CN101851289A - H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的人源化抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了可特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白之人源化抗体，该人源化抗体可用于预防，和治疗禽流感病毒，特别是H5亚型禽流感病毒引起的疾病.本发明也提供了相关的氨基酸序列，以及其含该人源化抗体的药物组合物。

Description

H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的人源化抗体及其用途

发明领域

本发明涉及可特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白之人源化抗体，及其保守性变异体或活性片段，及应用该人源化抗体或片段用于预防与治疗的方法和用途。背景技术自H5型禽流感于1996年首先在我国广东省农场的鹅群暴发以来(Xu X et al.，1999，Virology)，由此病毒演生出来的另一株H5病毒在香港的禽鸟农场(1997年4月)及市场(1997年11月)暴发，引起了历史上禽流感病毒第一次直接由禽传人事件，前后共18例确诊病例中有6人死亡。2003年以来，H5病毒株在整个东亚及东南亚国家的相继暴发，WHO及流感专家预测H5禽流感病毒将最有可能成为下一次人类大流感暴发的流行株。2004年初，H5型高致病性禽流感也先后在我国十几个省暴发，并在中国香港、泰国、荷兰等发现H5型禽流感传染鸡、鸭、苍鹭、虎、猫等多种动物的事件。更令人担忧的是，在泰国已经出现疑似人传染人事件，马来西亚也有多例报道。进入2005年，罗马尼亚、俄罗斯、土耳其等欧洲国家相继发现禽类感染H5型禽流感病毒致死事件，专家认为此乃带毒候鸟迁移的结果，这使得控制高致病性H5型禽流感病毒的进一步扩散传播变得更为困难。专家预测，随着侯鸟的传播，H5型禽流感病毒有可能通过欧亚、亚非大陆桥进一步传播到卫生条件极差的非洲国家，使得H5型禽流感病毒获得和其它人流感病毒充分重组的机会和时间，届时将很可能形成一种对人类高度致命的全新流感病毒，其给人类带来的各种损失将难以估计。根据WHO统计结果，截止2006年1月19日，全球因感染H5N1病毒死亡的人类个案已达80例，给全球公共卫生安全带来极大的考验。目前经过长期使用确定有效的两种的流感病毒治疗药物主要为两个类型：M2离子通道抑制剂金刚烷胺(amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)，神经酰胺酶抑制剂奥司他韦(oseltamivir)和扎那米韦(zanamivir)(Monto，A.S.Vaccine，2003.21(16)：1796-800)。前两者以抑制病毒离子通道蛋白M2而发挥抗病毒效果；后者能选择性地抑制病毒表面神经氨酸酶的活性，阻止子代病毒颗粒在宿主细胞的复制和释放，有效地预防感冒和缓解症状，使目前比较有效的抗流感病毒药物，但目前已不断发现新的H5N1病毒变异株对其有抗药性。这些药物如果在发病的最初2天内服用，将会缩短病程甚至拯救病人的生命。虽然离子通道抑制剂对于流感病毒的一些亚型十分有用(Dolin，R.etal.，N Engl J Med，1982.307(10)：580-4)，但是它却有很严重的副作用，并且病毒正在很快的进化出了耐药株(Shiraishi，K.et al.，JInfect Dis，2003，188(1)：57-61)，而且这些耐药株的传播性和致病性并没有减弱。感染过H5N1病毒而得到恢复的病人拥有在体外实验能中和病毒的抗体，提示抗体可作为治疗方法之一(de Jong，M.D.et al.，Nat Med.，2006，12：1203-1207)。在临床上，多克隆及单克隆抗体可有效地用于预防甲肝、乙肝、狂犬、呼吸道合胞病毒(RSV)感染(Sawyer，L.A.，Antiviral Res.，2000，47：57-77)。在1918年西班牙流感期间亦用人恢复期血清治疗，使流行期的死亡率下降了50％(Luke，T.C.etal.，Ann Intern Med.，2006，145：599-609)。我国SARS病人和H5N1感染病人的成功治疗经验，也发现利用病人恢复性血清能够很好的抑制病毒在体内的复制，从而使生命垂危的患者恢复健康。在小鼠动物模型中，H5N1特异的人源化鼠单抗、全人源单抗和F(ab’)2片段已被证明能有效地预防和治疗H5N1(Lu，J.et al.，Respir Res.，2006，7：43；Simmons，C.P.et al.，PLOS Medicine，2007，4(5)：928-936；Hanson，B.J.et al.，Respir Res.，2006，7：126)。高致病性禽流感病毒H5N1在受体结合位点的持续抗原突变即抗原漂变(antigenic drift)，对这些抗体的广谱抗病毒治疗能力提出了挑战。因此具有广谱中和能力的单抗的获得将成为H5N1治疗的希望，利用高质量的抗H5N1广谱中和性单抗治疗H5N1病毒感染患者可能会有抑制H5N1病毒在机体内的复制并获得理想的治疗效果，这是一种全新的抗病毒治疗方式。本实验室利用不同时间、不同地点、不同宿主分离到的多个禽流感病毒H5N1代表株免疫小鼠，持续进行单克隆抗体的制备，已制备出了包含400多株具有血凝抑制(HI)活性的H5特异性单克隆抗体的H5单抗库。根据对近千株全球各地H5N1病毒基因组序列进行的系统进化分析，我们筛选出34株不同地域、不同进化分支、不同宿主来源的H5N1代表株，加上2006年最新分离出的7个毒株共41个毒株组成代表性H5N1病毒库。对这41株H5N1病毒进行各单抗的HI活性测定，可根据HI活性的差异将这400多株单抗分为10个类型，同时可将这41株代表性病毒分为八个HI活性分支。初步筛选出17株单抗对2002以来的H5N1病毒株的抗原多样性进行分析。根据血凝抑制实验和细胞中和实验的结果，可将7种H5N1亚型分成4个抗原群。其中13D4、16F13等单抗均可对绝大部分毒株具有很高的中和活性，为治疗性抗体研究奠定了基础(Wu，W.L.，Chen，Y.，Wang，P.，Song，W.，Lau，S.Y.，Rayner，J.M.，Smith，G.J.，Webster，R.G.，Peiris，J.S.，Lin，T.，Xia，N.，Guan，Y.and Chen，H.2008，J Virol.82(4)，1798-1807)。

本发明的根本目的在于，获得13D4治疗性单抗的人源化抗体，及其保守性变异体或活性片段，以期用于H5N1病毒治疗性药物的研制及相关研究。

发明内容

本发明提供了可特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白之人源化抗体，该人源化抗体可用于预防和/或治疗禽流感病毒，特别是H5亚型禽流感病毒引起的疾病.本发明也提供了相关的核酸分子，以及其含该人源化抗体的药物组合物。附图说明图1是13D4鼠单抗人源化的模板及人源化抗体FR区部分氨基酸的替换.其中下划线斜体为CDR区；括号中的两个氨基酸表示该位点有两种氨基酸的替换方式.图2显示13D4人源化单链抗体库片段的PCR扩增策略。图3显示13D4人源化单链抗体库DNA片段的PCR扩增结果。图4显示带有13D4人源化单链抗体的噬菌粒载体pCANTAB 5E。图5显示噬菌体抗体在HA和YU22抗原上进行ELISA检测的结果。图6显示四株13D4人源化抗体VH，VL中保留的鼠抗体氨基酸位点。图7显示八株13D4人源化抗体VH，VL中保留的鼠抗体氨基酸位点.图8显示8株13D4人源化噬菌体单链抗体与HA1及YU22病毒的ELISA反应结果.M13噬菌体为阴性对照.二抗为HRP-anti-M13抗体.图9显示含有人抗体CH和CK片段的表达载体PLAN3-CHCK图10显示13D4人源化抗体的真核表达载体PLAN3-CHCK-H13D4.图11显示潮霉素抗性筛选表达人源化抗体的稳定细胞株图12显示经Protein A纯化后人源化抗体的SDS-PAGE结果.A.H1108-18；B.Y1213-21；C.H1121-29；D.H1108-18；E.37；F.H1121-37；G，H1126-08图13显示13D4人源化抗体与HA1反应的ELISA结果。

具体实施方式

本发明申请中涉及的有关术语的定义如下：

本发明中的“血凝素”一词指禽流感病毒的包膜糖蛋白。血凝素蛋白介导流感病毒针对宿主细胞的吸附和进入。禽流感病毒的血凝素蛋白有16个血清学亚型，HA1-HA16，分别对应于16个病毒亚型，即H1-H16。

