CN116478281A - SARS-CoV-2变异株中和抗体的制备及应用 - Google Patents
SARS-CoV-2变异株中和抗体的制备及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116478281A CN116478281A CN202310088822.9A CN202310088822A CN116478281A CN 116478281 A CN116478281 A CN 116478281A CN 202310088822 A CN202310088822 A CN 202310088822A CN 116478281 A CN116478281 A CN 116478281A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- cov
- cov2
- sars
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 75
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 title abstract description 38
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 36
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 25
- 102000053723 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 245
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 claims description 87
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 82
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 82
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 81
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 74
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 59
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 claims description 44
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims description 36
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 34
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 34
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 30
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 30
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 30
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 29
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 claims description 26
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 26
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 23
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 23
- 230000005888 antibody-dependent cellular phagocytosis Effects 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 17
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 claims description 16
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 claims description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 14
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 9
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 claims description 8
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims description 8
- -1 antibodies Substances 0.000 claims description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 8
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 claims description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims description 5
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 claims description 4
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 claims description 4
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 claims description 4
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 claims description 4
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 claims description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 4
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 4
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 claims description 3
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 102000014447 Complement C1q Human genes 0.000 claims description 2
- 108010078043 Complement C1q Proteins 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 13
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 abstract description 4
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 abstract description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 134
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 84
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 72
- 229940125677 REGEN-COV Drugs 0.000 description 51
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 48
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 47
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 46
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 41
- 230000006870 function Effects 0.000 description 38
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 32
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 30
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 28
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 27
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 26
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 23
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 21
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 20
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 20
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 20
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 18
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 18
- 102220049372 rs587783658 Human genes 0.000 description 18
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 17
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 17
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 17
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 17
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 17
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 15
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 15
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 15
- 238000011161 development Methods 0.000 description 15
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 15
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 14
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 11
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 230000009471 action Effects 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 9
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 9
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 7
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 6
