TW202208424A - 一種抗新型冠狀病毒的雙特異性抗體及其應用 - Google Patents

一種抗新型冠狀病毒的雙特異性抗體及其應用 Download PDF

Info

Publication number
TW202208424A
TW202208424A TW110128394A TW110128394A TW202208424A TW 202208424 A TW202208424 A TW 202208424A TW 110128394 A TW110128394 A TW 110128394A TW 110128394 A TW110128394 A TW 110128394A TW 202208424 A TW202208424 A TW 202208424A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
amino acid
seq
bispecific antibody
acid sequence
Prior art date
Application number
TW110128394A
Other languages
English (en)
Inventor
高福
吳燕
李世華
黎朝暉
譚曙光
Original Assignee
中國科學院微生物研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 中國科學院微生物研究所 filed Critical 中國科學院微生物研究所
Publication of TW202208424A publication Critical patent/TW202208424A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本發明涉及一種抗新型冠狀病毒的雙特異性抗體及其應用。本發明的雙特異性抗體通過基因工程方法對新冠病毒單抗H4和B38進行改造獲得，可以同時識別新型冠狀病毒S蛋白RBD的不同位點，對新冠病毒假病毒的中和活性遠高於母源單抗，對新冠病毒活病毒的抑制活性也高於母源單抗。本發明的雙特異性抗體提高了母源單抗的選擇性和中和活性，改善了單抗藥物的安全性和有效性，可作為製備診斷、預防、治療新型冠狀病毒引起疾病的潛在藥物，市場價值巨大，應用前景良好。

Description

一種抗新型冠狀病毒的雙特異性抗體及其應用
本發明涉及生物技術及免疫學技術領域，具體涉及一種抗新型冠狀病毒的雙特異性抗體及其製備方法與應用。
新型冠狀病毒（2019-nCoV）表面的刺突蛋白（Spike, S蛋白）在感染宿主的過程中結合宿主細胞受體血管緊張素轉換酶2（ACE2）分子，從而啟動病毒膜與宿主細胞膜發生融合，導致宿主細胞感染病毒。S蛋白分為S1和S2兩部分，已有研究證實S1的C端（CTD）的受體結合結構域（RBD）與ACE2結合，介導膜融合過程。
迄今為止，中和抗體已被證明是治療病毒性疾病的有效方法。目前已經上市的治療和預防病毒感染的藥物有預防小兒呼吸道合胞病毒（RSV）感染的帕利珠單抗(Synagis)，治療HIV感染的艾巴厘珠單抗(Trogarzo)，以及用於狂犬病毒暴露後預防的Rabishield。此外，還有多種針對不同病毒的單抗處於臨床研究的不同階段（https://clinicaltrials.gov/）。抗體主要通過兩方面起作用。一方面，具有中和活性的抗體可通過結合病毒囊膜蛋白，阻斷病毒與細胞受體的結合，從而阻斷病毒感染。另一方面，抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（ADCC）和補體依賴的細胞毒性作用（CDC）可募集巨噬細胞或是補體等免疫細胞和免疫分子，從而清除游離的病毒以及被感染的細胞。
雙特異性抗體(bispecific antibody，BsAb)是近年來在抗體藥物研究領域的重點方向之一。雙特異性抗體是含有兩種能夠特異性識別並結合不同抗原或不同抗原位元點的人工抗體。如果這兩種抗原位於不同的細胞表面，則這種雙特異性抗體能在這兩種抗原分子之間架起橋樑，從而形成細胞之間的交聯，介導細胞產生導向性的效應功能。BsAb在生物醫學、特別是在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應用前景。用於免疫治療的雙特異性抗體（免疫雙抗）是含有2種特異性細胞受體抗原結合位元點的人工抗體，能在病變細胞（靶細胞）和功能細胞(免疫細胞)之間架起橋樑，激發具有導向性的免疫反應。通過BsAb介導免疫細胞（如T細胞，NK細胞等）殺死腫瘤細胞是目前免疫治療應用研究的熱點，其作用機理是BsAb能同時結合腫瘤相關抗原和免疫效應細胞上的靶分子，在活化免疫細胞的同時，直接導向免疫效應細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷。目前，已經批准上市的雙特異性抗體包括EpCAM/CD3和CD19/CD3兩種，尚在臨床研究階段的雙特性抗體超過一百種。對於傳染性病原微生物，特別是容易發生變異的RNA病毒，使用一個靶向單位點的抗體進行感染治療，病毒容易在抗體的選擇壓力下發生突變，進而逃逸抗體的結合，產生對抗體治療不敏感的抗體。而同時靶向病毒抗原的兩個不同位點，能夠大大降低病毒逃逸突變產生的概率。不僅如此，同時靶向不同位元點能夠顯著提高病毒中和效果，降低抗體用量，提高治療效果。例如，在對埃博拉病毒感染的臨床治療中，利用結合埃博拉病毒表面糖蛋白（GP）的三種不同抗體，能夠顯著降低病人死亡率，對埃博拉病毒感染具有顯著的治療效果。
雙特異性抗體可通過多種途徑獲得，其製備方法主要有：化學偶聯法、雜交-雜交瘤法和基因工程抗體製備法。化學偶聯法是將2個不同的單克隆抗體用化學偶聯的方式連接在一起，製備的雙特異性單克隆抗體，這是最早的雙特異性單克隆抗體。雜交-雜交瘤法是通過細胞雜交法或者三元雜交瘤的方式產生雙特異性單克隆抗體，這些細胞雜交瘤或者三元雜交瘤是通過建成的雜交瘤融合，或者建立的雜交瘤和從小鼠的淋巴細胞融合而得到的，只能用於生產鼠源的雙特異性抗體，因此，其應用受到了極大的限制。而隨著分子生物學技術的迅速發展，出現了基因工程人源化或全人源的雙特異性抗體的多種構建模式，主要包括雙特異性微抗體、雙鏈抗體、單鏈雙價抗體、多價雙特異性抗體四類。目前，國際上已有數種基因工程雙特異性抗體藥物進入臨床試驗階段，並顯示有較好的應用前景。
與單克隆抗體相比，雙特異性抗體的優勢在於：雙特異性抗體可以同時識別兩種分子，提高了抗體的選擇性和功能性，改善了藥物的安全性和有效性。與兩種單克隆抗體藥物聯合用藥治療相比，雙特異性抗體藥物減少了開發和臨床試驗成本。對於感染性病原而言，同時作用於病原的兩個不同位點，使得在治療過程中產生抗體耐藥的可能性更低，且能夠抑制廣泛治療中病毒逃逸突變的產生。因此，開發靶向新型冠狀病毒不同位元點的雙特異性抗體，對於提高新冠肺炎治療效果、降低逃逸突變的產生等都具有重要意義。
為解決現有技術中存在的技術問題，本發明的目的在於提供一種具有特異的靶向作用、對新冠病毒具有良好親和力和顯著病毒抑制活性的雙特異性抗體及其應用。
為實現上述目的，在第一個方面，本發明提供一種雙特異性抗體，其技術方案如下：本發明通過對現有技術公佈的抗新冠肺炎單克隆抗體進行篩選和分析，創造性地發現，將單抗B38與單抗H4進行本發明所述的基因改造後，能夠更好地保留原母源單抗的特異性結合能力，同時具有兩個單克隆抗體的生物學功能，在病毒中和活性、安全性、穩定性等等方面較母源單抗具有明顯的優勢。
本發明中，所述單抗B38的重鏈可變區CDR1含有SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，CDR2含有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，CDR3含有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列；所述單抗B38的輕鏈可變區CDR1含有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，CDR2含有SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR3含有SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列。
所述單抗H4的重鏈可變區CDR1含有SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列，CDR2含有SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列，CDR3含有SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列；所述單抗H4的輕鏈可變區CDR1含有SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列，CDR2含有SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，CDR3含有SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列。
與傳統的單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體等的設計不同，雙特異性抗體在設計時需要考慮的因素和面臨的技術難度主要是：雙特異性抗體為不同結構的抗體之間形成的融合蛋白，不同結構的抗體分別結合兩種細胞的不同抗原或同一抗原的不同位點，發揮各自不同的功能。為使得雙特異性抗體中各抗體充分發揮其各自的功能，在抗體設計時，應儘量減少各抗體在序列和結構上相互影響對各自功能發揮造成的不利影響。以及雙特異性抗體在靶向不同抗原或不同位點時，若想最大程度地中和病毒滴度，雙特異性抗體與不同抗原或同一抗原不同位元點的結合親和力需要相互平衡、匹配，而並不是簡單地追求對兩個靶點的高親和力。
本發明發現在選擇單抗B38與單抗H4進行基因改造構建雙特異性抗體的過程中，不同的改造方法獲得的雙特異性抗體的親和力、中和活性、穩定性效果差異很大。經過反復篩選和探索，本發明提供了兩個經基因工程方法改造得到的效果優異的雙特異性抗體，為如下：