本发明中的“抗体”一词指任何免疫球蛋白，包括能结合特异性抗原的单抗、多抗、双特异性或多特异性抗体。一个完整的抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链含有一个可变区和第一、第二、第三三个恒定区；每条轻链包含一个可变区和一个恒定区。抗体呈“Y”型，“Y”型结构的颈部含有两条重链的第二和第三恒定区，其通过二硫键结合形成。“Y”型结构的每条臂含有其中一条重链的第一恒定区和可变区(VH)，和一条轻链的可变区(VL)和恒定区。轻链和重链的可变区决定抗原的结合；每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3(其由Kabat等人命名，见Sequences ofProteins of Immunological Interest，Fifth Edition(1991)，第1-3卷，NIH Publication 91-3242，Bethesda Md)。其中，三个CDR由构架区(FR)间隔开。构架区比CDR区更保守并形成一个架子状结构支撑超变区。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类，主要是：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些类还进一步分成亚类，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2等。

本发明中的“抗体”一词，除特指完整的免疫球蛋白外，也指免疫球蛋白的片段(如至少是免疫球蛋白分子的一个免疫活性区段)，如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、单链抗体分子或由含有一个或多个CDR区的免疫球蛋白分子的任意片段形成的多特异性抗体。另外，本发明涉及的抗体也可以是由一个特定的人免疫球蛋白中的一个或多个CDR区结合一个或多个不同的人免疫球蛋白的构架区形成的抗体。

抗体相关的“Fab”片段是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。

“Fab’”片段是指包含了部分铰链区的Fab片段。

F(ab′)2指的是Fab’的二聚体。

抗体的“Fc”指的是第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合成的抗体的一部分。抗体的Fc段有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。

抗体的“Fv”段指的是能结合完整的抗原结合位点的抗体的最小片段。一个Fv片段包括一条轻链的可变区(VL)结合到一条重链的可变区(VH)。

本发明中的“单链抗体”或“scFv”指的是由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体(Houston1988)

本发明中的“单链抗体Fv-Fc”或“scFv-Fc”也包括scFv连接抗体的Fc段形成的工程抗体。

本发明中的“抗原决定簇”(或称表位)指的是抗原分子中与抗体结合的那部分氨基酸或原子基团。

本发明中的“单抗”一词指的是来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除仅在少数情况下可能出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。单抗与多抗不同，多抗是包含了识别抗原上的不同表位的抗体分子。虽然传统的单抗是由杂交瘤细胞分泌的，但本发明涉及的单抗并不仅限于此制备方法。如，本发明涉及的单抗可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature，256：495，1975)，也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。

本发明中的“嵌合抗体”一词指的是抗体轻链或/和重链的一部分源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类的序列相同或同源的抗体，而抗体轻链或/和重链的另一部分源自另一物种或属于另一抗体类或亚类的序列相同或同源的抗体。不管怎样，这种抗体片段仍保留了对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567 to Cabilly et al.；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851 6855(1984))。

本申请中，“人源化抗体”一词指的是人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是有预期特异性、亲和性和反应性的小鼠、大鼠或兔抗体。另外，人源免疫球蛋白的构架区(FR)的氨基酸序列也可被相应的非人源抗体的氨基酸序列所替换。而且，人源化抗体的氨基酸残基也可以既非来源于受体抗体，也非来源于供体抗体的CDR区或构架区序列。这些人工修饰的目的是进一步完善或优化抗体性能。总之，人源化抗体是指含有至少一个、通常是两个几乎完整的可变区，其中对应的所有或几乎所有的CDR区是来自非人源抗体，其中的全部或几乎全部的FR区是来自人源抗体。理想的人源化抗体至少含有免疫球蛋白的Fc区的一部分，通常是人源免疫球蛋白的Fc区。更多详细内容请参阅：Jones et al.，Nature，321：522 525(1986)；Reichmann et al.，Nature，332：323 329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593 596(1992)；and Clark，Immunol.Today 21：397 402(2000).

本申请涉及的“被分离的”、“分离的”，指的是天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“被分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变或从天然环境下离分出该物质，或二者情况均有发生。比如，某一活体动物体内天然存在的某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为被分离。这里的“被分离”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

本发明中“载体”一词指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。

本发明中“宿主细胞”一词指的是导入载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。宿主细胞可以是离体的或者在体的，可以是培养的细胞或者细胞系。

“中和抗体”一词指的是能清除或显著降低目标病毒抗原结合毒力的抗体或抗体片段。

“序列相同百分比”一词指的是候选序列中的核酸或氨基酸分别与对应的核酸或多肽序列中核酸或氨基酸相同性的百分比。这里涉及到的与核酸序列或者多肽序列有关的术语“序列相似百分比”定义为候选核酸序列或氨基酸残基序列分别与目的核酸序列或氨基酸序列的相似百分比。对于某一个序列，将它和目的序列进行比对，必要时可跳过突变缺口，以达到最大的基因相似百分比，而不去考虑相似序列的任意保守性突变。本领域的多种比对方法可用于确定核酸或氨基酸序列的相似性，如可用的计算机软件包括BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)等。熟悉本领域技术的工作人员懂得给比对设定合适的测量参数，包括为使用最大可比性的一些运算法则达到而全长序列的比较。

“特异性结合”一词指的是，指两分子间的非随机结合反应，如抗体和产生该抗体的抗原间的反应。此处，结合第一种抗原的抗体对第二种抗原的结合亲和力是检测不到或很弱。在某些实施方式中，一个某抗原特异性抗体是指以亲和力(KD)≤10^-5M(如10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M等)结合该抗原，其中KD指解离率与结合率的比值(koff/kon)，其可以采用本领域技术人员熟悉的方法进行测定。本发明在如下段落中进行举例说明：

抗体

本发明所述单抗和人源化抗体能够特异性结合H5亚型禽流感病毒。本发明的一个方面涉及能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单抗和人源化抗体及其相应的抗原结合片段。

本发明所述抗H5单抗优选是由小鼠杂交瘤细胞株13D4所分泌的。单抗的名称以其相应的杂交瘤细胞株进行命名。也就是，此抗H5单抗由杂交瘤细胞株13D4产生，并命名为13D4。单抗13D4能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白。小鼠杂交瘤细胞株13D4已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，Wuhan University，Wuhan，China)进行保藏，保藏号是CCTCC-C200721(保藏时间2007年5月29日)

可以采用Kohler等在Nature 256：495(1975)中报道的杂交瘤制备方法来制备单抗。首先将免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。免疫原预先藕联到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆姨酶抑制剂上，可能会有助于增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以利用福氏佐剂或MPL-TDM等。动物受免疫后，体内会有分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞产生。另外，淋巴细胞也可以利用体外免疫获得。收集目的淋巴细胞与骨髓瘤细胞并用合适的融合剂，如PEG，进行融合以获得杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1996)。

上述制备的杂交瘤细胞可以接种到合适的培养液中生长，培养液中最好含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT or HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养液中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。

优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养液敏感等能力。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如MOP-21and MC-11小鼠肿瘤衍生株(THE Salk Institute Cell DistributionCenter，San Diego，Calif.USA)，和SP-2/0 or X63-Ag8-653细胞株(American Type Culture Collection，Rockville，Md.USA)。另外也有研究报道利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。

杂交瘤细胞生长的培养液用于检测针对特异抗原的单抗的产生。测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性有免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，利用Munson等在Anal.Biochem.107：220(1980)描述的Scatchard分析法可用来测定单抗的亲和力。

当杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性确定之后，目的细胞株可以通过(Goding，Monoclonal Antibodies：Principlesand Practice，pp.59-103，Academic Press，1996)所描述的标准的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。

利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。

本发明所述单抗还可以是通过基因工程重组技术获得。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，如E.coli细胞、猿猴COS、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。转染后的宿主细胞在特定条件下培养并表达目标抗体。

本发明的抗体和人源化抗体对H5血凝素蛋白结合具有高特异性和高亲和力。这些抗体对其它亚型的血凝素蛋白可能会有弱的交叉反应性，优选地，这些抗体对其它亚型的血凝素蛋白完全没有交叉反应性。一方面，本发明的抗体和人源化抗体结合H5血凝素的KD值小于1x10^-5M；优选地，KD值小于1x10^-6M；更优选地，KD值小于1x10^-7M，最优选地，KD值小于1x10^-8M。

本发明的单抗和人源化抗体可以是包含两条重链和两条轻链的传统的“Y”型结构状的抗体。另外，所述抗体也可以是保持了对血凝素蛋白亲和力的传统的“Y”型结构状的抗体上的Fab片段、Fab′、F(ab)₂、Fv、或其它类型的部分片段，其结合血凝素蛋白的亲和力可以高于或低于传统的“Y”型结构状的抗体。

