуклеотидного материала, например, к концу(ам) РНК или ДНК или внутри (у одного или нескольких нуклеотидов РНК или ДНК).
Используемый в данном документе термин выделенная РНК или выделенная ДНК относится к молекулам РНК или ДНК, которые по существу не содержат другого клеточного материала или культуральной среды, если они получены рекомбинантными методами, или по существу не содержат химических предшественников или других химических веществ, когда химически синтезируется.
Термин in vitro имеет общепризнанное в данной области значение, например, включая очищенные реагенты или экстракты, например клеточные экстракты. Термин in vivo также имеет общепризнанное в данной области значение, например, включающий живые клетки, например, иммортализованные клетки, первичные клетки, клеточные линии и/или клетки в организме.
Используемый в данном документе термин трансген относится к любой молекуле нуклеиновой кислоты, которая вставляется искусственным путем в клетку и становится частью генома организма, который развивается из клетки. Такой трансген может включать ген, который является частично или полностью гетерологичным (то есть чужеродным) для трансгенного организма, или может представлять собой ген, гомологичный эндогенному гену организма. Термин трансген также означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая включает одну или несколько выбранных последовательностей нуклеиновой кислоты, например ДНК, которые кодируют один или несколько сконструированных предшественников РНК, которые должны экспрессироваться в трансгенном организме, например животном, которые частично или полностью гетерологичны, т. е. чужеродны, указанному трансгенному животному или гомологичны эндогенному гену трансгенного животного, но предназначены для встраивания в геном животного в месте, отличном от места природного гена. Трансген включает один или несколько промоторов и любую другую ДНК, такую как интроны, необходимые для экспрессии выбранной последовательности нуклеиновой кислоты, все они функционально связаны с выбранной последовательностью и могут включать энхансерную последовательность.
Ген, вовлеченный в заболевание или расстройство, включает ген, нормальная или аберрантная экспрессия или функция которого воздействует на или вызывает заболевание или расстройство, или, по меньшей мере, один симптом указанных заболевания или расстройства.
Используемый в данном документе термин образец популяции относится к совокупности индивидуумов, включающей статистически значимое число индивидуумов.
Например, образец популяции может включать 50, 75, 100, 200, 500, 1000 или более индивидуумов. В конкретных вариантах осуществления образец популяции может включать индивидуумов, которые имеют, по меньшей мере, общий фенотип заболевания (например, расстройство с усилением функции) или мутацию (например, мутацию с усилением функции).
Используемый в данном документе термин гетерозиготность относится к фракции индивидуумов в популяции, которые являются гетерозиготными (например, содержат два или более различных аллелей) в конкретном локусе (например, в ОНП). Гетерозиготность может быть рассчитана для популяции образцов с использованием методов, которые хорошо известны специалистам в данной области.
Фраза исследование функции гена в клетке или организме относится к тестированию или изучению возникающей из этого экспрессии, активности, функции или фенотипа.
Используемый в данном документе термин редкий нуклеотид относится к встречающемуся в природе нуклеотиду, который встречается редко, включая встречающиеся в природе дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды, которые встречаются редко, например, встречающийся в природе рибонуклеотид, который не является гуанозином, аденозином, цитозином или уридином. Примеры редких нуклеотидов включают, но не ограничиваются ими, инозин, 1-метилинозин, псевдоуридин, 5,6-дигидроуридин,
- 12 044975 риботимидин, 2К-метилгуанозин и 2,2К,К-диметилгуанозин.
Термин сконструированный, как в сконструированном предшественнике РНК, или сконструированной молекуле нуклеиновой кислоты, указывает на то, что предшественник или молекула не обнаружены в природе, поскольку вся или часть последовательности нуклеиновой кислоты предшественника или молекулы создается или выбирается человеком. После создания или селекции последовательность может быть реплицирована, транслирована, расшифрована или иным образом обработана с помощью механизмов внутри клетки. Таким образом, предшественник РНК, продуцируемый в клетке из трансгена, который включает сконструированную молекулу нуклеиновой кислоты, представляет собой сконструированный предшественник РНК.
Используемый в данном документе термин сила связи или сила пары оснований относится к силе взаимодействия между парами нуклеотидов (или нуклеотидных аналогов) на противоположных цепях олигонуклеотидного дуплекса, обусловленных, главным образом, H-связыванием, Ван-дер-Ваальсовыми взаимодействиями и тому подобному между указанными нуклеотидами (или аналогами нуклеотидов).
Используемый в данном документе термин дестабилизирующий нуклеотид относится к первому нуклеотиду или нуклеотидному аналогу, способному образовывать пару оснований со вторым нуклеотидом или нуклеотидным аналогом, таким образом, что указанная пара оснований имеет более низкую прочность связи, чем обычная пара оснований (то есть Уотсон-Криковская пара оснований). В некоторых вариантах осуществления дестабилизирующий нуклеотид способен образовывать неправильно спаренную пару оснований со вторым нуклеотидом. В других вариантах осуществления дестабилизирующий нуклеотид способен образовывать нестабильную пару оснований со вторым нуклеотидом. В еще других вариантах осуществления дестабилизирующий нуклеотид способен образовывать неоднозначную пару оснований со вторым нуклеотидом. В еще одном варианте осуществления дестабилизирующий нуклеотид способен образовывать выпуклость, при этом дестабилизирующий нуклеотид не спаривается со вторым нуклеотидом.
Используемый в данном документе термин пара оснований относится к взаимодействию между парами нуклеотидов (или нуклеотидных аналогов) на противоположных цепях олигонуклеотидного дуплекса, главным образом через H-связи, ван-дер-Ваальсовские взаимодействия и тому подобное между указанными нуклеотидами (или нуклеотидными аналогами). Используемый в данном документе термин прочность связи или прочность пары оснований относится к прочности пары оснований.
Используемый в данном документе термин неправильно спаренная пара оснований относится к паре оснований, состоящей из некомплементарных или не Уотсон-Криковских пар оснований, например, ненормальных комплементарных пар оснований G:C, A:T или A:U. Используемый в данном документе термин неоднозначная пара оснований (также известный как недискриминационная пара оснований) относится к паре оснований, образованной универсальным нуклеотидом.
Используемый в данном документе термин универсальный нуклеотид (также известный как нейтральный нуклеотид) включает те нуклеотиды (например, определенные дестабилизирующие нуклеотиды), которые имеют основание (универсальное основание или нейтральное основание), которое существенно не различает основания на комплементарный полинуклеотид при образовании пары оснований. Универсальные нуклеотиды являются преимущественно гидрофобными молекулами, которые могут эффективно упаковываться в антипараллельные дуплексные нуклеиновые кислоты (например, двухцепочечную ДНК или РНК) из-за стекинговых взаимодействий. Основания универсальных нуклеотидов обычно содержат азотсодержащий ароматический гетероциклический фрагмент.
Используемые в данном документе термины достаточная комплементарность или достаточная степень комплементарности означают, что олигонуклеотидная последовательность является достаточно комплементарной для связывания желаемого целевого олигонуклеотида.
Различные методологии данного изобретения включают в себя этап, который включает в себя сравнение значения, уровня, признака, характеристики, свойства и т. д. с подходящим контролем, называемым в данном документе взаимозаменяемо как соответствующий контроль. Подходящий контроль или соответствующий контроль - это любой контроль или стандарт, знакомый специалисту в данной области техники, полезный для целей сравнения. В одном варианте осуществления, подходящий контроль или соответствующий контроль представляет собой значение, уровень, особенность, характеристику, свойство и т.д. определяемые до выполнения методики, как описано в данном документе. Например, скорость транскрипции, уровень мРНК, скорость трансляции, уровень белка, биологическая активность, характеристика или свойство клетки, генотип, фенотип и т. д. могут быть определены до введения синтетического РНК или ДНК-агента по данному изобретению в клетку или организм. В другом варианте осуществления подходящий контроль или соответствующий контроль представляет собой значение, уровень, признак, характеристику, свойство и т.д., определенные в клетке или организме, например, в контрольной или нормальной клетке или организме, демонстрирующих, например, нормальные черты. В еще одном варианте осуществления подходящий элемент управления или соответствующий элемент управления представляет собой предварительно определенное значение, уровень, особенность, характеристику, свойство и т.д.
Синтетические РНК или ДНК-агенты по данному изобретению могут быть непосредственно введе- 13 044975 ны в клетку (то есть внутриклеточно) или введены внеклеточно в полость, интерстициальное пространство, в кровообращение организма, введены орально или могут быть введены путем погружения клетки или организма в раствор, содержащий нуклеиновую кислоту. Сосудистая или внесосудистая циркуляция, кровеносная или лимфатическая система и спинномозговая жидкость представляют собой места, в которые можно вводить синтетические РНК или ДНК-агенты.
Синтетические РНК или ДНК-агенты по данному изобретению могут быть введены с использованием способов доставки нуклеиновых кислот, известных в данной области, включая инъекцию раствора, содержащего нуклеиновую кислоту, бомбардировку частицами, покрытыми РНК-агентом, погружение клетки или организма в растворе РНК-агента, или электропорация клеточных мембран в присутствии РНК-агента. Могут быть использованы другие способы, известные в данной области, для введения нуклеиновых кислот в клетки, такие как транспорт, опосредованный липидами, химически-опосредованный транспорт и катионная липосомная трансфекция, такая как с помощью фосфата кальция, и тому подобное. Синтетической РНК или ДНК - агент может быть введен вместе с другими компонентами, которые выполняют одно или более из следующих действий: усиливают поглощение нуклеиновой кислоты в клетке или иным образом усиливают ингибирование гена - мишени.
Физические способы введения нуклеиновых кислот включают инъекцию раствора, содержащего биосенсор, бомбардировку частицами, покрытыми биосенсором, погружение клетки или организма в растворе биосенсора или электропорацию клеточных мембран в присутствии биосенсора. Вирусная конструкция, упакованная в вирусную частицу, должна обеспечивать как эффективное введение экспрессирующей конструкции в клетку, так и транскрипцию РНК, кодируемой этой экспрессирующей конструкцией. Могут быть использованы другие способы, известные в данной области, для введения нуклеиновых кислот в клетки, такие как транспорт, опосредованный липидами, транспорт, опосредованный химическими веществами, такими как фосфат кальция и тому подобное. Таким образом, РНК может быть введена вместе с компонентами, которые выполняют одну или несколько из следующих активностей: усиливают поглощение РНК клеткой, ингибируют отжиг отдельных цепей, стабилизируют отдельные цепочки или иным образом увеличивают ингибирование гена-мишени.
Синтетический РНК или ДНК-агент может быть непосредственно введен в клетку (т.е. внутриклеточно) или введен внеклеточно в полость, интерстициальное пространство, в кровообращение организма, введен орально или может быть введен путем погружения клетки или организма в раствор, содержащий РНК или ДНК. Сосудистая или внесосудистая циркуляция, кровеносная или лимфатическая система и спинномозговая жидкость представляют собой места, в которые может быть введена РНК или ДНК.
Клетка-мишень может быть из зародышевой линии или соматической, тотипотентной или плюрипотентной, делящейся или неделящейся, паренхимы или эпителия, иммортализованной или трансформированной или тому подобным. Клетка может быть стволовой или дифференцированной клеткой. Дифференцированные типы клеток включают адипоциты, фибробласты, миоциты, кардиомиоциты, клетки эндотелия, нейроны, клетки глии, клетки крови, мегакариоциты, лимфоциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, тучные клетки, лейкоциты, гранулоциты, кератиноцитоциты, хондроциты, остеобласты, остеокласты, гепатоциты и клетки эндокринных или экзокринных желез.
Синтетический РНК или ДНК-агент может быть введен в количестве, которое позволяет доставлять, по меньшей мере, одну копию на клетку. Более высокие дозы (например, по меньшей мере, 5, 10, 100, 500 или 1000 копий на клетку) материала могут привести к более эффективному ингибированию; более низкие дозы также могут быть полезны для конкретных применений.
В иллюстративном аспекте эффективность биосенсора по данному изобретению проверяется на его способность специфически модулировать транскрипцию, трансляцию, альтернативный сплайсинг и/или стабильность мРНК мишени в клетке. Клетки могут быть трансфицированы одним или несколькими биосенсорами, описанными в данном документе. Измеряется избирательное снижение уровня целевой ДНК, целевой РНК (например, мРНК) и/или целевого белка. Уменьшение целевой ДНК, РНК или белка можно сравнить с уровнями целевой ДНК, РНК или белка в отсутствие биосенсора или в присутствии биосенсора, который не нацеливается на ДНК, РНК или белок. Экзогенно введенную ДНК, РНК или белок можно анализировать для целей сравнения. При использовании клеток нейронов, которые, как известно, в некоторой степени устойчивы к стандартным методам трансфекции, может быть желательным введение биосенсоров путем пассивного поглощения.
Лечение/обработка или лечить/обрабатывать в контексте данного описания определяется как применение или введение терапевтического агента (например, синтетического РНК или ДНК-агентов) пациенту или применение или введение терапевтического агента в изолированную ткань, или клеточную линию от пациента, у которого есть заболевание или расстройство, симптом заболевания или расстройства или предрасположенность к заболеванию или расстройству, с целью лечения, исцеления, облегчения, изменения, исправления, улучшения, или воздействия на заболевание или расстройство, симптомы заболевания или расстройства или предрасположенность к заболеванию.
В одном аспекте изобретение относится к способу предотвращения у субъекта заболевания или расстройства путем введения субъекту терапевтического агента (например, синтетических РНК или ДНКагентов или вектора или трансгена, кодирующего их). Субъекты, подверженные риску заболевания, мо- 14 044975 гут быть идентифицированы, например, с помощью любого или комбинации диагностических или прогностических факторов. Введение профилактического средства может происходить до проявления симптомов, характерных для заболевания или расстройства, так что заболевание или расстройство предотвращается или, альтернативно, задерживается в его прогрессировании.
Другой аспект изобретения относится к способам терапевтического лечения субъектов, т.е. к изменению симптомов заболевания или расстройства. В иллюстративном варианте осуществления способ модуляции по данному изобретению включает в себя приведение в контакт клетки, проявляющей расстройство, с терапевтическим агентом (например, синтетическими РНК или ДНК-агентами или вектором или кодирующим их трансгенами), который специфичен для одной или нескольких последовательностей-мишеней, так что достигается специфичное для указанной последовательности взаимодействие с целевой последовательностью. Эти способы могут быть выполнены in vitro (например, путем культивирования клетки с агентом) или, альтернативно, in vivo (например, путем введения агента субъекту).
Что касается как профилактических, так и терапевтических методов лечения, такие методы лечения могут быть специально адаптированы или модифицированы на основе знаний, полученных в области фармакогеномики. Фармакогеномика, как используется в данном документе, относится к применению технологий геномики, таких как сиквенирование генов, статистическая генетика и анализ экспрессии генов, к лекарственным средствам в клинической разработке и на рынке. Более конкретно, термин относится к исследованию того, как гены пациента определяют его или ее реакцию на лекарство (например, фенотип реакции на лекарство или генотип реакции на лекарство). Таким образом, в другом аспекте изобретения предлагаются способы адаптации профилактического или терапевтического лечения индивидуума либо с молекулами гена-мишени по данному изобретению, либо с модуляторами гена-мишени в соответствии с генотипом ответа лекарственного средства этого индивидуума. Фармакогеномика позволяет клиницисту или врачу назначать профилактическое или терапевтическое лечение пациентам, которые получат наибольшую пользу от лечения, и избегать лечения пациентов, которые испытывают токсические побочные эффекты, связанные с лекарственными средствами.
Терапевтические агенты могут быть протестированы на подходящей животной модели. Например, синтетические РНК или ДНК-агенты (или экспрессирующий вектор или трансген, кодирующие их), как описано в данном документе, можно использовать в животной модели для определения эффективности, токсичности или побочных эффектов лечения указанным агентом. Альтернативно, терапевтический агент может быть использован на животной модели для определения механизма действия такого агента. Например, агент можно использовать на животной модели для определения эффективности, токсичности или побочных эффектов лечения таким агентом. Альтернативно, агент может быть использован в животной модели для определения механизма действия такого агента.
Фармацевтическую композицию, содержащую синтетические РНК или ДНК-агенты по данному изобретению, можно вводить любому пациенту, у которого диагностировано или имеется риск развития расстройства. В одном варианте осуществления пациенту поставлен диагноз расстройства, и в целом у пациента хорошее состояние здоровья. Например, пациент не смертельно болен, и пациент, скорее всего, проживет не менее 2, 3, 5 или более лет после постановки диагноза. Пациент может лечиться сразу после постановки диагноза, или лечение может быть отложено до тех пор, пока у пациента не появятся более изнурительные симптомы. В другом варианте осуществления пациент не достиг продвинутой стадии заболевания.