（1）雙特異性抗體BS-mAb-1，其輕鏈可變區序列為B38單抗的輕鏈可變區N端與H4單抗輕鏈可變區的C端通過連接肽連接；其重鏈可變區序列為B38單抗的重鏈可變區N端與H4單抗輕鏈可變區的C端通過連接肽連接；或
（2）雙特異性抗體BS-mAb-2，包括B38單克隆抗體單元和H4單鏈抗體單元，
所述H4單鏈抗體單元包括2個單鏈抗體，所述單鏈抗體是H4單抗的重鏈可變區的C端與H4單抗輕鏈可變區的N端通過連接肽連接組成融合肽；所述2個單鏈抗體的C端分別通過連接肽與所述B38單克隆抗體的2條重鏈的N端連接，或所述2個單鏈抗體的N端分別通過連接肽與所述單克隆抗體的2條重鏈的C端連接。
進一步地，連接肽的氨基酸序列為（GGGGS）n，其中，n為1-4的自然數。優選地，上述（1）中，連接肽的n為2；上述（2）中，所述融合肽中的連接肽的n為4，單鏈抗體與單克隆抗體重鏈的連接肽的n為1。
在一種實施方式中，本發明的雙特異性抗體包含單抗B38的重鏈可變區、單抗B38的輕鏈可變區、單抗H4的重鏈可變區、單抗H4的輕鏈可變區，其中，
單抗B38的重鏈可變區包含：氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的CDR2、以及氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的CDR3；單抗B38的輕鏈可變區包含：氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的CDR2、以及氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示的CDR3；
單抗H4的重鏈可變區包含：氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的CDR2、以及氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的CDR3；單抗H4的輕鏈可變區包含：氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示的CDR2、以及氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示的CDR3。
優選地，所述單抗B38的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO. 32所示，單抗B38的輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO. 33所示；所述單抗H4的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO. 34所示，單抗H4的輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO. 35所示。
進一步優選地，還包括單抗B38的恒定區和/或單抗H4的恒定區；所述恒定區可以是本領域已知的任何適用的恒定區。
在一種優選的實施方式中，所述雙特異性抗體為BS-mAb-1，其具有如下結構（從N端到C端）：
重鏈：VHH4 -VHB38 -CHB38 ，
輕鏈：VLH4 -VLB38 -CLB38 ，
其中，VHH4 與VHB38 通過連接肽連接，VLH4 與VLB38 通過連接肽連接；
在另一種優選的實施方式中，所述雙特異性抗體為BS- mAb-2，其具有如下結構（從N端到C端）：
重鏈：VHB38 -CHB38 -VHH4 -VLH4 ，
輕鏈：VLB38 -CLB38 ；
其中，VHH4 與VLH4 通過連接肽連接，組成單鏈抗體；CHB38 與VHH4 通過連接肽連接。
優選地，所述雙特異性抗體包括兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈。
其中，所述連接肽的氨基酸序列為（GGGGS）n，其中，n為1-4的自然數。優選地，在抗體BS-mAb-1中，連接肽的n為2；在抗體BS-mAb-2中，所述VHH4 與VLH4 之間的連接肽的n為4，CHB38 與VHH4 之間的連接肽的n為1。
在上述以及本申請其它地方的描述中，VHB38 表示單抗B38的重鏈可變區，與(VH-B38)同義；CHB38 表示單抗B38的重鏈恒定區，包括CH1~CH3；VHH4 表示單抗H4的重鏈可變區，與(VH-H4)同義；VLH4 表示單抗H4的輕鏈可變區，與(VL-H4)同義；VLB38 表示單抗B38的輕鏈可變區，與(VL-B38)同義；CLB38 表示單抗B38的輕鏈恒定區，簡寫為CL。在一些實施方式中，單抗B38的重鏈恒定區與單抗H4的重鏈恒定區具有相同序列；單抗B38的輕鏈恒定區與單抗H4的輕鏈恒定區具有相同序列。
優選地，所述雙特異性抗體BS-mAb-1，其輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或經一個或多個氨基酸的替換、缺失或插入得到的具有相同功能的蛋白的氨基酸序列，其重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或經一個或多個氨基酸的替換、缺失或插入得到的具有相同功能的蛋白的氨基酸序列。
本發明採用融合肽的形式表達單鏈抗體，通過特定的抗體結構和序列設計，發現當單鏈抗體與單克隆抗體的連接方式不同時，分別採用特定的單鏈抗體融合肽序列能夠更好地提升抗體結構的穩定性以及與靶點的結合。
優選地，所述雙特異性抗體BS-mAb-2中，所述單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；進一步優選地，所述雙特異性抗體BS-mAb-2，其輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或經一個或多個氨基酸的替換、缺失或插入得到的具有相同功能的蛋白的氨基酸序列，其重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示或經一個或多個氨基酸的替換、缺失或插入得到的具有相同功能的蛋白的氨基酸序列。
上述「經一個或多個氨基酸的替換、缺失或插入得到的具有相同功能的蛋白的氨基酸序列」是指在一個或多個氨基酸殘基處不同於所示的序列但保留所得到的分子的生物學活性的序列，其可為「保守修飾的變體」或經「保守的氨基酸取代」改造得到的，「保守修飾的變體」或經「保守的氨基酸取代」是指本領域技術人員已知的氨基酸取代，進行這種取代通常不改變所得到的分子的生物學活性。一般而言，本領域技術人員公認在多肽非必需區的單個氨基酸取代基本上不改變生物學活性。示例性取代優選依照以下所示的取代進行：
表1 例示性保守氨基酸取代表
原殘基 保守取代 原殘基 保守取代 原殘基 保守取代
Ala (A) Gly, Ser Pro (P) Ala Gly (G) Ala
Arg (R) Lys, His Ser (S) Thr His (H) Asn, Gln
Asn (N) Gln, His Thr (T) Ser Ile (I) Leu, Val
Asp (D) Glu, Asn Trp (W) Tyr, Phe Lys (K) Arg, His
Cys (C) Ser, Ala Tyr (Y) Trp, Phe Met (M) Leu, Ile, Tyr
Gln (Q) Asn Val (V) Ile, Leu Phe (F) Tyr, Met, Leu
Glu (E) Asp, Gln        
本發明中，所述雙特異性抗體可以為鼠源抗體、人源化抗體、嵌合抗體或重組抗體。
所述人或人源化抗體包括IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、IgG4抗體中的一種。
在第二個方面，在上述雙特異性抗體氨基酸序列的基礎上，本發明還提供編碼所述雙特異性抗體的基因。
根據密碼子編碼規則以及密碼子的簡並性和偏好性，本領域技術人員可以根據上述雙特異性抗體的氨基酸序列設計編碼基因。
作為本發明的一種優選實施方式，所述雙特異性抗體輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，重鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或
所述雙特異性抗體輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，重鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
進一步地，本發明還提供包含所述基因的生物材料。
本發明中，所述生物材料包括重組DNA、表達盒、載體、宿主細胞、工程菌或細胞株。
在第三個方面，本發明還提供所述雙特異性抗體的製備方法，包括：分別構建含有所述雙特異性抗體BS-mAb-1或BS-mAb-2重鏈和輕鏈基因的重組表達載體；將重組表達載體導入宿主細胞，獲得穩定表達所述雙特異性抗體的宿主細胞；培養宿主細胞，經分離純化獲得所述雙特異性抗體。
在製備所述雙特異性抗體時，本領域技術人員可根據需要選擇本領域常規的宿主細胞、表達載體、將表達載體導入宿主細胞的方法以及抗體的分離純化方法。
在第四個方面，在上述雙特異性抗體的基礎上，本發明還提供一種藥物組合物，其包含本發明所述雙特異性抗體。
作為優選，所述藥物組合物還包括藥學領域允許的其它有效成分或輔料。
在第五個方面，本發明還提供一種診斷試劑或試劑盒，其包含本發明所述雙特異性抗體。優選地，包含BS-mAb-1和/或BS-mAb-2。
在第六個方面，本發明提供所述雙特異性抗體或所述雙特異性抗體的編碼基因或含有所述編碼基因的生物材料或所述藥物組合物或所述試劑盒的如下任一應用： （1）在製備預防或治療新型冠狀病毒感染所引起疾病的藥物中的應用； （2）在製備新型冠狀病毒診斷試劑或診斷試劑盒中的應用； （3）在製備新型冠狀病毒疫苗中的應用； （4）在預防或治療SARS-CoV-2冠狀病毒引起疾病中的應用； （5）在檢測新型冠狀病毒中的應用。