本发明的抗体片段可以利用水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto et al.，J.Biochem.Biophys.Methods 24：107-117(1992)and Brennan et al.，Science 229：81(1985))。另外，这些抗体片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed in Hudson，Curr.Opin.Immunol.11：548-557(1999)；Little et al.，Immunol.Today，21：364-370(2000))。比如，Fab′片段可以直接从E.coli细胞中获得或化学藕联形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology，10：163-167(1992))。再如，F(ab′)₂片段可以用亮氨酸拉链GCN4连接获得。另外，Fv、Fab或F(ab′)₂片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备抗体片段的其它技术。

抗体核酸序列

本发明涉及特异性结合H5血凝素蛋白的抗体或人源化抗体或抗体片段的编码核酸分子。编码抗体的核酸分子可以从杂交瘤细胞中分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓利用常规技术可以测定这些分子的核酸序列。本发明涉及的抗体核酸分子也可以利用传统的基因工程重组技术或化学合成方法获得。一方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列包含了抗H5抗体的重链可变区或抗体分子的部分核酸序列。另一方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列也包括抗H5抗体的轻链可变区或抗体分子的部分核酸序列。另一方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列还包括重链或轻链可变区的CDR序列。互补决定区(complementary determinant region，CDR)是与抗原表位结合的部位，本研究中的CDR序列通过Kabat方法进行确定。但是不同的划分方法得到的CDR序列稍有不同。

本发明还提供能特异性结合H5亚型禽流感病毒的抗体片段的编码序列的核酸分子。本发明更进一步还涉及编码抗体重链可变区氨基酸序列SEQ ID NOs：4-6之一的被分离的核酸分子。本发明还涉及编码抗体轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NOs：7-9之一的核酸分子。本发明更进一步还涉及编码人源化抗体重链可变区氨基酸序列SEQID NO：10、SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26，SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32之一的被分离的核酸分子。本发明还涉及编码抗体轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：33之一的核酸分子。

本发明涉及含有本发明所述核酸分子的重组表达载体，也涉及转化了这些分子或者载体的宿主细胞。而且，本发明还涉及利用包含了所述核酸分子的宿主细胞在特定条件下培养并分离得到发明所述抗体的方法。

人源化抗体和抗体多肽序列

单抗13D4重链和轻链可变区氨基酸序列可以从对应的核酸序列中推导得到。单抗13D4重链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。单抗13D4轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO：3。[0095]另一方面，本发明也包括了人源化抗体，它们是由鼠源单抗13D4或其变异体的一个或多个CDR嫁接到人源抗体的框架上组成的。一方面，本发明提供的人源化抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQID NO：10、SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：2O，SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26，SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：30、或SEQ ID NO：32。另一方面，本发明提供的人源化抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21，SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：33。

另一方面，本发明提供人源化抗体的重链可变区的一个或多个氨基酸替代的变异体，其氨基酸序列与SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20，SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32的序列相似性至少达70％，优选是至少75％，优选是至少80％，优选是85％，再优选是至少90％，最好的是至少95％。优选地，所述替代的氨基酸个数为1-20个，例如1-10个，优选1-5个，包括1、2、3、4、5个。

另一方面，本发明提供人源化抗体的轻链可变区的一个或多个氨基酸替代的变异体，其氨基酸序列与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21，SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：33的序列相似性至少达70％，优选是至少75％，优选是至少80％，优选是85％，再优选是至少90％，最好的是至少95％。优选地，所述替代的氨基酸个数为1-20个，例如1-10个，优选1-5个，包括1、2、3、4、5个。

单抗13D4的重链和轻链可变区的CDR的氨基酸序列确定如下：单抗13D4重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ IDNos：4-6。单抗13D4轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID Nos：7-9。

另一方面，本发明提供了抗H5的人源化抗体重链或片段，其含有如下CDR：来自SEQ ID NOs：4-6的一个或多个CDR。一实施方式中，抗H5人源化单抗重链或片段含有三个其氨基酸序列为SEQ IDNOs：4-6的CDR。

另一方面，抗H5人源化抗体的重链或片段的CDR含有的氨基酸序列可能是在SEQ ID NOs：4-6上出现一个或多个氨基酸的突变或增添或缺失。优选的是，突变或添加或缺失的氨基酸不超过3个氨基酸。更优选的是，突变或添加或缺失的氨基酸不超过2个氨基酸。最优选的是，突变或添加或缺失的氨基酸不超过1个氨基酸。

另一方面，本发明提供了抗H5人源化抗体轻链或片段含有如下CDR：来自SEQ ID NOs：7-9的一个或多个CDR。在一实施方式中，抗H5人源化抗体轻链或片段含有三个其氨基酸序列为SEQ ID NOs：7-9的CDR。

另一方面，抗H5人源化抗体的轻链或片段的CDR含有的氨基酸序列可能是在SEQ ID NOs：7-9上出现一个或多个氨基酸的突变、增添或缺失。优选的是，突变、添加或缺失的氨基酸不超过3个氨基酸。更优选的是，突变、添加或缺失的氨基酸不超过2个氨基酸。最优选的是，突变、添加或缺失的氨基酸不超过1个氨基酸。

上述人源化抗体或CDR区或可变区的氨基酸发生突变、添加或缺失之后的变异体仍然保留特异性结合H5亚型禽流感病毒的能力。本发明也包含这样的抗原结合片段的变异体。本发明还提供编码任何上述抗体、重链、轻链、可变区、CDR、片段、或变异体的核酸。还提供包含编码任何上述抗体、重链、轻链、可变区、CDR、片段、或变异体的核苷酸序列的核酸。

本发明的人源化抗体变异体可以通过传统的基因工程方法获得。本领域的技术人员完全知晓利用核酸突变改造DNA分子的方法。另外，编码重链和轻链变异体的核酸分子也可以通过化学合成获得。

融合蛋白

另一方面，本发明还提供了藕联或融合了某种分子的完全或部分含有本发明所述人源化抗体的融合蛋白。

人源化抗体和融合蛋白都可以利用传统的基因工程技术获得。如，编码单抗的DNA可以通过突变的方法把人源抗体的重链和轻链的恒定区的序列替换成同源性的鼠源序列而改造成(Morrison，et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.81：6851(1984))，或通过把整个或部分免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白编码序列进行共价藕联而获得人源化抗体或融合蛋白。

中和抗体

另一方面，本发明提供了能够中和H5亚型禽流感病毒之病毒活性的抗H5抗体。在一实施方式中，这种中和抗体能够中和H5亚型禽流感病毒之病毒活性的至少60％，或至少70％，或优选至少75％，或优选至少80％，或优选至少85％，或优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％。

本领域普通技术人员完全知晓利用传统的技术方法可以测定抗体中和H5亚型禽流感病毒的病毒活性。如本发明的实施例1中所描述的中和试验的方法即可用于测定本发明中的某一个特定H5单抗的中和活性。

治疗方法和药物组合物

本发明提供了一种预防和治疗禽流感病毒相关病毒感染患者的方法，包括对患者干预一定量的包含了一种或多种本发明所述单抗的有药物活性的药物组合物。本发明还提供了一种含有本发明所述的一种或多种人源化抗体或单抗的药物组合物或在此基础上得到的盐类药物。

本发明所述药物组合物的干预方式可以是传统的干预途径，包括口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径，但不仅局限于此。

适合肠胃外途径注射的药物组合物可能含有符合药物制备要求的无菌水或非水溶液、气雾剂、悬浮液或乳剂，可在临用时重悬成可注射的溶液或气雾剂的无菌粉剂。如适合的水性和非水性载体，工具和各种稀释液如水、乙醇、多羟基化合物(如丙烯乙二醇、聚乙烯二醇、丙三醇及其类似物)，合适的混合物，菜油(如橄榄油)，和可用于注射的有机脂，如乙烷油酸。如使用卵磷脂衣壳维持药物的合适流动性。如使用气雾剂、表面活性剂以维持合适的颗粒尺寸。

本发明所述的药物组合物还可含有一些起保护性、保湿、乳化和气雾化的佐剂，也可以含有预防微生物污染的速溶成分，如各种抗细菌试剂、抗真菌试剂，如parabens，chlorobutanol，苯酚，山梨酸及类似物。也可以包括维持渗透压的试剂，如糖、NaCl及其类似物。可使用延长吸附的试剂来延长注射用药物组合物吸附时间，如单硬脂酸盐和凝胶等。