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 6
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 3
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 229940052143 bamlanivimab Drugs 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 3
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-(2,6-diethylphenyl)-n-(methoxymethyl)acetamide;2,6-dinitro-n,n-dipropyl-4-(trifluoromethyl)aniline Chemical compound CCC1=CC=CC(CC)=C1N(COC)C(=O)CCl.CCCN(CCC)C1=C([N+]([O-])=O)C=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100030988 Angiotensin-converting enzyme Human genes 0.000 description 2
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 2
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 2
- 101000629313 Severe acute respiratory syndrome coronavirus Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 2
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 2
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000013504 emergency use authorization Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- VSIVTUIKYVGDCX-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].COC1=CC([N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 VSIVTUIKYVGDCX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 1
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011814 C57BL/6N mouse Methods 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000998953 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001138125 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1-17 Proteins 0.000 description 1
- 101000600434 Homo sapiens Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Proteins 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102100036887 Immunoglobulin heavy variable 1-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100020945 Immunoglobulin kappa variable 1-17 Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 206010025327 Lymphopenia Diseases 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 241000233805 Phoenix Species 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 102100037401 Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Human genes 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229940051183 casirivimab Drugs 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- RWYFURDDADFSHT-RBBHPAOJSA-N diane Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1.C1=C(Cl)C2=CC(=O)[C@@H]3CC3[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(C)=O)(OC(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RWYFURDDADFSHT-RBBHPAOJSA-N 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000003712 glycosamine group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 231100001023 lymphopenia Toxicity 0.000 description 1
- 230000006655 lysosomal degradation pathway Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229940125645 monoclonal antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000012409 standard PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明属于细胞免疫技术领域,涉及SARS‑CoV‑2变异株中和抗体的制备及应用。本发明公开的抗体可封闭SARS‑CoV‑2刺突蛋白(S蛋白)同ACE2受体的结合,高效中和SARS‑CoV‑2病毒侵染细胞。本发明公开编码所述抗体的核酸序列(包括重/轻链可变区)、含有所述核酸序列的载体、药物组合物和试剂盒。制备的人源化中和抗体具有广谱中和活性,可单独或与其他中和抗体组合用药用于预防和治疗不同SARS‑CoV‑2病毒株引起的急性呼吸道传染病。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2022年1月21日提交的中国专利申请202210071118.8的权益,该申请的内容通过引用被合并于本文。
技术领域
本发明涉及细胞免疫技术领域,提供可封闭SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)同ACE2受体的结合、高效中和SARS-CoV-2病毒侵染细胞的人源化抗体。其可用于治疗SARS-CoV-2引起的感染性疾病。本发明还提供了编码所述抗体的核酸序列、含有所述核酸序列的载体、细胞。
背景技术
新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)具有较强的传播能力,其传播过程中病毒基因突变随复制过程累积,逐渐形成并发展成为多种变异株。世界卫生组织将这些变异株分类为关切的变异株(Variants ofConcern,VOC)及关注的变异株(Variants of Interest,VOI)。VOC毒株主要有Alpha(B.1.1.7)株[2],Beta(B.1.351)株[3-6],Gamma(P.1)株[7,8],Delta(B.1.617.2)株[9];VOI的毒株主要有Epsilon(B.1.429)株[10],Iota(B.1.526)株[11],Kappa(B.1.617.1)株[12]。还有B.1.618株[13],VOC 20I/484Q株,C.36.3株等也存在着一定的传播风险。
单克隆抗体药物不仅具有显著的抗病毒疗效,同时还具有较高的安全性。制备针对SARS-CoV-2的单克隆中和抗体,可能成为预防或治疗性抗病毒药物的有效策略。目前已经先后有多家公司的单克隆抗体,获得FDA的EUA(Emergency Use Authorization)使用权,包括再生元的Casirivimab&Imdevimab鸡尾酒组合,礼来的Bamlanivimab&Etesevimab组合。GSK&Vir公司的VIR-7831,用于治疗轻-中度COVID-19患者。随着病毒变异株频率的增加以及治疗前对患者病毒变异情况监测的有限性,礼来的Bamlanivimab单药在应对多种突变株时存在治疗效果不佳的风险。同时,单抗药物的治疗,伴随出现了治疗产生的耐药突变,也会影响药物的疗效。因此,关注病毒变异对抗体药物功能的影响,研发具有广谱中和活性的抗体,可以有针对性的对不同流行变异株感染采取更有效的治疗方法。
发明内容
在一个方面,本发明提供一种分离的、封闭SARS-CoV-2刺突蛋白同ACE2受体的结合抗体或其抗原结合片段,其包含
i)重链可变区,其重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3域分别包含SEQ ID NO:13、14和15,和/或
ii)轻链可变区,其轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3域分别包含SEQ ID NO:10、11和12。
在一个实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段包含:
i)重链可变区,其序列包含SEQ ID NO:22或与其具有至少85%、88%、90%、95%、98%或99%序列同一性;和/或
ii)轻链可变区,其序列包含SEQ ID NO:23或与其具有至少85%、88%、90%、95%、98%或99%序列同一性。
在一个实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段为人源化抗体、嵌合或鼠源抗体。
在一个实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段,其抗体恒定区为IgG,IgM,IgA亚型,优选地,为IgG1、IgG2或IgG4亚型抗体;更优选地,为因其Fc区的氨基酸序列改变造成其与Fc受体和/或C1q补体结合功能降低的IgG1、IgG2或IgG4亚型抗体。
在一个实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段表位包含SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的G476、S477、P479、F486、N487、Y489或T478,优选地,表位包含G476、S477、P479、F486或N487。
在一个实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段进一步包含:
i)重链恒定区,优选地,其序列包含SEQ ID NO:24或与其具有至少90%、92%、95%、98%或99%序列同一性;和/或
ii)轻链恒定区,优选地,其序列包含SEQ ID NO:25或与其具有至少90%、92%、95%、98%或99%序列同一性。
在一个实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段的耐药突变位点为S477F和/或F486S。
在一个实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段,
c)其与重组SARS-CoV-2RBD的结合亲和力KD平均值为2.2E-12~15.6E-12M,优选3.4E-12~9.3E-12M,更优选为6.8E-12M;和/或
d)其与重组SARS-CoV-2Spike蛋白的结合亲和力KD平均值为0.5E-11~6.6E-11M,优选1.6E-11~4.5E-11M,更优选为2.2E-11M。
在一个实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段经单次静脉注射不同组剂量给予小鼠后,各剂量组动物的Cmax比值为1:3.31:12.17,AUClast比值为1:3.11:7.96,平均半衰期t1/2分别为434.54h、454.43和257.45h。