進一步地，本發明提供單劑量形式的藥物組合物，其中該單劑量形式含有180 mg-6000 mg的本發明所述的雙特異性抗體；優選地，其中該單劑量形式含有180 mg-3000 mg的本發明所述的雙特異性抗體；更優選地，其中該單劑量形式含有500 mg-1800 mg的本發明所述的雙特異性抗體；進一步優選地，其中該單劑量形式含有900 mg-1800 mg的本發明所述的雙特異性抗體；更進一步優選地，其中該單劑量形式含有500 mg-1000 mg的本發明所述的雙特異性抗體。
本發明單劑量形式的藥物組合物，其中該藥物組合物被配製為適合靜脈給藥的形式。
進一步地，本發明提供一種預防或治療新型冠狀病毒感染所引起的疾病的方法，包括向需要的人施用180 mg-6000 mg本發明的雙特異性抗體；優選地，包括向需要的人施用180 mg-3000 mg本發明的雙特異性抗體；更優選地，包括向需要的人施用500 mg-1800 mg本發明的雙特異性抗體；進一步優選地，包括向需要的人施用900 mg-1800 mg本發明的雙特異性抗體；更進一步優選地，包括向需要的人施用500 mg-1000 mg本發明的雙特異性抗體。
本發明提供一種預防或治療新型冠狀病毒感染所引起的疾病的方法，包括向有需要的受體施用本發明的雙特異性抗體，每週給藥1~2次，連續給藥2-4周；優選地，每週給藥2次，連續給藥4周。
進一步地，本發明提供一種診斷新型冠狀病毒感染的方法，包括使用本發明的雙特異性抗體、藥物組合物或製劑與待測樣本接觸。
本發明中，所述新型冠狀病毒為SARS-CoV-2冠狀病毒。
本發明的有益效果如下：本發明利用基因工程和抗體工程方法構建包含單鏈抗體和完整單克隆抗體結構的抗新冠病毒雙特異性抗體，該雙特異性抗體融合蛋白保留了完整的單克隆抗體結構，而且具有高度穩定的對稱結構，在進行宿主表達時，不會產生其它結構的蛋白異構體，從而大大降低了提取和純化工藝的難度，具有製備簡單、產量高的優勢。本發明的雙特異性抗體更好地保留了母源單抗B38與H4的生物學功能，實現了一個雙特異性抗體分子同時具有兩個單克隆抗體的生物學功能，同時識別新型冠狀病毒S蛋白RBD的不同位點，對新冠病毒假病毒的中和活性遠高於母源單抗，對新冠病毒活病毒的抑制活性也高於母源單抗，且毒性低、穩定性好。本發明的雙特異性抗體提高了母源單抗的選擇性和中和活性，改善了單抗藥物的安全性和有效性，可作為製備診斷、預防、治療新型冠狀病毒引起疾病的潛在候選藥物，市場價值巨大，應用前景良好。
下面將結合實施例對本發明的優選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，並不是用於對本發明的範圍進行限制。本領域的技術人員在不背離本發明的宗旨和精神的情況下，可以對本發明進行各種修改和替換。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例1 雙特異性抗體構建 雙特異性抗體的構建中，兩個抗體的可變區排布會對其與抗原的結合能力產生影響，而不同的構建可能導致抗病毒活性的差異。因此基於兩個不同位點的抗體構建的雙特異性抗體其雙位點結合活性是否得以保留，以及抗病毒活性是否能夠提高，仍存在較大不確定性。雙特異性抗體為不同結構的抗體之間形成的融合蛋白，不同結構的抗體分別結合兩種細胞的不同抗原或同一抗原的不同位點，發揮各自不同的功能。為使得雙特異性抗體中各抗體充分發揮其各自的功能，本實施例在抗體設計時，設計了大量備選的雙特異性抗體，以期儘量減少各抗體在序列和結構上相互影響對各自功能發揮造成的不利影響。
BS-mAb-1構建
在BS-mAb-1構建中，將B38和H4的V區以GS柔性鉸鏈區為連接進行串聯構建（圖1 A），由於抗原結合位點其相對距離最短，推測可能對於臨近表位的結合具有一定優勢，其構建特徵為：
輕鏈序列為: (VL-H4)-(GGGGS)2-(VL-B38)-CL；
重鏈序列為: (VH-H4)-(GGGGS)2-(VH-B38)-CH1-CH2-CH3。
將輕鏈和重鏈DNA序列（分別如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 1所示）分別克隆至表達載體pCAGGS (購自Addgene)中，從而得到分別編碼抗體重鏈和輕鏈的重組表達載體。表達重鏈和輕鏈的構建體的構建方案如下：
重鏈編碼序列（5’-3’）：CMV啟動子-EcoR I酶切位點-前導序列基因（序列為SEQ ID NO.22）(VH-H4)-(GGGGS)2 -(VH-B38)-CH1-CH2-CH3基因-Xho I酶切位點；
輕鏈（κ）編碼序列（5’-3’）：CMV啟動子-Sac I酶切位點-前導序列基因（序列為SEQ ID NO.23）-(VL-H4)-(GGGGS)2 -(VL-B38)-CL基因-Xho I酶切位點；
BS-mAb-2構建
在BS-mAb-2構建中，將H4抗體的VL和VH區以GS柔性鉸鏈區進行連接，構建單鏈抗體（scFv），之後將H4-scFv構建到B38抗體的重鏈C端，形成B38加H4-scFv的雙特異性抗體構建（圖1 B），其構建結構為： 輕鏈序列為: (VL-B38)-CL 重鏈序列為: (VH-B38)-CH1-CH2-CH3-GGGS-(VH-H4)-(GGGGS)4 -(VL-H4)
將輕鏈和重鏈DNA序列（分別如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 5所示）分別克隆至表達載體pCAGGS (購自Addgene)中，從而得到分別編碼抗體重鏈和輕鏈的重組表達載體。表達重鏈和輕鏈的構建體的構建方案如下：
重鏈編碼序列（5’-3’）：CMV啟動子-EcoR I酶切位點-前導序列基因（序列為SEQ ID NO.24）-(VH-B38)-CH1-CH2-CH3-GGGS-(VH-H4)-(GGGGS)4 -(VL-H4)基因-Xho I酶切位點；
輕鏈（κ）編碼序列（5’-3’）：CMV啟動子-Sac I酶切位點-前導序列基因（序列為SEQ ID NO.25）-(VL-B38)-CL基因-Xho I酶切位點。
實施例2 雙特性抗體重組表達構建及蛋白表達純化
在本實施例中，以H4和B38兩種新冠病毒S抗原特異性抗體為基礎，構建了兩種不同的雙特異性抗體，BS-mAb-1 和BS-mAb-2，其重鏈氨基酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6所示，其輕鏈氨基酸序列分別如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8所示。
在含10% FBS的DMEM中培養HEK293T細胞（ATCC CRL-3216）。用上述BS-mAb-1 和BS-mAb-2雙特性分別編碼抗體重鏈和輕鏈的重組表達載體共轉染HEK 293T細胞。轉染4-6小時後，將細胞培養液更換成無血清的DMEM，並且繼續培養3天。收集上清，然後補加DMEM，繼續培養4天，然後再次收集上清。
將收集的上清以5000 rpm離心30 min，然後與含有20 mM磷酸鈉(pH 7.0)的緩衝液等體積混合，隨後用0.22 μm濾膜進行過濾，然後裝載至與protein A預裝柱（5 mL，GE Healthcare）。以10 mM甘氨酸(pH 3.0)洗脫結合至預裝柱的蛋白。將洗脫級分濃縮，然後通過分子篩層析法進行純化。隨後，通過SDS-PAGE (還原性和非還原性)檢測所純化的目的蛋白。結果如圖2所示。圖2的結果顯示，經純化獲得了經純化的BS-mAb-1和BS-mAb-2抗體，在非還原條件SDS-PAGE中抗體呈現單一條帶，在還原條件下SDS-PAGE中抗體的Fc區二硫鍵被打開，從而顯示為兩個條帶，且抗體純度超過95%。
實施例3 BS-mAb-1和BS-mAb-2抗體與S蛋白RBD的雙位點結合能力的評估
在本實施例中，利用ForteBio Octet RED 96生物膜層表面干涉技術對所純化抗體與S蛋白RBD進行結合分析，同時評價BS-mAb-1和BS-mAb-2抗體是否具有雙位點結合能力。
將帶有組氨酸標籤的S蛋白RBD (Science. 2020 Jun 12;368(6496):1274-1278)固定在探針(Fortebio公司)上。為評價BS-mAb-1抗體的雙位點結合能力，首先將固定RBD蛋白的探針與H4抗體(Science. 2020 Jun 12;368(6496):1274-1278)結合，並使之達到飽和。之後將BS-mAb-1與等濃度的H4抗體混合物流經H4抗體飽和結合的探針。結果表明，與H4-H4抗體與RBD的結合水準相比，H4抗體飽和結合的RBD仍能夠結合BS-mAb-1，表明其包含的與H4抗體非競爭性的BS38抗體發揮了結合作用（圖3的A）。同樣的，將固定RBD蛋白的探針首先與B38抗體結合，並使之達到飽和。之後將BS-mAb-1與等濃度的B38抗體(Science. 2020 Jun 12;368(6496):1274-1278)混合物流經B38抗體飽和結合的探針。結果表明，與B38-B38抗體與RBD的結合水準相比，B38抗體飽和結合的RBD仍能夠結合BS-mAb-1，表明其包含的與B38抗體非競爭性的H4抗體發揮了結合作用（圖3的A）。BS-mAb-2抗體的雙位點結合能力通過上述類似的實驗進行了檢測，結果表明，BS-mAb-2抗體也具有雙位點結合能力，表明其所包含的H4和B38抗體的scFv均發揮了抗原結合能力（圖3的B）。
實施例4 BS-mAb-1和BS-mAb-2抗體與RBD結合能力的評估
首先，將抗人 IgG的抗體（購自GE Healthcare公司）以氨基偶聯的方式固定在CM5晶片的通道（flow cell, Fc）。固定量控制在8,000回應值（response units, RU）左右。然後，以抗體捕獲的方式，分別結合純化的B38、H4、BS-mAb-1或BS-mAb-2抗體。另外，以20 mM HEPES，150 mM NaCl，pH 7.4溶液連續倍比稀釋RBD蛋白。然後，將連續稀釋的RBD蛋白（6.25 nM – 100 nM）依次通過各通道（從低濃度開始逐一上樣）。記錄各抗體結合RBD蛋白的動力學曲線，並利用BIAevaluation software 8K (Biacore, Inc.) 軟體計算動力學常數（圖4）。