口服固相剂型包括胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂等。这些固相剂型中的活性成分至少混有一种传统的惰性药物赋形剂(或载体)如柠檬酸钠、磷酸钙，或(a)填充剂或添加剂如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖和硅酸；(b)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；(C)湿润剂，如甘油；(d)碎裂剂，如琼脂，碳酸钙，马铃薯粉或木薯粉；(e)缓凝剂，如石蜡；(f)促吸收剂，如四氨基混合物；(g)保湿剂，如十六烷基醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，如高岭土和斑脱土；(i)润滑剂，如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，硫酸十二烷醇钠，或其上述物质的混合物。在片剂和胶囊剂型中，可能还含有缓冲剂。

固相剂型可以通过做成改良释放或脉冲释放剂型，是在上述提到的各种直接释放赋形剂中添加一些能改变药物释放速率的赋形剂而形成，可以包含在剂型中也可以做成外衣的形式。速率释放改造剂包括羧丙基甲基纤维素，甲基纤维素，碳甲基纤维素钠，纤维素乙烷，醋酸纤维素，聚乙烯氧化物，黄原胶糖，异丙烯酸氨共聚物，氢化调味油，巴西棕榈蜡，石蜡，邻苯二酸醋酸纤维素，邻苯二甲酸羧丙基甲基纤维素，甲基丙烯酸共聚物或上述物质的混合物。改良释放和脉冲释放剂型可能含有一种或一组具有改良释放速率的赋形剂。

本发明所述药物组合物还可由快速的雾化剂或消溶剂(FDDFs)组成，可以包含如下成分：天冬氨酰苯丙氨酸甲酯，磺胺钾，柠檬酸，croscarmellose sodium，crospovidone，抗坏血酸，乙烷基丙烯酸盐，乙烷基纤维素，明胶，氢氧基丙基甲基纤维素，硬脂酸镁，甘露醇，甲基乙丁烯酸盐，调味薄荷，聚乙二醇，气化硅胶，二氧化硅，乙醇酸淀粉钠，硬脂酸延胡索酸钠，山梨醇，木糖醇。这里用于描述FDDFs的“雾化和消溶”一词，依赖于所用药物的溶解性，如药物是不可溶的，可制成快速的雾化剂型，如药物是可溶的，则可制成快速的溶剂型。

类似形式的固相组合物也使用诸如乳糖或牛奶糖或其它高分子量的聚乙二醇及类似的赋形剂制成软明胶或硬明胶的填充剂型。

诸如片剂、糖衣剂、胶囊剂和颗粒剂等之类的固体剂型可以通过诸如肠衣或其它本领域普通人员均知晓的外包衣壳的方式制成。也可以是含有乳浊剂、也可以是含有能起缓慢、延迟、控制活性药物释放的类似的成分。也可以使用多聚物和石蜡等成分进行包埋。如果合适，也可用上述一种或多种赋形剂把活性成分制成微囊的形式的剂型。

用于口服的液体剂型，包括符合药物要求的乳状剂、溶液、悬浮液、糖浆和西也剂等。除了活性成分，液体剂型也可含有本领域常用的一些惰性溶液，如水或其它溶剂，可溶性试剂和乳化剂，如乙烷基醇，异丙基醇，乙烷基碳酸盐，苯基安息香酸盐，丙稀乙二醇，1，3-丁烯乙二醇，油，特别是，棉籽油，落花生油，玉米油，橄榄油，调味油和芝麻油，甘油，氢糠基醇，聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯，以及上述物质的混合物或类似的物质。

除了这些惰性稀释液，药物组合物也可包括保湿剂、乳化剂、悬浮剂、糖化剂、调味剂和香味剂等佐剂。另外，药物组合物还可包括乙氧基化均聚乙醇，聚氧乙烯烷基山梨醇和山梨聚糖脂，微晶纤维素，间氢氧化铝，膨润土，琼脂聚合物和黄芪胶，或这些物质的混合物之类的悬浮剂。

本发明所述药物组合物也制成适合兽用治疗的混合物，或符合兽用的盐类，或符合兽用的溶剂或初成药，并根据普通兽医和兽医从业者的要求制成一种最适合某种特定动物的给药剂量和途径药物的合适剂型。

本发明所述一个或多个人源化抗体可以结合其它抗病毒试剂用于预防和或治疗H5禽流感病毒感染相关疾病。单抗可以和这些抗病毒试剂同时、分开或连续给药。其它抗病毒试剂包括利巴韦林，金刚烷，羧基脲，IL-2，IL-12和五羧链胞酸，但不仅限于这些。

实施例

下面结合具体实施例与附图，对本发明进一步加以描述，但这些描述并不构成对本发明的限制。实施例113D4抗体序列分析及人源模板的选择我们已克隆出13D4鼠单抗的基因可变区氨基酸序列，重链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，轻链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：3。采用Kabat方法，找出其中的CDR序列，如表1所示。表1通过Kabat方法确定的13D4单克隆抗体CDR氨基酸序列

通过CDR移植的方法对鼠源抗体13D4进行人源化。通过Blast搜索基因数据库(NCBI+GenBank+DDBJ+Kabat Database)，首先找出与鼠源抗体13D4的FR区同源性最高的人VH和VL胚系基因可变区序列。经同源性分析，确定以1-69-04，1-39-01(Hwang WY，Almagro JC，Buss TN，Tan P，Foote J.Use of human germline genes in a CDR homology-basedapproach to antibody humanization.Methods，2005，36(1)：35-42)及其胚系基因序列作为人抗体的模板，在NCBI，Kabat或GenBank中均有报道。再将鼠源抗体13D4的重链和轻链CDR区分别移植到人源模板VH和VL的FR框架上。然后通过构建噬菌体单链抗体库的方式来优化筛选人源化抗体的FR区氨基酸回复突变。具体方法为，分析人模板的FR区与鼠抗体的FR区中的不同氨基酸，靠近CDR区的氨基酸以及性质差别大的氨基酸均可存在两种可能的替换方式，即可以保持鼠源氨基酸，也可以是人源的氨基酸。总体而言，在FR区有21个位点有两种氨基酸的替换，因此构建的13D4人源化单链抗体库的氨基酸序列多样性理论上为1X10⁶。实施例213D4人源化单链抗体基因库的PCR引物设计及PCR方案采用重叠延伸PCR(splicing overlapping extension-PCR，SOE-PCR)方法获得13D4人源化单链抗体库基因片段。位于FR区的氨基酸替换采用简并引物方式来扩增。分别将重链和轻链拆分为大小约50bp的寡核苷酸序列，片段之间重叠约20bp。扩增13D4人源化单链抗体的寡核苷酸引物序列见表2，引物在13D4人源化单链抗体上的相应位置见图2。表2：13D4人源化单链抗体库基因扩增引物

引物名称	引物序列
		VhF11	5>AGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGC(TAC)ACATTCAGTGGGCACTGG<3
VhR1	5>CACTCAAGTCCTTGTCCAGGGSCCTGCYTTACCCACTCTATCCAGTG<3
		VhF12	5>CAGTCTGGAGCTGAGGTGAWGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAG<3
VhF13	5>TTCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTTCAGCTGGTG(CAG)CAGTCTGGAGCTGAGGTG<3
		VhF2	5>CTGGACAAGGACTTGAGTGGATSGGAGAGATTTTACCTGG<3
VhR2	5>TCCATGTAGGCTGTGCTCGTGGATKTATCTGCGGYGAWCGTGRCCYTGCCCTTAAACTTC<3
		VhF3	5>ACGAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGASATCTGAGGACACTGCCGTCTATTAC<3
VhR3	5>CCGCCTCCACCGCTACCACCCCCTCCAGATCCGCCACCTCCGGAGGACACGGTCACC<3
		VkF11	5>GTCTCCATCCTCCCTGTCCGCATCAGTAGGAGACAGGGTCWCCRTCACCTGCAAGGCCAG<3
VkR1	5>CTGTACCGGTAGGATGCCGAGTAAATCAGGAG(GGC)TTTCGGGGCTTTCCCTGGTTTCTGTTG<3
		VkF12	5>GGTGGTAGCGGTGGAGGCGGGAGTGACATCCAG(GTG)ATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTC<3
VkF2	5>CTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCATCC(GAC)CGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGG<3
		VkR2	5>GCAAAATCTTCAGGTTGCAGACTGCTGATGGTGAGAGTG<3
VkF3	5>CTGCAACCTGAAGATTTTGCAACC(GAC)TACTTC(TAC)TGTCAGCAATATAACAAC<3

 