在一个实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段,
同CD16a几乎不结合;
同CD32a和CD32b不结合;
同CD64不结合;
同C1q不结合;
无ADCC作用;
无ADCP作用;
无CDC作用;
几乎无ADE效应。
在一个实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体。
在一个实施方式中,所述抗原结合片段包含Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fd片段、Fd'片段、单链抗体分子或单域抗体;其中单链抗体分子优选包含scFv、di-scFv、tri-scFv、双体抗体或scFab。
在另一个方面,本发明提供一种改构抗体-药物分子,其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段和与之共价或非共价连接的小分子或生物大分子,优选地通过接头连接。
在又一个方面,本发明提供一种核酸,其编码本发明所述的抗体或其抗原结合片段,其为mRNA和/或DNA。
在一个实施方式中,所述核酸包含
i)分别如SEQ ID NO:30所示的重链可变区核苷酸序列和/或如SEQ ID NO:31所示的轻链可变区核苷酸序列;和任选地
ii)分别如SEQ ID NO:32所示重链恒定区核苷酸序列和/或如SEQ ID NO:33所示的轻链恒定区核苷酸序列;
或i)和ii)的变体。
在又一个方面,本发明提供一种表达载体,其包含如本发明所述的核酸。
在又一个方面,本发明提供一种宿主细胞,其包含如本发明所述的核酸或如本发明所述的表达载体。
在又一个方面,本发明提供一种用于产生如本发明所述的抗体或其抗原结合片段的方法,其包括在适合于抗体表达的条件下培养如本发明所述的宿主细胞,和从培养基中回收表达的抗体。
在又一个方面,本发明提供一种药物组合物,其包含
如本发明所述的抗体或其抗原结合片段或如本发明所述的改构抗体-药物分子或如本发明所述的核酸或如本发明所述的表达载体;
药学上可接受的载体;任选地
一种或多种其他治疗剂,优选地,其他治疗剂选自抗病毒药物或炎性因子抑制剂、其他机制的小分子化学药;优选地,抗病毒药物选自包含不限于I型干扰素药物、抗体类、蛋白酶抑制剂类、RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)抑制剂类、靶向宿主的抗病毒类药物。
在又一个方面,本发明提供一种药物组合物,包含两种或两种以上分离的、封闭SARS-CoV-2刺突蛋白同ACE2受体的结合抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段分别包含
i)重链可变区,其重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3域分别包含SEQ ID NO:13、14
和15,和/或
轻链可变区,其轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3域分别包含SEQ ID NO:10、11和12;或
ii)重链可变区,其重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3域分别包含SEQ ID NO:43、44
和45,和/或
轻链可变区,其轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3域分别包含SEQ ID NO:40、41
和42;
以及,药学上可接受的载体;
任选地
一种或多种其他治疗剂,优选地,其他治疗剂选自抗病毒药物或炎性因子抑制剂、其他机制的小分子化学药;优选地,抗病毒药物选自包含不限于I型干扰素药物、抗体类、蛋白酶抑制剂类、RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)抑制剂类、靶向宿主的抗病毒类药物。
在一个实施方式中,所述两种或两种以上抗体或其抗原结合片段分别包含
i)重链可变区,其序列包含SEQ ID NO:22或与其具有至少85%、88%、90%、95%、98%或99%序列同一性,和/或轻链可变区,其序列包含SEQ ID NO:23或与其具有至少85%、88%、90%、95%、98%或99%序列同一性;或
ii)重链可变区,其序列包含SEQ ID NO:46或与其具有至少85%、88%、90%、95%、98%或99%序列同一性,和/或轻链可变区,其序列包含SEQ ID NO:47或与其具有至少85%、88%、90%、95%、98%或99%序列同一性。
在一个实施方式中,所述两种或两种以上抗体或其抗原结合片段进一步包含
重链恒定区,或其序列包含SEQ ID NO:24或与其具有至少90%、92%、95%、98%或99%序列同一性,和/或
轻链恒定区,其序列包含SEQ ID NO:25或与其具有至少90%、92%、95%、98%或99%序列同一性,
在一个实施方式中,所述的药物组合物,
c)其与重组SARS-CoV-2RBD的结合亲和力KD为2.5E-12~16.1E-12M,优选4.5E-12~10.6E-12M,更优选为7.8E-12M;和/或
d)其与重组SARS-CoV-2Spike蛋白的结合亲和力KD为2.2E-11~15.6E-11M,优选7.2E-11~11.4E-11M,更优选为9.2E-11M。
又一个方面,如本发明所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明所述的改构抗体-药物分子、如本发明所述的核酸、如本发明所述的表达载体、如本发明所述的药物组合物,其用于预防和治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病。
在又一个方面,如本发明所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明所述的改构抗体-药物分子、如本发明所述的核酸、如本发明所述的表达载体、如本发明所述的药物组合物在用于制备用于预防和治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病的药物中的应用。
在又一个方面,本发明提供一种药物组合,其包含
如本发明所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明所述的改构抗体-药物分子、如本发明所述的核酸、如本发明所述的表达载体、如本发明所述的药物组合物;以及一种或多种另外的治疗剂。
在又一个方面,本发明提供一种试剂盒,其包含
如本发明所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明所述的改构抗体-药物分子、如本发明所述的核酸、如本发明所述的表达载体、如本发明所述的药物组合物;优选地,还进一步包含给药的装置。
在又一个方面,本发明提供一种预防和治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病的方法,其包含给予受治疗者如本发明所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明所述的改构抗体-药物分子、如本发明所述的核酸、如本发明所述的表达载体、如本发明所述的药物组合物、如本发明所述的药物组合、或如本发明所述的试剂盒。
在又一方面,本发明提供一种分离的、封闭SARS-CoV-2刺突蛋白同ACE2受体的结合抗体或其抗原结合片段,其结合表位包含SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的G476、S477、P479、F486、N487、Y489或T478,优选地,表位包含G476、S477、P479、F486或N487。
在又一方面,本发明提供一种SARS-CoV-2刺突蛋白的结合表位,其包含SARS-CoV-2刺突蛋白的G476、S477、P479、F486、N487、Y489或T478,优选地,表位包含G476、S477、P479、F486或N487。
附图说明
图1 CoV2-M89Y噬菌体单克隆与重组SARS-CoV-2-RBD蛋白结合;
图2 CoV2-M89Y噬菌体单克隆竞争CoV2-HB27-Fd6-IgG1,ACE2结合重组SARS-CoV-2-RBD蛋白;
图3鼠源抗体CoV2-mh89Y与重组SARS-CoV-2RBD蛋白的结合;
图4鼠源抗体CoV2-mh89Y封闭重组RBD蛋白与ACE2蛋白的结合;
图5鼠源抗体CoV2-mh89Y中和SARS-CoV-2假病毒;
图6人源化抗体CoV2-H89Y抗原表位鉴定(A)及表位图(B);
图7ELISA检测人源化抗体COV2-H89Y与重组SARS-CoV-2RBD(A)及Spike(B)蛋白的结合;
图8Octet检测人源化抗体COV2-H89Y与重组SARS-CoV-2RBD(A,B,C)及Spike(D,E,F)蛋白的结合亲和力;
图9ELISA检测人源化抗体CoV2-H89Y竞争重组ACE2蛋白与重组SARS-CoV-2RBD蛋白(A)或Spike蛋白(B)的结合;
图10人源化抗体CoV2-H89Y在293FT-ACE2(A,B),VERO E6(C,D),Huh-7(E,F)细胞的假病毒中和活性;
图11人源化抗体CoV2-H89Y与重组CD16a蛋白的结合;
图12人源化抗体CoV2-H89Y与重组CD32a蛋白的结合;
图13人源化抗体CoV2-H89Y与重组CD32b蛋白的结合;
图14人源化抗体CoV2-H89Y与重组CD64蛋白的结合;
图15人源化抗体CoV2-H89Y与重组C1q蛋白的结合,OD450-B表示去除背景值后的OD值;
图16人源化抗体CoV2-H89Y介导的ADCC作用;
图17人源化抗体CoV2-H89Y介导的ADCP作用;
图18人源化抗体CoV2-H89Y介导的CDC作用;
图19人源化抗体CoV2-H89Y的ADE效应;
图20人源化抗体CoV2-H89Y与人、鼠、猴FcRn的结合,OD450-B表示去除背景值后的OD值;
图21小鼠单次静脉注射不同剂量CoV2-H89Y后血药浓度均值-时间曲线(n=6);
图22CoV2-HB27-Fd6-IgG1与CoV2-H89Y组合的抗原识别表位鉴定(A)及表位图(B);图23CoV2-HB27-Fd6-IgG1与CoV2-H89Y非竞争结合重组SARS-CoV-2RBD蛋白(A)重组Spike蛋白(B);
图24ELISA检测CoV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y组合与重组SARS-CoV-2RBD(A),Spike(B)蛋白的结合;
图25Octet检测CoV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y组合与重组SARS-CoV-2RBD(A),Spike(B)蛋白的结合亲和力;
图26ELISA检测CoV2-HB27-Fd6-IgG1+CoV2-H89Y组合竞争重组ACE2蛋白与重组SARS-CoV-2RBD蛋白(A),Spike蛋白(B)的结合;
图27CoV2-HB27-Fd6-IgG1+CoV2-H89Y组合在293FT-ACE2(A,B),Vero E6(C,D),Huh-7(E,F)细胞的假病毒中和活性;
图28CoV2-HB27-Fd6-IgG1+CoV2-H89Y组合与重组CD16a蛋白的结合;
图29CoV2-HB27-Fd6-IgG1+CoV2-H89Y组合与重组CD32a蛋白的结合;
图30CoV2-HB27-Fd6-IgG1+CoV2-H89Y组合与重组CD32b蛋白的结合;
图31CoV2-HB27-Fd6-IgG1+CoV2-H89Y组合与重组CD64蛋白的结合;
图32CoV2-HB27-Fd6-IgG1+CoV2-H89Y组合与重组C1q蛋白的结合,OD450-B表示去除背景值后的OD值;
图33CoV2-HB27-Fd6-IgG1+CoV2-H89Y组合介导的ADCC作用;
图34CoV2-HB27-Fd6-IgG1+CoV2-H89Y组合介导的ADCP作用;
图35CoV2-HB27-Fd6-IgG1+CoV2-H89Y组合介导的CDC作用;
图36CoV2-HB27-Fd6-IgG1+CoV2-H89Y组合的ADE效应;
具体实施方式
定义
除非另有说明,本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的技术领域的普通技术人员通常理解的含义。为了本发明的目的,进一步定义以下术语。
当用于本文和所附权利要求书中时,单数形式“一”、“一种”、“另一”和“所述”包括复数指代对象,除非上下文明确地另有指示。
术语“RBD受体结合域(Receptor binding domain,RBD)”在本说明书和所附的权利要求书中特指“冠状病毒棘突蛋白的ACE2受体结合结构域(SARS-CoV-2RBD)”,以上术语互换使用。SARS-CoV-2的宿主细胞受体蛋白为血管紧张素转化酶2(ACE2)。病毒的三聚体S蛋白(Spike protein)同ACE2受体结合后被宿主蛋白酶切割为包含受体结合域(Receptorbinding domain,RBD)的S1多肽和负责介导病毒同细胞膜融合的S2多肽。