圖4的結果顯示，H4抗體和B38抗體與RBD的親和力分別為8.25 nM和22.5 nM, 而雙特異性抗體BS-mAb-1和BS-mAb-2與RBD的親和力分別為4.14 nM和21.7 nM。這表明雙特異性抗體與RBD的親和力與B38和H4抗體維持在同一水準。
實施例5 BS-mAb-1和BS-mAb-2抗體中和2019-nCoV假病毒能力的評估
將hACE2全長基因(UNIPRO: Q9BYF1)構建到Pcdna4.0表達質粒（購自Invitrogen），順轉至Hela細胞，並在2 μg/ml 嘌呤黴素（購自Gibco公司）的選擇壓力下培養，並單細胞分選為單克隆細胞，製備穩定表達hACE2基因的Hela穩轉細胞株(Hela-hACE2)備用。
將純化的B38、H4、BS-mAb-1或BS-mAb-2抗體從200 μg/mL開始倍比稀釋至第10個梯度，然後分別與表達新冠病毒S抗原的假病毒（野生型VSV-SARS-CoV-2假毒）（獲自中國食品藥品檢定研究院）在37℃混合孵育2小時。孵育後，將病毒加入到預先接種了表達人ACE2的Hela穩轉細胞株（Hela-hACE2）的96孔板中，並於37℃，5% CO2 培養箱中培養24小時，通過檢測假病毒感染後所啟動的螢光素酶底物反應水準，計算B38、H4、BS-mAb-1或BS-mAb-2抗體的中和滴度。結果如圖5所示。圖5顯示了不同濃度的B38、H4、BS-mAb-1或BS-mAb-2抗體抗2019-nCoV假病毒的中和活性。結果顯示，BS-mAb-1抗體對2019-nCoV假病毒的中和滴度（半數中和濃度，NC50 ）為0.119 μg/mL，相對於H4（NC50 = 0.718 μg/mL）和B38（NC50 = 0.681 μg/mL）抗體提高了6-7倍。BS-mAb-2抗體對2019-nCoV假病毒的中和滴度為0.048 μg/mL，相對於H4和B38抗體提高了14-15倍。因此，雙特異性抗體BS-mAb-1和BS-mAb-2構建相對於H4和B38單克隆抗體具有更高的中和活性。
實施例6  BS-mAb-1和BS-mAb-2抗體中和2019-nCoV活病毒能力的評估
將實施例1純化的BS-mAb-1和BS-mAb-2抗體從100 μg/mL開始倍比稀釋至第10個梯度，然後分別與半數組織培養感染劑量（TCID50）的BetaCoV/Shenzhen/SZTH-003/2020病毒（GISAID號: EPI_ISL_406594）在37攝氏度混合孵育2小時。孵育後，將病毒加入到預先接種了Vero細胞的96孔板中，並於37攝氏度，5% CO2 培養箱中培養4天，觀察致細胞病變效應（CPE），並計算BS-mAb-1和BS-mAb-2抗體的中和滴度。結果如圖6所示。圖6顯示了不同濃度的BS-mAb-1和BS-mAb-2抗體抗2019-nCoV活病毒的中和活性。結果顯示，BS-mAb-1抗體對2019-nCoV活病毒的中和滴度（半抑制濃度，IC50 ）為1.725 μg/mL，BS-mAb-2抗體對2019-nCoV活病毒的中和滴度（半抑制濃度，IC50 ）為0.656 μg/mL，具有良好的中和活性。
實施例7 其它雙抗構建及驗證
為證明雙特異性抗體的可變區排布或者連接兩個單抗部分的連接肽會對其與抗原的結合能力產生影響，申請人基於單抗B38和H4，還構建了其它的雙特異性抗體進行驗證。其它雙特異性抗體為：1#、6#和12#，結構分別為：
1#：
輕鏈: (VL-B38)-GQPKAAP-(VL-H4)-(TKQPS)-CL，氨基酸序列如SEQ ID NO. 26所示；
重鏈: (VH-H4)-S-(VH-B38)-RT-CH1-CH2-CH3，氨基酸序列如SEQ ID NO. 27所示；
6#：
輕鏈: (VL-B38)- (G)10-(VL-H4)-CL，氨基酸序列如SEQ ID NO. 28所示；
重鏈: (VH-H4)-(G)7-(VH-B38)-S-CH1-CH2-CH3，氨基酸序列如SEQ ID NO. 29所示；
12#：
輕鏈序列為: (VL-H4)- (G)10-(VL-B38)-CL，氨基酸序列如SEQ ID NO. 30所示；
重鏈序列為: (VH-B38)-(G)7-(VH-H4)-S-CH1-CH2-CH3，氨基酸序列如SEQ ID NO. 31所示。
（一）抗體構建
根據實施例1中BS-mAb-1的構建方式製備這3種抗體，並根據實施例2的描述純化抗體以及檢驗純度。
圖7的結果顯示，獲得了經純化的1#、6#和12#抗體，在還原條件下SDS-PAGE中抗體的Fc區二硫鍵被打開，從而顯示為兩個條帶，且抗體純度超過95%。
（二）中和2019-nCoV活病毒能力評估
將上述純化的1#、6#和12#抗體從100 μg/mL開始倍比稀釋至第10個梯度，然後分別與半數組織培養感染劑量（TCID50）的BetaCoV/Shenzhen/SZTH-003/2020病毒（GISAID號: EPI_ISL_406594）在37攝氏度混合孵育2小時。孵育後，將病毒加入到預先接種了Vero細胞的96孔板中，並於37攝氏度，5% CO2 培養箱中培養4天，觀察致細胞病變效應（CPE），並計算1#、6#和12#抗體的中和滴度。結果如圖8所示，顯示了不同濃度的1#、6#和12#抗體抗2019-nCoV活病毒的中和活性。結果顯示，1#抗體對2019-nCoV活病毒的中和滴度（半抑制濃度，IC50 ）為5004 μg/mL，6#抗體對2019-nCoV活病毒的中和滴度（半抑制濃度，IC50 ）為54304 μg/mL，12#抗體對2019-nCoV活病毒的中和滴度（半抑制濃度，IC50 ）為102.6 μg/mL。
實施例8：雙特異性抗體針對新冠病毒野生株/變異株假病毒體外中和活性實驗
本實驗驗證實施例2構建的BS-mAb-2抗體對40株新冠狀病毒假病毒株的中和活性情況。
1）材料
Huh7細胞（JCRB，Cat#0403）、中檢院SARS-Cov-2假病毒共31株、DMEM高糖培養基、螢火蟲螢光素酶檢測試劑、無菌PBS（pH7.2）、胎牛血清、1%（m/v）雙抗（青黴素/鏈黴素抗生素）、0.25%（m/v）胰酶-EDTA。
31株中國食品藥品研究院構建的新型冠狀病毒假病毒具體如下表2所示。 表2：31株假病毒
序號 毒株類別 假病毒名稱 突變位點
1 首次發現於中國的毒株 WH-1 無
2 D614G D614G
3 首次發現於英國的毒株 B1.1.7（VOC 202012/01） 69del、70del、145del、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H
4 D614G+69-70del+N439K D614G、69-70del、N439K
5 D614G+L18F+A222V D614G、L18F、A222V
6 D614G+A222V D614G、A222V
7 D614G+S477N D614G、S477N
8 D614G+L18F D614G、L18F
9 D614G+69-70del D614G、69-70del
10 D614G+N501Y D614G、N501Y
11 D614G+A570D D614G、A570D
12 D614G+P681H D614G、P681H
13 D614G+T716I D614G、T716I
14 D614G+S982A D614G、S982A
15 D614G+D1118H D614G、D1118H
16 首次發現於南非的毒株 D614G+K417N D614G、K417N
17 D614G+E484K D614G、E484K
18 D614G+E484K+N501Y D614G、E484K、N501Y
19 D614G+242-244Del D614G、242-244Del
20 首次發現於丹麥Mink的毒株 D614G+Y453F D614G、Y453F
21 D614G+69-70del+Y453F D614G、69-70del、Y453F
22 D614G+69-70del+Y453F+S1147L D614G、69-70del、Y453F、S1147L
23 Y453F+G261D Y453F、G261D
24 D614G+F486L D614G、F486L
25 D614G+F486L+L452M D614G、F486L、L452M
26 D614G+A262S+F486L+Q314K D614G、A262S、F486L、Q314K
27 D614G+A262S D614G、A262S
28 首次發現于巴西的毒株 P.2 D614G、E484K、V1176F
20 首次發現於印度的毒株 B.1.617.1 D614G、E154K、E484Q、G142D、L452R、P681R、Q1071H、T95I
30 B.1.617.2 A222V、D614G、D950N、L452R、P681R、T19R、T478K
31 B.1.617.3 D614G、D950N、E156G、E484Q、F157del、L452R、P681R、R158del、T19R
2）稀釋法：原液（30.7 g/L）稀釋30倍；繼而如下表3所示，取96孔板，於第2列（CC：細胞對照，僅加細胞和培養基，見表3）加入DMEM完全培養基（1%雙抗，25 mM HEPES，10%FBS）150 μl/孔，於第3列、第6列、第9列（第3列、第6列、第9列依次為假病毒對照 VC1、VC2、VC3，下一96孔板編號以此類推；VC：假病毒對照，僅加入假病毒、細胞和培養基）加入DMEM完全培養基100 μl/孔，於C4-G5、C7-G8、C10-G11孔中加入DMEM完全培養基100μl/孔，於B4-B5、B7-B8、B10-B11孔加入DMEM完全培養基142.5 μl/孔。
加樣：於B4-B5、B7-B8、B10-B11孔加入待檢抗體：7.5 μl/孔（工作液30倍初始稀釋）……以此類推。
3）樣品稀釋：將多道移液器調至50 μl，對B4-B5、B7-B8、B10-B11孔中液體輕柔的反復吹吸6～8次充分混勻，然後轉移50 μl液體至對應的C4-C5、C7-C8、C10-C11孔，輕柔的反復吹吸6～8次後轉移至D4-D5、D7-D8、D10-D11孔，以此類推，最後從G4-G5、G7-G8、G10-G11中吸棄50 μl液體，96孔細胞培養板加樣位置參照表3。加樣完成後將樣品放回。