VkR3	5>TTTGCGGCCGCCCGTTTTATTTCCACCTTGGTGCCGCC(GGC)ACCGAACGIGAGCGG<3
		plan3VHF1	5>TCCTGCTACTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTCCCAGGTTCAGCTGGTGCAG<3
plan3VHF2	5>CTCAAGCTTATGGGAAGGCTTACTTCTTCATTCCTGCTACTGATTGTCCC<3
		plan3VHR	5>TTTTGGTACCGGAGGACACGGTCACGGAG<3
plan3VKF1	5>GCTGCTGCTGTGGCTTACAGATGCAAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTC<3
		plan3VKF2	5>CGCGGATCCATGTCTGTGCCAACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTAC<3
plan3VKR	5>TTTTGATATCCCGTTTTATTTCCAGCTTG<3

以鼠源抗体13D4的重链可变区基因为模板，利用引物VhF11/VhR1，VhF2/VhR2，VhF3/VhR3进行第一轮PCR扩增，PCR条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，重复10个循环，再72℃反应10min，通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，并用DNA纯化回收试剂盒(TianGen，DP214-03)回收纯化PCR产物，获得第一轮扩增产物H1，H4，H5片段；以H1为模板，利用引物VhF12/VhR1进行PCR扩增，PCR条件同上，获得片段H2；以H2为模板，利用引物VhF13/VhR1进行PCR扩增，PCR条件同上，获得片段H3；对H3/H4进行SOE-PCR，具体步骤为：各取5ul片段H3，H4，不加引物，以同上条件进行PCR扩增5个循环后，取出扩增产物3ul为模板，加引物VhF13/VhR2，同上条件进行PCR扩增8个循环，获得片段H6；对H5/H6进行SOE-PCR，方法同上，获得片段H7。同样，以鼠源抗体13D4轻链可变区基因为模板，利用引物VkF11/VkR1，VkF2/VkR2，VkF3/VkR3进行第一轮PCR扩增，获得产物K1，K3，K4片段；以K1为模板，利用引物VkF12/VkR1进行PCR扩增，获得片段K2；对K3/K4进行SOE-PCR，获得片段K5；对K2/K5进行SOE-PCR，获得片段K6。将H7/K6进行SOE-PCR，PCR条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸50s，重复12个循环，再72℃反应10min，纯化回收后便获得13D4的人源化单链抗体库片段H-K。各PCR扩增片段结果如图3所示。实施例3：13D4人源化单链抗体库的构建将13D4的人源化单链抗体库DNA片段H-K用SfiI、NotI双酶切后，按片段与载体pCANTAB 5E(Amersham公司)2∶1的摩尔比进行连接。连接物用乙醇纯化后，经电穿孔(电转条件：25μF、2.5KV、200Ω)转化入电转感受态大肠杆菌ER2738(感受态效率为8×10⁸)。SOC培养基恢复45min后，取出100ul用于检测库容量，余下的菌液涂布LB(含100g/L的氨苄青霉素)平板，37℃静置培养过夜。菌斑长满整个平板后，加8ml LB(含100g/L的氨苄青霉素)+2ml 50％的甘油，用涂布器轻轻刮下菌落，分装于1.5ml小管，-80℃保存备用。最终确认库容量为3×10⁷。随机挑取10个克隆测序，结果表明，插入片段均为13D4人源化的单链抗体片段，并且在序列多样性符合设计要求。质粒的构建如图4所示。实施例4：13D4人源化单链抗体噬菌体展示库的扩增200ul含单链抗体库的细菌转接于70ml LB中，37℃振荡培养至OD＝0.5，加氨苄青霉素(100g/L)，再振荡培养至OD＝0.8，加辅助噬菌体M13KO7，37℃进行超感染2h后，6000rpm离心5min，弃去上清，收集细胞，用含氨苄青霉素和卡那霉素(100g/L)的双抗性培养基重新悬起，37℃振荡培养过夜；4℃ 5000rpm离心10min，然后将上清转移至干净的EP管中，加原体积1/5的(20％PEG8000+2.5mol NaCl)沉淀噬菌体8h，4℃ 13700rpm离心20min，弃上清，沉淀用1mlTBS重新悬起，再加原体积1/5的(20％PEG8000+2.5mol NaCl)进行二次沉淀，4℃13700rpm离心20min，弃上清，沉淀用200ul TBS重新吹溶，便为13D4人源化单链抗体库一次扩增产物；取出10ul稀释至10^-5用于滴定，从滴定板挑单克隆用于下一步检测。实施例5：13D4人源化单链抗体噬菌体展示库的筛选从噬菌体展示库中筛选人源化13D4单链抗体。取1ug/mL酵母表达的禽流感病毒血凝素蛋白HA1(本实验室制备)，用CB(碳酸盐缓冲液，pH 9.6)包被ELISA板，37℃温育2h后，PBST洗涤1次，再加入200ulED封闭液，37℃温育2h，4℃储存备用。另外，将针对禽流感的单克隆抗体2F2和3G4(本实验室制备)以10ug/mL的浓度混合包板，每孔加100ul包被液，37℃温育2h后，PBST洗涤1次，再加入200ul ED封闭液，37℃温育2h，拍干后，加入100ul 4HI的YU22病毒稀释液，37℃温育2h，PBST洗涤5次，4℃储存备用。以上述包被了HA1和YU22病毒的两种抗原板为固相筛选介质，对13D4人源化单链抗体库进行3轮“吸附-竞争-扩增”富集筛选。取13D4人源化单链抗体噬菌体展示库(1×10¹¹)用TBS稀释100倍后，分别向HA1和YU22抗原板的各5孔，每孔加入100ul，同时设非相关抗原板239(10mg/ml)为阴性对照，37℃温育1h后，用TBS洗涤5次。然后采用竞争洗脱法获得富集的噬菌体抗体。具体方法是，用TBS稀释13D4mAb至1mg/ml，每孔加入100ul，37℃温育1h后，收集竞争上清液共1ml，从中取出1ul滴定，剩下的全部用于感染对数期的ER2738菌，按照实施例4的方法进行噬菌体抗体扩增，然后进入下一轮筛选；第二轮筛选，第三轮筛选方法同第一轮。分别从第二轮和第三轮富集后的噬菌体抗体滴定板上，随机各挑选23个克隆制备噬菌体抗体。非相关抗原板上的竞争上清液的滴定板没有细菌克隆生长，说明HA1和YU22抗原板与13D4人源化单链抗体库有特异性的结合。将上述46个克隆，用含100g/L的氨苄青霉素抗性的LB培养至OD＝0.5，加M13KO7辅助超感染2h后加100g/L的卡那霉素，37℃振荡培养10h，5000rpm离心10min收集菌体，4℃保存上清用于检测。取准备好的HA1和YU22抗原板，每孔加入100ul待测噬菌体抗体上清，双孔重复，以M13KO7培养上清为阴性对照。37℃温育1h后，用TBS洗涤5次，然后加以1∶5000稀释的M13-HRP 100ul，37℃温育30min后，用TBS洗涤5次，加底物TMB溶液显色10min，H₂SO₄终止显色反应，于OD_450/620测定读值。取读值大于阴性对照3倍以上者为阳性克隆，将阳性克隆进行基因序列测定。由图5的ELISA检测结果可以看出，HA1-10，Yu22-6，Yu22-8和S2K2-42四个噬菌体抗体的反应为阳性。提取核酸进行测序，四株13D4人源化抗体的VH和VL氨基酸序列编号见表3，它们的FR区保留的鼠单抗氨基酸及带入的少数突变氨基酸见图6。如果将这四种人源化的VH和VL序列与人恒定区序列组装成完整抗体分子，那么人源化的13D4抗体的人源化程度在88.3％-89.05％之间。表313D4人源化抗体的VH和VL氨基酸序列编号

13D4人源化抗体	VH氨基酸序列	VL氨基酸序列
			HA1-10	SEQ ID NO：10	SEQ ID NO：11
Yu22-6	SEQ ID NO：12	SEQ ID NO：13
			Yu22-8	SEQ ID NO：14	SEQ ID NO：15
S2K2-42	SEQ ID NO：16	SEQ ID NO：17
			H1202-34	SEQ ID NO：18	SEQ ID NO：19
H1124-38	SEQ ID NO：20	SEQ ID NO：21
			H1126-08	SEQ ID NO：22	SEQ ID NO：23
H1213-21	SEQ ID NO：24	SEQ ID NO：25
			H1108-18	SEQ ID NO：26	SEQ ID NO：27
H1121-37	SEQ ID NO：28	SEQ ID NO：29
			Y1121-29	SEQ ID NO：30	SEQ ID NO：31
37	SEQ ID NO：32	SEQ ID NO：33