术语“抗体”意指免疫球蛋白分子,是指表现所需生物学活性的抗体的任何形式。包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体),甚至包括抗体片段。典型地,全长抗体结构优选包含4条多肽链,通常通过二硫键相互连接的2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链包含重链可变区和重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区和轻链恒定区。在此典型全长抗体结构外,其结构还包括其他衍生形式。
术语“可变区”指抗体重链或轻链中涉及抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)一般具有类似的结构,可进一步细分为穿插在更保守的区域(称为框架区(FR))中的高变区(称为互补决定区(CDR))。
术语“互补决定区”(CDR,例如CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区的这样一些氨基酸残基,其存在对于抗原结合来说是必需的。每个可变区通常具有3个被鉴别为CDR1、CDR2和CDR3的CDR区域。每个互补决定区可包含来自如Kabat所定义的“互补决定区”的氨基酸残基(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immulological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.1991))和/或来自“高变环”的那些残基(Chothia and Lesk;J Mol Biol 196:901-917(1987))。
术语“构架”或“FR”残基是如本文中所定义的CDR残基之外的那些可变区残基。
每个重链可变区和轻链可变区通常包含3个CDR和最多达4个FR,所述CDR和FR从氨基末端至羧基末端以例如以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
给定抗体的互补性决定区(CDR)和框架区(FR)可以使用Kabat体系标识(Kabat等:Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,美国卫生和公众服务部,PHS,NIH,NIH出版编号91-3242,1991)。
术语“恒定区”是指抗体的轻链和重链上的这样一些氨基酸序列,不直接参与抗体与抗原的结合,但展现出多种效应子功能,例如抗体依赖性细胞毒性。
根据其重链恒定区的氨基酸序列,完整的抗体可归属于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五类抗体,其中IgG和IgA还可进一步分为亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。相应地,五类抗体的重链分别归入α、δ、ε、γ和μ链。根据其轻链恒定区的氨基酸序列,抗体的轻链可归入κ和λ。
“抗体的抗原结合片段”包含完整抗体分子的一部分,其保留母体抗体的至少某些结合特异性,通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗原结合片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fd片段、Fd'片段、单链抗体分子(例如scFv,di-scFv或tri-scFv、双体抗体或scFab)、单域抗体。
“抗体片段”是保留母体抗体的至少某些生物学特性的非完整抗体分子,其实例除上述“抗原结合片段”所述及的那些之外,还包括但不限于Fc片段。
术语“改构药物分子”是指抗体或其片段,如抗原结合片段与另一分子形成共价或非共价连接物或形成重组多靶点融合药物,另一分子选自小分子化合物或生物大分子。
术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种,而其余部分来源于不同来源或物种的抗体。“人源化抗体”是“嵌合抗体”的子集。
术语“人源化抗体”或“人源化抗原结合片段”在本文中被定义为这样的抗体或抗体片段:(i)来源于非人来源(例如,携带异源免疫系统的转基因小鼠)且基于人种系序列的抗体;或(ii)可变区是非人来源而恒定区是人来源的嵌合抗体;或者(iii)CDR移植的,其中可变区的CDR来自非人来源,而可变区的一个或多个构架区为人来源的,并且恒定区(如果有的话)是人来源的。“人源化”的目的是消除非人来源抗体在人体内的免疫原性,而同时最大可能地保留亲和力。选择与非人来源抗体构架序列最相似的人构架序列为模板进行人源化改造是有利的。在某些情况下,可能需要用非人构架中相应的残基替换人类构架序列中的一个或多个氨基酸,以避免亲和性的丧失。
“单克隆抗体”是指获自基本上同质的抗体群体的抗体,即,所述包含单一抗体的群体除了可能以极少量存在的可能突变(例如天然突变)之外是相同的。因此,所述术语“单克隆”表明所述抗体的性质,即不是不相关抗体的混合物。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反,单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体均针对抗原上的单独一组决定簇。除了其特异性之外,单克隆抗体制剂的优点在于它们通常不会被其他抗体污染。所述术语“单克隆”不应被理解为需要通过任何特定的方法产生所述抗体。所述术语单克隆抗体具体地包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
抗体“特异性结合”目的抗原例如病毒相关抗原蛋白(本文中,刺突蛋白S),即以足够的亲和力结合所述抗原以使得所述抗体可用作治疗剂,靶向表达所述抗原的病毒或细胞,并且与其他蛋白质无显著交叉反应或者与除了上文提到的抗原靶的同源体和变体(例如突变形式、剪接变体,或蛋白水解作用截短的形式)以外的蛋白质无显著交叉反应。
术语“结合亲和力”是指分子的单个结合位点与其结合伴侣之间非共价相互作用总和的强度。除非另有说明,用于本文时“结合亲和力”是指固有的结合亲和力,其反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间1:1的相互作用。“KD”、“结合速率常数kon”和“解离速率常数koff”通常用于描述分子(例如抗体)与其结合伴侣(例如抗原)之间的亲和力,即,配体结合特定蛋白的紧密程度。结合亲和力受非共价分子间相互作用的影响,例如氢键,静电相互作用,两个分子之间的疏水和范德华力。另外,配体与其靶分子之间的结合亲和力可能受到其他分子的存在的影响。亲和力可通过本领域中已知的常规方法来分析,包括本文描述的ELISA。
术语“表位”包括能够特异性结合至抗体或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链,或其组合)组成,并且通常具有特定三维结构特征以及特定的电荷特征。
“分离的”抗体是已经被鉴别并且从天然表达该抗体的细胞中分离的抗体。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体以及通常通过至少一个纯化步骤进行制备的抗体。
两条多肽或核酸序列之间的“序列同一性”表示所述序列之间相同的残基的数目占残基总数的百分比。在计算同一性百分数时,将正在比较的序列以产生序列之间最大匹配的方式比对,通过特定算法解决比对中的空位(如果存在的话)。确定两个序列之间同一性的优选计算机程序方法包括,但不限于,GCG程序包,包括GAP、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410)。上述程序可以公开地从国际生物技术信息中心(NCBI)和其他来源得到。熟知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。
术语“受体”,是一个生物化学上的概念,指一类能传导细胞外信号,并在细胞内产生特定效应的分子。产生的效应可能仅在短时间内持续,比如改变细胞的代谢或者细胞的运动。也可能是长效的效应,比如上调或下调某个或某些基因的表达。
术语“Fc受体”或“FcR”指与抗体Fc区结合的受体。优选天然序列的人FcR,且优选与IgG抗体结合的受体(γ受体),其包括FcγRI,FcγRII和FcγRIII亚型,以及这些受体的变体。其它FcR均被包含在术语“FcR”中。该术语也包括新生儿受体(FcRn),其负责将母体的IgG转运至胎儿(Guyer等,免疫学杂志117:587(1976)和Kim等,免疫学杂志24:249(1994))。
术语“新生儿Fc受体”、简称“FcRn”,其结合IgG抗体Fc区。新生儿Fc受体(FcRn)在体内IgG类抗体的代谢命运中起重要作用。FcRn行使功能以从溶酶体降解途径营救IgG,从而降低其在血清中的清除率并加长半衰期。因此,IgG体外FcRn结合性质/特征指示它在血液循环中的体内药代动力学性质。
术语“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性,其随抗体同种型而不同。抗体效应子功能的实例包括:C1q结合和依赖补体的细胞毒性(CDC)、Fc受体(如CD16、CD32、CD64)结合、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞激活。
术语“效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应子功能的白细胞。在一个方面,所述效应细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从天然来源,例如,血液中分离。效应细胞通常是与效应子阶段相关联的淋巴细胞,并发挥作用,以产生细胞因子(辅助T细胞)、杀死被病原体感染的细胞(细胞毒性T细胞)或分泌抗体(分化的B细胞)。
“免疫细胞”包括具有造血的起源并在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞包括:淋巴细胞,例如B细胞和T细胞;天然杀伤细胞;髓样细胞,例如单核细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和粒细胞。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式,其中结合到在某些细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fcγ受体上的分泌Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合至承载抗原的靶细胞,随后使用例如细胞毒素杀死所述靶细胞。为了评估目的抗体的ADCC活性,可进行体外ADCC测定法,例如记载于美国专利No.5,500,362或5,821,337或美国专利No.6,737,056(Presta)中的体外ADCC测定法、本申请的实施例中记载的方法。用于这类测定法的有用效应细胞包括PBMC和NK细胞。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体的存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的活化由补体系统的第一组分(C1q)与(适当亚类的)抗体结合起始,其中该抗体与其相应抗原结合。为了评估补体活化,可进行CDC测定法,例如记载于Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol Methods 202:163(1996)中的CDC测定法、例如本申请的实施例中记载的方法、例如在美国专利No.6,194,551Bl和WO1999/51642中记载的方法,其中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列的多肽变体(具有变体Fc区的多肽)和具有增强或降低的C1q结合的多肽变体。
“抗体依赖性细胞吞噬作用”(ADCP)是指细胞介导的反应,其中表达FcγR的非特异的细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体,并随之引起靶细胞的吞噬。
“抗体依赖的增强效应(ADE)”,或称为免疫增强或疾病增强,是指病毒与非中和性抗体结合、或与亚中和浓度的抗体结合后,抗体的Fc段与表面表达FcR的细胞结合并介导病毒进入这些细胞,从而增强病毒的感染性。这种现象会导致感染性和毒性的增强,ADE能调节免疫反应,并能引起持续的炎症、淋巴减少和/或细胞因子风暴。
术语“病毒样颗粒”(VLP)或“假病毒”指由相应天然病毒结构蛋白组成的多蛋白结构,但是缺少全部或部分病毒基因组,特别是病毒基因组的复制和传染组分,因此不具复制性和传染性。该多蛋白结构在形态和尺寸上高度模拟其相应的天然病毒颗粒,能在重组表达病毒的结构蛋白后自发形成。