4）用DMEM完全培養基將各株假病毒稀釋至1.3×104(1×104～2 ×104)TCID50/ml（按提供的稀釋倍數稀釋），於第3～5列加入假病毒1、第6～8列加入假病毒2、第9～11列加入假病毒3，以此類推，每孔加50 μl，使假病毒的量為650 (500-1000)/孔。加完病毒後，將上述96孔板置於細胞培養箱中（37℃，5%CO2 ）孵育1小時。 表3： 96孔板加樣位置表
      假病毒1 假病毒2 假病毒3  
  1 2 3 4   5 6 7   8 9 10   11 12
A                  
B   CC VC1 稀釋度1 VC2 稀釋度1 VC3 稀釋度1  
C   CC VC1 稀釋度2 VC2 稀釋度2 VC3 稀釋度2  
D   CC VC1 稀釋度3 VC2 稀釋度3 VC3 稀釋度3  
E   CC VC1 稀釋度4 VC2 稀釋度4 VC3 稀釋度4  
F   CC VC1 稀釋度5 VC2 稀釋度5 VC3 稀釋度5  
G   CC VC1 稀釋度6 VC2 稀釋度6 VC3 稀釋度6  
H                  
當孵育時間至半小時，取出培養箱中事先準備好的細胞（匯合率達80%～90%），吸棄瓶中的培養基，加入5 ml PBS緩衝液清洗細胞，傾去PBS後，加入3 ml 0.25%胰酶-EDTA，使其浸沒細胞消化1分鐘，傾去胰酶，置於細胞培養箱中消化5分鐘，輕輕拍打培養瓶側壁使細胞脫落，加入10 ml培養基中和胰酶，吹打幾次後，細胞計數，用DMEM完全培養基將細胞稀釋至2×105 個/ml。孵育至1小時，向96孔板中每孔加100 μl細胞，使每孔細胞為2×104 個。將96孔板前後左右輕輕晃動，使細胞在孔中分散均勻，將96孔板放入細胞培養箱中，37 ℃，5% CO2 培養20～28小時。從細胞培養箱中取出96孔板，用多道移液器從每個上樣孔中吸棄150 μl上清，然後加入100 μl螢光素酶檢測試劑，室溫避光反應2 min。反應結束後，用多道移液器將反應孔中的液體反復吹吸6～8次，使細胞充分裂解，從每孔中吸出150 μl液體，加于對應96孔化學發光檢測板中，置於多功能微孔板檢測儀中讀取發光值。
5）計算中和抑制率：抑制率＝[1－（樣品組的發光強度均值－空白對照CC均值）/（陰性組的發光強度均值－空白對照值CC均值）]×100％。根據中和抑制率結果，採用Reed-Muench法計算IC50 值。其中，陰性組為不含抗新冠病毒抗體的正常人血清+假病毒+細胞+培養基。
重複試驗：每個變異株檢測按上述方法再重複兩次，三次測定的抗體與假病毒變異株的IC50 均值為抗體針對某個變異株的最終IC50 值。
6）結果
將抗體濃度稀釋至100μg/mL進行檢測，檢測結果見表4。 表4：本發明抗體對不同病毒株的中和活性檢測結果
毒株類別 假病毒名稱 IC50 值1 （μg/mL） IC50 值2 （μg/mL） IC50 值3 （μg/mL） IC50 均值 （μg/mL）
首次發現於中國的毒株 WH-1 0.021 0.022 0.021 0.021
D614G 0.051 0.093 0.063 0.069
首次發現於英國的毒株 B1.1.7（VOC 202012/01） 0.164 0.221 0.215 0.200
D614G+69-70del+N439K 0.022 0.025 0.025 0.024
D614G+L18F+A222V ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014
D614G+A222V ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014
D614G+S477N ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014
D614G+L18F 0.015 ＜0.014 0.014 ≈0.014
D614G+69-70del 0.031 0.032 0.034 0.032
D614G+N501Y 0.086 0.081 0.093 0.087
D614G+A570D 0.018 0.018 0.019 0.018
D614G+P681H ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014
D614G+T716I ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014
D614G+S982A ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014
D614G+D1118H ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014
首次發現於南非的毒株 D614G+K417N 1.695 1.613 1.786 1.698
D614G+E484K 0.099 0.095 0.116 0.103
D614G+E484K+N501Y 2.381 2.632 1.923 2.312
D614G+242-244Del 0.141 0.111 0.124 0.125
首次發現於丹麥Mink的毒株 D614G+Y453F ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014
D614G+69-70del+Y453F ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014
D614G+69-70del+Y453F+S1147L 0.129 0.125 0.122 0.125
Y453F+G261D ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014
D614G+F486L 1.786 1.316 1.266 1.456
D614G+F486L+L452M 0.459 0.515 0.352 0.442
D614G+A262S+F486L+Q314K 0.358 0.377 0.379 0.371
D614G+A262S ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014
首次發現于巴西的毒株 P.2 0.113 0.077 0.124 0.105
首次發現於印度的毒株 B.1.617-1 0.357 0.439 0.392 0.396
B.1.617-2 ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014 ＜0.014
B.1.617-3 1.724 2.326 2.174 2.075
由此可見，本發明的抗體能夠不同程度地體外中和抑制多種變異的假病毒毒株，說明本發明抗體針對新冠病毒及其多種變異株都有效果，使用範圍廣。其中，首次發現於印度的B.1.617-1毒株即為德爾塔毒株，其是目前已知最具傳染性呼吸道病毒之一，並且在世界各地迅速傳播，本發明的抗體對其中和活性極高。
實施例9：雙特異性抗體的毒性實驗
（一）重複給藥實驗
本實驗評價BS-mAb-2抗體重複靜脈輸注給予食蟹猴，每週給藥2次，連續給藥4周後可能出現的毒性反應、毒性靶器官、毒代動力學特性及免疫原性，以及末次藥後4周毒性反應恢復情況或可能出現的延遲毒性反應。
實驗動物以及分組：共使用40隻食蟹猴（20隻/性別）（來源：廣西雄森靈長類實驗動物養殖開發有限公司；實驗動物生產許可證號：SCXK（桂）2016-0003；實驗動物品質合格證編號：0002914、0002923、0002931；生產許可證簽發單位：廣西壯族自治區科學技術廳；年齡：2.8-4歲），隨機分為4個組（5隻/性別/組），第1組動物給予氯化鈉注射液作為陰性對照品（0 mg/kg），第2、3、4組動物分別給予25、50和150 mg/kg的BS-mAb-2抗體，為供試品低、中和高劑量組。每週給藥2次，連續給藥4周，共給藥9次（D1、D5、D8、D12、D15、D19、D22、D26和D29）。使用輸注泵於食蟹猴後肢皮下靜脈輸注給藥，給藥容量為10 mL/kg，給藥速度約為0.5 mL/kg/min。雄性和雌性首次給藥當天分別定義為該性別動物的試驗D1。
檢測指標：實驗期間，對動物進行了臨床觀察，定期監測動物的體重、食量、體溫、心電圖（馬甲遙測）、呼吸功能（馬甲遙測）、心電圖（肢體導聯II ECG）、血壓、眼科檢查、血細胞計數、凝血功能、血液生化和尿液分析。D1和D26給藥前和給藥後，以及D15、D19和D22藥前進行血藥濃度檢測和毒代動力學分析。為評價免疫反應，週期性的檢測淋巴細胞亞群（CD3+ 、CD3+ CD4+ 、CD3+ CD8+ 、CD20+ 、CD3+ CD4+ / CD3+ CD8+ ）、細胞因數（TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6）、免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）、補體（C3、C4）和BS-mAb-2抗體。給藥期結束後，第1-4組前3隻/性別/組動物于4周藥後（D30）按計劃實施安樂死，第1-4組剩餘的2隻/性別/組動物于4周恢復期結束（D57）按計劃實施安樂死。第1-4組動物進行系統解剖，對臟器重量、大體解剖及組織病理學等進行檢查。
結果：
1）實驗期間，1-4組所有動物未見死亡或瀕死情況。供試品25、50和150 mg/kg劑量組動物的臨床觀察均未見與供試品相關的異常改變。
2）實驗期間，供試品25、50和150 mg/kg劑量組動物的體重及體重增長、食量、體溫、心電指標（馬甲遙測）、呼吸功能（馬甲遙測）、心電圖（肢體導聯II ECG）、血壓、眼科檢查、血細胞計數、凝血功能、血液生化、尿液分析、淋巴細胞亞群、細胞因數、免疫球蛋白和補體均未見與供試品相關或具有毒理學意義的改變。
3）BS-mAb-2抗體以25、50和150 mg/kg的劑量重複靜脈輸注給予食蟹猴後，50和150 mg/kg劑量組各1隻動物給藥後第29天產生了抗藥抗體（ADA），ADA滴度分別為1:160和1:1280，供試品組樣品總陽性率為1.4%，個體總陽性率為6.7%。抗體產生的時間、發生率及滴度未見明顯性別差異及給藥劑量相關性；表明食蟹猴對BS-mAb-2抗體的免疫原性較弱。