按照以上同样的方法，本研究对13D4人源化单链抗体库共进行了7次的筛选，每次检测情况如表4所示。经过7次的筛选，本研究一共检测了524个克隆，挑选出了91个阳性克隆，阳性比例为17％；测序结果表明，其中完全正确的人源化单链抗体序列有37个，占检测总数的7％。从筛选获得的37个阳性克隆中，挑选出与抗原结合活性比较高，人源化程序比较好的8个人源化序列进行序列分析(见图7)，其他的人源化序列保留备用。这8个人源化单链抗体的噬菌体表达上清与HA1及YU22抗原板的ELISA反应结果，如图8所示。这8个人源化抗体的VH和VL氨基酸序列编号见表3，以理论上完全人源化的13D4mAb，即框架区完全为人源氨基酸残基的H13D4为参照(人源化程度为：90.61％)，它们的FR区保留的鼠单抗氨基酸个数及构建成完整抗体后的人源化程度见表5。人源化程度＝(抗体的全部氨基酸个数-可变区上保留的鼠源氨基酸个数)/抗体的全部氨基酸个数×100％。表413D4人源化单链抗体库所有筛选结果

表513D4人源化抗体部分阳性克隆的人源化程度分析

实施例6：13D4人源化抗体表达载体的构建和人源化抗体的表达采用Invitrogen公司的Flp-In表达系统来表达人源化抗体。以商品化的表达载体PCDNA5.1为基础，构建双启动真核表达载体PlAN3，并以PLAN3为基础，构建含有人抗体CH和CK片段的真核抗体表达载体PLAN3-CHCK，如图9所示。CH为人gamma-1重链恒定区，CK为人kappa轻链恒定区。分别以引物plan3VHF1/plan3VHR，plan3VHF2/plan3VHR(具体序列见表2)，扩增获得带有分泌信号肽序列的人源化13D4的VH片段H13D4VH；以引物plan3VKF/plan3VKR(具体序列见表2)，扩增获得带有分泌信号肽序列的13D4人源化的VK片段H13D4VK。H13D4VH以HindIII和Kpn I双酶切，连入以同样内切酶双酶切的载体PLAN3-CHCK中；H13D4VK以BamH I和EcoR V双酶切，连入以同样内切酶双酶切的并且已经确认连入H13D4VH片段的载体PLAN3-CHCK中。构建好的含有13D4人源化抗体的真核表达载体PLAN3-CHCK-H13D4如图10所示。构建好的含有13D4人源化抗体的真核表达载体PLAN3-CHCK-H13D4，与pOG44质粒共转染Flp-In^TM-CHO细胞。四天后检测分泌表达的人源化抗体的活性。实施例7.血凝抑制实验鉴定13D4人源化抗体的活性按照WHO的流感试验指南(http://www.who.int/csr/resources/publications/influenza/en/whocdscsrncs20025rev.pdf)进行，先调配8AD的病毒。然后将人源化抗体的细胞表达上清倍比稀释：在血凝板的第2个孔到最后一个孔中加入25μL的PBS，在第1孔中加入50μL人源化抗体的细胞上清，然后从第1孔中吸取25μL到第2孔中混匀后再吸取25μL到第3个孔中，如此向后倍比稀释至最后一孔并弃去最后的25μL；每孔加入25μL 8AD病毒，然后加入0.75％的鸡红细胞悬液50μL，轻轻混匀，静置30min后，观察结果；读取血凝抑制值(HI值)时，第1孔的读值为起始样品的稀释度值(如1∶2)，相应的第2孔开始为1∶4、1∶8、1∶16、1∶32等。以纯化后的13D4cAb(稀释至2.0mg/L)为阳性对照，各人源化抗体与YU22，115，5，QH15，999，2439等11株H5N1病毒的代表株的血凝抑制活性及广谱性检测结果如表6所示，8个人源抗体与13D4cAb一样对YU22等11株H5N1病毒都有不同(数字表示稀释倍数)的血凝抑制活性，说明他们都保留了13D4cAb的广谱HI活性，但他们对其中的一些代表株病毒的血凝活性比13D4cAb低，说明人源化的改造对他们的活性有影响，其中H1202-34人源化抗体的HI广谱反应性最好，基本上与嵌合抗体相似。表6.13D4人源化抗体的广谱血凝抑制活性测定

实施例8.13D4人源化抗体稳定表达细胞株的筛选Flp-in CHO细胞为经过筛选后带有FRT整合位点的稳定细胞株，冻存和复苏不需要抗性Zeocin抗性，但是在培养时需有Zeocin抗性，在筛选过程中需要潮霉素(Hygromycin)抗性，详见Invitrogen系统介绍(www.invitrogen.com)。将含有目的人源化抗体基因序列的Plan3质粒，转染Flp-In CHO细胞，密度大约为5-8×105，转染质粒浓度需大于0.3ug/uL，RNA含量(260/280)需小于2.0。将目的质粒与POG44以1∶9的比例在六孔板中进行转染，DNA总量为4ug。设不含POG44只带有质粒的阴性对照。转染6-12h内换新鲜温育培养基并不再含有Zeocin抗性。培养48h后将细胞传至10mm大板，待2-3h细胞贴壁后加入600ug/ml的潮霉素抗性。3-4天换一次新鲜培养基并加入潮霉素抗性，仔细观察细胞生长状态。12天后稳定表达细胞株克隆开始出现，用Marker笔标注出，并观察其随天数增加的形态变化。14-15天后吸出培养基，用verson洗一遍，再用灭菌过后剪成方块的滤纸沾胰酶挑出克隆株入96孔板培养。从96孔板到6孔板，再到10cm培养板，不断加压并扩大培养，待细胞量足够时就冻存初筛后的细胞，并继续扩大培养。取稳定表达人源化抗体的CHO细胞，在10cm细胞培养皿中培养，培养条件为：1640培养基(10％FBS，1％谷氨酰胺，1％双抗)，5％CO2，37℃。待板上细胞密度达到90％以上时按1∶2比例传代扩增。待需要表达抗体时，选取密度达到95％左右的板直接更换无血清培养基(SFM4CHO+1％谷氨酰胺，HyClone)进行培养。如图11所示，在潮霉素抗性的选择下，没有整合入目的基因的CHO细胞在第11天时，基本上处于漂浮不贴壁生长状态，剩下还能正常贴壁生长的细胞，就可能是成功整合入目的抗体基因的稳定表达细胞，继续加压至第15天，不贴壁生长的漂浮细胞全部死亡，贴壁生长的细胞面积反而扩大，说明它们完全具有了潮霉素抗性。以不加pOG44质粒的转染细胞为对照，在加压第14天后，对照组细胞出全部中毒死亡。将筛选获得的稳定细胞群落，不断扩大培养并冻存第1，2代的细胞。最后共获得7株稳定表达不同人源化抗体的细胞株.先利用有血清培养基培养这些稳定表达细胞株，等扩增至20板，即共200mL时，全部换成无血清培养基进行培养，培养至第5天时，收集细胞上清，开始纯化。实施例9.13D4人源化抗体的纯化收集无血清培养的细胞上清，利用Protein A纯化抗体。具体步骤如下：收获细胞培养上清约200ml，8000rpm，离心10min，保留上清，利用干粉Na₂HPO₄调节其PH值为8.2-8.5之间，然后用0.22μm孔径滤膜过滤。取偶联上Protein A的Sepharose 4B介质(Protein A为本实验室表达并偶联)10ml装柱，连接至AKTA Explorer100系统，将A泵接入0.2M磷酸氢二钠溶液，B泵接入0.1M柠檬酸溶液。选取检测波长UV280nm，流速6ml/min，调节A/B泵进样比例，先取100％B(pH2.3)冲洗柱子出去杂蛋白，取10％B(pH 8.0)平衡pH，待检测波长稳定后归零，上样，待穿透峰过后取10％B继续平衡至检测波长降至零点并稳定后，用70％B(pH4.0)洗脱，收取洗脱峰，进行SDS PAGE纯度检测。最后获得7种纯化的人源化抗体，贮存浓度均为2mg/ml。图12为纯化的7种人源化抗体的SDS-PAGE电泳结果，从银染结果可以看出，经Protein A纯化过后的34纯度可以达到90％。实施例10人源化抗体与抗原结合能力的检测先将各人源化抗体浓度调整到同一水平(25ug/mL)，然后取包被好的抗原板HA1(200ng/孔)，分别加入不同的人源化抗体，37℃反应1h，PBST洗板5次，加GAH-HRP酶标(1∶2000)抗体，37℃反应30min，PBST洗板5次，加底物TMB溶液显色15min，H₂SO₄终止显色反应，于OD450/620测定读值，分析结果。如图13所示，各人源化抗体与HA1的结合能力差别不大，其中37和H1126-08与HA1的结合能力较好。实施例11纯化13D4人源化抗体的广谱血凝抑制活性测定按照WHO的流感试验指南(http://www.who.int/csr/resources/publications/influenza/en/whocdscsrncs20025rev.pdf)进行，先调配8HA的病毒。纯化后的13D4人源化抗体和13D4cAb在2.0mg/L浓度基础上，再倍比稀释：在血凝板的第2个孔到最后一个孔中加入25μL的PBS，在第1孔中加入50μL原倍的人源化抗体，然后从第1孔中吸取25μL到第2孔中混匀后再吸取25μL到第3个孔中，如此向后倍比稀释至最后一孔并弃去最后的25μL；每孔加入25μL 8HA病毒，轻轻混匀，静置30min后，加入0.75％的鸡红细胞悬液50μL，轻轻混匀，静置30min后，观察结果；读取血凝抑制值(HI值)时，第1孔的读值为起始样品的稀释度值(如1∶1)，相应的第2孔开始为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等。以纯化后的13D4MAb(稀释至2.0mg/L)为阳性对照，各人源化抗体及13D4cAb与YU22，115，5，QH15等14株H5N1病毒的代表株的血凝抑制活性及广谱性检测结果如表7所示，7个人源抗体及13D4CAb与13D4MAb一样对YU22等14株H5N1病毒都有不同(数字表示稀释倍数)的血凝抑制活性，说明他们都保留了13D4MAb的广谱HI活性，但他们对其中的一些代表株病毒的血凝活性比13D4MAb低，说明人源化的改造对他们的活性有影响，其中人源化抗体37、H1126-08的HI广谱反应性最好，基本上与13D4MAb相似。表7.13D4人源化抗体的广谱血凝抑制活性测定(2.0mg/mL)