本发明首先采用重组SARS-CoV-2-RBD-his(T293)多糖偶联物蛋白来免疫小鼠,然后通过噬菌体抗体库筛选获得1株与SARS-CoV-2-RBD-His蛋白特异性结合的scFv抗体克隆。之后采用PCR方法将编码scFv抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列分别与编码人IgG1重链恒定区和人kappa轻链恒定区的核苷酸序列进行拼接,插入瞬转表达载体,进行培养表达。采用蛋白A纯化柱进行纯化获得高纯度人鼠嵌合抗体。
采用经典的CDR移植方法进行鼠抗体的人源化改造[15,16]。分别选择与人鼠嵌合抗体轻链和重链可变区相似性均在50%以上的胚系基因序列做为人源化模板,将鼠源抗体轻链或重链的3个CDR序列置换人源化模板中相应的CDR氨基酸序列中。通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库,选择出用于轻、重链可变区移植的人源模板。将鼠源抗体轻链和重链的3个CDR序列分别移植到相应的人源模板中。由于鼠源框架区的关键位点对于维持CDR空间结构的稳定性至关重要,因此将关键点回复突变为鼠抗体的相应氨基酸。分别将轻链/重链信号肽序列、回复突变的人源化抗体轻链/重链的可变区序列、人IgG1重链恒定区/人kappa轻链恒定区序列依次拼接,获得人源化抗体的氨基酸序列和核苷酸序列。
本发明人源化抗体重链IgG1恒定区经基因工程改造得到降低Fc功能IgG1亚型人源化抗体CoV2-H89Y。
本发明的核酸
本发明还涉及编码本发明的抗体或其部分的核酸分子。这些核酸分子的一些示例序列见序列表。
本发明的核酸分子不限于本文公开的序列,还包括变体及与其对应的其他核酸形式,如mRNA,cDNA以及其变体。本发明中变体可以参照它们在杂交中的物理特性来描述。本领域技术人员会认识到利用核酸杂交技术,核酸可用于鉴别其互补物以及其等同物或同系物。还会认识到杂交可以以低于100%互补性发生。然而,考虑到条件的适当选择,杂交技术可用于基于DNA序列与特定探针的结构相关性来区分所述DNA序列。对于这类条件的指导参见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.;Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989和Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,&Struhl,K.eds.(1995).CurrentProtocols in Molecular Biology.New York:John Wiley and Sons。
重组载体和表达
本发明还提供了包含本发明的一个或多个核苷酸序列的重组构建体。本发明的重组构建体可与载体一起使用,所述载体例如质粒、噬粒、噬菌体或病毒载体,编码本发明的抗体的核酸分子被插入所述载体中。
本文提供的抗体可通过在宿主细胞中重组表达编码轻链和重链或其部分的核苷酸序列来制备。为了以重组方法表达抗体,可用携带编码轻链和/或重链或其部分的核苷酸序列的一个或多个重组表达载体转染宿主细胞,以使得所述轻链和重链在所述宿主细胞中表达。标准重组DNA方法学被用于制备和/或获得编码重链和轻链的核酸、将这些核酸纳入重组表达载体中并且将所述载体引入至宿主细胞中,例如Sambrook,Fritsch andManiatis(eds.),Molecular Cloning;A Laboratory Manual,Second Edition,ColdSpring Harbor,N.Y.,(1989)、Ausubel,F.M.et al.(eds.)Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Associates,(1989)和Boss et al.的美国专利No.4,816,397中记载的那些。
此外,可将编码所述重链和/或轻链的可变区的核苷酸序列转化为例如编码全长抗体链、Fab片段或scFv的核苷酸序列:例如可以将编码轻链可变区或重链可变区的DNA片段可操作地连接(以使得所述两个DNA片段编码的氨基酸序列都在框架中)至编码例如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段。人重链和轻链恒定区的序列是本领域中已知的(参见,例如Kabat,E.A.,el al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242),包括这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。
为了表达所述抗体,可使用标准重组DNA表达方法(参见,例如Goeddel;GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990))。例如,可将编码所需抗体的核苷酸序列插入至表达载体中,随后将所述表达载体转染至合适的宿主细胞中。合适的宿主细胞为原核细胞和真核细胞。原核宿主细胞的实例为细菌,真核宿主细胞的实例为酵母、昆虫或哺乳动物细胞。应理解,包括选择调节序列的表达载体的设计受到多种因素的影响,例如宿主细胞的选择、所需的蛋白质的表达水平以及表达是组成型的还是可诱导型的。
本发明的抗体可通过公知方法从重组细胞培养物回收和纯化,所述公知方法包括但不限于,硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、蛋白A亲和层析、蛋白G亲和层析、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟磷灰石色谱法以及凝集素色谱法。高效液相色谱法(“HPLC”)也可用于纯化。参见例如,Colligan,CurrentProtocols in Immunology,或Current Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001),例如第1、4、6、8、9、10章,各自以引用的方式全文纳入本文。
本发明的抗体包括天然纯化的产物、化学合成方法的产物和通过重组技术从原核及真核宿主产生的产物,所述真核宿主包括,例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。本发明的抗体可以是糖基化的,或者可以是非糖基化的。这类方法记载于许多标准实验室手册中,例如上文的Sambrook,第17.37-17.42节;上文的Ausubel,第10、12、13、16、18和20章。
因此,本发明的实施方案还为包含所述载体或核酸分子的宿主细胞,其中所述宿主细胞可为高等真核宿主细胞例如哺乳动物及昆虫细胞、低等真核宿主细胞例如酵母细胞,并可为原核细胞例如细菌细胞。
本发明的抗体的特性和功能
ELISA测试表明,获得的鼠源抗体CoV2-mh89Y能与重组SARS-CoV-2RBD蛋白特异性结合,随SARS-CoV-2RBD蛋白包被浓度升高结合增强,能有效封闭受体ACE2与重组SARS-CoV-2RBD蛋白的结合,并且在293FT-ACE2细胞上,CoV2-mh89Y可有效中和SARS-CoV-2假病毒,且呈浓度依赖性,半数抑制浓度IC50为4.45ng/mL。人源化抗体COV2-H89Y能与重组SARS-CoV-2RBD及Spike蛋白特异性结合,EC50分别为5.31ng/mL,4.57ng/mL;人源化抗体CoV2-H89Y同重组RBD蛋白、Spike蛋白均具有较高的亲和力,CoV2-H89Y与重组RBD蛋白的亲和力为6.8E-12M,结合常数为5.8E+05Ms-1,解离常数为4.0E-06s-1,CoV2-H89Y与重组Spike蛋白的亲和力为2.2E-11M,结合常数为2.1E+06Ms-1,解离常数为4.5E-05s-1;CoV2-H89Y抗体能有效地竞争ACE2蛋白与SARS-CoV-2RBD或Spike蛋白的结合,CoV2-H89Y竞争ACE2受体结合重组SARS-CoV-2RBD或Spike蛋白的IC50分别为273.1ng/mL和21.92ng/mL;在293FT-ACE2细胞、Vero-E6细胞和Huh-7细胞上CoV2-H89Y均可有效中和SARS-CoV-2的假病毒,并呈浓度依赖性,CoV2-H89Y的IC50平均值分别为0.8ng/mL、3.0ng/mL和2.4ng/mL;CoV2-H89Y可有效中和SARS-CoV-2分离株活病毒,中和IC50为146ng/ml;CoV2-H89Y几乎不与重组CD16a蛋白和C1q蛋白结合,不与重组CD32a蛋白、CD32b、CD64蛋白结合;CoV2-H89Y无ADCC的作用,ADCP作用和CDC作用;CoV2-H89Y对稳定表达CD32a、CD32b或CD64的CHO细胞几乎无ADE效应,临床安全性风险大幅降低;CoV2-H89Y与重组人、鼠、猴FcRn蛋白均具有很好的结合,结合EC50分别为73.0ng/mL(R2=0.9996)、396.0ng/mL(R2=0.9992)和126.9ng/mL(R2=0.9981);CoV2-H89Y对D614G B.1流行株、关切的变异株VOC(Variant of Concern),如Alpha B.1.1.7,Beta B.1.351,Gamma P.1;及关注的变异株VOI(Variant of Interest),EpsilonB.1.429,B.1.526,Kappa B.1.617.1,Lambda C.37及其它一些国家地区流行突变株如B.1.618,VOC 20I/484Q,C.36.3,B.1.214.2等均具有较好的中和活性。因此,CoV2-H89Y具有广谱高中和活性;CoV2-H89Y具有良好的药代动力学特征,各剂量组动物(15、50和150mg/kg)的Cmax比值为1:3.31:12.17,AUClast比值为1:3.11:7.96,表明给药后CoV2-H89Y的峰浓度和暴露量均与给药剂量呈正相关。各组动物的平均t1/2分别为434.54、454.43、257.45h,半衰期均较长,且系统暴露量较高。
发明人的发明名称《SARS-CoV-2中和抗体的制备及应用》,申请号为PCT/CN2021/089748的发明专利申请中报道了SARS-CoV-2中和抗体CoV2-HB27及不同Fc功能形式人源化抗体CoV2-HB27的制备、表征和性能鉴定。发明人通过表位分析创造性地发现人源化抗体CoV2-H89Y的表位区位于RBD中相对于人源化抗体CoV2-HB27表位的另一侧,提示二者在结构上具有组合用药的合理性,且通过SARS-CoV-2Spike蛋白结合实验验证了CoV2-HB27,尤其是降低Fc功能形式的CoV2-HB27(CoV2-HB27-Fd6-IgG1)与CoV2-H89Y可以非竞争性结合重组SARS-CoV-2Spike蛋白和RBD蛋白,人源化抗体CoV2-H89Y的IgG1重链恒定区序列和kappa轻链恒定区序列和CoV2-HB27-Fd6-IgG1相同。
ELISA测试表明,CoV2-HB27-Fd6-IgG1+CoV2-H89Y抗体组合能与重组SARS-CoV-2RBD蛋白和SARS-CoV-2Spike蛋白特异性结合,在一定浓度范围内随抗体浓度升高结合增强;CoV2-HB27-Fd6-IgG1+CoV2-H89Y抗体组合同重组RBD蛋白、Spike蛋白均具有较高的亲和力,抗体组合与重组RBD蛋白的亲和力为7.8E-12M,结合常数为3.9E+05Ms-1,解离常数为3.1E-06s-1,与重组Spike蛋白的亲和力为9.2E-11M,结合常数为1.0E+06Ms-1,解离常数为9.7E-05s-1;抗体组合能有效地竞争ACE2蛋白与SARS-CoV-2RBD蛋白或Spike蛋白的结合,抗体组合竞争ACE2受体结合重组SARS-CoV-2RBD或Spike蛋白的IC50分别为382.9ng/mL和33.42ng/mL;在293FT-ACE2细胞、Vero-E6细胞和Huh-7细胞上抗体组合均可有效中和SARS-CoV-2的假病毒,抗体组合的IC50平均值分别为2.4ng/mL、3.4ng/mL和1.8ng/mL;抗体组合可有效中和SARS-CoV-2分离株活病毒,中和IC50为49ng/ml;抗体组合几乎不与重组CD16a蛋白和C1q蛋白结合,不与重组CD32a蛋白、CD32b、CD64蛋白结合;抗体组合无介导ADCC的作用,ADCP作用和CDC作用;抗体组合对稳定表达CD32a、CD32b或CD64的CHO细胞几乎无ADE效应,临床安全性风险大幅降低;假病毒中和试验结果表明,抗体组合对D614G B.1流行株、关切的变异株VOC(Variant of Concern),如Alpha B.1.1.7,Beta B.1.351,Gamma P.1,DeltaB.1.617.2;及关注的变异株VOI(Variant of Interest),Epsilon B.1.429,B.1.526,Kappa B.1.617.1,Lambda C.37及其它一些国家地区流行突变株如B.1.618,VOC 20I/484Q,C.36.3,B.1.214.2等均具有较好的中和活性。因此,CoV2-HB27-Fd6-IgG1+CoV2-H89Y组合具有广谱高中和活性。
用途
本发明的抗体和/或抗体组合可用于治疗、预防或检测SARS-CoV-2病毒引起的疾病,如SARS-CoV-2病毒引起的急性呼吸道传染病。
药物组合物