Синтетический РНК или ДНК-агент можно вводить в стандартной дозе менее чем около 1,4 мг на кг массы тела или менее чем 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001 0,00005 или 0,00001 мг на кг массы тела и менее чем 200 нмоль РНК-агента (например, около 4,4х1016 копий) на кг массы тела или менее чем 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7,5, 1,5, 0,75, 0,15, 0,075, 0,015, 0,0075, 0,0015, 0,00075, 0,00015 нмоль синтетических РНК или ДНК-агентов на кг массы тела. Единичная доза, например, может быть введена путем инъекции (например, внутривенно или внутримышечно, интратекально или непосредственно в мозг), вдыхаемой дозы или местного применения. Особенно предпочтительные дозировки составляют менее 2, 1 или 0,1 мг/кг массы тела.
Доставка синтетических РНК или ДНК-агентов непосредственно в орган может осуществляться в дозировке порядка от 0,00001 мг до 3 мг на орган или предпочтительно около 0,0001-0,001 мг на орган, около 0,03-3,0 мг на орган, около 0,1-3,0 мг на глаз или около 0,3-3,0 мг на орган. Дозировка может представлять собой количество, эффективное для лечения или предотвращения расстройства. В одном варианте осуществления единичная доза вводится реже, чем один раз в день, например, реже, чем каждые 2, 4, 8 или 30 дней. В другом варианте осуществления единичная доза не вводится с частотой (например, не с регулярной частотой). Например, единичная доза может вводиться однократно. В одном варианте осуществления эффективная доза вводится другими традиционными терапевтическими способами.
В одном варианте осуществления субъекту вводят начальную дозу и одну или несколько поддерживающих доз синтетических РНК или ДНК-агентов. Поддерживающая доза или дозы обычно ниже начальной дозы, например, на половину ниже начальной дозы. Поддерживающий режим может включать в себя лечение субъекта дозой или дозами в интервале от 0,01 мг до 1,4 мг/кг массы тела в день, например, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, или 0,00001 мг на кг массы тела в день. Поддерживающие дозы предпочтительно
- 15 044975 вводить не чаще одного раза в 5, 10 или 30 дней. Кроме того, схема лечения может длиться в течение периода времени, который будет варьироваться в зависимости от природы конкретного заболевания, его тяжести и общего состояния пациента. В предпочтительных вариантах осуществления дозировка может доставляться не более одного раза в день, например, не более одного раза в 24, 36, 48 или более часов, например, не более одного раза в 5 или 8 дней. После лечения пациент может быть проверен на предмет изменений в его состоянии и для облегчения симптомов болезненного состояния. Дозировка соединения может быть либо увеличена в случае, если пациент не реагирует значительно на текущие уровни дозировки, либо доза может быть уменьшена, если наблюдается ослабление симптомов болезненного состояния, если болезненное состояние было устранено, или если наблюдаются нежелательные побочные эффекты.
Эффективная доза может быть введена в одной дозе или в двух или более дозах, как желательно или считается целесообразным в конкретных обстоятельствах. При желании для облегчения повторных или частых инфузий может быть целесообразно имплантировать устройство доставки, например, насос, полупостоянный стент (например, внутривенный, внутрибрюшинный, внутрицистернальный или внутрикапсулярный) или резервуар. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция включает множество видов синтетических РНК или ДНК-агентов. В другом варианте осуществления синтетические виды РНК или ДНК-агентов имеют последовательности, которые не перекрываются и не соседствуют с другими видами по отношению к встречающейся в природе последовательности-мишени. В другом варианте осуществления множество видов синтетических РНК или ДНК-агентов является специфическим для различных встречающихся в природе мишеней. В другом варианте осуществления множество видов синтетических РНК или ДНК-агентов нацелены на две или более последовательностеймишеней (например, две, три, четыре, пять, шесть или более последовательностей-мишеней).
После успешного лечения, может быть желательно, чтобы пациент прошел поддерживающую терапию для предотвращения рецидива болезненного состояния, в котором соединение по данному изобретению вводят в поддерживающих дозах, в пределах от 0,01 мкг до 100 г на кг массы тела (см. патент США № 6107094).
Концентрация композиции синтетических РНК или ДНК-агентов представляет собой количество, достаточное для того, чтобы быть эффективным для лечения или предотвращения расстройства или для регулирования физиологического состояния у людей. Концентрация или количество вводимого синтетического РНК или ДНК-агента будет зависеть от параметров, определенных для агента, и способа введения, например, назального, буккального или легочного. Например, назальные составы, как правило, требуют гораздо более низких концентраций некоторых ингредиентов, чтобы избежать раздражения или жжения носовых ходов. Иногда желательно разбавить пероральную композицию до 10-100 раз, чтобы получить подходящую назальную композицию.
Определенные факторы могут влиять на дозировку, необходимую для эффективного лечения субъекта, включая, но не ограничиваясь этим, тяжесть заболевания или расстройства, предшествующее лечение, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и другие имеющиеся заболевания. Кроме того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством синтетического РНК или ДНК-агента может включать однократное лечение или, предпочтительно, может включать серию применений лечения. Также следует понимать, что эффективная дозировка синтетического РНК или ДНК-агента для лечения может увеличиваться или уменьшаться в ходе определенного лечения.
Изменения в дозировке могут возникать и становиться очевидными из результатов диагностических анализов, как описано в данном документе. Например, субъект может наблюдаться после введения композиции синтетического РНК или ДНК-агента. На основании информации, полученной в результате мониторинга, можно вводить дополнительное количество композиции синтетического РНК или ДНКагента.
Дозирование зависит от тяжести и чувствительности болезненного состояния, подлежащего лечению, с курсом лечения, который длится от нескольких дней до нескольких месяцев, или до тех пор, пока не произойдет излечение или не будет достигнуто облегчение болезненного состояния. Оптимальные графики дозирования могут быть рассчитаны на основе измерений накопления лекарственного средства в организме пациента. Специалисты могут легко определить оптимальные дозировки, методики дозирования и частоту повторения. Оптимальные дозы могут варьироваться в зависимости от относительной активности отдельных соединений и, как правило, могут быть оценены на основе ЕС50, которые оказались эффективными в моделях на животных in vitro и in vivo.
Данное изобретение относится к применению описанных выше средств для профилактического и/или терапевтического лечения, как описано ниже. Соответственно, модуляторы (например, синтетические РНК или ДНК-агенты) по данному изобретению могут быть включены в фармацевтические композиции, подходящие для введения. Такие композиции обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, белок, антитело или модулирующее соединение и фармацевтически приемлемый носитель. Используемый в данном документе термин фармацевтически приемлемый носитель подразумевает включение любых и всех растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических и задерживающих абсорбцию агентов и тому подобного, совместимых с фарма- 16 044975 цевтическим введением. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. За исключением тех случаев, когда любые обычные среды или агент несовместимы с указанным активным соединением, предполагается использование их в композициях. В композиции также могут быть включены дополнительные активные соединения.
Фармацевтическая композиция по данному изобретению составлена так, чтобы она была совместимой с предполагаемым путем введения. Примеры путей введения включают парентеральное, например, внутривенное (ВВ), внутрикожное, подкожное (ПК или SQ), внутрибрюшинное, внутримышечное, оральное (например, ингаляционное), трансдермальное (местное) и трансмукозальное введение. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного или подкожного применения, могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, физиологический раствор, жирные масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатообразующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для регулирования тонуса, такие как хлорид натрия или декстроза. рН можно регулировать кислотами или основаниями, такими как соляная кислота или гидроксид натрия. Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или многоразовые флаконы из стекла или пластика.
Фармацевтические композиции, пригодные для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы (в случае наличия водорастворимости) или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных растворов для инъекций или дисперсии. Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический солевой раствор, бактериостатическую воду, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) или забуференный фосфатом физиологический раствор (ФСБ). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть жидкой до такой степени, чтобы ее можно было легко вводить в шприц. Она должна быть стабильной при условиях производства и хранения и должна предохраняться против загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси. Должную текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Предотвращения действия микроорганизмов можно достичь с помощью различных антибактериальных и противогрибных агентов, например парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и тому подобного. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит, хлорид натрия. Длительное всасывание инъекционных композиций может быть достигнуто путем включения в состав агента, который задерживает всасывание, например моностеарата алюминия и желатина.
Стерильные инъекционные растворы могут быть получены путем включения активного соединения в требуемом количестве в подходящем растворителе с использованием одного или комбинации ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости с последующей стерилизацией путем фильтрации. Как правило, дисперсии готовят путем включения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и необходимые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и сублимационная сушка, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из его предварительно стерильно отфильтрованного раствора.
Пероральные композиции обычно включают инертный разбавитель или съедобный носитель. Они могут быть заключены в желатиновые капсулы или спрессованы в таблетки. Для целей перорального терапевтического введения активное соединение можно вводить с вспомогательными веществами и использовать в форме таблеток, пастилок или капсул. Пероральные композиции также могут быть получены с использованием жидкого носителя для использования в качестве полоскания для рта, при этом соединение в жидком носителе применяют перорально и полощут, отхаркивают или проглатывают. В состав композиции могут быть включены фармацевтически совместимые связывающие агенты и/или адъювантные материалы. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и тому подобное могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединений аналогичной природы: связующее, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; эксципиент, такой как крахмал или лактоза, дезинтегрирующий агент, такой как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния или стеротес; глидант, такой как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как мята перечная, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор.
Для введения путем ингаляции соединения доставляются в форме аэрозольного спрея из находящегося под давлением контейнера или дозатора, который содержит подходящий пропеллент, например газ, такой как диоксид углерода, или распылитель.
- 17 044975
Системное введение также может осуществляться трансмукозальным или трансдермальным способом. Для трансмукозального или трансдермального введения в составе используют пенетранты, соответствующие барьеру, через который необходимо проникнуть. Такие пенетранты обычно известны в данной области и включают, например, для трансмукозального введения, детергенты, соли желчных кислот и производные фузидовой кислоты. Трансмукозальное введение может быть осуществлено с использованием назальных спреев или суппозиториев. Для трансдермального введения активные соединения включают в состав мазей, бальзамов, гелей или кремов, как общеизвестно в данной области.
Соединения также могут быть получены в виде суппозиториев (например, с обычными основаниями для суппозиториев, такими как масло какао и другие глицериды) или в виде удерживающих клизм для ректальной доставки.
Синтетический РНК или ДНК-агент также можно вводить путем трансфекции или инфекции с использованием способов, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, способы, описанные в McCaffrey et al. (2002), Nature, 418(6893), 38-9 (гидродинамическая трансфекция); Xia et al. (2002), Nature Biotechnol., 20 (10), 1006-10 (вирус-опосредованная доставка); или Putnam (1996), Am. J. Health Syst. Pharm. 53 (2), 151-160, ошибка в Am. J. Health Syst. Pharm. 53(3), 325 (1996).
Синтетический РНК или ДНК-агент также можно вводить любым способом, подходящим для введения агентов на основе нуклеиновой кислоты, таких как ДНК-вакцина. Эти способы включают в себя генные пистолеты (gene gun), биоинжекторы и кожные пластыри, а также безыгольные методы, такие как технология ДНК-вакцин на основе микрочастиц, раскрытая в патенте США № 6194389 и трансдермальной безыгольной вакцинации млекопитающих вакциной в форме порошка, как описано в патенте США № 6168587. Кроме того, возможна интраназальная доставка, как описано, среди прочего, в Hamajima et al. (1998), Clin. Immunol. Immunopathol., 88(2), 205-10. Липосомы (например, как описано в патенте США № 6472375) и микроинкапсулирование также могут быть использованы. Также можно использовать биоразлагаемые нацеленные системы доставки микрочастиц (например, как описано в патенте США № 6471996).
В одном варианте осуществления активные соединения получают с носителями, которые будут защищать соединение от быстрого выведения из организма, такими как состав с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Могут использоваться биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Специалистам в данной области техники будут очевидны способы получения таких составов. Материалы также могут быть получены коммерчески от Alza Corporation и Nova Pharmaceuticals, Inc. Липосомные суспензии (включая липосомы, нацеленные на инфицированные клетки с помощью моноклональных антител к вирусным антигенам) также могут быть использованы в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области, например, как описано в патенте США № 4522811.
Особенно предпочтительно составлять пероральные или парентеральные композиции в стандартной лекарственной форме для удобства введения и единообразия дозировки. Используемая в данном документе стандартная лекарственная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для объекта, подлежащего лечению; причем каждая единица содержит предопределенное количество активного соединения, рассчитанное для получения целевого терапевтического эффекта в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификация дозированных лекарственных форм по данному изобретению продиктована и напрямую зависит от уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который должен быть достигнут, а также от ограничений, присущих искусству приготовления такого активного соединения для лечения индивидуумов.
Токсичность и терапевтическую эффективность таких соединений можно определить стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, для определения LD50 (доза, летальная для 50% популяции) и ED50 (доза, терапевтически эффективная в 50% популяции). Соотношение доз между токсическим и терапевтическим эффектами является терапевтическим показателем, и его можно выразить как соотношение LD50/ED50. Соединения, которые демонстрируют высокие терапевтические показатели, являются предпочтительными. Хотя могут использоваться соединения, которые проявляют токсические побочные эффекты, следует позаботиться о разработке системы доставки, которая направляет такие соединения на участок пораженной ткани, чтобы минимизировать потенциальное повреждение неинфицированных клеток и, таким образом, уменьшить побочные эффекты.
Данные, полученные из анализов клеточных культур и исследований на животных, могут быть использованы при составлении диапазона дозировок для применения у людей. Дозировка таких соединений предпочтительно находится в диапазоне циркулирующих концентраций, которые включают ED50 с небольшой токсичностью или без нее. Дозировка может варьироваться в этом диапазоне в зависимости от используемой лекарственной формы и используемого пути введения. Для любого соединения, используемого в способе по данному изобретению, терапевтически эффективная доза может быть первоначаль
- 18 044975 но оценена из анализов клеточных культур. Доза может быть составлена на животных моделях для достижения диапазона концентраций в циркулирующей плазме, который включает ЕС50 (то есть концентрацию тестируемого соединения, которая достигает полумаксимального ответа), определенную в культуре клеток. Такая информация может быть использована для более точного определения полезных доз для человека. Уровни в плазме могут быть измерены, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Фармацевтические композиции могут быть включены в контейнер, упаковку или дозатор вместе с необязательными инструкциями для введения.
Как в данном документе определено, что терапевтически эффективное количество синтетического РНК или ДНК-агента (т. е. эффективная дозировка) зависит от выбранного синтетического РНК или ДНК-агента. Например, может вводится однократная доза в диапазоне от около 1 мкг до 1000 мг; в некоторых вариантах осуществления, 10, 30, 100 или 1000 мкг может быть введено. В некоторых вариантах осуществления можно вводить 1-5 г композиций. Композиции можно вводить от одного или нескольких раз в день до одного или нескольких раз в неделю; в том числе один раз в день. Специалист в данной области поймет, что определенные факторы могут влиять на дозировку и сроки, необходимые для эффективного лечения субъекта, включая, помимо прочего, тяжесть заболевания или расстройства, предшествующее лечение, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и наличие других болезней. Кроме того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством синтетического РНК или ДНКагента может включать однократное лечение или, предпочтительно, может включать серию применений лечения.
Молекулы нуклеиновой кислоты по данному изобретению могут быть вставлены в экспрессирующие конструкции, например, вирусные векторы, ретровирусные векторы, экспрессионные кассеты или плазмидные вирусные векторы, например, с использованием методов, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, методы, описанные в Xia et al. (2002), выше. Экспрессирующие конструкции могут быть доставлены субъекту, например, путем ингаляции, перорального введения, внутривенной инъекции, местного введения (см. патент США № 5328470) или путем стереотаксической инъекции (см., например, Chen et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3054-3057). Фармацевтический препарат с вектором доставки может включать вектор в приемлемом разбавителе или может содержать матрицу с медленным высвобождением, в которую встроен носитель для доставки. Альтернативно, когда полный вектор для доставки может быть получен интактным из рекомбинантных клеток, например ретровирусный вектор, фармацевтический препарат может включать одну или несколько клеток, которые продуцируют указанную систему доставки генов.
Путь доставки может зависеть от расстройства пациента. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления субъекту можно вводить синтетический РНК или ДНК-агент по данному изобретению путем внутривенного или подкожного введения. В дополнение к синтетическому РНК или ДНК-агенту по данному изобретению пациенту может быть назначена вторая терапия, например, паллиативная терапия и/или терапия, специфичная для заболевания. Вторичная терапия может быть, например, симптоматической (например, для облегчения симптомов), защитной (например, для замедления или остановки прогрессирования заболевания) или восстановительной (например, для реверсирования процесса заболевания).
Как правило, синтетический РНК или ДНК-агент по данному изобретению можно вводить любым подходящим способом. Используемый в данном документе термин местная доставка может относиться к прямому нанесению синтетического РНК или ДНК-агента на любую поверхность тела, включая глаз, слизистую оболочку, поверхности полости тела или на любую внутреннюю поверхность. Составы для местного применения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, спреи и жидкости. Обычные фармацевтические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и тому подобное могут быть необходимыми или желательными. Местное введение также можно использовать в качестве средства для селективной доставки синтетического РНК или ДНК-агента в эпидермис или дерму субъекта или в его специфические слои или в подлежащую ткань.