实施例1213D4人源化抗体的中和活性测定细胞微孔中和实验中和滴度测定使用终点判定法，实验周期约5天具体步骤如下：(1)MDCK细胞的准备：提前1天在96孔板上接种MDCK细胞，细胞密度约为2×10⁴个/孔。第二天进行使用病毒抗体混合液感染细胞测定滴度。(2)抗体的准备：在96孔细胞板上进行抗体的稀释，在第A排微孔中各加入80μL按1∶100稀释的单抗，第BH排的微孔中各加入40μL MEM，然后从A孔中吸取40μL液体到B孔中，依次到H孔，做倍比稀释，最终抗体稀释度为1∶100 1∶12800。(3)抗体病毒混合液制备：在上述加有单抗的细胞孔中，分别加入40μL的200TCID50(2×102TCID50/100μL)病毒液，稍稍混匀，置37℃孵育培2h。(4)MDCK细胞的感染：取出MDCK细胞培养板，先用200μL无血清MEM培养基洗涤MDCK细胞一次；然后每个孔加入35μL病毒抗体混合液，置37℃，5％CO2培养箱孵育1h。(5)细胞换液：取出感染病毒的上述细胞板，吸去上清，在每个孔中加入200μL含10％FBS的MEM培养基，置37℃，5％CO2培养箱培养72h。(6)HA方法判定中和滴度：3天后，取出上述细胞板，吸取50μL感染病毒后的MDCK细胞上清，加入到96孔血凝板中，然后加入0.5％的鸡血50μL，孵育30min后读值，血凝活性呈现阴性孔对应的抗体最高稀释度即为此抗体的中和滴度。13D4VH氨基酸序列：SEQ ID NO：1QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSGHWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGNIHYNEKFKGKATFAADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTSVTVSS13D4VH氨基酸序列：SEQ ID NO：2QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSGHWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGNIHYNEKFKGKATFAADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTLVTVSS13D4VL氨基酸序列：SEQ ID NO：3DIVMTQSQKFMSASVGDRVSVTCKASQNVGTHLAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSGDLADYFCQQYNNFPLTFGAGTKLEIKRHA1-10VH氨基酸序列：SEQ ID NO：10QVQLQQSGAEVMKPGSSVKVSCKASGYTFSGHWIEWVKQAPGQGLEWIGEILPGSGNIHYNEKFKGRATITADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTLVTVSSHA1-10VL氨基酸序列：SEQ ID NO：11DIQMTQSPSSLSASVGDRISVTCKASQNVGTHLAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYNNFPLTFGAGTKVEIKRYu22-6VH氨基酸序列：SEQ ID NO：12QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSGHWIEWVKQGPGQGLEWIGEILPGSGNIHYNEKFKGKATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTLVTVSSYu22-6VL氨基酸序列：SEQ ID NO：13DIVMTQSPSSLSASVGDRVTVTCKASQNVGTHLAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYRGVPDSFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFCQQYNNLPLTFGAGTKVEIKRYu22-8VH氨基酸序列：SEQ ID NO：14QVQLVQSGAEVMKPGSSVKVSCKASGGTFSGHWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGNIHYNEKFKGRATIAADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTLVTVSSYu22-8VL氨基酸序列：SEQ ID NO：15DIQMTQSPSSLSASVGDGVTITCKASQNVGTHLAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDFADYFCQQYNNFPLTFGAGTKVEIKRS2K2-42VH氨基酸序列：SEQ ID NO：16QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSGHWIEWVKQAPGQGLEWMGEILPGSGNIHYNEKFKGRATFTADTSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTLVTVSSS2K2-42VL氨基酸序列：SEQ ID NO：17DIQMTQSPSSLSASVGDRVTVTCKASQNVGTHLAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNFPLTFDAGTKVEIKRH1202-34VH氨基酸列：SEQ ID NO：18QVQLQQSGAEVKKPGSLVKVSCKASGYTFSGHWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGNIHYNEKFKGKVTITADTSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTLVTVSSH1202-34VL氨基酸序列：SEQ ID NO：19DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTHLAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNFPLTFGAGTKVEIKRH1124-38VH氨基酸序列：SEQ ID NO：20QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSGHWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGNIHYNEKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTLVTVSSH1124-38VL氨基酸序列：SEQ ID NO：21DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTHLAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFCQQYNNLPLTFGAGTKVEIKRH1126-08VH氨基酸序列：SEQ ID NO：22QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSGHWIEWVKQGPGQGLEWIGEILPGSGNIHYNEKFKGKVTFTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTLVTVSSH1126-08VL氨基酸序列：SEQ ID NO：23DIVMTQSPSSLSASVGDRVSVTCKASQNVGTHLAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPPRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYNTFPLTFGAGTKVEIKRH1213-21VH氨基酸序列：SEQ ID NO：24QVQLQQSGAEVMKPGSSVKVSCKASGYTFSGHWIEWVRQRPGQGLEWMGEILPGSGNIHYNEKFKGKATFTANKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTLVTVSSH1213-21VL氨基酸序列：SEQ ID NO：25DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTHLAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYNNFPLTFGGGTKVEIKRH1108-18VH氨基酸序列：SEQ ID NO：26QVQLQQSGAEVMKPGSSVKVSCKASGYTFSGHWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGNIHYNEKFKSRVTFAANTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTLVTVSSH1108-18VL氨基酸序列：SEQ ID NO：27DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTHLAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYNNFPLTFGAGTKVEIKRH1121-37VH氨基酸序列：SEQ ID NO：28QVQLQQSGAEVMKPGSSVKVSCKASGYTFSGHWIEWVKQAPGQGLEWIGEILPGSGNIHYNEKFKDKATFTADTSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTLVTVSSH1121-37VL氨基酸序列：SEQ ID NO：29DIVMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQNVGTHLAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYNNFPLTFGGGTKVEIKRY1121-29VH氨基酸序列：SEQ ID NO：30QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSGHWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGNIHYNEKFKGKVTFTADKSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTLVTVSSY1121-29VL氨基酸列：SEQ ID NO：31DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTHLAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYYCQQYNNFPLTFGAGTKVEIKR37VH氨基酸序列：SEQ ID NO：32QVQLQQSGAEVMKPGSSVKVSCKASGYTFSGHWIEWVKQRPGQGLEWMGEILPGSGNIHYNEKFKGKVTFTANTSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCARLGTTAVERDWYFDVWGQGTLVTVSS37VL氨基酸序列：SEQ ID NO：33DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTHLAWYQQKPGKAPKALIYSASYQYSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFCQQYNNFPLTFGAGTKVEIKR