可将本发明的抗体、抗原结合片段、改构抗体-药物分子、核酸、载体之一种或多种与至少一种其他抗体或化学剂制备成药物组合物,其包括上述活性成分和一种或多种药物可接受载体、稀释剂或赋形剂;任选地,还可以包含一种或多种其他治疗剂。
试剂盒
本发明还涉及药物包装和包含一个或多个容器的试剂盒,所述容器装有上文提到的本发明的药物组合物。与这类容器相关的可以是管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的提示,其反映被所述产品的生产、使用或销售的机构批准用于人类给药。
制备和储存
本发明的药物组合物可以以本领域中已知的方式制备,例如通过常规的混合、溶解、造粒、研磨、乳化、包裹、包埋或冻干方法。
在已经制备包含配制于可接受的载体中的本发明化合物的药物组合物之后,可以将它们放置在适当的容器中并贴上标签用于治疗所标明的病症。这类标签会包括给药的量、频率和方法。
药物组合
上述包含本发明的抗体的药物组合物还与一种或多种其他治疗剂组合,其中所得组合不会引起不可接受的不利影响。
以下实施例用于示例性地说明本发明,而非对本发明进行限制。
以下实施例中,所用的SARS-CoV-2中和抗体CoV2-HB27-Fd6-IgG1,其制备、表征和性能鉴定记载于2021年4月26日提交的PCT/CN2021/089748。人源化抗体CoV2-HB27-Fd6-IgG1轻链CDR1-CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO:40-42,重链CDR1-CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO:43-45,重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:46,轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:47,CoV2-HB27-Fd6-IgG1的重链恒定区序列和kappa轻链恒定区序列与人源化抗体CoV2-H89Y相同:即重链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO:24,轻链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO:25。
实施例
实施例1:采用噬菌体抗体展示文库筛选结合SARS-CoV-2RBD的鼠源抗体
1.1小鼠免疫
采用SARS-CoV-2-RBD-his(T293)多糖偶联物蛋白(来源:神州细胞工程有限公司)由SARS-CoV-2刺突蛋白(RBD)(YP_009724390.1)(Arg319-Phe541,SEQ ID NO:1)C端与his标签蛋白融合,免疫小鼠。具体方法为:免疫Balb/c小鼠4只。每次免疫时,每只小鼠注射抗原佐剂混合物100μL,组成为抗原3μg,MF59佐剂2mg,Alum佐剂25μg,组氨酸浓度为10nM,pH为6.2。经小鼠胫骨前肌注射,共进行四次免疫,间隔时间为14天、14天、66天。第三次免疫后一周经小鼠眶静脉丛采血50-100μL,室温静置1小时后4℃过夜,离心分离上层血清备检血清效价。第四次免疫后三天,采用ELISA方法根据血清效价结果挑选小鼠,摘眼球收集全部血,二氧化碳安乐死处死小鼠,取脾脏于液氮保存。全血室温静置1小时后4℃过夜,离心分离上层血清,用于检测血清效价和假病毒中和活性。ELISA检测第二次免疫小鼠血清滴度8000倍稀释达到2.876,血清VSV(Vesicular stomatitis virus)-Spike假病毒中和滴度NAT50为20123。
1.2噬菌体抗体库的构建
用Trizol提取小鼠脾组织的RNA,用反转录试剂盒TriPure Isolation Reagent(来源:Invitrogen Cat.No.18080-051)进行反转录得到cDNA产物,cDNA样品用于鼠源V-Gene PCR反应。经V-Gene PCR获得编码鼠抗体轻链和重链的可变区基因片段,经重叠延伸拼接PCR将二者拼接成编码scFv的基因片段,接头(linker)序列:TCTAGTGGTGGCGGTGGTTCGGGCGGTGGTGGAGGTGGTAGTTCTAGATCTTCC(SEQ ID NO:2)。拼接好的scFv片段,通过限制性内切酶SfiI连接到噬菌体载体pComb3x(来源:北京义翘神州科技有限公司)中,电转化XL1-Blue感受态细胞(来源:Biomed)得到菌库,铺板计库容。菌库经辅助噬菌体VCSM13/MB2helper phage侵染,包装,扩增,提库得到浓缩的噬菌体展示scFv抗体库。
得到噬菌体展示scFv抗体库,库容6.4E+08cfu,原始库大小为1.12E+12cfu。
1.3结合SARS-CoV-2RBD噬菌体库的筛选
按照常规固相淘洗方法,第一轮包被SARS-CoV-2-RBD-his(来源:神州细胞工程有限公司,下文同),筛选与SARS-CoV-2RBD蛋白结合的噬菌体。第二轮筛选竞争ACE2结合RBD的噬菌体,包被浓度为10μg/mL的ACE2-his蛋白(来源:北京义翘神州科技有限公司,下文同)于96孔板上,每孔100μL,在室温孵育约3h。次日洗板,3%脱脂奶粉37℃封闭1小时后,取850μL一轮淘洗库到2.0mL离心管中,加入脱脂奶粉及2.62μg SARS-CoV-2-RBD-his-biotin蛋白(来源:神州细胞工程有限公司)37℃孵育1小时。将该混合物,加入到已包被好ACE2-his蛋白且封闭好的96孔板上进行扣除,吸出上清,加入封闭好的SA-beads,进行液相淘洗。2轮淘洗富集后得到噬菌体库及含有其单克隆菌落的2YT-ATG菌板,第二天,挑取2YT-ATG菌板上单克隆37℃250rpm振荡培养过夜。
从富集的文库中挑取单克隆菌体进行表达,用ELISA方法检测其与SARS-CoV-2-RBD-His的结合。对2轮淘洗富集后得到噬菌体库的单克隆phage进行一次表达ELISA检测。将浓度为250ng/mL的SARS-CoV-2-RBD-His蛋白包被于96孔板上,100μL/孔,并设置不加蛋白只加蛋白稀释液的blank对照,4℃包被过夜。次日洗板,室温封闭1小时后,加入10倍稀释的一次表达噬菌体单克隆样品,室温孵育1小时。之后洗板去除未结合噬菌体,每孔加入50μL辣根酶标记anti-M13噬菌体衣壳蛋白GP8的单克隆抗体,室温孵育1小时后重复洗板,加入底物显色液进行显色,终止后酶标仪读取OD450。
ACE2-his竞争检测:包被10μg/mL ACE2-his,先加入10倍稀释的一次表达噬菌体单克隆样品和200ng/mL SARS-CoV-2-RBD-his-biotin,室温孵育约1小时30分钟后重复洗板。之后洗板去除未结合噬菌体,每孔加入Streptavidin-HRP 100μL,室温孵育1小时重复洗板,加入底物显色液进行显色,终止后检测OD450。
CoV2-HB27-Fd6-IgG1抗体竞争检测:包被250ng/mL的SARS-CoV-2-RBD-his蛋白于96孔板上,100μL/孔,并设置不加蛋白只加蛋白稀释液的blank对照。包被过夜,洗板。室温封闭约1小时,加入10μg/mL抗体CoV2-HB27-Fd6-IgG1,每孔100μL,室温孵育约1小时。然后加入10倍稀释的一次表达噬菌体单克隆样品,室温孵育约2小时。之后洗板去除未结合噬菌体,每孔加入50μL辣根酶标记anti-M13噬菌体衣壳蛋白GP8的单克隆抗体,室温孵育1小时30分钟后重复洗板,加入底物显色液进行显色,终止后检测OD450。
结果如图1,2所示,2轮噬菌体库筛选一株与SARS-CoV-2-RBD-His蛋白特异性结合的单克隆CoV2-M89Y(图1);该单克隆与ACE2竞争结合SARS-CoV-2-RBD-his-biotin(图2),并可与CoV2-HB27-Fd6-IgG1抗体非竞争结合SARS-CoV-2-RBD-his-biotin(图2)。将CoV2-M89Y噬菌体侵染菌液送测序获得抗体序列(SEQ ID NO:3)。
1.4鼠源抗体的生产
PCR扩增CoV2-M89Y scFv抗体的重链可变区核苷酸序列,通过In-fusion方法插入到带重链信号肽(SEQ ID NO:28)和人IgG1恒定区(SEQ ID NO:6)的经过Sca I+Nhe I(来源:Fermentas)酶切的pSE-hIgG1CH(o)载体(来源:神州细胞工程有限公司,下文同)中获得人鼠嵌合抗体CoV2-mh89Y重链(SEQ ID NO:36)的表达载体。PCR扩增CoV2-M89Y scFv的轻链可变区核苷酸序列,通过In-fusion方法插入到带轻链信号肽(SEQ ID NO:29)和人kappa恒定区(SEQ ID NO:7)的经过Sca I+BsiW I(来源:Fermentas,下文同)酶切的pSE-hkappa(o)载体中获得人鼠嵌合CoV2-mh89Y轻链(SEQ ID NO:37)的表达载体。
扩增可变区引物:
提质粒后转染293E细胞进行培养表达7天,采用蛋白A纯化柱纯化获得高纯度抗体。
实施例2:结合SARS-CoV-2RBD鼠源抗体的功能检测
2.1鼠源抗体同SARS-CoV-2标准株RBD蛋白结合能力检测
将重组SARS-CoV-2标准株(基因组序列编号GenBank Accession No.MN908947.3,全文同)RBD蛋白(来源:神州细胞工程有限公司)稀释到10ng/mL、20ng/mL和100ng/mL分别包被于96孔板上,每孔100μL,2-8℃包被过夜。次日洗板,室温封闭6小时后,分别加入100μL2μg/mL的CoV2-mh89Y和阴性对照H7N9-R1(来源:神州细胞工程有限公司,下文同)孵育1小时。之后洗板去除未结合抗体,加入检测二抗IgG F(ab)2/HRP(来源:Jackson ImmunoResearch)孵育后重复洗板,加入底物显色液进行显色,终止后酶标仪检测OD450。
结果如图3所示,CoV2-mh89Y抗体能与重组SARS-CoV-2RBD蛋白特异性结合,随SARS-CoV-2RBD蛋白包被浓度升高结合增强,阴性对照H7N9-R1与重组SARS-CoV-2RBD蛋白无结合。
2.2鼠源抗体竞争ACE2受体同SARS-CoV-2标准株RBD蛋白的结合
将浓度1μg/mL的SARS-CoV-2RBD蛋白包被于96孔板上,每孔100μL,2-8℃包被过夜。次日洗板,室温封闭约6h后,加入100μL 0.2μg/mL ACE2蛋白,同时加入0.5μg/mL,2μg/mL的CoV2-mh89Y抗体和阴性对照H7N9-R1共同孵育1小时。洗板去除未结合抗体,加入0.5μg/mL C-his-R023/HRP(来源:北京义翘神州科技有限公司)孵育后重复洗板,最后加入底物显色液进行显色,终止后检测OD450。抑制率PI%=(OD空白-OD样品)/OD空白×100%,其中OD空白表示正常包被只加ACE2不加抗体组的OD值,OD样品表示正常包被同时加ACE2和抗体的待测组OD值。以抗体浓度为横坐标,抑制率PI为纵坐标,利用GraphPad Prism 8.0软件分析抗体竞争ACE2受体与SARS-CoV-2RBD结合的能力。
结果如图4所示,ACE2蛋白可结合包被的SARS-CoV-2RBD蛋白,CoV2-mh89Y能有效封闭受体ACE2与重组SARS-CoV-2RBD蛋白的结合。
2.3鼠源抗体中和试验
将抗体以1:3的比例连续稀释,从500ng/ml开始稀释9个浓度,50μL/孔加入96孔板,然后50μL/孔加入100TCID50的VSV假病毒(SARS-CoV-2标准株,来源:神州细胞工程有限公司,下文同),混匀后置于37℃、5% CO2培养箱孵育1h。孵育结束后,100μL/孔接种3×104个293FT-ACE2细胞(来源:神州细胞工程有限公司,下文同),混匀后置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养约20h。培养结束后,去掉培养上清,50μL/孔加入1×Passive Lysis Buffer(来源:Promega,下文同),混匀裂解细胞。取40μL/孔转入96孔全白化学发光板,采用LB960微孔板式发光检测仪40μL/孔加入萤光素酶底物并检测发光值(RLU),计算中和率。中和率%=(阳性对照RLUs–样品RLUs)/(阳性对照RLUs–阴性对照RLUs)×100%,阳性对照孔表征细胞与病毒共同孵育孔的RLUs值,阴性对照孔表征只包含细胞的RLUs值,样品孔表征包含细胞、病毒及不同稀释度抗体的RLUs值。
结果如图5,在293FT-ACE2细胞上,CoV2-mh89Y可有效中和SARS-CoV-2假病毒,且呈浓度依赖性,IC50为4.45ng/mL。
实施例3:鼠抗体的人源化改造及生产
3.1鼠抗体轻链及重链的CDR确定
根据实施例1.3中测定的核苷酸序列推导出CoV2-mh89Y中和抗体的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:8)和轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。参考Kabat[14]以及IMGT编号方式确定CoV2-mh89Y中和抗体轻链及重链各3个CDR的氨基酸序列,序列详见SEQ IDNO:10-15及表1。上述抗体的轻链及重链CDR在后续人源化步骤中直接移植到最终获得的人源化抗体CoV2-H89Y中。