Композиции для интратекального или внутрижелудочкового введения могут включать стерильные водные растворы, которые также могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки. Композиции для интратекального или внутрижелудочкового введения предпочтительно не включают реагент для трансфекции или дополнительный липофильный фрагмент, кроме, например, липофильного фрагмента, присоединенного к синтетическому РНК или ДНК-агенту.
Композиции для парентерального введения могут включать стерильные водные растворы, которые также могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки. Внутрижелудочковая инъекция может быть облегчена внутрижелудочковым катетером, например, прикрепленным к резервуару. Для внутривенного применения следует контролировать общую концентрацию растворенных веществ, чтобы сделать препарат изотоническим.
Синтетический РНК или ДНК-агент по данному изобретению может быть введен субъекту путем легочной доставки. Композиции для доставки в легкие могут быть доставлены путем вдыхания дисперсии, так что композиция в дисперсии может достигать легкого, при этом она может легко всасываться
- 19 044975 через альвеолярную область непосредственно в кровообращение. Легочная доставка может быть эффективной как для системной доставки, так и для локальной доставки для лечения заболеваний легких.
Легочная доставка может быть достигнута различными подходами, включая использование распыленных, аэрозольных, мицеллярных и сухих порошковых составов. Доставка может быть достигнута с помощью жидких распылителей, аэрозольных ингаляторов и устройств для диспергирования сухого порошка. Приборы с измерением дозы являются предпочтительными. Одним из преимуществ использования распылителя или ингалятора является то, что вероятность загрязнения сведена к минимуму, поскольку устройства являются автономными. Устройства для диспергирования сухого порошка, например, доставляют лекарства, которые могут быть легко приготовлены в виде сухих порошков. Композиция синтетического РНК или ДНК-агента может стабильно храниться в виде лиофилизированных или высушенных распылением порошков сама по себе или в сочетании с подходящими порошковыми носителями. Доставка композиции для ингаляции может быть опосредована элементом времени дозирования, который может включать в себя таймер, счетчик дозы, устройство измерения времени или индикатор времени, который при включении в устройство обеспечивает отслеживание дозы, контроль соблюдения режима и/или инициацию введения дозы пациенту во время приема аэрозольного лекарственного средства.
Типы фармацевтических наполнителей, которые могут быть использованы в качестве носителей, включают стабилизаторы, такие как человеческий сывороточный альбумин (HSA - Human Serum Albumin), наполнители, такие как углеводы, аминокислоты и полипептиды; регуляторы pH или буферы; соли, такие как хлорид натрия; и тому подобное. Эти носители могут быть в кристаллической или аморфной форме или могут быть смесью двух.
Наполнители, которые являются особенно ценными, включают совместимые углеводы, полипептиды, аминокислоты или их комбинации. Подходящие углеводы включают моносахариды, такие как галактоза, D-манноза, сорбоза и тому подобное; дисахариды, такие как лактоза, трегалоза и т п.; циклодекстрины, такие как 2-гидроксипропил-в-циклодекстрин; и полисахариды, такие как рафиноза, мальтодекстрины, декстраны и тому подобное; альдиты, такие как маннит, ксилит и тому подобное. Предпочтительная группа углеводов включает лактозу, трегалозу, рафинозу, мальтодекстрины и маннит. Подходящие полипептиды включают аспартам. Аминокислоты включают аланин и глицин, причем глицин является предпочтительным.
Подходящие регуляторы pH или буферы включают органические соли, полученные из органических кислот и оснований, таких как цитрат натрия, аскорбат натрия и тому подобное; цитрат натрия является предпочтительным.
Синтетический РНК или ДНК-агент по данному изобретению можно вводить пероральной и назальной доставкой. Например, лекарственные средства, вводимые через эти мембраны, имеют быстрое начало действия, обеспечивают терапевтические уровни в плазме, избегают эффекта первого прохождения печеночного метаболизма и избегают воздействия лекарственного средства на агрессивную желудочно-кишечную (ЖК) среду. Дополнительные преимущества включают в себя легкий доступ к участкам мембраны, так что лекарство может быть легко нанесено, локализовано и удалено. В одном варианте осуществления синтетический РНК или ДНК-агент, вводимый пероральной или назальной доставкой, был модифицирован, чтобы быть способным преодолевать гематоэнцефалический барьер.
В одном варианте осуществления стандартные дозы или измеренные дозы композиции, которая включает синтетический РНК или ДНК-агенты, дозируются имплантированным устройством. Устройство может включать сенсор, который контролирует параметр у субъекта. Например, устройство может включать в себя насос, такой как осмотический насос и, необязательно, связанную электронику.
Синтетический РНК или ДНК-агент может быть упакован в вирусный природный капсид или в химически или ферментативно полученный искусственный капсид или полученную из него структуру.
В некоторых других аспектах изобретение обеспечивает наборы, которые включают подходящий контейнер, содержащий фармацевтическую композицию синтетического РНК или ДНК-агента. В определенных вариантах осуществления отдельные компоненты фармацевтической композиции могут быть предоставлены в одном контейнере. Альтернативно, может быть желательно предоставить компоненты фармацевтической композиции раздельно в двух или более контейнерах, например, в одном контейнере для приготовления синтетического РНК или ДНК-агента и, по меньшей мере, в другом для соединенияносителя. Набор может быть упакован в несколько различных конфигураций, таких как один или несколько контейнеров в одной коробке. Различные компоненты могут быть объединены, например, в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору. Компоненты могут быть объединены в соответствии со способом, описанным в данном документе, например, для приготовления и введения фармацевтической композиции. В комплект также может входить устройство доставки.
Специалистам в данной области техники будет очевидно, что другие подходящие модификации и адаптации описанных в данном документе способов могут быть выполнены с использованием подходящих эквивалентов, не выходя за рамки раскрытых в данном документе вариантов осуществления. После подробного описания некоторых вариантов осуществления, они будут более понятны при ссылке на следующие примеры, которые включены только в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения.
- 20 044975
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, как обычно понимает средний специалист в области, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, могут использоваться при практическом применении или испытании данного изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном документе, включены в качестве ссылки в полном объеме. В случае конфликта данное описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.
Примеры
Пример 1. Использование информации, полученной от биологических РНК для остовов библиотеки для селекции.
Изучение малых биологических РНК с многоспиральной упаковкой (т.е. с третичным свертыванием) выявило две повторяющиеся архитектуры, которые можно считать привилегированными остовами. Первым является псевдоузел Н-типа, который широко обнаруживается в биологических РНК, включая небольшие рибозимные рибосомные элементы остова в вирусных мРНК, а также природные и синтетические аптамеры. Тем не менее, с точки зрения дизайна это свертывание может быть сложно спроектировать. Другой - это тройной стык (3WJ), поддерживаемый удаленным третичным взаимодействием, которое организует спиральное упорядочивание вокруг стыка. Это свертывание больше подходит для разработки устройств на основе РНК, которые включают аптамеры, так как оно позиционирует конструируемый спиральный элемент (называемый спиралью Р1), проксимально по отношению к лигандсвязывающему сайту, типично размещенному в стыке.
В группе с тройным стыком имеется большой выбор потенциальных кандидатов, которые можно использовать для создания исходной библиотеки последовательностей для селекции in vitro. Здесь приведены три примера: аптамерный домен гуанинового рибопереключателя xpt-pbuX В. subtilis (называемый в данном документе GR), аптамерный домен рибопереключателя Vc2 циклического di-GMP Vibrio cholerae (называемый в данном документе как CDG) и рибозим хаммерхэд Schistosoma mansoni (обозначаемый в данном документе как HH) (фиг. 1). В каждом из этих родительских каркасов РНК стык содержит ключевую биологическую активность, в проксимальном положении по отношению к спирали Р1, которая может служить вторичным структурным мостом к домену считывания.
Исходные библиотеки были спроектированы так, чтобы сохранить общую вторичную и третичную структуру остова при рандомизации достаточного количества нуклеотидов в соединении для обеспечения адекватного разнообразия пула, чтобы появились победители (результаты). Все нуклеотиды в соединяющихся цепях стыка были рандомизированы (равные популяции четырех нуклеотидов в каждом положении), также как и, по крайней мере, одна пара оснований в каждой спирали, проксимальной по отношению к стыку (фиг. 1). Для остова GR это дало исходную библиотеку из 23 рандомизированных положений нуклеотидов, что равнялось размеру библиотеки около 7х1013 последовательностей (423 последовательности); CDG и НН содержат сходные уровни разнообразия (21 рандомизированное положение нуклеотидов, что соответствует размеру библиотеки около 4х1012 последовательностей; 421 последовательность). Это количество последовательностей теоретически полностью представлено в исходном пуле РНК с, по меньшей мере, пятикратной избыточностью. Хотя это существенно меньшее разнообразие, чем рекомендуется для типичной селекции, новые аптамеры были получены из начальных пулов с еще более ограниченным выбором вариантов последовательностей.
Три каркаса были интегрированы в кассету библиотеки с особыми конструкционными особенностями. Р1 спираль каждого каркаса, содержащая начальные и конечные основания каркасных последовательностей была заменена во всех библиотеках на сконструированную спираль, содержащую структурированные кассеты амплификации на основе тех, которые были разработаны для химического зондирования структуры РНК с помощью селективного 2'-гидроксил ацилирования анализируемого удлинением праймеров (SHAPE - Selective 2'-Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension) (фиг. 17). Это гарантирует, что константные участки, необходимые для репликации, структурированы и с меньшей вероятностью будут включены в выбранный аптамер. Чтобы дополнительно минимизировать возможность участия константных участков в образовании лиганд-связывающего сайта, спираль Р1 была расширена, по меньшей мере, до десяти пар оснований. Полные последовательности шаблонов ДНК, кодирующих исходные начальные библиотеки, приведены в табл. 1 и на фиг. 23.
- 21 044975
Таблица 1
Последовательности олигонуклеотидов и шаблонов
Олиго | Последовательность |
нукле | |
отид | |
Селекция in vitro | |
Шабл | GCGCGCGAATTCTAATACGACTCACTATAGGACTTCGGTCCAAGCTAATGCACTCNNNNNN |
он | NCGCGTGGATATGGCACGCANNNNNNNNNNGGGCACCGTAAATGTCCNNNNNNGGGT |
библи | G С ATTAG С A A A ATCG G G CTTCG GTCCG GTTC |
отеки | |
GR/SSI |
- 22 044975
IIa | |
Шабл | GCGCGCGAATTCTAATACGACTCACTATAGGACTTCGGTCCTTGGATAGGACTCNNNNNN |
он | NCGCGTGGATATGGCACGCANNNNNNNNNNGGGCACCGTAAATGTCCNNNNNNGGGTC |
библи | СТАТССССА ATCG G G CTTCG GTCCG GTTC |
отеки | |
GR/Gsl | |
Шабл | GCGCGCGAATTCTAATACGACTCACTATAGGACTTCGGTCCTTGGATAGGACANNNNNNN |
он | Ν N САА ACCATTCG AAAG AGTG GGACGNNNNN CCTCCGG ССТА AACCG AAAGGTAG GTAG |
библи | CGGGGNNNNNNN TGTCCTATCCCC AATCG G G CTTCG GTCCG GTTC |
отеки | |
CDG/G | |
si | |
Шабл | GCGCGCGAATTCTAATACGACTCACTATAGGACTTCGGTCCTTGGATAGGAGCNNNNTGG |
он | TATCCAATGAAAATGTACTACCANNNNNNNNNNCCCAAATAGGNNNNNNNGCTCCTATC |
библи | CCCAATCGG G CTTCG GTCCG GTTC |
отеки | |
HH/Gs 1 | |
Прай | G CG CG CG A ATTCTA ATACG ACTC ACT ATAG G ACTTCG GTCC A AG СТА ATG С ACTC |
мер | |
добав | |
ления | |
сайта | |
Т7 | |
ОТ- | GAACCG GACCGAAG CCCG |
ПЦР | |
прайм | |
θΡ | |
Высокоэффективное сиквенирование (HTS) | |
Прай | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGTGTAGCCTAGTCAGTCAGCCGAACCGGACCGA |
мер | AGCCCG |
HTS |
- 23 044975
обрат ного сикве ниров а ния, GR/SSI II | |
Прай мер HTS обрат ного сикве ниров а ния, GR/Gsl | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAACGATAAGTCAGTCAGCCGAACCGGACCGA AGCCCG |
Прай мер HTS обрат ного сикве ниров а ния, CDG/G si | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACCAGGTGTAGTCAGTCAGCCGAACCGGACCGA AGCCCG |
Прай мер HTS обрат ного сикве | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTGTACGGATTAGTCAGTCAGCCGAACCGGACCGA AGCCCG |
- 24 044975
ниров а н ия, HH/Gs 1 | |
Прямо | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATGGTAATTGTGCGCGCGAATTCTAATACGA |
й | CTCACTATAG |
прайм | |
ер для | |
сикве | |
ниров | |
ания | |
ОТ | AGTCAGTCAGCCGAACCGGACCGAAGCCCG |
прайм | |
θΡ | |
Инде к | CGGGCTTCGGTCCGGTTCGGCTGACTGACT |
сирую | |
щий | |
прайм | |
θΡ | |
Кристаллизация | |
5НТР- | GGACACTCTGATGATCGCGTGGATATGGCACGCATTGAATTGTTGGACACCGTAAATGTCC |
II | TAACACGTGTCCA |
Изотермическая калориметрия титрования | |
5HTP-I | GGAGCTAATGCACTCTTAACGCCGCGTGGATATGCACGCAACCGTGAATCGGGCACCGTAA |
аптам | ATTCCGTAAGTGGGTGCATTAGC |
ерь | |
5НТР- | GGCACTCTGATGATCGCGTGGATATGGCACGCATTGAATTGTTGGACACCGTAAATGTCCT |
II | AACACGGGTGCC |
аптам | |
ер | |
5НТР- | GGAGCTAATGCACTCCCATTTTCCGTGGATATGGCACGCTACCGATGTTGGGACCGTAATG |
III | TCCATTACGGGTGCATTAGC |
- 25 044975
аптам ер | |
5НТР- | GGATAGGACTCTCTGGTTCGCGTAGATATGGCACGCAATTGAAGAATGGGCACCGTAAAT |
IV | GTCTGTAGACGGGTCCTATCC |
аптам | |
ер | |
5НТР- | GGATAGGACTCATTCGGCCGCGTGGATATGGCACGCAGGAGATGTGTGGACACCGTAAAT |
V | GTCCGTAGGCGGGTCCTATCC |
аптам | |
ер | |
5НТР- | GGATAGGACTCAACATCTCGCGTGGATATGGCACGCAGACTTCCAGTGGGCACCGTAAAT |
VI | GTCCGTAG ACG G GTCCTATCC |
аптам | |
ер | |
5НТР- | GGATAGGACATGTAATCTCCAAACCATTCGAAAGAGTGGGACGCTAGACCTCCGGCCTAAA |
VII | CCG A A AG GT AG GTAGCGGGG CTAG GTATGTCCTATCC |
аптам | |
ер | |
5НТР- | GGATAGGAGCTGTTTGGTATCCAATGAAAATGTACTACCAACTTGAATCTCCCAAATAGGC |
VIII | TAGGTAGCTCCTATCC |
аптам | |
ер | |
Химическое зондирование SHAPE | |
5НТР- | GGACTTCGGTCCAAGCTAATGCACTCTTAACGCCGCGTGGATATGCACGCAACCGTGAATC |
1, | GG G CACCGTAAATTCCGTAAGTG GGTG CATTAG CAATCG ATCCG GTTCG CCG G ATCCAAAT |
SHAPE | CGGGCTTCGGTCCGGTTC |
5НТР- | GGACTTCGGTCCAAGCTAATGCACTCTGATGATCGCGTGGATATGGCACGCATTGAATTGT |
II, | TGGACACCGTAAATGTCCTAACACGGGTGCATTAGCAATCGATCCGGTTCGCCGGATCCAA |
SHAPE | ATCG G G CTTCG GTCCG GTTC |
5НТР- | GGACTTCGGTCCAAGCTAATGCACTCCCATTTTCCGTGGATATGGCACGCTACCGATGTTGG |
III, | GACCGTAATGTCCATTACGGGTGCATTAGCAAAATCGATCCGGTTCGCCGGATCCAAATCG |
SHAPE | GGCTTCGGTCCGGTTC |
- 26 044975
5HTP- | GGACTTCGGTCCTTGGATAGGACTCTCTGGTTCGCGTAGATATGGCACGCAATTGAAGAAT |
ιν, | GGGCACCGTAAATGTCTGTAGACGGGTCCTATCCAATCGGGCTTCGGTCCGGTTC |
SHAPE | |
5HTP- | GGACTTCGGTCCTTGGATAGGACTCATTCGGCCGCGTGGATATGGCACGCAGGAGATGTG |
V, | TG G ACACCGTAA ATGTCCGTAGG CG G GTCCTATCCAATCG GG CTTCG GTCCG GTTC |
SHAPE | |
5HTP- | GGACTTCGGTCCTTGGATAGGACTCAACATCTCGCGTGGATATGGCACGCAGACTTCCAGT |
VI, | GG G CACCGTAAATGTCCGTAG ACG GGTCCTATCCAATCGG G CTTCG GTCCG GTTC |
SHAPE | |
5HTP- | GGACTTCGGTCCTTGGATAGGACATGTAATCTCCAAACCATTCGAAAGAGTGGGACGCTAG |
VII, | ACCTCCGGCCTAAACCGAAAGGTAGGTAGCGGGGCTAGGTATGTCCTATCCAATCGGGCTT |
SHAPE | CG GTCCG GTTC |
5HTP- | GGACTTCGGTCCTTGGATAGGAGCTGTTTGGTATCCAATGAAAATGTACTACCAACTTGAAT |
VIII, | CTCCCA A ATAG G CTAG GTAG CTCCTATCC A ATCG G G CTTCG GTCCG GTTC |
SHAPE | |
Сенсо | |
P | |
Brocco | |
Ii | |
5HTP | GGACGGAGACGGTCGGGTCATATGATGATCGCGTGGATATGGCACGCATTGAATTGTTGG |
ll/A- | ACACCGTAAATGTCCTAACAATATTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCGTCC |
Brocco | |
Ii | |
5HTP | GGACGGAGACGGTCGGGTCTATAGATGATCGCGTGGATATGGCACGCATTGAATTGTTGG |
ll/U- | ACACCGTAAATGTCCTAACATATATCGAGTAGAGTGTGGGCTCCGTCC |
Brocco | |
Ii | |
5HTP- | GGACGGAGACGGTCGGGTCATATTCTGGTTCGCGTAGATATGGCACGCAATTGAAGAATG |
IV/A- | GGCACCGTAAATGTCTGTAGACATATTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCGTCC |
Brocco | |
Ii | |
5HTP- | GGACGGAGACGGTCGGGTCTATATCTGGTTCGCGTAGATATGGCACGCAATTGAAGAATG |
- 27 044975
IV/U- Вгоссо Ii | GGCACCGTAAATGTCTGTAGACTATATCGAGTAGAGTGTGGGCTCCGTCC |
5НТР- VII/A- Вгоссо Ii | GGACGGAGACGGTCGGGTCATATATATTCGATGTAATCTCCAAACCATTCGAAAGAGTGG G ACG CTAG ACCTCCG G CCTAAACCG AA AGGTAG GTAG CG G GG CTAG GTAGTAG AGTGTG GGCTCCGTCC |
5НТР- VII/U- Вгоссо Ii | GGACGGAGACGGTCGGGTCTATATGTAATCTCCAAACCATTCGAAAGAGTGGGACGCTAG ACCTCCGGCCTAAACCGAAAGGTAGGTAGCGGGGCTAGGTATATATCGAGTAGAGTGTGG GCTCCGTCC |
5НТР- VIII/A- Вгоссо Ii | GG ACG G AG ACG GTCG G GTCATATTGTTTG GTATCCAATG AAAATGTACTACCAACTTG ААТ CTCCCAAATAGGCTAGGTAATATTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCGTCC |
5НТР- VIII/U- Вгоссо Ii | GG ACG G AG ACG GTCG G GTCTATATGTTTG GTATCCAATG AAAATGTACTACCAACTTG ААТ CTCCCAAATAG G CTAGGTATATATCG AGTAG AGTGTGG G CTCCGTCC |
Однократная транскрипция in vitro | |
5НТРIV/риб опере ключи тель pbuE | AATATTGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTAAATAGCTATTA TCAGGATTTTTCTGGTTCGCGTAGATATGGCACGCAATTGAAGAATGGGCACCGTAAATGT CTGTAGACAAAATCCTGATTACAAAATTTGTTTATGACA1 1 1 1 1 1G1 AA 1CAGGA1 1 1 1 1 1 1А TTTATCAAAACATTTAAGTAAAGGAGTTTGTTATG |
а - N, представляет положение, в котором А, С, G и Т присутствуют с вероятностью около 25% каждый.