序列表

<110>厦门大学

<120>H5型禽流感病毒血凝素蛋白的人源化抗体及其用途

<130>IDC090110

<160>33

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>123

<212>PRT

<213>人工

<400>1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Gly His

            20                  25                  30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Lys Ala Thr Phe Ala Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>2

<211>123

<212>PRT

<213>人工

<400>2

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Gly His

            20                  25                  30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Lys Ala Thr Phe Ala Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>3

<211>108

<212>PRT

<213>人工

<400>3

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65                  70                  75                  80

Gly Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210>4

<211>5

<212>PRT

<213>人工

<400>4

Gly His Trp Ile Glu

1               5

<210>5

<211>10

<212>PRT

<213>人工

<400>5

Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His

1               5                   10

<210>6

<211>14

<212>PRT

<213>人工

<400>6

Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val

1               5                   10

<210>7

<211>11

<212>PRT

<213>人工

<400>7

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His Leu Ala

1               5                   10

<210>8

<211>7

<212>PRT

<213>人工

<400>8

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser

1               5

<210>9

<211>9

<212>PRT

<213>人工

<400>9

Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Leu Thr

1               5

<210>10

<211>123

<212>PRT

<213>人工

<400>10

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly His

            20                  25                  30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>11

<211>108

<212>PRT

<213>人工

<400>11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Ile Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210>12

<211>123

<212>PRT

<213>人工

<400>12

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Gly His

            20                  25                  30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Gly Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>13

<211>108

<212>PRT

<213>人工

<400>13

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Arg Gly Val Pro Asp Ser Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Leu Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210>14

<211>123

<212>PRT

<213>人工

<400>14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Gly His

            20                  25                  30

Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ala Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>15

<211>108

<212>PRT

<213>人工

<400>15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Gly Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210>16

<211>123

<212>PRT

<213>人工

<400>16

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly His

            20                  25                  30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>17

<211>108

<212>PRT

<213>人工

<400>17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Asp Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210>18

<211>123

<212>PRT

<213>人工

<400>18

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1               5                   10                  15

Leu Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly His

            20                  25                  30

Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>19

<211>108

<212>PRT

<213>人工

<400>19

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210>20

<211>123

<212>PRT

<213>人工

<400>20

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly His

            20                  25                  30

Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>21

<211>108

<212>PRT

<213>人工

<400>21

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Leu Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210>22

<211>123

<212>PRT

<213>人工

<400>22

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly His

            20                  25                  30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Gly Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Lys Val Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>23

<211>108

<212>PRT

<213>人工

<400>23

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Phe Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210>24

<211>123

<212>PRT

<213>人工

<400>24

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly His

            20                  25                  30

Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asn Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>25

<211>108

<212>PRT

<213>人工

<400>25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210>26

<211>123

<212>PRT

<213>人工

<400>26

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly His

            20                  25                  30

Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Ser Arg Val Thr Phe Ala Ala Asn Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>27

<211>108

<212>PRT

<213>人工

<400>27

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210>28

<211>123

<212>PRT

<213>人工

<400>28

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly His

            20                  25                  30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>29

<211>108

<212>PRT

<213>人工

<400>29

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210>30

<211>123

<212>PRT

<213>人工

<400>30

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly His

            20                  25                  30

Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Lys Val Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>31

<211>108

<212>PRT

<213>人工

<400>31

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210>32

<211>123

<212>PRT

<213>人工

<400>32

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Met Lys Pro Gly Ser

1               5                   10                  15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly His

            20                  25                  30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Lys Val Thr Phe Thr Ala Asn Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Leu Gly Thr Thr Ala Val Glu Arg Asp Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>33

<211>108

<212>PRT

<213>人工

<400>33

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr His

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Gln Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Leu

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

Claims (30)

1.能与鼠单克隆抗体13D4竞争结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的人源化抗体，所述鼠单克隆抗体13D4为杂交瘤细胞株13D4所产生的单克隆抗体，杂交瘤细胞株13D4保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCC-C200721。

2.权利要求1所述的人源化抗体，其是衍生自鼠单抗13D4的人源化抗体。

3.权利要求1或2所述的人源化抗体，包含：含有氨基酸序列为SEQ ID NOs：4-6的CDR中的一个或多个(如1、2或3个)CDR的重链可变区，或其含有一个或多个(例如1-10个，1、2、3、4或5个)氨基酸替代的变异体。

4.权利要求1或2所述的人源化抗体，包含：含有氨基酸序列为SEQ ID NOs：7-9的CDR中的一个或多个(如1、2或3个)CDR的轻链可变区，或其含有一个或多个(例如1-10个，1、2、3、4或5个)氨基酸替代的变异体。

5.如权利要求3所述的人源化抗体，其中，所述的重链可变区包括选自如下一组的氨基酸序列：

SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：26，SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或其变异体或片段。

6.如权利要求4所述的人源化抗体，其中，所述的轻链可变区包括选自如下一组的氨基酸序列：

SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33或其变异体或片段。

7.权利要求1-6任一项所述的人源化抗体，其包括非-CDR区，该非-CDR区来自不是鼠类的物种。

8.权利要求7所述的人源化抗体，其中，所述的非-CDR区来自人类的抗体。

9.权利要求8所述的人源化抗体，其中，所述的人类非-CDR区具有一个或多个(例如1-20个，优选1-10个，1-5个)保守氨基酸替代。

10.权利要求1-9任一项所述的人源化抗体，其中，所述的抗体为Fab、Fab′、F(ab)₂、scFv或Fv。

11.权利要求1-10任一项所述的人源化抗体，其结合H5亚型禽流感病毒血凝素的KD值小于1x10^-5M。

12.如权利要求11所述的抗体，其结合H5亚型禽流感病毒血凝素的KD值小于1x10^-6M。

13.一种能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，其包含：含有氨基酸序列为SEQ ID NOs：4-6的CDR中的一个至三个CDR的重链可变区，和/或含有氨基酸序列为SEQ ID NOs：7-9的CDR中的一个至三个CDR的轻链可变区。

14.权利要求13所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体为杂交瘤细胞株13D4所产生的单克隆抗体，杂交瘤细胞株13D4的保藏号是CCTCC-C200721.

15.权利要求13或14的单克隆抗体的人源化抗体，其能特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白，优选地其基本上保持所述单克隆抗体的特异性、亲和性和反应性，例如保持至少70％、80％、优选90％的特异性、亲和性和反应性。

16.编码权利要求1-15任一项的抗体的重链、轻链、重链可变区、或轻链可变区的核酸分子。

17.一种核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，而所述的抗体重链可变区则包含选自如下一组的氨基酸序列：SEQ IDNOs：4-6。

18.一种核酸分子，其包含能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，而所述的抗体轻链可变区则包含选自如下一组的氨基酸序列：SEQ IDNOs：7-9。

19.权利要求17所述的核酸分子，其中，所述的重链可变区包含选自如下一组的氨基酸序列：

SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：26，SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32.

20.权利要求18所述的核酸分子，其中，所述的轻链可变区包含选自如下一组的氨基酸序列：

SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33。

21.一种包含如权利要求16-20任一项所述的核酸分子的表达载体。

22.一种包含如权利要求21所述的表达载体的宿主细胞。

23.一种药物组合物，其包含如权利要求1-15任一项所述的抗体或其在药学上可接受的盐。

24.权利要求23所述的药物组合物，其进一步包括其它抗病毒成分或其在药学上可接受的盐。

25.权利要求24所述的药物组合物，其中，所述的抗体为Fab、Fab′、F(ab)₂、scFv或Fv。

26.一种预防或治疗禽流感病毒感染或由禽流感病毒感染在人或动物上引发的疾病的方法，其包括向所述的人或动物给药有效剂量的、权利要求1-15任一项的抗体、权利要求16-20的核酸分子、权利要求21的表达载体、或权利要求23-25任一项所述的药物组合物。

27.权利要求1-15任一项所述的人源化抗体用于禽流感疾病的治疗药物筛选的用途。

28.权利要求1-15任一项所述的人源化抗体用于制备预防或治疗禽流感病毒感染或禽流感疾病的疫苗的用途。

29.权利要求1-15任一项的抗体、权利要求16-20的核酸分子、权利要求21的表达载体、或权利要求23-25任一项所述的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗禽流感病毒感染或由禽流感病毒感染在人或动物上引发的疾病。

30.权利要求1-15任一项中定义的CDR、重链、轻链、重链可变区、或轻链可变区。

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