表1鼠源抗体和人源化抗体的轻链及重链CDR序列
3.2鼠抗体人源化CDR移植
采用经典的CDR移植方法进行鼠抗体的人源化改造[15,16]。分别选择与CoV2-mh89Y轻链和重链可变区相似性均在50%以上的胚系基因序列为人源化模板,将鼠源抗体轻链或重链的3个CDR序列置换人源化模板相应的CDR氨基酸序列中。本实施例中通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库,选择出用于CoV2-mh89Y的轻链可变区移植的人源模板为IGKV1-17*01,该模板与CoV2-mh89Y轻链的同源性为71.6%;用于重链可变区移植的人源模板为IGHV1-2*02,该模板与CoV2-mh89Y重链的同源性为65.3%。
3.3人源化可变区序列框架区的回复突变
由于鼠源框架区的关键点对于维持CDR空间结构的稳定性具有至关重要的作用,因此需将关键点回复突变为鼠抗体的相应氨基酸。按照IMGT编号,将轻链的第74位回复突变为K;重链的第1位回复突变为E,第53位回复突变为I。经CDR人源化移植和框架区回复突变获得人源化抗体CoV2-H89Y,其重链和轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:22/23所示;其含有信号肽的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:18/19所示,分别包含依次连接的重链/轻链信号肽氨基酸序列(SEQ ID NO:20/21);其人源化抗体重链/轻链的可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:22/23);其人源化抗体的恒定区为人IgG1重链恒定区/人kappa轻链恒定区序列(SEQ ID NO:32/33),人源化抗体CoV2-H89Y的IgG1重链恒定区序列和kappa轻链恒定区序列和CoV2-HB27-Fd6-IgG1相同
3.4人源化抗体的生产
通过全基因合成的方法获得CoV2-H89Y重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:30),通过In-fusion方法构建到带重链信号肽(SEQ ID NO:28)和重链IgG1恒定区的表达载体。以该载体为模板,通过PCR扩增获得CoV2-H89Y重链信号肽(SEQ ID NO:28)和可变区核苷酸序列(SEQ ID NO:30),通过In-fusion方法插入到带IgG1突变型恒定区(SEQ ID NO:32)的经Hind III+Nhe I(来源:Fermentas,下文同)酶切的pSE-hIgG1CH(Fd6)载体(来源:神州细胞工程有限公司)中获得CoV2-H89Y重链(SEQ ID NO:26)IgG1突变型表达载体,其中IgG1突变型恒定区是参考文献对IgG1恒定区进行的突变改造[17],获得降低介导免疫功能的抗体Fc片段。
通过全基因合成的方法分别获得CoV2-H89Y轻链可变区(SEQ ID NO:31)核苷酸序列。通过In-fusion方法插入到带轻链信号肽(SEQ ID NO:29)和轻链kappa恒定区核苷酸序列(SEQ ID NO:33)的经Sca I+BsiW I(来源:Fermentas)酶切的pSE-hkappa(o)载体(来源:神州细胞工程有限公司)中获得CoV2-H89Y轻链(SEQ ID NO:27)表达载体。
提质粒后转染293E细胞进行培养表达7天,采用蛋白A纯化柱纯化获得高纯度抗体。
全基因合成CoV2-H89Y重链可变区引物:
PCR CoV2-H89Y重链信号肽和可变区引物:
F12 | SEQ ID No:70 | GTCACCGTCCTGACACGAAGCTTGCCGCCACC |
R12 | SEQ ID No:71 | TGGGCCCTTGGTGCTTGC |
全基因合成CoV2-H89Y轻链可变区引物:
实施例4:人源化抗体H89Y的表位分析
实施例2.2表明,CoV2-mh89Y可竞争ACE2受体同SARS-CoV-2RBD蛋白的结合,本实施例选取了位于ACE2结合区域及附近的RBD位点,将其突变为和原残基类型性质差异较大的其它残基。以SARS-CoV-2RBD-His(SARS-CoV-2标准株)作为模板,使用PCR进行定点突变,并进行测序验证。瞬时转染表达突变型及野生型(WT)SARS-CoV-2RBD蛋白并用ELISA检测抗体CoV2-H89Y同各个突变蛋白的结合能力。在研究中同时加入了已知抗原结合表位的RBD中和抗体REGN10933(序列来源:PDB:6XDG)和REGN10987(序列来源PDB:6XDG)。
分别将SARS-CoV-2RBD野生型蛋白或RBD突变蛋白稀释到0.2μg/mL包被于96孔板上,每孔100μL,2-8℃包被过夜。次日洗板,室温封闭1小时以上。抗体稀释到0.1μg/mL,每孔100μL加入孔板中,室温孵育1-2小时,之后洗板去除未结合抗体。加入250ng/mL山羊抗人IgG Fc/HRP,每孔70μL,室温孵育1小时后重复洗板。加入底物显色液进行显色,终止后酶标仪检测OD450。先以各自抗体与WT SARS-CoV-2RBD的OD450读数标准化各抗体检测结果,结合比值(抗体,突变体)=OD450(抗体,突变体)/OD450(抗体,WT)*100%。再针对SARS-CoV-2RBD突变体,对于其抗体,根据组内最高的抗体结合读数(设为100%)进一步标准化此抗体对该突变体的结合信号,结合率(抗体,突变体)=结合比值(抗体,突变体)/max(结合比值(抗体组,突变体))*100%。
结果表明,SARS-CoV-2RBD蛋白的不同位点的突变,对于各个抗体的结合有着不同程度的影响。综合参考各抗体与WT和I472V等非敏感突变株结合的结果,亲和力高低判断为:CoV2-H89Y>REGN10933>REGN10987。当某抗体针对特定突变体的结合率下降到50%以下时,将该残基位点定义为该抗体的显著结合表位。若某抗体针对特定突变体的结合率下降到25%以下时,定义为该抗体的高度显著表位。利用Pymol软件(https://pymol.org/),根据PDB结构文件6LZG(http://www.rcsb.org/structure/6LZG)进行结构做图,可以将各个抗体的表位信息展示在SARS-CoV-2RBD的结构上。
结果如图6所示,CoV2-H89Y的高度显著表位包括G476、S477、P479、F486和N487,显著表位包括Y489。其中,T478位点突变虽然在上述突变检测实验中针对CoV2-H89Y没有显示出很强的敏感性,但也使CoV2-H89Y的结合率降至69%,且T478邻接CoV2-H89Y的S477和P479结合位点并位于它们中间,因此也判断T478位于CoV2-H89Y的表位区。
实施例5:人源化抗体H89Y的抗原结合及中和能力检测
5.1人源化抗体同SARS-CoV-2标准株RBD、Spike蛋白的结合
将浓度为2μg/mL的重组SARS-CoV-2RBD蛋白(来源:神州细胞工程有限公司)、重组SARS-CoV-2Spike蛋白(北京义翘神州科技有限公司)分别包被于96孔板上,每孔100μL,2-8℃包被过夜。次日洗板,室温封闭1小时以上,分别加入100μL不同浓度的抗体,以1:3的比例连续稀释,从300ng/ml开始稀释8个浓度,加入的抗体为CoV2-H89Y、同时设置阳性对照分子REGEN-COV(REGN10933与REGN109871按质量比1:1混合)、Bamlanivimab(LY-CoV555)与Etesevimab组合(CB6)按质量比1:2混合,序列来源:PDB ID:7KMG,7C01,下文同)和阴性对照H7N9-R1-Fd6-IgG1(来源:神州细胞工程有限公司)孵育1-2小时,设置2个重复孔。之后洗板去除未结合抗体,加入检测二抗山羊抗人IgG F(ab)2/HRP孵育后重复洗板,加入底物显色液进行显色,终止后酶标仪检测OD450。
结果如图7所示,COV2-H89Y抗体能与重组SARS-CoV-2RBD及Spike蛋白特异性结合,EC50为5.31ng/mL,4.57ng/mL(表2)。
表2COV2-H89Y与重组SARS-CoV-2RBD及Spike蛋白的特异性结合EC50
5.2人源化抗体同SARS-CoV-2标准株RBD、Spike蛋白亲和力
采用生物分子相互作用分析系统测定重组RBD蛋白与COV2-H89Y及对照分子亲和力。选用SA Sensor,平衡60s,分别上样2μg/mL生物素标记的RBD蛋白或1μg/mL生物素标记的Spike蛋白,再次平衡100s洗去Sensor上未结合的生物素标记的RBD蛋白或Spike蛋白。与RBD亲和力检测中,加入不同浓度(CoV2-H89Y:0.41,0.90,2.07,3.45,6.90nM或REGEN-CoV及LY-CoV555+CB6:0.90,2.07,3.45,6.90,13.8nM)的抗体;与Spike亲和力检测中,加入不同浓度(CoV2-H89Y:0.14,0.21,0.41,0.90,2.07nM或LY-CoV555+CB6:0.21,0.41,0.90,2.07,3.45nM或REGEN-CoV:0.41,0.90,2.07,3.45,6.90nM)的抗体结合600s,之后解离600s。用Data Analysis 11.1软件对数据进行处理计算得到抗体亲和力(KD)、结合常数(kon)、解离常数(kdis)。
COV2-H89Y及其对照分子与重组RBD蛋白亲和力检测结果如图8A-C、表3所示,COV2-H89Y和对照分子与重组SARS-CoV-2RBD蛋白亲和力相近。COV2-H89Y与重组RBD蛋白的亲和力为6.8E-12M,结合常数为5.8E+05Ms-1,解离常数为4.0E-06s-1;REGEN-COV与重组RBD蛋白的亲和力为6.0E-11M,结合常数为3.3E+05Ms-1,解离常数为2.0E-05s-1;LY-CoV555+CB6与重组RBD蛋白的亲和力为2.4E-11M,结合常数为3.7E+05Ms-1,解离常数为9.0E-06s-1。COV2-H89Y的RBD结合亲和力略优于REGEN-COV及LY-CoV555+CB6。
表3COV2-H89Y及其对照分子与重组RBD蛋白亲和力
COV2-H89Y及其对照分子与重组Spike蛋白亲和力检测结果如图8D-F,表4所示,COV2-H89Y与重组Spike蛋白的亲和力为2.2E-11M,结合常数为2.1E+06Ms-1,解离常数为4.5E-05s-1;REGEN-COV与重组Spike蛋白的亲和力为1.6E-10M,结合常数为8.5E+05Ms-1,解离常数为1.4E-04s-1。LY-CoV555+CB6与重组Spike蛋白的亲和力为1.4E-10M,结合常数为1.3E+06Ms-1,解离常数为1.8E-04s-1。COV2-H89Y的Spike结合亲和力略优于REGEN-COV及LY-CoV555+CB6。
表4COV2-H89Y及其对照分子与重组Spike蛋白亲和力
5.3人源化抗体竞争ACE2受体同SARS-CoV-2标准株RBD、Spike蛋白的结合
将浓度1μg/mL的重组SARS-CoV-2RBD蛋白或Spike蛋白包被于96孔板上,每孔100μL,2-8℃包被过夜。次日洗板,室温封闭1小时以上,加入100μL 0.05μg/mL带his标签的ACE2蛋白(来源:北京义翘神州科技有限公司),同时加入100μL不同浓度的抗体COV2-H89Y、对照分子REGEN-COV、LY-CoV555+CB6及阴性对照分子H7N9-R1-Fd6-IgG1,竞争同RBD结合检测中,抗体以1:3的比例连续稀释,从900ng/ml开始稀释8个浓度;竞争同Spike结合检测中,抗体以1:2的比例连续稀释,从6000ng/ml开始稀释9个浓度,共同孵育,设置2个重复孔。洗板去除未结合抗体,加入0.5μg/mL的his标签检测抗体C-his-R023/HRP(来源:北京义翘神州科技有限公司)孵育后重复洗板,最后加入底物显色液进行显色,终止后检测OD450。抑制率PI%=(OD空白-OD样品)/OD空白×100%,其中OD空白表示正常包被只加ACE2不加抗体组的OD值,OD样品表示正常包被同时加ACE2和抗体的待测组OD值。利用GraphPad Prism 8.0软件拟合S型曲线并分析抗体竞争ACE2受体与SARS-CoV-2RBD结合的能力。重组SARS-CoV-2Spike蛋白的结合方法大致同上。不同于上述方法,该蛋白包被、封闭后加入100μL 0.4μg/mL生物素标记ACE2蛋白(来源:北京义翘神州科技有限公司)与不同浓度的上述四种抗体共同孵育。洗板去除未结合抗体后,加入0.5μg/mL Streptavidin/HRP(来源:Vector Laboratories)孵育后重复洗板,最后加入底物显色液进行显色,终止后检测OD450。
结果如图9所示,COV2-H89Y抗体能有效地竞争ACE2蛋白与SARS-CoV-2RBD或Spike蛋白的结合,COV2-H89Y竞争ACE2受体结合重组SARS-CoV-2RBD或Spike蛋白的IC50分别为273.1ng/mL和21.92ng/mL(表5)。
表5COV2-H89Y竞争重组SARS-CoV-2RBD蛋白与重组ACE2蛋白结合IC50
5.4人源化抗体中和SARS-CoV-2标准株假病毒能力检测