4）供試品重複靜脈輸注給予食蟹猴後，各供試品組動物毒代動力學參數結果如表5所示： 表5：抗體BS-mAb-2的動物毒代動力學參數結果：
      D1 D26  
組別 性別   Cmax AUClast Cmax AUClast AF
劑量 動物數   μg/mL h·mg/mL μg/mL h·mg/mL -
低劑量組 25 mg/kg 雄 n=5 Mean 460 22.4 761 37.4 1.69
SD 88.2 3.03 76.4 7.13 0.37
雌 n=5 Mean 470 22.5 945 51.3 2.28
SD 49.0 2.35 84.3 6.41 0.11
總體 n=10 Mean 465 22.5 853 44.3 1.99
SD 67.4 2.56 123 9.71 0.40
中劑量組 50mg/kg 雄 n=5 Mean 917 41.0 1420 75.1 1.83
SD 77.2 3.27 305 16.9 0.37
雌 n=5 Mean 864 41.3 1650 89 2.17
SD 127 3.62 133 8.4 0.29
總體 n=10 Mean 891 41.1 1530 82.0 2.00
SD 103 3.25 253 14.5 0.36
高劑量組 150 mg/kg 雄 n=5 Mean 2850 139 4460 234 1.69
SD 180 13.5 708 13.7 0.08
雌 n=5 Mean 2710 126 4480 218 1.74
SD 214 15.8 404 19.4 0.18
總體 n=10 Mean 2780 132 4470 226 1.72
SD 201 15.4 543 18.0 0.13
備註：n為動物數；蓄積因數AF = AUClast , 8th /AUClast , 1st
供試品重複靜脈輸注給予食蟹猴後，僅低劑量組D26的Cmax 和AUClast 出現雌雄差異（p ＜ 0.05，但相差不大，雌/雄比值分別為1.24和1.37），其餘各組雌雄動物的藥代動力學參數均無統計學差異（p ＞ 0.05），表明各組動物不同性別間參數基本一致。第8次（D26）給藥後，供試品組雌、雄動物蓄積因數（AF = AUClast , 8th /AUClast , 1st ）介於1.69-2.28，均未見明顯的藥物蓄積。
5）供試品BS-mAb-2抗體在25 ~ 150 mg/kg的劑量範圍內重複靜脈輸注給予食蟹猴，各組不同性別動物間血清藥物濃度時間變化趨勢基本一致，血清藥物峰濃度及血清藥物暴露量均與給藥劑量正相關。
6）給藥結束安樂死（D30）和觀察期結束（D57）安樂死，供試品25、50和150 mg/kg劑量組動物的臟器重量、大體解剖檢查和組織病理學檢查均未見與供試品相關的病理改變。
7）供試品25、50和150 mg/kg劑量組動物的給藥局部（即注射局部）的肉眼觀察、大體解剖檢查和組織病理學檢查均未見與供試品相關異常改變。
結論：綜上所述，在本實驗條件下，BS-mAb-2抗體以25、50和150 mg/kg的劑量重複靜脈輸注給予食蟹猴，每週給藥2次，連續給藥4周（共9次給藥），恢復期4周。各劑量組動物均未見全身毒性反應和毒性靶器官。本實驗未觀察到臨床不良反應的劑量水準（NOAEL）為150 mg/kg。該劑量下第8次（D26）藥後雄性動物的Cmax 和AUClast 分別為4460 ng/mL和234 h·mg/mL，雌性動物的Cmax 和AUClast 分別為4480 ng/mL和218 h·mg/mL。
（二）單次給藥實驗
本實驗評價單次靜脈輸注BS-mAb-2抗體後，食蟹猴可能出現的毒性反應、毒性靶器官和在體內的代謝特徵，以及觀察給藥期結束後14天毒性反應情況。
6隻食蟹猴，隨機分為3組（1隻/性別/組），第1組為陰性對照組（氯化鈉注射液，0 mg/kg），第2-3組分別給予50和300 mg/kg的BS-mAb-2抗體。動物於第1天（D1）單次給藥，使用注射泵于動物後肢皮下靜脈輸注給藥，給藥容量為12 mL/kg，給藥速度約為0.5 mL/kg/min。實驗期間，給藥後連續觀察約4小時，並定期對動物的臨床觀察、體重、體溫、心電圖、血細胞計數、凝血功能、血液生化、T淋巴細胞亞群、細胞因數和毒代動力學指標進行檢查。
實驗期間，各組動物均未見死亡或瀕死現象。BS-mAb-2抗體的50 mg/kg劑量組和300 mg/kg劑量組均未見供試品相關的臨床異常現象，體重、體重增長、體溫、心電圖指標、血細胞計數、凝血功能、血液生化、T淋巴細胞亞群也均未見供試品相關的異常改變。觀察期結束後（D15），BS-mAb-2抗體50和300 mg/kg劑量組動物的大體觀察未見異常，未進行組織病理學檢查。毒代試驗結果顯示，各組不同性別動物間血清藥物濃度變化趨勢基本一致，血清藥物濃度與給藥劑量正相關。
綜上所述，在本實驗條件下，BS-mAb-2抗體以50和300 mg/kg劑量單次靜脈輸注給予食蟹猴後未見明確與BS-mAb-2抗體相關的毒性反應，無可見有害作用水準（NOEL）為300 mg/kg。
實施例10：抗體治療性實驗
本實施例以SARS-CoV-2病毒感染恒河猴模型，對BS-mAb-2抗體在恒河猴內治療效果進行評價。
1）實驗材料：
（1）SARS-CoV-2毒株：來源於雲南省昆明市COVID-19患者痰液臨床樣本（經雲南省衛生健康委協調批准轉移），該株病毒由中國醫學科學院醫學生物學研究所於BSL-3實驗室（實驗室已通過國家CNAS認可，並經國家衛生健康委批准可從事SARS-CoV-2研究）分離，經Vero細胞適應後，完成毒種鑒定、測序和保存（SARS-CoV-2-KMS1/2020 /GenBank accession number: MT226610.1）。
（2）細胞：非洲綠猴腎細胞株（Vero）購自ATCC（Manassas, VA, USA），使用含100 U/mL青黴素、100 μg/mL鏈黴素、10%新生牛血清的MEM培養基於5% CO2 ，37℃條件下培養。
（3）實驗動物：恒河猴，1.5-1.7歲，體重1.5-2.5kg，16隻，雄性，由中國醫學科學院醫學生物學研究所靈長類實驗動物中心提供（實驗動物生產許可證號：SCXK（滇）K2020-0005）。所有實驗動物的使用均根據雲南省及本所實驗動物管理委員會相關規定，並經中國醫學科學院醫學生物學研究所實驗動物倫理委員會批准（批准號DWSP 202104 010）。所有動物實驗均在已通過中國合格評定國家認可委員會(China National Accreditation Service for Conformity Assessment, CNAS)認證的生物安全防護三級實驗室（ABSL-3）條件下進行，從事SARS-CoV-2病毒的實驗工作已得到國家衛生健康委的批准。
2）病毒滴度檢測
半數細胞培養感染劑量法（50% Cell culture infections does, CCID50）：於測定前一天將Vero細胞以1×104～5×104個細胞/孔的濃度加入96孔細胞培養板中，培養液為含10%新生牛血清的MEM完全培養液，體積共100μl，次日將原培養液倒出，200 μl PBS洗細胞一次，以去除剩餘血清及死細胞。實驗前，每孔加入含3%新生牛血清的MEM完全培養液100 μl，37℃培養細胞備用。同時，將待測病毒液從-80℃取出，常溫或37℃融化後旋渦混勻，利用不含血清的MEM培養液將病毒液進行10倍稀釋（10-1、10-2、10-3、…、10-8）。稀釋病毒時吸取病毒液的移液器槍頭懸空將病毒液打入稀釋液中（勿將槍頭伸入稀釋液中），充分漩渦混勻後，繼續下一步稀釋，每稀釋一步更換移液器槍頭一次。後將稀釋好的病毒液依次加入96孔板的Vero細胞中，每個稀釋度8個平行孔，並設置病毒原液陽性對照孔及MEM培養液的陰性對照孔。後將細胞置於37℃，5%CO2 環境中培養，培養至第6-7天觀察細胞病變（cytopathic effect, CPE）。 結果利用Karber法計算: lgCCID50=（lg最低稀釋倍數）-（稀釋組距）×（陽性病變孔比率總和-0.5）CCID50=10 lgCCID50/0.1mL。
3）SARS-CoV-2螢光PCR鑒定
引物、探針與試劑：所有引物均為華大基因公司合成，經雙蒸水溶解為10 μmol/μl的工作液濃度後，於-20°C保存備用。 表6：SARS-CoV-2螢光PCR鑒定引物序列
引物 SARS-CoV-2 E_Sarbeco-F 5’ -3’ ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT
SARS-CoV-2 E_Sarbeco-R 5’-3’  ATATTGCAGCAGTACGCACACA
探針 5’FAM-TAMRA-3’  ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG
4）實驗設計
實驗用猴經常規檢疫後，SARS-CoV-2抗體檢測陰性入選本實驗。設置對照組、低劑量組、高劑量組和預防給藥組，每組4隻。
實驗方案：
（1）攻毒：各實驗組攻毒劑量為5.0 logCCID50/隻，100 μl滴鼻感染；
（2）分組：
預防組：在攻毒前12小時注射抗體，50 mg/kg體重，靜脈注射；
低劑量組：攻毒後12小時第一次注射抗體，25 mg/kg 體重，靜脈注射；在第一次注射抗體後的72小時，進行第二次注射抗體，劑量同第一次。
高劑量組：攻毒後12小時第一次注射抗體，50 mg/kg 體重，靜脈注射；在第一次注射抗體後的72小時，進行第二次注射抗體，劑量同第一次。
空白對照組：不做任何處理。
（3）觀察動物臨床表現，測量體溫、體重、每天採集鼻拭、咽拭、肛拭樣品進行病毒qPCR檢測，第1、3、5、7天進行鼻拭、咽拭、肛拭樣品病毒qPCR、亞基因組RNA和CCID50檢測；第7天麻醉後處死實驗動物，採集主要組織進行病理、病毒載量檢測分析。
檢測內容：
（1）感染後排毒及組織內病毒載量分析
咽拭子、鼻拭子、肛拭子、組織提取樣本RNA後進行q-PCR，利用標準曲線和Ct值進行樣本病毒載量計算。
（2）組織病理學檢查
動物組織樣本使用4%的甲醛溶液固定，石蠟包埋。
（3）統計分析
資料統計採用Graphad Prism8.0軟體，結果以mean，或mean±SD 表示（中和抗體以GMT或GMT±SD）表示。
5）實驗結果：