b - РНК-аптамер и сенсорные/детекторные последовательности приведены в виде их эквивалентных последовательностей ДНК.
Еще одной осложняющей проблемой при селекции остова было низкое качество транскрипции вирусными обратными транскриптазами (ОТ). Разработка ОТ MMLV для улучшения термостабильности и технологичности для создания наиболее часто используемых версий этого фермента снизила ее и без того низкое качество транскрипции. Неверное включение или делеция нуклеотидов в консервативных последовательностях остова легко нарушает третичные взаимодействия, которые стабилизируют всю свернутую структуру. РНК, лишенные структуры, более эффективно амплифицируются с помощью ОТ, что может вносить существенное предрасположенность во время этапа репликации каждого раунда селекции, что отчасти, вероятно, приводит к феномену тирании малых мотивов, наблюдаемому при отборе. Для решения этой проблемы недавно начала применяться ОТ, полученная из мобильного интрона группы II из термофильного Geobacillus stearothermophilus (GsI-IIC-MRF или GsI), которая сохраняет активность до 70°С (по сравнению с 55°С для SSIII) и по своей природе обладает более высоким качеством транскрипции, чем ОТ полученные из MMLV. Для сравнения селекция остова GR была выполнена с использованием ОТ, полученной из MMLV (Superscript III или SSIII) также как и остова GsI.
Пример 2. Селекция с учетом остова против 5НТР дает много потенциальных аптамеров.
Мишенью для селекции был 5-гидрокси-L-триптофан (5НТР; фиг. 2А), непосредственный биосинтетический предшественник серотонина, который был иммобилизован на твердой матрице через его карбоксилатную группу. Было проведено семь раундов селекции с каждой библиотекой, с отбором против L-триптофана и все более строгими процедурами отмывки в поздних раундах. При селекции SSIII применялся обычный протокол SELEX, в котором аффинную колонку тщательно промывали в ранних раун
- 28 044975 дах перед конкурентным элюированием для удаления несвязывающих РНК. Конкурентное элюирование первоначально наблюдалось в четвертом раунде и достигло пика в >50% от общего количества вводимой РНК в шестом раунде. При селекции GsI использовался менее строгий протокол, чем обычно рекомендованный, в котором последние около 10% всей РНК оставленных на колонке при конкурентном элюировании, собирали для амплификации в первых четырех раундах, чтобы сохранить разнообразие последовательностей в пуле, перед тем как увеличить эффективность отмывки. Детали селекции приведены в примерах 6-8 и табл. 2.
Таблица 2
Условия селекции на цикл.
Раунд | [РНК] пмоль | Отмывки* | Заметки |
Выбор SS-111 | |||
1 | 1000 | 3 | Противоселекция против АсО-сефарозы |
2 | 400 | 6 | Противоселекция против АсО-сефарозы |
3 | 400 | 10 | |
4 | 400 | 10 | |
5 | 100 | 10 | |
6 | 100 | 10 | 30-ти секундная противоселекция с использованием 100 мМ L-триптофана |
7 | 100 | 10 | 30-ти секундная противоселекция с использованием 100 мМ L-триптофана |
GsI селекции | |||
1 | 1000 | 3 | Противоселекция против АсО-сефарозы |
2 | 400 | 3 | Противоселекция против АсО-сефарозы |
3 | 400 | 5 | |
4 | 400 | 5 | |
5 | 400 | 10 | |
6 | 200 | 6 | 30-ти секундная противоселекция с использованием 100 мМ L-триптофана |
7 | 200 | 10 | 30-ти секундная противоселекция с использованием 100 мМ L-триптофана |
*Каждая отмывка составляла 3 объема колонки буфера.
При сохранении разнообразия последовательностей и минимизации ранних стохастических событий была использована комбинация сиквенирования следующего поколения (NGS - next generation sequencing) и последующего биоинформационного анализа для выявления потенциальных аптамеров и выяснения ключевых особенностей селекции. Для каждой селекции >200 000 операций чтения были получены для РНК из последнего раунда, и результирующие последовательности были сгруппированы и сгенерированы деревья максимальной похожести. Сравнение выборок SSIII и GsI с использованием остова GR выявило несколько важных особенностей.
Матрикс расстояний селекции GR/SSIII четко показал только несколько изолированных кластеров, и внутри каждого кластера последовательности имеют высокую степень внутренней взаимосвязи (фиг. 2В). Большинство (>80%) последовательностей объединяются в три отдельных семейства, связанных с последовательностями, называемыми 5HTP-I, II и III (фиг. 2D), а оставшиеся кластеризуются в небольшие группы, которые трудно интерпретировать. Это типично для традиционного SELEX, при этом часто идентифицируют отдельные изоляты, и для получения информации о ковариации необходим дальнейший мутагенез и селекция. Напротив, селекция GR/GsI дала более разнообразные кластеры с более высокой выборкой последовательностей, которые заполняют участки между основными кластерами (фиг. 2С и 2D). Селекции CDG и НН с GsI является так же разнообразными по своей последовательности с большим количеством потенциальных аптамеров (фиг. 7). Хотя традиционные подходы к селекции часто основаны на избыточной селекции для облегчения поиска аптамера с ограниченной информацией о последовательности, сохранение разнообразия победителей (выбранных молекул) и анализ последовательно- 29 044975 сти с помощью NGS позволили провести более тщательный анализ моделей консервации и ковариации, что помогло определить консенсусные последовательности аптамера. Аналогичные результаты наблюдались при селекции L-DOPA на GR-каркасе (фиг. 18). Подмножество 250 последовательностей из каждого из кластеров, которые дали подтвержденные 5НТР-аптамеры, описано далее в данном документе.
Неожиданно, в дополнение к ограниченному разнообразию последовательностей селекции SSIII, наблюдалось сильное накопление делеций и точечных мутаций, так что в последнем раунде не было обнаружено никаких последовательностей, сохраняющих полную идентичность константных участков остова. Два из кластеров, 5HTP-I и 5НТР- III (фиг. 2D), имеют делеций в L2 или L3 остова, необходимые для формирования петлевого взаимодействия пуриновых рибопереключателей. Кроме того, члены 5НТРIII содержат несколько точечных делеций, полученных во время селекции, что дает потенциал для кардинально альтернативной вторичной структуры. Анализ минимальной свободной энергии (MFE - minimal free energy) и ковариации этой последовательности позволяют предположить вторичную структуру, согласующуюся с консенсусной последовательностью аптамера L-триптофана (аптамера, который включает двойной стык; Majerfeld & Yarus, Nucleic Acids Research, 2005, 33, 5482-5493), что также указывает на то, что остов не поддерживался в семействе 5НТР- III. 5НТР- II является единственным основным кластером, поддерживающим требования последовательности, необходимые для третичной структуры, встроенной в библиотеку, и является единственной распространенной последовательностью, одинаковой в селекциях SSIII и GsI. В отличие от селекции с использованием SSIII, селекции GsI демонстрировали низкое количество мутаций, накапливающихся в константном участке остова, что указывает на надежное поддержание остова (фиг. 8).
Чтобы идентифицировать последовательности с высоким аптамерным потенциалом, десять наиболее густонаселенных кластеров из каждого пула были индивидуально выровнены, предсказаны структуры MFE и сгенерированы ковариационные модели. Это позволило получить широкое представление о главных консенсусных последовательностях, представленных селекциями. Поскольку эксперимент GR/SSIII дал большое количество селекции, для дальнейшего подтверждения была выбрана наиболее распространенная последовательность из каждого из трех основных кластеров. Для селекций GsI были отобраны доминантные последовательности из одного или нескольких кластеров, консенсусная структура MFE которых соответствовала родительскому остову.
Пример 3. Большинство заполненных кластеров сохраняют архитектуру скаффолдов и связывают 5НТР с высокой селективностью.
Этот структурный остов значительно облегчает подтверждение структурных особенностей и особенностей взаимодействия полученных аптамеров. Химическое зондирование структуры РНК с использованием N-метилизатического ангидрида (NMIA -N-methylisatoic anhydride), по методике называемой 5НАРЕ, демонстрирует, сохранилась ли вторичная и третичная архитектура родительских остовов, а также лиганд-зависимые структурные изменения в аптамере. При селекции GR/SSIII аптамеры 5HTP-I и 5HTP-II имеют локализованные изменения в характере реактивности NMIA в присутствии лиганда в элементах тройного стыка, что согласуется с тем, что это является сайтом связывания лиганда (фиг. 3А, фиг. 19). 5HTP-III, однако демонстрирует изменения вне J2/3 в константных областях, что согласуется с предсказанной структурой и сайтом связывания L-Trp ранее описанного аптамера триптофана (Majerfeld & Yarus). Сохранение GR-каркаса оценивали с использованием уникальной, лиганд-независимого характера реактивности NMIA в L3, который присутствует только при его взаимодействии с L2 (Stoddard et al., RNA, 2008, 14, 675-684). 5HTP-II - единственная последовательность из трех кластеров селекции SSIII, демонстрирующая эту особенность. И наоборот, все протестированные последовательности из селекции GR/GsI имеют этот характер третичной структуры (фиг. 9А и 20). Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что в результате селекции GR/SSIII были получены три различных аптамера, содержащие только 5HTP-II, которые сохраняли структурный остов, в то время как селекция GR/GsI дала много молекул, которые поддерживали остов. Хотя 5НТР-зависимые характеристики для изолятов GR/GsI слабее, чем у 5HTP-II и родительского аптамера, количественная оценка демонстрирует, что они локализуются в стыке аналогичным образом (фиг. 3В). Характеризация с помощью SHAPE селекции CDG/GsI и HH/GsI продемонстрировала лиганд-зависимые изменения для новых классов аптамеров и общую картину реактивности, напоминающую родительский остов (фиг. 9В, 9С, 21 и 22).
Сродство и селективность этих аптамеров в отношении 5НТР и ряда химически сходных соединений оценивали с помощью изотермической калориметрии титрования (ITC-isothermal titration calorimetry). Важно отметить, что для всех протестированных аптамеров 5'- и 3'-кассетные последовательности не требовались для связывания 5НТР, что указывает на успешное конструирование нейтральных последовательностей (фиг. 3С). Некоторые тенденции появляются из этого анализа. Во-первых, оба аптамера, которые не сохраняют родительский остов (5HTP-I, -III), не различают 5НТР и L-триптофан (табл. 3), что является критическим требованием для применений с использованием клеток. Во-вторых, большинство аптамеров, сохраняющих остов с тройным стыком, имеют более высокое сродство к 5НТР, чем аптамеры с разрушенными каркасами, и все они строго исключают L-триптофан. Это указывает на то, что архитектура остова важна для создания селективного связывающего кармана при сохранении аффинностей, сравнимых с другими синтетическими и природными аптамерами, которые связывают ами
- 30 044975 нокислоты. 5HTP-I и 5HTP-III демонстрируют сильную дискриминацию между 5НТР и серотонином, подразумевая, что атомы главной цепи распознаются напрямую. Напротив, многие из аптамеров, которые сохраняют остов, связывают N-метил-5-гидрокси-L-триптофаномид с аффинностью в 2-4 раза выше, чем у 5НТР. Кроме того, они связывают серотонин, продукт декарбоксилирования 5НТР, что указывает на меньшую потребность в атомах основной цепи при связывании (табл. 3). Таким образом, некоторые из этих аптамеров могут быть выдающимися серотониновыми сенсорами. Наиболее впечатляющим из селекций GsI является то, что доминантные аптамеры из каждой селекции, несмотря на разную архитектуру остова, сходятся по очень сходным связывающим аффинностям и профилям селективности, демонстрируя, что тройной стык является надежным и эффективным свертыванием для размещения карманов связывания 5НТР. Вместе эти данные демонстрируют, что различные олигонуклеотидные стыки, такие как варианты архитектуры с тройным стыком, способны найти надежные решения для распознавания 5НТР.
Таблица 3
Сродство аптамеров к 5НТР и родственным соединениям
Последовательность для селекции | 5НТР KD, мкМ а | L-Trp KD, мкМ | Серотонин KD, мкМ | Ме-5НТР KD, мкМ | |
GR/SSIII | 5HTP-I | 33 ± 1 | 41 ± 1 | >1000 | — |
5HTP-II | 3,9 ± 0,1 | 280 ± 30 | 38 ±8 | 26 ±9 | |
5HTP-III | 38 ± 14 | 20 ±5 | >1000 | — | |
GR/Gsl | 5HTP-IV | 8,8 ± 1,5 | 520 ± 90 | 4,7 ±0,3 | 1,3 ± 0,1 |
5HTP-V | 11 ± 1 | 170 ± 10 | 16±4 | 6,6 ± 0,4 | |
5HTP-VI | 60 ± 15 | н/оь | 16±2 | 25 ±8 | |
CDG/Gsl | 5HTP-VII | 9,3 ± 0,3 | н/о | 1,2 ± 0,1 | 2,1 ±0,4 |
НН/GsI | 5HTP-VIII | 7,3 ± 2,8 | н/о | 1,2 ±0,2 | 2,5 ±0,5 |
аВсе измерения проведены при 25°С в 10 мМ MgCl2 - содержащем буфере.
bHe обнаруживается.