5.1）臨床表現：
（1）所有實驗猴在1-7天未出現精神、飲食明顯變化；未出現動物死亡；對照組有1隻實驗猴從第2天起出現輕微腹瀉情況，飲食未見明顯變化。
（2）體溫：除對照組和預防組實驗猴體溫出現較為明顯降低趨勢外，所有實驗猴在1-7天未出現明顯體溫升高和降低的情況，所有實驗猴的體溫均處於正常參考範圍值內。
（3）體重：所有實驗猴在1-7天體重未見明顯增加和減低情況。
5.2）病毒檢測
攻毒試驗使用病毒劑量為5.0 log CCID50/隻，以100 μl滴鼻感染。第1-7天採集咽、鼻、肛拭子，檢測病毒拷貝數。咽拭子、鼻拭子和肛拭子病毒載量結果分別如下所示。（1）咽拭子結果
對照組咽部從第3天起出現排毒，在4-5天出現明顯排毒情況，其中第4天最高，達4.98 log（拷貝/100 μl），第6天起未檢測到；而預防組和BS-mAb-2抗體治療組除個別猴子在特定天數內檢測到病毒載量外，其餘實驗猴在1-7天檢測均值處於檢測閾值以下，詳見圖9所示。
（2）鼻拭子結果
鼻拭子病毒檢測檢測結果顯示，對照組從第1天起持續到第7天均出現排毒情況，在4-5天出現明顯排毒高峰，其中第4天最高達5.52 log（拷貝/100 μl），而預防組、BS-mAb-2抗體低劑量組和BS-mAb-2抗體高劑量組均在在第1天出現排毒高峰分別為4.32 log（拷貝/100 μl）、5.07 log（拷貝/100 μl）和4.89 log（拷貝/100 μl），其中預防組和BS-mAb-2抗體低劑量組第4-7天與對照組比較，病毒載量下降大於2個log值；高劑量組與對照組比較，在第6-7天病毒載量下降大於2個log值，詳見圖10所示。
（3）肛拭子結果
所有實驗猴在第1-7天均未檢測到糞樣排毒情況，詳見圖11所示。
5.3）大體檢測
（1）大體結果
大體病理觀察結果顯示，抗體預防組和高低劑量組實驗猴肺臟體積大小基本正常，除肺臟顏色呈現不同程度灰紅交錯變化，肺臟表面散在出血點外，未出現嚴重的肺部出血或結節情況。
（2）組織病毒載量結果
組織病毒載量檢測結果顯示，預防組所有實驗猴的鼻粘膜、氣管和肺組織病毒載量檢測值均低於檢測閾值，頸部淋巴結、肺淋巴結中均未檢測到病毒載量。BS-mAb-2抗體低劑量組和高劑量組中除個別猴子肺、肺淋、頸淋、氣管、和鼻粘膜組織中檢測到少量病毒核酸外，其餘組織中均未檢測出SARS-CoV-2病毒。
以上實驗結果說明，恒河猴經預防性和治療性給予BS-mAb-2抗體後進行SARS-CoV-2病毒攻擊，低劑量組、高劑量組和預防組的實驗猴在早期和中期的病毒增殖與排毒情況能夠得到一定程度抑制。
根據以上實驗可知，對恒河猴以劑量5.0 log CCID50/隻，100 μl滴鼻感染，病毒感染後12小時單次給藥注射BS-mAb-2 25mg/kg，與對照組相比有顯著的降低鼻、咽拭子病毒基因拷貝及病毒感染能力的作用，則恒河猴起效劑量為25mg/kg。據NMPA頒佈的《健康成年志願者首次臨床試驗藥物最大推薦起始劑量的估算指導原則》中「種屬間不按mg/m2 進行劑量換算的其他情況：分子量大於100000道爾頓的血管內給藥的蛋白，應當按mg/kg換算」，推算出人等效劑量（HED）為8.6 mg/kg。以成人體重60kg計，估算人體起效劑量約為：500 mg。考慮安全性，選擇該劑量的1/2~1/3作為首次人體給藥劑量，則人起效劑量範圍為180~250 mg。
根據單次靜脈輸注給予食蟹猴的劑量探索試驗，無可見有害作用水準（NOEL）為300 mg/kg，相應人體等效劑量（HED）為100 mg/kg，按人體體重60 kg計算，相應人體劑量為6000 mg；根據食蟹猴重複給藥4周毒理學研究結果，未觀察到臨床不良反應的劑量水準（NOAEL）為150 mg/kg，相應人體等效劑量（HED）為50 mg/kg，按人體體重60 kg計算，相應人體劑量為3000 mg。目前臨床前研究所支持的最大人體劑量為6000 mg。單次給藥劑量為180~6000 mg，如180、250、500、900、1000、1800mg、3000 mg或6000 mg，或上述數值區間。給藥方式為單/多次給藥。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附附圖之說明如下： 圖1為本發明雙特異抗體BS-mAb-1（A）和BS-mAb-2（B）的結構示意圖。 圖2為雙特異性抗體BS-mAb-1（A）和BS-mAb-2（B）的分子篩層析結果與SDS-PAGE檢測結果圖。其中，凝膠圖上的「-」表示沒有添加DTT（非還原性SDS-PAGE）；「+」 表示添加了DTT（還原性SDS-PAGE）。 圖3為BS-mAb-1（A）和BS-mAb-2（B）與RBD結合的雙位點結合特性檢測示意圖。其中，A圖中，H4-BS-mAb-1表示先用過量的H4抗體飽和結合固定有RBD的探針，之後進行BS-mAb-1抗體的結合，與H4-H4結合曲線相比較，在加入BS-mAb-1抗體後曲線有顯著上升，表明其能夠結合H4飽和的RBD。H4-H4表示為第一階段先流過H4抗體後，在第二階段再次流過H4抗體；H4-BS-mAb-1表示為第一階段先流過H4抗體後，在第二階段後流過BS-mAb-1抗體；B38-BS-mAb-1表示為第一階段流過B38抗體後，在第二階段後流過BS-mAb-1抗體。B圖中，圖注解讀參考A圖。 圖4為H4、B38、BS-mAb-1及BS-mAb-2抗體結合RBD蛋白的動力學曲線結果圖。 圖5為不同濃度的H4、B38、BS-mAb-1及BS-mAb-2抗體抗2019-nCoV假病毒的中和活性結果圖。 圖6為不同濃度的BS-mAb-1及BS-mAb-2抗體抗2019-nCoV活病毒的中和活性結果圖。 圖7為雙抗1#、6#和12#抗體的SDS-PAGE檢測結果圖。 圖8為不同濃度的1#、6#和12#抗體抗2019-nCoV活病毒的中和活性結果圖。 圖9為實施例10的恒河猴咽拭子病毒載量檢測結果示意圖。 圖10為實施例10的恒河猴鼻拭子病毒載量檢測結果示意圖。 圖11為實施例10的恒河猴肛拭子病毒載量檢測結果示意圖。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029

Claims (15)

  1. 一種抗新型冠狀病毒的雙特異性抗體包含單抗B38的重鏈可變區、單抗B38的輕鏈可變區、單抗H4的重鏈可變區、單抗H4的輕鏈可變區，其中， 單抗B38的重鏈可變區包含：氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的CDR2、以及氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的CDR3；單抗B38的輕鏈可變區包含：氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的CDR2、以及氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示的CDR3； 單抗H4的重鏈可變區包含：氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的CDR2、以及氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的CDR3；單抗H4的輕鏈可變區包含：氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示的CDR2、以及氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示的CDR3。
  2. 根據請求項1所述的雙特異性抗體，其中，所述單抗B38的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO. 32所示，單抗B38的輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO. 33所示；所述單抗H4的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO. 34所示，單抗H4的輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO. 35所示。
  3. 根據請求項2所述的雙特異性抗體，其中，所述雙特異性抗體為BS-mAb-1，其具有從N端到C端的如下結構： 重鏈：VHH4 -VHB38 -CHB38 ， 輕鏈：VLH4 -VLB38 -CLB38 ， 其中，VHH4 與VHB38 通過連接肽連接，VLH4 與VLB38 通過連接肽連接；或者， 所述雙特異性抗體為BS- mAb-2，其具有從N端到C端的如下結構： 重鏈：VHB38 -CHB38 -VHH4 -VLH4 ， 輕鏈：VLB38 -CLB38 ； 其中，VHH4 與VLH4 通過連接肽連接，組成單鏈抗體；CHB38 與VHH4 通過連接肽連接。
  4. 根據請求項3所述的雙特異性抗體，其中，所述連接肽的氨基酸序列為（GGGGS）n，其中，n為1-4的自然數；優選地，在抗體BS-mAb-1中，連接肽的n為2；在抗體BS-mAb-2中，所述VHH4 與VLH4 之間的連接肽的n為4，CHB38 與VHH4 之間的連接肽的n為1。
  5. 根據請求項4所述的雙特異性抗體，其中，所述雙特異性抗體BS-mAb-1，其輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或經一個或多個氨基酸的替換、缺失或插入得到的具有相同功能的蛋白的氨基酸序列，其重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或經一個或多個氨基酸的替換、缺失或插入得到的具有相同功能的蛋白的氨基酸序列。
  6. 根據請求項4所述的雙特異性抗體，其中，所述雙特異性抗體BS-mAb-2，其輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或經一個或多個氨基酸的替換、缺失或插入得到的具有相同功能的蛋白的氨基酸序列，其重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示或經一個或多個氨基酸的替換、缺失或插入得到的具有相同功能的蛋白的氨基酸序列。