Пример 4. Структурный анализ аптамера 5GR-II демонстрирует, что повторяющийся мотив РНК используется для связывания 5НТР.
Чтобы дополнительно продемонстрировать, что описанная в данном документе стратегия селекции с использованием остова сохранила свертывание родительской РНК и выяснить, как РНК может распознавать 5НТР, была определена структура 5HTP-II в комплексе с 5НТР с разрешением 2,0 А (фиг. 30, репрезентативные карты электронной плотности продемонстрированы на фиг. 10, а кристаллографические статистические данные приведены в табл. 4). Эта структура глобально накладывается с родительским аптамером xpt гуанинового рибопереключателя с среднеквадратичным средним значением 6,5 А по всем атомам остова цепи в остатках 19-77, причем основные источники отклонения происходят по причине нахождения Р1 под другим углом по отношению к связывающему карману и вариабельному участку стыка (фиг. 16А-С). В пределах третичного взаимодействия L2-L3 характер взаимодействий основание-основание и геометрия остова практически идентичны между двумя РНК (г. m. s. d. 0,96 А по всем атомам в остатках 31-39, 61-67). Таким образом, остов GR оставался нетронутым, как глобально, так и локально, во время процесса селекции.
- 31 044975
Таблица 4
Кристаллографические данные и статистика уточнения.
Сбор данных Пространственная группа Размеры клетки а, Ь, с (А) а, β, у (°) Разрешение (А) ^sym ИЛИ Rmerge //σ 1 Законченность (%) Избыточность Уточнение Разрешение (А) Количество уникальных отражений | 5HTP-II РНК/5НТР С121 127,55,26,59,63,37 90, 106,32, 90 19,95-2,00(2,07-2,00)* 0,084 (0,191) 11,2 (5,4) 96,2 (73,8) 4,34 (3,65) 18,33 - 2,00 (2,07 - 2,00) 13725 |
^раб. / ^своб. | 21,7/25,8 (20,1/26,0) |
№ атомов | |
РНК | 1513 |
Лиганд/ион | 16/90 |
Вода | 112 |
В -факторы (среднее) | |
РНК | 29,5 |
Лиганд/ион | 16,2/35 |
Вода | 23,5 |
г. гл. s. d. (root-mean-square deviation - корневое среднее квадратичное отклонение) | |
Длина связи (А) | 0,007 |
Углы связи(°) | 1,308 |
*Значения в скобках относятся к оболочке с самым высоким разрешением.
Связывающий лиганд карман 5HTP-II находится в тройном стыке, который имеет радикально отличную локальную структуру от родительской РНК. Прямые контакты с лигандом в основном опосредуются нуклеотидами в J2/3 с использованием общего структурного модуля РНК, Т-петли (фиг. 4А). Первые пять нуклеотидов J2/3 образуют каноническую Т-петлевую структуру, практически идеально перекрывающуюся с Т-петлей тРНКРЬе (r. m. s. d. 0,49 А для остатков остова). Стабилизация положения 3 в Т-петле т-РНК с помощью дистанционного Уотсон-Криковского спаривания с D-петлей является критическим для активности. 5HTP-II обладает аналогичным взаимодействием между G47 Т-петли и С75 J3/1. Т-петля 5HTP-II содержит 5НТР, вставленный между положениями 4 и 5, ортологически по отношению к тому, как Т-петля тРНК содержит интеркалирующий пурин из D-петли и это также сходно с распознаванием тиаминпирофосфата (ТРР) его рибопереключателем (фиг. 4В). Хотя Т-петля непосредст- 32 044975 венно ответственна за распознавание лиганда, нуклеотиды из всех трех рандомизированных участков участвуют в локальной структуре, способствуя образованию компактного стыка, который стабилизирует
Т-петлю. Учитывая, что такой сложный набор взаимодействий поддерживает Т-петлю, маловероятно, что изолированная Т-петля будет связывать 5НТР.
Кристаллическая структура 5HTP-II дает дополнительное понимание распознавания 5НТР другими каркасными аптамерами. Самый распространенный кластер в выборке GR/GsI, 5HTP-IV, также содержит UUGAA характеристику Т-петли. Мотив, однако, смещен в 3' направлении на один нуклеотид, что, вероятно, приводит к альтернативной ориентации в тройном стыке, о чем свидетельствуют существенные различия последовательностей в J1/2 и J3/1 между 5HTP-II и 5HTP-IV. При селекции НН наиболее распространенная последовательность наиболее густонаселенного кластера (5HTP-VIII) также содержит консервативную последовательность UUGAA Т-петли в J2/3. Анализ вариации последовательности этого участка аптамера 5HTP-VIII выявляет закономерность консервации, совпадающую с таковой для биологических Т-петель с небольшими отклонениями (фиг. 11). Это говорит о том, что мотив Т-петли может быть надежным модулем для распознавания малых плоских соединений с помощью РНК. В то время как в РНК селекций CDG нет четко идентифицируемой Т-петли, параметры связывания почти полностью совпадают с параметрами двух других селекций, что предполагает сходный режим распознавания.
Пример 5. Аптамеры с каркасом могут быть легко встроены в надежные и эффективные низкомолекулярные сенсорные устройства.
С помощью методов селекции с использованием остова, доказавших свою способность создавать хорошо сложенные, высокоструктурированные и специфичные РНК-аптамеры, была проверена его способность продуцировать функциональные синтетические РНК-биосенсоры. Для создания этих устройств, использовали стратегию соединения аптамера, связывающего малую молекулу, с модулем, связывающим флуорофор через короткий спиральный элемент. Ведущий кандидатный аптамер из каждой библиотеки был соединен с аптамером, связывающим флуорофор с Broccoli, с двумя спиральными вариантами (коммуникационные модули обозначены как А и U, фиг. 12), соединяющими два аптамера. Это привело к набору РНК, способных детектировать 5НТР и/или серотонин в в диапазоне нескольких порядков in vitro с различными динамическими диапазонами выходной флуоресценции (табл. 5 и 6). Многие из этих сенсоров в присутствии лиганда способны генерировать уровни флуоресценции, равные или превышающие уровни флуоресценции неконъюгированного аптамера Broccoli в одинаковых условиях. Этой системе присущ пониженный очевидный F50 (определяемый как концентрация лиганда, необходимая для получения половины максимального флуоресцентного ответа) относительно KD выделенного аптамера, по визуализации флуоресценцией Broccoli. Однако некоторые каркасные аптамеры демонстрируют только ~10-кратное различие между их KD и F50. В целом это выгодно отличается от примеров природных доменов аптамеров рибопереключателя в литературе, чьи различия в KD и F50 могут приближаться к 1000-кратному значению, что важно учитывать, когда чувствительность или токсичность лиганда является ограничивающим фактором при применении рибопереключателя.
Таблица 5
In vitro производительность 5НТР/серотониновых сенсоров на основе Broccoli
линкер/лиганд | А/5НТР а | А/5НТ | U/5HTP | U/5HT | |
аптамер | F50, мкМ | Fso, мкМ | F 50, мкМ | F 50/ мкМ | |
5HTP-II | 190 ± 30 | Н/Оь | 180 ± 20 | Н/О | |
5HTP-IV | н/о | 190 ± 70 | 240 ± 20 | 52 ±4 | |
5HTP-VIII | н/о | 790 ± 190 | 590 ± 90 | 260 ± 50 |
аВсе измерения проведены при 25°С в 5 мМ MgCl2 содержащем буфере. bHe обнаруживается.
- 33 044975
Таблица 6
Производительность сенсоров 5HTP-Broccoli
Сенсор | Лиганд | [MgCl2 ], мМ | F max | ||
Кратность Индукции а | (% Broccoli) ь | F 50 с, мкМ | |||
5HTP-II/A | 5НТР | 1 | 3,5 | 18,5 | |
3 | 6,3 | 71 | |||
5 | 7,3 | 122 | 190±30 | ||
10 | 6 | 168 | |||
20 | 4,1 | 180 | |||
5НТ | 1 | 1,3 | 6,9 | ||
3 | 3,1 | 34,6 |
- 34 044975
5 | 3,7 | 62,7 | n,d, | |
10 | 3,9 | 108 | ||
20 | 3 | 134 | ||
5HTP ll/U 5HTP | 1 | 1,9 | 21,1 | |
3 | 3,1 | 72,2 | ||
5 | з,з | 105 | 180±20 | |
10 | з,з | 130 | ||
20 | 3,2 | 135 | ||
5HT | 1 | 0,4 | 4,7 | |
3 | 0,8 | 18,2 | ||
5 | 1,1 | 33,2 | n,d, | |
10 | 1,3 | 52,6 | ||
20 | 1,6 | 66,4 | ||
5HTP-IV/A 5HTP | 1 | 1,2 | 2,7 | |
3 | 1,3 | 2,9 | ||
5 | 1,4 | 3,1 | n,d, | |
10 | 1,7 | 3,8 | ||
20 | 2 | 4,3 | ||
5HT | 1 | ι,ο | 2,4 | |
3 | 1,3 | 2,75 | ||
5 | 1,4 | 3,2 | 190±70 | |
10 | 1,8 | 4 | ||
20 | 2,2 | 4,7 | ||
5HTP-IV/A 5HTP | 1 | 2,5 | 8,5 | |
3 | 6 | 37,1 | ||
5 | 8,2 | 71,2 | 240±20 | |
10 | 8,2 | 111 | ||
20 | 6,1 | 126 | ||
5HT | 1 | 5,1 | 17,2 | |
3 | 8,8 | 54,1 | ||
5 | 9 | 78,1 | 52±4 | |
10 | 7,2 | 98,3 | ||
20 | 5,1 | 105 |
-35 044975
5HTP-VIII/A | 5НТР | 1 | 1,1 | 3,7 |
3 | 1,8 | 7 | ||
5 | 2,4 | 10,4 | ||
10 | 3,7 | 18 | ||
20 | 5,1 | 26,9 | ||
5НТ | 1 | 1,5 | 5 | |
3 | 4,4 | 17,7 | ||
5 | 7,2 | 31,4 790±190 | ||
10 | 10,9 | 53,3 | ||
20 | 13 | 69,5 | ||
5HTP-VIII/U | 5НТР | 1 | 1,6 | 12,3 |
3 | 2,5 | 43,3 | ||
5 | 2,8 | 69,7 590±90 | ||
10 | 3,1 | 109 | ||
20 | 3 | 126 | ||
5НТ | 1 | 3,8 | 30 | |
3 | 5,5 | 93,4 | ||
5 | 4,8 | 116 260±50 | ||
10 | 3,7 | 131 | ||
20 | 3,2 | 136 |
аОпределяется как (флуоресценция при насыщении лигандом/флуоресценция в отсутствие лиганда); затенение серым цветом обозначает сенсоры, которые имели высокие показатели.
bОпределяется как (максимальная флуоресценция сенсора/флуоресценция изолированного аптамера Broccoli)x100.
сОпределяется как концентрация лиганда, необходимая для выявления полумаксимальной реакции флуоресценции.
Из вышеуказанных устройств 5HTP-II (А) способен специфически детектировать 5НТР в E. coli. Этот генетически кодированный сенсор вызывал быструю индукцию флуоресценции при добавлении 2 мМ 5НТР к Е.coli, растущей в богатой химически определенной среде (10 мин), при этом около 80% бактерий демонстрировали наблюдаемый ответ в течение 20 мин (фиг. 5). Сигнал флуоресценции полностью зависел от связывания РНК-устройством 5НТР. Не наблюдалось усиление сигнала, когда Lтриптофан был включен в среду или когда сенсор содержал точечную мутацию (A48U) в модуле Тпетли, которая устраняла связывание лиганда с изолированным аптамером (данные не продемонстрированы). Кроме того, увеличение относительной флуоресценции в присутствии 5НТР было сравнимо с надежными и эффективными сенсорами циклических динуклеотидов, основанными на доменах аптамеров природных рибопереключателей в живых клетках. Важно отметить, что эти наблюдения противоречат утверждениям о том, что ненатуральные аптамеры имеют худшие внутриклеточные характеристики по сравнению с природными аптамерами в контексте флуорометрических сенсоров (You, PNAS (2015) 112: 21, Е2756-2765).
Отобранные каркасные аптамеры 5НТР также были соединены со сконструированными модульными вторичными переключателями, полученными из естественных платформ экспрессии рибопереключателей, для создания регуляторных элементов генов. Используя стратегию связывания, в которой спираль Р1 аптамера и платформа экспрессии напрямую спарены, эффективный лиганд-зависимый регулятор транскрипции был сконструирован путем слияния 5HTP-IV сенсора и платформы pbuE ВКЛ переключателя (фиг. 6А). Получающийся в результате РНК-элемент способен активировать транскрипционное считывание in vitro с профилем специфичности, идентичным изолированному домену аптамера, и обладает динамическим диапазоном, согласующимся с природными рибосвитчами (фиг. 6В); неожиданно, но L-Trp совершенно неспособен обеспечить детектируемую транскрипцию. Опять же, расхождение между KD и Т50 не было незначительным (6-кратное для серотонина, 22-кратное для 5НТР), но отражало наблюдаемые тенденции для естественных рибопереключателей, при этом термодинамические свойства аптамера не всегда диктуют его способность взаимодействовать с адапторной последовательностью.
Пример 6. Аптамеры с каркасом согласно иллюстративным вариантам осуществления.
- 36 044975
Аптамер Broccoli был присоединен к остову тРНК для стабилизации биосенсора для применений с использованием клеток. Четыре различных 5НТР-аптамера с GR остовом были спарены с четырьмя коммуникационными модулями разной длины (от двух до пяти пар оснований A-U и U-A; фиг. 14А), и каждый полученный биосенсор тестировался на способность флуоресцировать зависимым от лиганда образом. Каждый сенсор оценивали по кратности изменения лиганд-зависимой флуоресценции и максимальной яркости относительно изолированного аптамера Broccoli как in vitro (фиг. 14В; табл. 7 и 8), так и в E. coli (фиг. 14D; табл. 9 и 10). Для обеспечения быстрого скрининга кандидатов in vitro биосенсоры транскрибировали и использовали непосредственно в флуорометрическом анализе без дальнейшей очистки. Эти данные демонстрируют, что три аптамера (5GR-II, IV и V) дают сенсоры, которые могут обнаруживать 5НТР и/или серотонин как in vitro, так и в клеточном контексте, при этом 5GR-II демонстрирует наилучшую эффективность в отношении комбинированного увеличения кратности в флуоресценции и максимальной яркости.
Чтобы дополнительно продемонстрировать потенциал аптамеров с остовом, визуализацию живых клеток использовали для визуализации поглощения 5НТР Е.соН с использованием биосенсора 5GRII/CM-4. Флуоресцентная визуализация отдельных клеток показала быструю индукцию флуоресценции при добавлении 2 мМ 5НТР к Е.coli, растущей в богатой химически определенной среде, при этом около 80% бактерий демонстрировали наблюдаемый ответ в течение 20 мин (фиг. 15А, D). Сигнал флуоресценции полностью зависел от связывания РНК-устройством 5НТР; обнаруживаемого усиления сигнала не наблюдалось, когда в среду был включен L-триптофан (фиг. 15В, Е) или когда сенсор содержал точечную мутацию (A48U) в модуле Т-петли, которая устраняла связывание лиганда с изолированным аптамером (фиг. 15С, F). Наблюдаемое увеличение относительной флуоресценции в присутствии 5НТР было сравнимо с надежными циклическими динуклеотидными сенсорами на основе природных доменов аптамеров рибопереключателя в живых клетках. Эти результаты контрастируют с предыдущими утверждениями о том, что синтетические аптамеры обладают худшими внутриклеточными характеристиками по сравнению с природными аптамерами, и в данном документе продемонстрировано, что несколько синтетических аптамеров способны функционировать в Е.соН в контексте аллостерической флуорогенной РНК.
Вышеуказанные биосенсоры 5НТР были разработаны с учетом биохимического и биофизического анализа отдельных аптамеров. Тем не менее, оптимальный рабочий процесс для быстрой разработки биосенсоров мог бы использовать информацию, полученную только из вычислительного анализа селекции, для разработки кандидатных РНК. Чтобы продемонстрировать, что каркасные аптамеры включают принципы дизайна, которые позволяют создавать биосенсор в отсутствие экспериментальной характеризации, вышеуказанная стратегия биосенсора была использована для четырех аптамеров, полученных из селекции L-DOPA. Ни один из этих аптамеров не был подтвержден каким-либо образом до их включения в аллостерические флуорогенные датчики. Скрининг полученных биосенсоров с L-DOPA и дофамином in vitro (фиг. 14С; табл. 7 и 8) и в E. coli (фиг. 14Е; табл. 9 и 10) выявил два аптамера (DG-I и DG-II), которые функционируют в обоих контекстах.