  7. 根據請求項1-6任一所述的雙特異性抗體，其中，所述雙特異性抗體為鼠源抗體、人源化抗體、嵌合抗體或重組抗體；優選地，所述抗體為IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、IgG4抗體中的一種。
  8. 一種編碼請求項1-7任一項所述雙特異性抗體的基因。
  9. 根據請求項8所述的基因，其中，所述雙特異性抗體輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，重鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或 所述雙特異性抗體輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，重鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
  10. 一種包含請求項8或9所述基因的生物材料，所述生物材料是重組DNA、表達盒、載體、宿主細胞、工程菌或細胞株。
  11. 一種請求項1-7任一項所述雙特異性抗體的製備方法，包括：分別構建含有所述雙特異性抗體BS-mAb-1或BS-mAb-2重鏈和輕鏈基因的重組表達載體；將重組表達載體導入宿主細胞，獲得穩定表達所述雙特異性抗體的宿主細胞；培養宿主細胞，經分離純化獲得所述雙特異性抗體。
  12. 一種藥物組合物，含有請求項1-7任一項所述雙特異性抗體。
  13. 一種試劑盒，含有請求項1-7任一項所述雙特異性抗體。
  14. 一種請求項1-7任一項所述雙特異性抗體或請求項8或9所述基因或請求項10所述生物材料或請求項12所述的藥物組合物或請求項13所述的試劑盒的如下任一應用： （1）在製備預防或治療新型冠狀病毒感染所引起疾病的藥物中的應用； （2）在製備新型冠狀病毒診斷試劑或診斷試劑盒中的應用； （3）在製備新型冠狀病毒疫苗中的應用； （4）在預防或治療SARS-CoV-2冠狀病毒引起疾病中的應用； （5）在檢測新型冠狀病毒中的應用。
  15. 一種單劑量形式的藥物組合物，所述單劑量形式含有180 mg-6000 mg的請求項1~7任一項所述的雙特異性抗體；優選地，含有180 mg-3000 mg的請求項1~7任一項所述的雙特異性抗體；更優選地，含有500 mg-1800 mg的請求項1~7任一項所述的雙特異性抗體；進一步優選地，含有900 mg-1800 mg的請求項1~7任一項所述的雙特異性抗體；更進一步優選地，含有500 mg-1000 mg的請求項1~7任一項所述的雙特異性抗體；優選地，所述藥物組合物被配製為適合靜脈給藥的形式。
TW110128394A 2020-07-31 2021-08-02 一種抗新型冠狀病毒的雙特異性抗體及其應用 TW202208424A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010763140 2020-07-31
CN202010763140.X 2020-07-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202208424A true TW202208424A (zh) 2022-03-01

Family

ID=78167869

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW110128394A TW202208424A (zh) 2020-07-31 2021-08-02 一種抗新型冠狀病毒的雙特異性抗體及其應用

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN113563475B (zh)
TW (1) TW202208424A (zh)
WO (1) WO2022022666A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114149509B (zh) * 2021-12-23 2023-04-28 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 抗冠状病毒双特异性中和抗体与应用
CN113980135B (zh) * 2021-12-27 2022-04-19 三优生物医药(上海)有限公司 一种结合冠状病毒双特异性抗体的抗药抗体及其制备方法和应用
WO2023131262A1 (zh) * 2022-01-10 2023-07-13 杰库(上海)生物医药研究有限公司 特异性结合SARS-CoV-2的抗原结合蛋白
CN116617388A (zh) * 2022-01-26 2023-08-22 百奥泰生物制药股份有限公司 靶向冠状病毒的抗体在预防、治疗或改善covid-19中的应用
CN114605555B (zh) * 2022-03-28 2023-09-05 中国医学科学院病原生物学研究所 一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的双特异中和抗体及其应用
CN115057939B (zh) * 2022-06-28 2023-01-03 广东菲鹏制药股份有限公司 结合新型冠状病毒的双特异性结合蛋白、药物和方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109563166B (zh) * 2016-04-28 2022-12-20 拜奥穆尼克斯制药 靶向egfr和her2的双特异性抗体
CN111196855B (zh) * 2018-11-19 2022-11-15 三生国健药业（上海）股份有限公司 抗egfr/pd-1双特异性抗体
CN111378048A (zh) * 2018-12-28 2020-07-07 复旦大学 针对中东呼吸综合征冠状病毒的抗体-多肽双特异性免疫治疗剂
CN111333722A (zh) * 2020-03-03 2020-06-26 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) SARS-CoV-2抑制剂及其应用
CN111303280B (zh) * 2020-03-22 2022-01-07 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体及应用
CN111423508A (zh) * 2020-03-31 2020-07-17 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) 一种分离的抗病毒感染的SARS-CoV-2蛋白结合分子

Also Published As

Publication number Publication date
CN113563475B (zh) 2022-07-22
CN113563475A (zh) 2021-10-29
WO2022022666A1 (zh) 2022-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2022022666A1 (zh) 一种抗新型冠状病毒的双特异性抗体及其应用
CN111690058B (zh) 针对冠状病毒的具有中和活性的抗体及其用途
Planchais et al. Potent human broadly SARS-CoV-2–neutralizing IgA and IgG antibodies effective against Omicron BA. 1 and BA. 2
TW200927760A (en) Monoclonal antibodies that bind to hGM-CSF and medical compositions comprising same
KR20100091195A (ko) 항ｒｓｖ ｇ 단백질 항체
WO2021174595A1 (zh) 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用
CN113444169B (zh) 新型冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用
US10030069B2 (en) High affinity human antibodies to human cytomegalovirus (CMV) gB protein
CN111333723B (zh) 针对狂犬病病毒g蛋白的单克隆抗体及其用途
CN112574300B (zh) 抗sar-cov-2全人源单克隆抗体及其制法与应用
TW202207983A (zh) 用於sars-cov-2感染的抗體療法
WO2021174594A1 (zh) 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用
CN115087667B (zh) 特异性结合SARS-CoV-2的抗原结合蛋白
WO2020233715A1 (zh) 抗乙肝病毒抗体及其用途
CN113980125B (zh) 一种抗sftsv的中和性单克隆抗体及其应用
WO2022143815A1 (zh) 抗新冠病毒受体结合区域表位中和抗体及其应用
RU2803082C2 (ru) Антитела против вируса гепатита в и их применение
WO2022148374A1 (zh) 抗冠状病毒的全人广谱中和抗体76e1及其应用
WO2022188829A1 (zh) 新型冠状病毒抗体及其用途
WO2023131262A1 (zh) 特异性结合SARS-CoV-2的抗原结合蛋白
CN116143910A (zh) 靶向SARS-CoV-2刺突蛋白的纳米抗体及其应用
CN116425869A (zh) 一种抗柯萨奇病毒a6型的单克隆抗体及其制备方法和应用
CN116478281A (zh) SARS-CoV-2变异株中和抗体的制备及应用
CN115028714A (zh) 一种检测冠状病毒的抗体及其应用