Таблица 7
Кратность индукции in vitro флуорогенных аптамеров с GR каркасом
Аптамер | Лиганд | СМ-2 | СМ-3 | СМ-4 | СМ-5 |
5GR-II | 5HTPa | 3.5 ±0.1“ | 5.1 ±0.2 | 2.5 ±0.1 | 1.210.1 |
5GR-IV | 5HTP | 14 ± 1 | 3.5 ±0.7 | 4.1 ±0.2 | 2.71 0.2 |
5GR-V | 5HTP | 13± 1 | 11 ± 1 | 7.4 1 0.4 | 1.810.1 |
5GR-VI | 5HTP | 0.91 0.1 | 1.2 ± 0.1 | 0.910.1 | 1.1 ±0.1 |
5GR4! | Серотонин | 1.5 ± 0.1 | 3.7 ±0.1 | 1.8 ±0.1 | 1.1 ±0.1 |
5GR-IV | Серотонин | 1611 | 5.5 ± 1.1 | 4.2 ±0.2 | 3.2 ± 0.2 |
5GR-V | Серотонин | 11 ± 1 | 8.9 ±0.8 | 7.3 ±0.6 | 1.310.2 |
5GR-VI | Серотонин | 0.710.1 | 1.410.2 | 0.810.1 | 1.110.1 |
DGR-I | 3,4-DHF | 2.4 ± 0.2 | 6.410.6 | 2.3 ± 0.2 | 1.510.1 |
DGR-II | 3,4-DHF | 2.3 ± 0.4 | 3.8 ±0.8 | 1.2 ±0.1 | 1.1 ± 0.1 |
DGR-III | 3,4-DHF | 1.3± 0.1 | 1.4 ±0.1 | 1.610.1 | 1.1 ±0.2 |
DGR-IV | 3,4-DHF | 1.91 0.1 | 1.7 ±0.1 | 4.310.2 | 1.310.1 |
DGR-I | Дофамин | 3.5 1 0.6 | 7.9 ±0.9 | 2.5 1 0.2 | 1.510.1 |
DGR-II | Дофамин | 4.6 ± 0.8 | 4.2 ± 1.1 | 1.310.1 | 1.11 0.1 |
DGR-III | Дофамин | 1.2 1 0.1 | 1.4 ±0.1 | 1.710.1 | 1.010.1 |
DGR-IV | Дофамин | 2.6 ±0.1 | 2.0 ±0.1 | 8.010.3 | 1.310.1 |
^Концентрация лиганда составляет 2 мМ.
ъКратность индукции (КИ) рассчитывается как (общая флуоресценция, + лиганд)/(общая флуоресценция, -лиганд).
Ошибка докладывается как стандартная ошибка среднего для трех независимых экспериментов.
- 37 044975
Таблица 8
In vitro яркость флуорогенных аптамеров с GR каркасом относительно родительской Broccoli
Аптамер | Лиганд | СМ-2 | СМ-3 | СМ-4 | СМ-5 |
5GR-II | 5НТР3 | 54 ± 10 | 75 ± 14 | 89 ±16 | 97 ±20 |
5GR-IV | 5НТР | 5.9 ± 1.4 | 0.4 ± 0.1 | 10 ± 2 | 1914 |
5GR-V | SHTP | 13±3 | 3.4 ± 0.5 | 5.7 ±1.3 | 5.5 ± 1.0 |
5GR-VI | 5НТР | 1.0 ±0.1 | 1212 | 14 ± 3 | 4318 |
5GR-II | Серотонин | 22 ±3 | 54 ±9 | 63 ±9 | 88 ± 17 |
5GR-IV | Серотонин | 7±2 | 0.6 ±0.1 | 11 ±3 | 23 ±5 |
5GR-V | Серотонин | 11 ±2 | 2.7 ± 0.2 | 6.2 ±1.3 | 3.8 ± 0.5 |
5GR-VI | Серотонин | 0.810.1 | 13± 1 | 12 ± 3 | 45 ±9 |
DGR-I | 3.4-DHF | 0.5 ±0.1 | 8.9 ± 0.7 | 6.711.1 | 22 ±4 |
DGR-II | 3.4-DHF | 1.3 ±0.7 | 11 ±4 | 4.7 ±1.1 | 1711 |
DGR-III | 3,4-DHF | 3.3 ± 0.2 | 25 ±4 | 15±2 | 61 ± 11 |
DGR-IV | 3.4-DHF | 11 ±3 | 47 ±8 | 35 ±5 | 76 ± 10 |
DGR-I | Дофамин | 0.8 ±0.1 | 1211 | 7.7 ± 1.6 | 25 ±6 |
DGR-II | Дофамин | 2.6 ±1.3 | 1214 | 5.1 ± 1.0 | 19 ± 2 |
DGR-III | Дофамин | 3.1 ±0.2 | 25 ±4 | 16 ± 2 | 56 ± 11 |
DGR-IV | Дофамин | 1514 | 53 ±9 | 66 ± 11 | 76 ±9 |
концентрация лиганда аптамера составляет 2 мМ.
ьПроцент яркости рассчитывается как (общая флуоресценция сенсора, + лиганд)/(общая флуоресценция Broccoli, + лиганд). Ошибка докладывается как стандартная ошибка среднего значения для трех независимых экспериментов.
Таблица 9
Кратность индукции in vivo флуорогенных аптамеров с GR остовом
Аптамер | Лиганд | СМ-2 | СМ-3 | СМ-4 | СМ-5 |
5GR-II | shtp3 | 0.9 ±0.1 | 2.6 ±0.3 | 5.3 ± 0.2 | 3.1 ±0.45 |
5GR-IV | 5НТР | 1.0 ±0.2 | 1.7 ±0.7 | 1.4 ±0.15 | 1.9 ±0.55 |
5GR-V | 5НТР | 1.2 + 0,2 | 1,4 ±0.2 | 1.6 ±0,2 | 0.9 ±0,1 |
5GR-VI | 5НТР | 0.9 ±0.1 | 1.1 ±0.1 | 1.1 ±0.1 | 1.4 ±0.1 |
5GR-II | Серотонин | 1.0 ±0.1 | 1.8 ±.1 | 3.0 ± 0.4 | 2.510.3 |
5GR-IV | Серотонин | 1.0 ± 0.1 | 0.9 ±0.1 | 2.6 ± 0.7 | 6.9 ± 1.2 |
5GR-V | Серотонин | 1.1 ± 0.1 | 1.7 ± 0.4 | 1.8 ±0.2 | 0.7 ±0.1 |
5GR-VI | Серотонин | 1.0 ±0.2 | 1.6 ±0.1 | 1.6 ±0,1 | 1.9 ±0.2 |
DGR-I | Дофамин | 0.7 ±0.1 | 0.9 ±0.3 | 1,6 ±0,6 | 2.710,5 |
DGR-II | Дофамин | 0.6 ±0.1 | 1.0 ±0.4 | 3.1 ±0.8 | 2.9 ± 0.5 |
DGR-III | Дофамин | 0.6 ±0.1 | 0.4 ±0.2 | 0.7 ±0.1 | 0.8 ± 0.1 |
DGR-IV | Дофамин | 1.7 ±0.9 | 0.7 ± 0.2 | 1.3 ±0.1 | 0.9 ±0.5 |
концентрация лиганда составляет 2 мМ.
ьКратность индукции (КИ) рассчитывается как (общая флуоресценция, +лиганд)/(общая флуоресценция, -лиганд). Ошибка докладывается как стандартная ошибка среднего для трех независимых экспериментов.
Таблица 10
In vivo яркость флуорогенных аптамеров с GR каркасом относительно родительского аптамера Broccoli
Аптамер | Лиганд | СМ-2 | СМ-3 | СМ-4 | СМ-5 |
5GR-II | 5НТРа | 0.4 ±0.1 | 2 ±0.3 | 20 ±2 | 27 ±2 |
5GR-IV | 5НТР | 0.4 ±0.1 | 0.7 1 0.4 | 07102 | 0-910.3 |
5GR-V | 5НТР | 0.5 ±0.1 | 0.4 ±0.1 | 0.810.1 | 0.810.1 |
5GR-VI | 5НТР | 0.4 ±0.1 | 0.7 ±0.1 | 0.610.1 | 7 ±0.4 |
5GR-II | Серотонин | 0.4 ±0.1 | 2.2 ±0.1 | 15±2 | 25 ±6 |
5GR-IV | Серотонин | 0.510.1 | 0.410.1 | 1.510.3 | 4.810.8 |
5GR-V | Серотонин | 0.7 ± 0.1 | 0.6 ±0.1 | 1.0 ±0.2 | 0.810.1 |
5GR-VI | Серотонин | 0,4 ±0.1 | 1.3 ±0.1 | 1.1 ±0.3 | 9.710,3 |
DGR-I | Дофамин | 0.7 ± 0.1 | 0.3 ±0.1 | 0.810.5 | 2±1 |
DGR-II | Дофамин | 0.4 ± 0.1 | 0.710.3 | 311 | 312 |
DGR-III | Дофамин | 0.5 ±0.1 | 0.210.1 | 0.610.1 | 3± 1 |
DGR-IV | Дофамин | 0 4 ± 0.1 | 0.410-2 | 1 ±0.3 | 312 |
-38044975 аКонцентрация лиганда составляет 2 мМ.
ьПроцент яркости рассчитывается как (общая флуоресценция сенсора, +лиганд)/(общая флуоресценция Broccoli, +лиганд). Ошибка докладывается как стандартная ошибка среднего для трех независимых экспериментов.
Пример 7. Обсуждение.
Устройства на основе РНК постепенно превращаются в надежный инструмент в синтетической биологии, что вызвано уникальным набором функций по сравнению с альтернативами на основе белков, включая способность регулировать в цис-положении, предсказуемую вторичную структуру и небольшой генетический след. Усилия были сосредоточены на создании синтетических рибопереключателей, аптазимов и флуорогенных РНК-сенсоров, но их потенциал еще не полностью реализован в значительной степени из-за ограниченной доступности низкомолекулярных рецепторов, которые функционируют в контексте таких устройств. В работе, представленной в данном документе, была разработана стратегия, которая использует вторичную и третичную структурную архитектуру естественно эволюционирующих рибопереключателей и рибозимов для создания карманов связывания малых молекул, полученных посредством селекции in vitro. Важно отметить, что, не используя никакой информации, кроме той, которая получена в результате высокопроизводительного сиквенирования последнего раунда селекции, аптамеры, отобранные для L-DOPA с использованием этого подхода, были соединены с модулем флуорогенного аптамера для получения генетически кодируемых биосенсоров, которые функционируют в клеточном контексте.
Одной из основных сильных сторон способов и композиций, описанных в данном документе, является использование множества остовов в параллельных выборках для получения набора аптамеров. Это существенно отличается от традиционных выборок, известных в данной области техники, при этом одно и то же подмножество решений воспроизводимо генерируется из простого рандомизированного пула, который значительно ограничивает разнообразие сенсоров и их разработку. Хотя аптамеры, полученные из разных остовов, имеют сходное сродство к 5НТР и селективность по отношению к L-триптофану, они явно имеют отличные характеристики в отношении их способности коммуникации с доменом считывания через спираль Р1, что является общей характеристикой для всех остовов. У биологических рибопереключателей лиганд либо находится в прямом контакте, либо вызывает конформационные изменения в РНК, которые включают спираль Р1, которая связывает аптамер с нижестоящим регуляторным переключателем. Не намереваясь ограничиваться научной теорией, предполагается, что различия в характеристиках сенсора у разных аптамеров частично связаны с различием в пространственных отношениях между лигандом и междоменной (Р1) спиралью, особенностью, которой нельзя полностью управлять при селекции. Однако, в отличие от глубоких селекций, представленный в данном документе подход селекции с использованием остова сильно смещает отборы в сторону благоприятной ориентации лиганда/Р1 путем ограничения возможного положения лиганда.
С набором аптамеров могут быть использованы комбинаторные подходы для быстрого скрининга сенсоров без обширной характеризации аптамера или оптимизации устройства, как это продемонстрировано разработкой дофаминового сенсора в данном документе (фиг. 19). Разработка РНК-устройства из аптамеров, полученных из глубоких селекции, требует тщательной характеризации наряду с широким скринингом коммуникационных модулей, оставляя сенсорный аптамер в качестве фиксированного, неизменяемого узла из-за отсутствия разнообразия. С помощью описанных в данном документе способов селекции и составов с каркасом набор различных аптамеров может быть комбинаторно связан с набором коммуникационных модулей и быстро проверен на варианты с желаемой активностью, как продемонстрировано с помощью селекции L-DOPA. Таким образом, способы и композиции, представленные в данном документе, должны облегчать целесообразную разработку РНК-устройств и сенсоров, расширяя ключевое узкое место в их разработке. Примечательно, что, хотя в этом исследовании были сосредоточены только самые густонаселенные кластеры в каждой селекции для характеризации и/или разработки сенсора, в каждой селекции есть много кластеров, содержащих альтернативные последовательности, которые могут дополнительно обогатить первоначальный пул аптамеров для разработки последующих применений.
Вторым мощным преимуществом способов и композиций селекции, описанных в данном документе, является возможность надежного свертывания в клеточном контексте, обеспечиваемая третичным взаимодействием архитектуры тройного стыка. Каждый из этих аптамеров имеет свертывание, которое подверглось экстенсивной биологической эволюции. Кроме того, дистальные третичные взаимодействия, которые организуют ядро тройного стыка, могут быть очень устойчивыми. Как взаимодействие L2L3 пуринового рибопереключатель, так и рецепто тетрапетля-тетрапетля остова циклического di-GMP рибопереключателя, способны к стабильному формированию вне контекста другой структуры РНК. Напротив, взаимодействие большого радиуса действия, которое организует рибозим хаммерхэд S. mansoni является динамическим, что является еще одним аспектом разнообразия по отношению к выбранным остовам. Наличие прочной вторичной и третичной структуры в остове позволяет этим элементам потенциально управлять свертыванием всех членов исходной библиотеки. Напротив, неправильное свертывание РНК во время селекции и/или наличие множества структур MFE в конечных аптамерах часто являет- 39 044975 ся серьезной проблемой для традиционной глубокой селекции. Поскольку в типичном протоколе селекции нет значительного давления селекции для свертывания с высокой точностью, предоставление этой информации в исходной библиотеке может стать путем к надежным и эффективным свертывающимся
РНК.
Хотя в качестве предмета данного исследования были выбраны остовы с тройным стыком, разнообразие природных рибопереключателей и рибозимов может обеспечить дополнительное сырье для этого подхода. В семействе с тройным стыком имеется широкий ряд последовательностей, которые изменяют ориентацию трех спиралей, размер участков соединения и характер дистального третичного взаимодействия, который может обеспечить превосходные остовы для конкретного лиганда или сенсора. Кроме того, другие свертывания могут быть предрасположены к связыванию целевой малой молекулы в зависимости от природы когнатного лиганда. Например, другим логическим выбором для остова, связывающего 5НТР, является домен аптамера лизинового рибосвича. Более крупные лиганды могут легче распознаваться остовами, происходящими из рибопереключателей флавинового мононуклеотида или кобаламина, тогда как динуклеотиды, такие как NADH, могут быть легко приняты одним из аптамеров дициклического нуклеотида. Поскольку было обнаружено, что природные РНК-аптамеры распознают химически разнообразные малые молекулы, использование их архитектуры для селекции новых аптамеров может способствовать разработке новых мощных инструментов для мониторинга и реагирования на малые молекулы в клеточной среде в широком диапазоне применений.
Пример 8. Построение библиотеки.
Для каждого остова нуклеотиды в пределах оболочки 8 А, окружающей сайт связывания лиганда или активный сайт родительской РНК, были идентифицированы по их кристаллической структуре (GR, PDB ID 4FE5; CDG, PDB ID 3IWN; НН, PDB ID 3ZD5). Соответствующие положения были рэндомизированы в ДНК-ультрамере, который охватывал весь аптамерный домен с консервативными фланкирующими последовательностями для обратной транскрипции и амплификации (Integrated DNA Technologies; последовательности всех нуклеиновых кислот, использованных в этом исследовании, представлены в табл. 1). оцДНК превращали в матрицы дцДНК для транскрипции с использованием стандартных условий ПЦР для Taq, в которых ~2х10’12 моль ДНК (что соответствует ~1012 отдельных последовательностей) использовали в каждой 100 мкл реакции ПЦР и амплифицировали в течение 15 циклов с праймерами, добавляющими сайт T7, и праймерами для ОТ-ПЦР. Приблизительно 1х1014 последовательностей транскрибировали в 12,5 мл реакции транскрипции, содержащей 40 мМ трис-HCl, pH 8,0, 25 мМ DTT, 2 мМ спермидин, 0,01% тритон Х-100, 4 мМ каждый гНТР, pH 8,0, 0,08 единиц неорганической фосфатазы (Sigma- Aldrich, лиофилизированный порошок) и 0,25 мг/мл T7 РНК-полимеразы и инкубировали при 37°С в течение 4 ч. Образцы транскрипции затем осаждали в 75% этаноле при -20°С, осаждали и восстанавливали в растворе 300 мкл формамида, 3 мл 8 М мочевины и 300 мкл 0,5 М ЭДТА pH 8,0. РНК полной длины очищали денатурирующим 8%, 29:1 акриламид: бисакриламидным гелем. Продукт РНК вырезали из геля после визуализации путем УФ-затенения и элюировали в 0,3 М NaOAc pH 5,0 перед очисткой и хранением в 0,5х ТЕ.
Пример 9. Синтез 5НТР аффинного матрикса для колонки.
Для дериватизированных колонок 3 мл слоя ЕАН-сефарозы 4В (GEHealthcare) дегидратировали диметилформамидом (ДМФ). 10 мкмоль Fмок(moc)-5-гидрокси-L-триптофана и 10 мкмоль бензотриазол-1ил-окситрипирролидинофосфоний гексафторфосфата (РуВОР) растворяли в 1 мл ДМФ и добавляли в дегидратированную колонку с 20 мкмоль N,N-диизопропилэтиламина (DIPEA-N,N-diisopropylethylamine) и инкубировали с встряхиванием в течение 2 ч при комнатной температуре. Матрицу колонки затем осушали и тщательно промывали ДМФ. Непрореагировавшие сефарозные амины ацетилировали путем добавления 1 ммоля уксусного ангидрида и 1 ммоля DIPEA в около 1 мл ДМФ и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Из колонки сливали ацетилирующую смесь и промывали ДМФ перед снятием защиты с Fmok, используя 20 об./об.% пиперидин/ДМФ. Концентрацию аминокислоты на колонке определяли путем измерения концентрации Fmok во фракциях снятия защиты (A301 нм=8000 М-1 см 1). Этот метод генерировал около 0,5-1 мМ аминокислоты без защиты на мл смолы. Для противоселекции ЕАН-сефарозу готовили точно так же, за исключением того, что пропускали стадию спаривания с лигандом, что приводило к ацетилированной сефарозе.
Пример 10. Селекция in vitro.
Для селекции с GR остовом с использованием обратной транскриптазы Superscript III (GR/SSIII) 350 мкл ацетилированной сефарозы уравновешивали в буфере для селекции (10 мМ Na-HEPES, pH 7,0, 250 мМ NaCl, 50 мМ KCI, 10 мМ MgCl2, 0,1 мг/мл тРНК) и 1 нмоль библиотечной РНК в 350 мкл буфера для селекции инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин со встряхиванием. Нанесенный раствор удаляли и матрицу колонки промывали один раз 350 мкл буфера для селекции. Объединенную жидкость после промывки (всего 750 мкл) добавляли в предварительно уравновешенную 5НТРдериватизованную 4В колонку с сефарозой и инкубировали в течение 45 мин. Колонку затем осушали и трижды промывали буфером для селекции перед элюцией 10 мМ 5НТР в буфере для селекции (две инкубации в течение 1 ч в 350 мкл; общий объем элюированного - 700 мкл). Затем элюированные фракции
- 40 044975 концентрировали до 50 мкл в 0,5 мл MWCO-фильтре Ultracel 10 кД (Millipore) и осаждали этанолом в 0,3
М ацетате натрия (pH 5,0), 5 мкг гликогена и доводили до конечной концентрации этанола 75% перед хранением при -70°С в течение 30 мин. Детали условий каждого цикла приведены в табл. 2.
Для превращения конкурентно элюированной РНК в новую популяцию РНК фракции элюирования осаждали этанолом, центрифугировали при 13000xg при 4°С, декантировали и сушили в вакууме. Высушенный осадок восстанавливали 0,7 мМ каждого dNTP, 7 мкМ ОТ-ПЦР-праймера и доводили до общего объема 14 мкл перед нагреванием до 65°С в течение 5 мин и инкубацией на льду в течение 10 мин. Затем раствор доводили до 1х буфера первой цепи Superscript III (5х: 250 мМ трис-HCl, pH 8,3, 375 мМ KCl, 15 мМ MgCl2) с 5 мМ DTT и 200 единицами Superscript III (Life Technologies) до общего объема 20 мкл перед 15-минутной стадией удлинения при 54°С. Весь 20 мкл раствора обратной транскрипции амплифицировали с помощью ПЦР в общем объеме 500 мкл с использованием стандартных условий для Taq ДНК-полимеразы. Затем амплифицированный пул транскрибировали путем добавления 100 мкл реакции ПЦР к 1 мл реакции транскрипции, содержащей 40 мМ трис-HCl, pH 8,0, 25 мМ DTT, 2 мМ спермидин, 0,01% тритон Х-100, 4 мМ каждого НТФ pHTP pH 8,0, 0,08 единиц неорганической фосфатазы и 0,25 мг/мл Т7 РНК-полимеразы и инкубировали при 37°С в течение 2 ч. Реакцию транскрипции в 100 мкл для меченной 32Р РНК проводили в аналогичных условиях, за исключением того, что концентрацию рНТФ снижали до 2 мМ для УТФ, ЦТФ и ГТФ, тогда как концентрацию АТФ снижали до 200 мкМ и ~100 мкКю 32Р-АТФ. Образцы транскрипции очищали в геле, как описано выше, с соответствующими условиями загрузки геля.
Селекцию с использованием обратной транскриптазы GsI проводили, как описано выше, со следующими изменениями. Буфер для селекции содержал пониженную концентрацию магния и более физиологически значимые одновалентные катионы: 25 мМ Na-HEPES, pH 7,0, 150 мМ KCl, 50 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2. Вместо Superscript III была использована обратная транскриптаза GsI-IIC-MRF. Обратная транскриптаза GsI-IIC MRF была экспрессирована в Е.coli и очищена, как описано (Mohr et al., RNA, 2013, 19, 958-970). К осажденному осадку РНК добавляли в растворе 1,25 мМ дНТФ и 20 мкМ ОТ-ПЦРпраймера перед денатурацией при 65°С, отжигом при 4°С и уравновешиванием при 60°С. Затем раствор доводили до состояния 1х буфера GsI-IIC-MRF (10 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 20 мМ TrisCl, pH 7,5, 1 мМ DTT) в общем объеме 20 мкл и добавляли достаточное количество фермента для удлинения при 60°С. ПЦР проводили, как описано выше.
Пример 11. Высокопроизводительное сиквенирование и биоинформационный анализ.
Стандартная ПЦР была проведена для добавления гибридизационных последовательностей Illumina, необходимых для отжига в проточную ячейку. Каждую библиотеку амплифицировали с помощью праймера для прямого сиквенирования и уникального обратного праймера, содержащего отличительный штрих-код из 12 нуклеотидов (последовательности приведены в табл. 1). Образцы сиквенировали с использованием набора реагентов v3 для 150 циклов на MiSeq (Illumina) с пользовательскими праймерами для считывания и индексации.
Полученные последовательности были демультиплексированы, обрезаны и подвергнуты качественной фильтрации с использованием скриптов от QIIME (Caporaso et al., Nat. Methods, 2010, 7, 335-336). Вся информация о последовательностях за пределами стебля Р1 была обрезана, и в анализе использовались только последовательности, содержащие оценку Phred>20 для каждого нуклеотида. Полученные файлы формата fasta для каждой библиотеки затем подвергали кластеризации с помощью USEARCH (Edgar, Bioinformatics, 26, 2460-2461), которая генерировала затравочные последовательности, которые были сгруппированы при идентичности 90%; любые кластеры, содержащие одну последовательность, отбрасывались. Десять лучших густонаселенных кластеров затем были картированы к их исходному файлу последовательности, и 250 отдельных последовательностей были случайным образом взяты в качестве репрезентативной селекции каждого кластера для дальнейшего анализа. Последовательности в каждом кластере были выровнены с использованием MUSCLE (Edgar, NAR, 2004, 32, 1792-1797), а результирующее выравнивание проанализировано с использованием CMfinder (Yao et al., Bioinformatics, 2006, 22, 445-452). R2R (Weinberg & Breaker, BMC Bioinformatics, 2011, 12, 3) был запущен с настройками по умолчанию, чтобы сгенерировать фигуры консервации последовательности, картированные на вторичную структуру с минимальной свободной энергией (MFE).
Пример 12. Химическое зондирование NMIA.
РНК готовили, как описано ранее (Edwards et al., Methods Mol. Biol., 2009, 535, 135-163). Структурные кассеты, фланкирующие 5' и 3' концы РНК, добавляли для облегчения обратной транскрипции, и модификацию NMIA проводили с использованием установленных протоколов (Wilkinson et al., Nat. Protoc, 2006, 1, 1610-1616) при 25°С. РНК зондировали при концентрации 100 нМ в 100 мМ Na-HEPES, pH 8,0, 100 мМ NaCl и 6 мМ MgCl2. Концентрация лиганда составляла 500 мкМ, где указано. Изображения геля анализировали с помощью SAFA (Das et al., RNA, 2005, 11, 344-354) и ImageJ (NIH).
Пример 13. Изотермическая калориметрия титрования (ITC - Isothermal Titration Calorimetry).
Для всех протестированных РНК буфер был заменен на буфер для селекции SSIII (10 мМ NaHEPES, pH 7,0, 250 мМ NaCl; 50 мМ KCl; 10 мМ MgCl2) и они были промыты три раза на фильтре
- 41 044975
MWC0 10 кДа (EMD Millipore). Лиганд растворяли из сухого твердого вещества непосредственно в буфере для связывания и концентрацию устанавливали на NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) с использованием коэффициента экстинкции при 275 нм, равного 8000 моль-1 см-1 для 5-гидроксииндольного фрагмента. РНК разводили до 50-100 мкМ, и лиганд титровали до концентрации в около 10 раз больше концентрации РНК. Титрование проводили при 25°С с использованием микрокалориметра MicroCal iTC200 (GE Healthcare) с использованием установленных протоколов (Gilbert and Batey, Methods Mol. Biol., 2009, 540, 97-114). Данные были проанализированы и проведена подгонка с помощью пакета программного обеспечения Origin 5. 0 (Origin Laboratories).
Пример 14. Определение структуры комплекса 5HTP-II/5HTP.
РНК для кристаллизации получали, как описано ранее (Edwards et al., Methods Mol. Biol., 2009, 535, 135-163). РНК концентрировали в фильтре Amicon Ultra 15 10k MWCO (EMD Millipore, Inc.) и заменяли буфер на в 0,5 х ТЕ. Кристаллы дифракционного качества были получены путем смешивания 2 мкл комплекса РНК: лиганд (1:1) и 3,5 мкл маточного раствора (8-14% 2-метил-2,4-пентандиола, 40 мМ какодилата натрия, pH 5,5, 4 мМ MgCl2, 12 мМ NaCl, 80 мМ KCl и 4-9 мМ гексамина кобальта), микрзатравки и инкубации при 22°С в течение 1-3 дней. Кристаллы не нуждались в дальнейшей криозащите и были быстро заморожены в жидком азоте перед сбором данных. Данные собирали с помощью системы визуализации планшетов Rigaku R-Axis IV с использованием излучения CuKa (1,5418 А) при 100 К, и индексировали и масштабировали с использованием D*TREK (Pflugrath, Acta Crystallogr). D Biol. Crystallogr., 1999, 55, 1718-1725). Данные о производном тяжелого атома, полученном путем замены гексамина кобальта 1-11 мМ гексамином иридия, также собирали на лабораторном рентгеновском источнике. Фазы определяли методом однократного изоморфного замещения с аномальным рассеянием (SIRAS - single isomorphous replacement with anomalous scattering). AutoSol (Adams et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2010, 66, 213-221) было использовано для нахождения 12 атомов иридия, которые затем использовались для расчета фаз. Полученная в результате экспериментальная карта плотности показала однозначные особенности остова РНК и спиралей и использовалась для построения модели.
Первоначальная модель была итеративно построена без лиганда в Coot (Emsley & Cowtan, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2004, 60, 2126-2132) между раундами уточнения в PHENIX (Adams et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2010, 66, 213-221). Модель РНК была подвергнута нескольким раундам уточнения и имитации отжига, прежде чем 5НТР был встроен в модель. На этом этапе строительства в связывающем кармане была четкая плотность лиганда, что позволяло уверенно размещать и ориентировать лиганд. Расположение лиганда и оснований было подтверждено составной картой пропусков (фиг. 10В). Размещение воды было автоматизировано в последних раундах уточнения после размещения лиганда на основе размера пика на карте разности Fo-Fc. Получившаяся модель имела хорошую геометрию, как было оценено с использованием MolProbity (Chen et al., 2010, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 2010, 66, 213-221) и итоговую статистическую модель (Rpaб и Ясвоб составляют 21,9% и 26,2% соответственно). Все кристаллографические данные и статистические данные модели приведены в табл. 4.
Пример 15. Анализы на основе сенсора Broccoli in vitro.
РНК готовили, как описано выше, с дополнительными промывками 0,5х ТЕ буфера в 10k MWCO Amicon Ultra (Millipore), чтобы минимизировать перенос ионов металлов. Все РНК-сенсоры анализировали при концентрациях РНК 0,5 мкМ и 10 мкМ (Z)-4-(3,5-дифтор-4-гидроксибензилиден)-1,2-диметил1Н-имидазол-5(4Н)-она (DFHBI-(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-1,2-dimethyl-1H-imidazol-5(4H)one) в буфере, содержащем 80 мМ Трис-HCl, pH 7,4, 150 мМ KCl и 50 мМ NaCl. Буфер, лиганд, магний (концентрации приведены в табл. 6) и DFHBI смешивали перед добавлением РНК, и всем реакциям позволяли инкубироваться в течение 30 мин при комнатной температуре. Флуоресценцию DFHBI измеряли, помещая реакционный объем 200 мкл в 96-луночный черный флуоресцентный планшет Greiner с плоским дном (Thermo Scientific) и считывли в планшетном ридере Tecan Infinite M200 PRO. Образцы возбуждали при 460 нм и излучение флуоресценции измеряли как средний сигнал между 506 и 510 нм. Концентрацию лиганда, чтобы вызвать половинный максимальный ответ флуоресценции, определяли путем подгонки наблюдаемой флуоресценции как функции концентрации лиганда к модели с двумя состояниями.
Сконструированные сенсоры были синтезированы в виде G-блоков (последовательности сенсоров приведены на фиг. 23; Integrated DNA Technologies) и клонированы между сайтами XbaI и BlpI в рЕТ30Ь с использованием стандартных методов молекулярного клонирования. Все полученные плазмиды были проверены путем сиквенирования. Для реакций транскрипции РНК-полимеразы Т7 ДНК-матрицу генерировали с помощью ПЦР с использованием 1 мкМ внешних праймеров (5': GGCCGTAATACGACTCACTATAGGAGCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCAG, 3':
TGGCGCCCGAACAGGGACTTGAACCCTGGA ) с использованием стандартной реакции ПЦР.
Шаблоны непосредственно добавляли в реакцию транскрипции in vitro (см. выше), и синтезу РНК давали возможность протекать в течение 2 ч при 37°С. РНК из вышеуказанной реакции транскрипции была непосредственно использована в анализах без дальнейшей очистки.
- 42 044975
Активность каждого сенсора контролировали в 100 мкл реакции, содержащей 50 мкл реакции транскрипции in vitro, 10 мкл 10-кратного буфера для исследования (1х: 50 мМ K-HEPES, pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 150 мМ KCl, 50 мМ NaCl), 30 мкМ DFHBI-1T и 2 мМ лиганда (для реакций плюс-лиганд). Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин и измеряли флуоресценцию DFHBI, помещая реакционный объем 90 мкл в 96-луночный черный планшет Greiner для флуоресценции с плоским дном (Thermo Scientific) и считывая в планшетном ридере Tecan Infinite M200 PRO. Образцы возбуждали при 460 нм и излучение флуоресценции измеряли как средний сигнал между 506 и 510 нм. Для всех экспериментов проводили положительный контроль аптамера Broccoli на основе тРНК в присутствии и в отсутствие лиганда, который также использовали в качестве эталона для относительной яркости. Индукцию сгиба рассчитывали путем деления значений флуоресценции для реакции DFHBI-1T плюс лиганд на значение флуоресценции только для условия DFHBI-1T. Все эксперименты были выполнены в трипликатах и измеренные данные были представленны со стандартной ошибкой среднего значения (СОС).
Пример 16. Анализы с сенсором Broccoli in vitro.
Клетки Е.coli One Shot® BL21 Star (DE3) (Thermo Fisher) трансформировали плазмидой, полученной из рЕТЗОЬ, содержащей сенсор под индуцибельным контролем, высевали на LB агар с добавлением 50 мкг/мл канамицина и инкубировали при 37°С в течение около 16 ч. Отдельные колонии собирали и выращивали в течение ночи (около 16 ч) в 5 мл LB с добавлением 50 мкг/мл канамицина, чтобы позволить культуре достичь насыщения. Для экспериментов по скринингу 5 мкл насыщенной ночной культуры добавляли к 5 мл LB с добавлением 50 мкг/мл канамицина и выращивали до средней логарифмической фазы (ОП600 около 0,4-0,6) при 37°С. Чтобы вызвать экспрессию одного аптамера Broccoli или слитых конструкций аптамера Broccoli/рибопереключатель, IPTG добавляли до конечной концентрации 1 мМ в каждую культуру, которые затем выращивали в течение дополнительных 2 ч при 37°С. Затем клетки осаждали центрифугированием и один раз промывали 5 мл 1х солей М9 с добавлением MgSO4 до конечной концентрации 5 мМ и канамицина до конечной концентрации 50 мкг/мл. После промывания клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 250 мкл вышеуказанной среды М9 и разделяли на две аликвоты по 100 мкл. В половине аликвот добавляли DFHBI-1T до конечной концентрации 50 мкМ до конечного объема 110 мкл. В другой половине аликвот DFHBI-1T добавляли до конечной концентрации 50 мкМ и лиганд (5НТР, 5НР или дофамин) добавляли до конечной концентрации 1 мМ до конечного объема 110 мкл. Затем клетки инкубировали при 37°С в течение 30 мин, чтобы обеспечить поглощение каждого соединения. После 30-минутной инкубации 100 мкл каждой аликвоты пипеткой переносили в 96-луночный черный микропланшет Greiner и охлаждали на льду в течение 30 мин. Для измерений флуоресценции DFHBI-1T наблюдали при длине волны возбуждения 472 нм и длине волны излучения 520 нм. Количественные данные представляют собой средние значения флуоресценции ± стандартная ошибка среднего (СОС) из трех биологических повторов, которые были скорректированы по фону с использованием контроля с пустым вектором рЕТЗОЬ. Кратность индукции рассчитывали путем деления средних значений флуоресценции клеток, подвергшихся воздействию лиганда, на среднюю флуоресценцию клеток без лиганда.
Пример 17. Внутриклеточная визуализация флуоресценции 5НТР.
ДНК и культуры готовили, как описано (Paige et al., Science, 2012, 335, 1194). Вкратце, слитая последовательность тРНК/Broccoli была клонирована в рЕТЗОЬ между сайтами XbaI и BlpI после индуцируемого промотора Т7. Отсиквенированная плазмида была трансформирована в клетки STAR BL21 (DE3) (Invitrogen) и отдельные колонии выращивались в течение ночи в бульоне Лурия (LB) с добавлением 50 мкг/мл канамицина. Ночную культуру использовали для инокуляции в свежую среду LB с канамищином в разведении 1:1000, и культуру выращивали при 37°С до ОП600=0,4-0,6 перед индукцией 1 мМ IPTG и ростом при 37°С в течение 2-4 ч. 200 мкл полученной культуры центрифугировали, декантировали и ресуспендировали в 2 мл среды с минимальными солями М9, дополненной 50 мкг/мл канамицина, 5 мМ MgSO4 и 1 мМ IPTG. 200 мкл ресуспендированной культуры переносили в 96-луночные планшеты со стеклянным дном, покрытые поли-О-лизином (MatTek), и инкубировали при 37°С в течение одного часа. Среду затем удаляли и лунки промывали средой М9/канамицин/1 мМ IPTG перед добавлением 200 мкл среды М9, 1 мМ IPTG и 400 мкМ DFHBI-1T (Lucerna). Флуоресцентные изображения в реальном времени были получены на Andor iXon3 897 EMCCD с использованием 60-кратного масляного объектива, фильтра возбуждения 472/30, дихроичного зеркала 490 (длинный путь) и эмиссионного фильтра 520/40 на микроскопе Nikon Ti-E и проанализированы с помощью FIJI (Schindelin et al., Nat. Methods, 2012, 9, 676-682).
Пример 18. Анализ однократной транскрипции in vitro.
Шаблоны дцДНК транскрибировали, как описано ранее (Trausch et al., Structure, 2011, 19, 14131423). Вкратце, 50 нг ДНК-матрицы инкубировали при 37°С в течение 10 мин в 12,5 мкл 2х буфера транскрипции (140 мМ трис-HCl, pH 8,0, 140 мМ NaCl, 0,2 мМ ЭДТА, 28 мМ 3-меркаптоэтанол и 70 мг/мл BSA), 2,5 мкл 50 мМ MgCl2, 100-200 мкКю 32Р-АТФ и 0,25 единиц голофермента σ70 РНК-полимеразы E.coli (Epicenter Biotechnologies) на реакцию и доводили до 23 мкл. Уравновешенные реакции затем ини-
Claims (2)
- циировали добавлением 7,5 мкл реакционного буфера (165 мкМ каждого рНТФ, 0,2 мг/мл гепарина и желаемой концентрации лиганда) и инкубировали в течение 15 мин при 37°С, а затем гасили 8 М мочевиной. Реакции затем разделяли на 8% -ном денатурирующем ПААГ, сушили и экспонировали на экране устройства для визуализации радиоактивного фосфора. Измерение интенсивностей на гелях затем проводят в ImageJ (NIH) и данные подгоняют к модели с двумя состояниями.Номера доступа.Координаты и структурные факторы были депонированы в RSCB Protein Data Bank под номером доступа 4ZAQ.Включение с помощью ссылки.Содержание всех ссылок (включая ссылки на литературу, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и одновременно находящиеся на рассмотрении патентные заявки), цитируемых в данном изобретении, полностью включено в данный документ посредством ссылки. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, соответствуют значению, общеизвестному специалисту в данной области техники.Эквиваленты.Специалисты в данной области техники распознают или смогут установить, используя не более чем обычные эксперименты, многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления, представленных в данном документе. Такие эквиваленты предназначены для охвата следующей формулой изобретения.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Библиотека олигонуклеотидов РНК, содержащая множество неидентичных олигонуклеотидов РНК, при этом индивидуальные олигонуклеотиды РНК содержат структурный остов, включающий:a) первую последовательность, содержащую спиральный домен;b) вторую последовательность, содержащую первый шпильковидный домен;c) третью последовательность, содержащую второй шпильковидный домен; иd) стык (junction) олигонуклеотидов, при этом указанный стык олигонуклеотидов включает (i) последовательность, объединяющую спиральный домен, первый шпильковидный домен и второй шпильковидный домен и (ii) лигандсвязывающий домен, и при этом указанная библиотека содержит множество неидентичных лиганд-связывающих доменов.2. Библиотека олигонуклеотидов РНК, содержащая множество неидентичных олигонуклеотидов, при этом индивидуальные олигонуклеотиды содержат структурный остов, включающий:a) первую последовательность, содержащую спиральный домен;b) вторую последовательность, содержащую первый шпильковидный домен;c) третью последовательность, содержащую второй шпильковидный домен; иd) стык олигонуклеотидов, при этом указанный стык олигонуклеотидов включает (i) последовательность, объединяющую спиральный домен, первый шпильковидный домен и второй шпильковидный домен, и (ii) предварительно выбранный лиганд-связывающий домен, и при этом указанная библиотека содержит множество неидентичных лиганд-связывающих доменов.3. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что каждый спиральный домен независимо представляет собой полностью комплементарную спираль, необязательно содержащую один или несколько дестабилизирующих нуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из несовпадающей пары оснований, нестабильной пары оснований G-U и выпуклости.4. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что каждый спиральный домен представляет собой полностью комплементарную спираль.5. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что каждый первый шпильковидный домен независимо содержит один или несколько дестабилизирующих нуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из несовпадающей пары оснований, нестабильной пары оснований G-U и выпуклости.6. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что каждый второй шпильковидный домен независимо содержит один или несколько дестабилизирующих нуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из несовпадающей пары оснований, нестабильной пары оснований G-U и выпуклости.7. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанный спиральный домен имеет длину, по меньшей мере, от 4 до 10 пар оснований.8. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.7, отличающаяся тем, что указанный спиральный домен имеет длину, по меньшей мере, 10 пар оснований.9. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанные олигонуклеотиды являются олигорибонуклеотидами.10. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что индивидуальные оли-- 44 044975 гонуклеотиды содержат последовательность, имеющую ряд соединенных последовательностей в соответствии с формулой I:Pl-Jl/2-P2-L2-P2'-J2/3-P3-L3-P3'-J3/l-Pl ' (I), при этом - представляет собой связь;Р1 и Р1' образуют спираль;Р2, L2 и Р2' образуют первую шпильку;Р3, L3 и Р3' образуют вторую шпильку; иJ1/2, J2/3 и J3/1 вместе образуют стык олигонуклеотидов.11. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.10, отличающаяся тем, что J2/3 содержит мотив Тпетли.12. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.11, отличающаяся тем, что мотив Т-петли содержит последовательность UUGAA.13. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.12, отличающаяся тем, что гуанозин Т-петли образует Уотсон-Криковскую пару оснований с цитидином в J3/1.14. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанный спиральный домен имеет первый конец и второй конец, и указанный первый конец проксимален по отношению к стыку олигонуклеотидов, а второй конец соединен с модулем считывания на основе олигонуклеотида.15. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.14, отличающаяся тем, что указанный модуль считывания на основе олигонуклеотида представляет собой флуорогенный модуль или модуль считывания на основе переключателя.16. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.15, отличающаяся тем, что указанный флуорогенный модуль представляет собой аптамер Broccoli, связывающий флуорофор.17. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.15, отличающаяся тем, что основанный на переключателе модуль представляет собой переключатель pbuE.18. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.14, отличающаяся тем, что модуль считывания на основе олигонуклеотида представляет собой модуль считывания на основе олигорибонуклеотида.19. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что индивидуальные олигонуклеотиды содержат последовательности, имеющие последовательность, соответствующую последовательности гуанинового рибопереключателя xpt-pbuX Bacillus subtilis, включающую около 23 вариабельных нуклеотидных остатков в пределах стыка олигонуклеотидов.20. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что индивидуальные олигонуклеотиды содержат последовательности, имеющие последовательность, соответствующую последовательности рибопереключателя Vc2 циклического di-GMP Vibrio cholera, включающую около 21 вариабельного нуклеотидного остатка в пределах стыка олигонуклеотидов.21. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что индивидуальные олигонуклеотиды содержат последовательности, имеющие последовательность, соответствующую последовательности рибозима хаммерхэд Schistosoma mansoni, включающую около 21 вариабельного нуклеотидного остатка в пределах стыка олигонуклеотидов.22. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанный стык олигонуклеотидов представляет собой N-членный стык, при этом N равно трем, четырем или пяти.23. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанный стык олигонуклеотидов представляет собой N-членный стык, при этом N равно трем.24. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанный стык олигонуклеотидов представляет собой N-членный стык, при этом N равно четырем.25. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанный стык олигонуклеотидов представляет собой N-членный стык, при этом N равно пяти.26. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что библиотека содержит от около 4 до около 4 неидентичных членов.27. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что предварительно выбранный лиганд-связывающий сайт содержит сайт связывания для соединения, выбранного из группы, состоящей из аминокислоты, пептида, нуклеинового основания, нуклеозида, нуклеотида, иона металла, нейротрансмиттера, гормона, активного фармацевтического ингредиента и их производных.28. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.27, отличающаяся тем, что предварительно выбранный лиганд-связывающий сайт содержит сайт связывания для лиганда, выбранного из группы, состоящей из аминокислоты, нуклеинового основания, нуклеозида, нуклеотида, нейротрансмиттера, гормона и их производных.29. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.28, отличающаяся тем, что предварительно выбранный лиганд-связывающий сайт содержит сайт связывания для лиганда, выбранного из группы, состоящей из нуклеотида, нейротрансмиттера, гормона и их производных.30. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что предварительно выбранный лиганд-связывающий сайт содержит сайт связывания, по меньшей мере, для одного лиганда,- 45 044975 выбранного из группы, состоящей из 5-гидрокси-L-триптофана, L-триптофана, серотонина и 5-гидроксиL-триптофан-метиламида.31. Библиотека олигонуклеотидов РНК по п.30, отличающаяся тем, что лигандом является, по меньшей мере, один из 5-гидрокси-L-триптофана или серотонина.32. Способ селекции множества неидентичных лиганд-связывающих олигонуклеотидов РНК, включающий стадии:1) контактирования библиотеки олигонуклеотидов РНК, содержащей множество олигонуклеотидов РНК, с лигандом в условиях, подходящих для связывания лиганда, при этом индивидуальные олигонуклеотиды РНК содержат структурный остов, включающий:a) первую последовательность, содержащую спиральный домен;b) вторую последовательность, содержащую первый шпильковидный домен;с) третью последовательность, содержащую второй шпильковидный домен; иd)стык олигонуклеотидов, при этом указанный стык олигонуклеотидов включает последовательность, объединяющую спиральный домен, первый шпильковидный домен и второй шпильковидный домен; и
- 2) разбиение библиотеки олигонуклеотидов РНК на пространственно адресуемые части, так что выбирается множество неидентичных лиганд-связывающих олигонуклеотидов РНК, при этом выбираются указанные олигонуклеотиды РНК, имеющие указанный стык олигонуклеотидов, дополнительно содержащий лиганд-связывающий домен, и при этом указанные лиганд-связывающие домены указанной библиотеки олигонуклеотидов содержат вариабельные нуклеотидные остатки.33. Способ по п.32, который дополнительно включает этап 1а) между этапом 1) и этапом 2), этап 1а), включающий конкурентное разделение указанной библиотеки олигонуклеотидов РНК с помощью раствора свободного лиганда.-
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/432,879 | 2016-12-12 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA044975B1 true EA044975B1 (ru) | 2023-10-18 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220170009A1 (en) | Use of biological rna scaffolds with in vitro selection to generate robust small molecule binding aptamers for genetically encodable biosensors | |
Ciesielski et al. | Animal mitochondrial DNA replication | |
Famulok et al. | Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy | |
KR20170029512A (ko) | 인트론 잔류의 감소 | |
US6446032B1 (en) | Designing compounds specifically inhibiting ribonucleic acid by binding to the minor groove | |
US9061043B2 (en) | Aptamers to glycoprotein VI | |
JP2002518452A (ja) | Hivの治療薬物の製造のための他の抗hiv薬と組み合わせた3’−アジド−2’,3’−ジデオキシウリジンの使用 | |
de Breyne et al. | Translation initiation is driven by different mechanisms on the HIV-1 and HIV-2 genomic RNAs | |
Puah et al. | Selective binding to mRNA duplex regions by chemically modified peptide nucleic acids stimulates ribosomal frameshifting | |
US8106179B2 (en) | Small interfering RNA specific to sub-units α, α′and β of the Kinase Protein ck2, and the applications of the same | |
Ciesielska et al. | Remdesivir triphosphate blocks DNA synthesis and increases exonucleolysis by the replicative mitochondrial DNA polymerase, Pol γ | |
Romanucci et al. | New findings on the d (TGGGAG) sequence: Surprising anti-HIV-1 activity | |
EA044975B1 (ru) | Использование биологических рнк-остовов с селекцией in vitro для получения эффективных и надежных аптамеров, связывающих малые молекулы, для генетически кодируемых биосенсоров | |
CN114574496B (zh) | 核苷类衍生物改性的核酸适体sgc8 | |
Bera et al. | Differential assembly of Rous sarcoma virus tetrameric and octameric intasomes is regulated by the C-terminal domain and tail region of integrase | |
NZ795228A (en) | Use of biological rna scaffolds with in vitro selection to generate robust small molecule binding aptamers for genetically encodable biosensors | |
Bailey et al. | Stability-Based Proteomics for Investigation of Structured RNA–Protein Interactions | |
EP1311672B1 (en) | tRNA-derived inhibitors of HIV reverse transcriptase | |
Deogharia | Pseudouridine Modifications in Human tRNAs and Archaeal rRNAs | |
AU2001284570A1 (en) | New sequences | |
Srinivasan | Understanding The Molecular Mechanisms Of The RNA Helicases DHX36 And DDX41 | |
Brazane | Functions of the ribose methyltransferase FTSJ1 in regulation of gene expression and neural development | |
WO2015006641A2 (en) | Methods and compositions for interference with dna polymerase and dna synthesis | |
Bhagdikar et al. | Cellular, Molecular & Biochemical Sciences Training Program/Center for RNA Biology Annual Symposium 2019 | |
Bhattacharjee | Characterization of the DNA Binding Properties of CST (CTC1-STN1-TEN1) And Their Importance for CST Function in Telomeric as well as Genome-wide Replication |