参照实施例2.3评价293FT-ACE2细胞上人源化抗体COV2-H89Y中和SARS-CoV-2假病毒能力,结果具体如图10A、B所示。
COV2-H89Y中和SARS-CoV-2假病毒IC50结果如表6,COV2-H89Y及对照分子均具有中和SARS-CoV-2假病毒的作用,且呈浓度依赖性。COV2-H89Y对SARS-CoV-2假病毒的中和作用优于REGEN-COV和LY-CoV555+CB6,相对活性分别为600%和6675%。COV2-H89Y的IC50平均值为0.8ng/mL,REGEN-COV和LY-COV555+CB6的IC50平均值分别为5.4ng/mL和26.7ng/mL。
表6COV2-H89Y中和SARS-CoV-2假病毒IC50
采用Vero-E6细胞评价人源化抗体COV2-H89Y中和SARS-CoV-2假病毒能力。Vero-E6细胞提前一天按3×104,50μL/孔接种与96孔平底板中,过夜。第二天,将抗体以1:3的比例连续稀释,从1333ng/ml开始稀释9个浓度,以30μL/孔加入96孔板,若使用抗体组合,则各抗体占比50%,然后30μL/孔加入1250TCID50的假病毒,混匀后置于37℃、5% CO2培养箱孵育1h。孵育结束后,取50μL抗体病毒混合液加入Vero-E6细胞孔中,后置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养22h。培养结束后,去掉培养上清,25μL/孔加入Passive 5x lysis buffer,在摇床上放置5min进行细胞裂解。取10μL/孔转入96孔全白化学发光板,采用LB960-微孔板式发光检测仪加入萤光素酶底物并检测发光值(RLU),计算中和率。中和率%=(阳性对照RLUs–样品RLUs)/(阳性对照RLUs–阴性对照RLUs)×100%。,阳性对照孔表征细胞与病毒共同孵育孔的RLUs值,阴性对照孔表征只包含细胞的RLUs值,样品孔表征包含细胞、病毒及不同稀释度抗体的RLUs值。利用GraphPad Prism软件分析并绘制量效曲线,横坐标为样品的浓度,纵坐标为中和率,计算IC50值。
结果如图10C、D表7所示,COV2-H89Y可以有效中和SARS-CoV-2假病毒,且呈剂量相关性。COV2-H89Y与REGEN-COV对SARS-CoV-2假病毒有相近的中和活性,相对活性为158%。COV2-H89Y对假病毒的中和效果略好于LY-CoV555+CB6,相对活性为428%。COV2-H89Y的平均IC50分别为3.0ng/mL。REGEN-COV和LY-COV555+CB6的平均IC50分别为3.8ng/mL和15.3ng/mL。
表7COV2-H89Y中和SARS-CoV-2假病毒作用
采用Huh-7细胞评价人源化抗体COV2-H89Y中和SARS-CoV-2假病毒能力的检测方法。将不同浓度抗体以1:3的比例连续稀释,从500ng/ml开始稀释9个浓度,以50μL/孔加入96孔板,然后50μL/孔加入650TCID50的假病毒,混匀后置于37℃、5% CO2培养箱孵育1h。孵育结束后,100μL/孔接种2×104个Huh-7细胞,混匀后置于37℃、5% CO2培养箱中静置培养约20h。培养结束后,去掉培养上清,50μL/孔加入1×Passive Lysis Buffer,混匀裂解细胞。取40μL/孔转入96孔全白化学发光板,采用LB960微孔板式发光检测仪40μL/孔加入萤光素酶底物并检测发光值(RLU),计算中和率。中和率%=(阳性对照RLUs–样品RLUs)/(阳性对照RLUs–阴性对照RLUs)×100%,阳性对照孔表征细胞与病毒共同孵育孔的RLUs值,阴性对照孔表征只包含细胞的RLUs值,样品孔表征包含细胞、病毒及不同稀释度抗体的RLUs值,计算IC50值。
结果如图10E、F,表8所示,COV2-H89Y及对照分子均具有中和SARS-CoV-2假病毒的作用,且呈浓度依赖性。COV2-H89Y与REGEN-COV对SARS-CoV-2假病毒的中和作用相当,但优于LY-CoV555+CB6,相对活性分别为170%和696%。COV2-H89Y的IC50平均值为2.4ng/mL,REGEN-COV和LY-COV555+CB6的IC50平均值分别为3.9ng/mL和16.7ng/mL。
表8COV2-H89Y中和SARS-CoV-2假病毒IC50
5.5人源化抗体中和SARS-CoV-2分离株活病毒能力检测
使用细胞病变效应(CPE)测定抗体对新冠病毒活病毒的中和活性。将50μl不同浓度的抗体,抗体以1:2的比例连续稀释,从6250ng/ml开始稀释9个浓度(使用细胞维持液进行2倍或3倍连续稀释)与相同体积的100CCID50基因组序列号为GWHACAX01000000,且与SARS-CoV-2标准株Spike序列相同的新冠病毒分离株(下文简称为分离株)混合,同时设立病毒对照和正常细胞对照,在37℃温度下孵育1小时。每孔加100μl Vero细胞悬液,放置37℃培养箱培养3-5天观察结果。用Karber法计算中和活性,即能够保护50%细胞不受100CCID50目标病毒感染的抗体最高稀释度对应的浓度为该抗体的半数有效中和浓度(IC50)。
结果如表9显示,COV2-H89Y可抑制SARS-CoV-2感染Vero细胞所致的细胞病变。COV2-H89Y对SARS-CoV-2分离株活病毒的中和活性(IC50为146ng/ml)与REGEN-COV分子(IC50为98ng/ml)相近,优于LY-CoV555+CB6分子组合(IC50为293ng/ml)。
表9 COV2-H89Y中和SARS-CoV-2活病毒IC50
实施例6:人源化抗体H89Y的Fc功能检测
6.1人源化抗体H89Y的CD16a结合功能
将浓度10μg/mL的Avidin(来源:Sigma-Aldrich Merck)包被于96孔板上,每孔100μL,2-8℃包被过夜。次日洗板,室温封闭1小时以上,加入100μL 5μg/mL生物素化重组CD16a蛋白(来源:北京义翘神州科技有限公司),室温孵育1-2h后洗板。加入不同浓度,的COV2-H89Y、对照分子REGEN-COV、LY-CoV555+CB6及阴性对照H7N9-R1-Fd6-IgG1,抗体以1:3的比例连续稀释,从3000ng/ml开始稀释6个浓度,设置2个重复孔。孵育1-2小时后洗板去除未结合抗体,加入山羊抗人IgG F(ab)2/HRP(来源:Jackson ImmunoResearch)孵育后重复洗板,最后加入底物显色液进行显色,终止后酶标仪读取OD450。利用GraphPad Prism 8.0软件拟合S型曲线并分析抗体与CD16a蛋白的结合。
结果如图11所示,COV2-H89Y及阴性对照分子H7N9-R1-Fd6-IgG1几乎均不与重组CD16a蛋白结合,REGEN-COV、LY-CoV555+CB6与重组CD16a蛋白有明显结合,且结合随抗体浓度升高而增强。
6.2人源化抗体H89Y的CD32a、CD32b结合功能
人源化抗体H89Y的CD32a结合功能的具体评价方法与实施例6.1大致相同。不同之处在于室温封闭后加入100μL 5μg/mL生物素化重组CD32a蛋白(来源:北京义翘神州科技有限公司)进行室温孵育,其余步骤同上。
人源化抗体与CD32a蛋白结合的分析结果如图12所示,COV2-H89Y及阴性对照H7N9-R1-Fd6-IgG1均不与重组CD32a蛋白结合,REGEN-COV、LY-CoV555+CB6与重组CD32a蛋白结合随抗体浓度升高而增强。
人源化抗体H89Y的CD32b结合功能的具体评价方法与实施例6.1大致相同。不同之处在于室温封闭后加入100μL 5μg/mL生物素化重组CD32b蛋白(来源:北京义翘神州科技有限公司)进行室温孵育,其余步骤同上。
抗体与CD32b蛋白结合的分析结果如图13所示,COV2-H89Y及阴性对照H7N9-R1-Fd6-IgG1均不与重组CD32b蛋白结合,REGEN-COV、LY-CoV555+CB6与重组CD32b蛋白结合随抗体浓度升高而增强。
6.3人源化抗体H89Y的CD64结合功能
人源化抗体H89Y的CD64结合功能的具体评价方法与实施例6.1大致相同。不同之处在于室温封闭后,加入100μL 0.5μg/mL生物素化重组CD64蛋白(来源:北京义翘神州科技有限公司)进行室温孵育,其余步骤同上。
抗体与CD64蛋白结合能力的分析结果如图14所示,COV2-H89Y及阴性对照H7N9-R1-Fd6-IgG1均不与重组CD64蛋白结合,REGEN-COV、LY-CoV555+CB6与重组CD64蛋白结合随抗体浓度升高而增强。
6.4人源化抗体H89Y的C1q结合功能
将不同浓度的COV2-H89Y、REGEN-COV、LY-CoV555+CB6及阴性对照H7N9-R1-Fd6-IgG1包被于96孔板上,抗体以1:3的比例连续稀释,从30000ng/ml开始稀释5个浓度,每孔100μL,设置2个重复孔,2-8℃包被过夜。次日洗板,室温封闭1小时以上,分别加入100μL的5μg/mL重组C1q蛋白(来源:Quidel),孵育1-2小时后洗板去除未结合C1q蛋白,加入5μg/mL的anti C1q/HRP二抗(来源:Abcam)100μL,孵育1-2小时后重复洗板,加入底物显色液进行显色,终止后酶标仪检测OD450。以抗体包被浓度为横坐标,OD450为纵坐标,利用Origin 8.0软件拟合S型曲线并分析抗体与重组C1q蛋白的结合。
抗体与C1q蛋白结合的分析结果如图15所示,COV2-H89Y及阴性对照H7N9-R1-Fd6-IgG1几乎均不与重组C1q蛋白结合,REGEN-COV、LY-CoV555+CB6与重组C1q蛋白结合随抗体浓度升高而增强。
6.5人源化抗体H89Y介导的ADCC功能
将293FT-SARS-CoV-2-S靶细胞以3×104、25μL/孔均匀接种于96孔板,然后每孔加入50μL不同浓度的样品,抗体以1:3的比例连续稀释,从30ng/ml开始稀释8个浓度,随后加入25μL 1×105个效应细胞Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16AV(来源:神州细胞工程有限公司),置CO2培养箱37℃、5%CO2条件下孵育4h。每组设置3个复孔以及靶细胞、效应细胞和阴性对照孔。孵育4h后,每孔加入25μL 5×Passive Lysis Buffer(来源:Promega,下文同),震板混匀裂解细胞。然后每孔取20μL上清液转移至96孔白底板,每孔加入60μL荧光素酶底物并用微孔板式发光检测仪检测发光值(RLU)。利用GraphPad Prism作图软件分析并绘制量效曲线,横坐标为样品浓度的对数值,纵坐标为生物发光强度(样品RLU)。
如图16所示,COV2-H89Y无ADCC的作用;阳性对照分子具有介导ADCC的作用,且呈浓度依赖性,EC50为1.1ng/mL,最大诱导倍数为144.8;REGEN-COV具有ADCC作用,EC50为3.9ng/mL,最大诱导倍数为64.4;LY-CoV555+CB6具有ADCC作用,相对较弱,作用的最大诱导倍数为36.1。
6.6人源化抗体H89Y介导的ADCP功能
将293FT-SARS-CoV-2-S靶细胞以3×104、25μL/孔均匀接种于96孔板,然后每孔加入50μL不同浓度的样品,抗体以1:3的比例连续稀释,从300ng/ml开始稀释8个浓度,随后加入25μL 1×105个效应细胞Jurkat-NFAT-Luc2p-CD64(来源:神州细胞工程有限公司),置CO2培养箱37℃、5% CO2条件下孵育6h。每组设置3个复孔及靶细胞、效应细胞和阴性对照孔。孵育6h后,每孔加入25μL5×Passive Lysis Buffer,震板混匀裂解细胞。然后每孔取20μL上清液转移至96孔白底板,每孔加入60μL荧光素酶底物并用微孔板式发光检测仪检测发光值(RLU)。利用GraphPad Prism作图软件分析并绘制量效曲线,横坐标为样品浓度的对数值,纵坐标为生物发光强度(样品RLU)。
结果如图17所示,COV2-H89Y无ADCP作用;阳性对照CoV2-mhF38-IgG1(o)具有介导ADCP作用且呈剂量相关性,EC50为10.1ng/mL,最大诱导倍数为52.8;REGEN-COV具有ADCP作用,EC50为5.8ng/mL,最大诱导倍数为13.6;LY-CoV555+CB6具有ADCP作用,EC50为15.7ng/mL,最大诱导倍数为8.3。
6.7人源化抗体H89Y介导的CDC功能
用含0.1% BSA的RPMI 1640培养基重悬293FT-SARS-CoV-2-S细胞(Spike:SARS-CoV-2标准株),5×104/孔均匀接种于96孔板,随后每孔加入50mL不同浓度的样品,抗体以1:4的比例连续稀释,从50000ng/ml开始稀释9个浓度,然后每孔加入50μL 1:4稀释的补体(来源:One lambda)。37℃、5% CO2孵育3小时后,每孔加入15μL的WST-8显色液,显色稳定后置酶标仪测定OD450/OD630吸光度。设置空白和阴性对照组,阴性对照为细胞与补体共孵育的OD读值,空白对照为空的96孔板的OD读值。计算结果为OD样品-OD空白,杀伤率%=(OD阴性对照-OD样品)/OD阴性对照×100%。
结果如图18所示,COV2-H89Y及对照分子均无CDC作用。
6.8人源化抗体H89Y介导的ADE作用
将CHO-K1-CD32A-9,CHO-K1-CD32B-5,CHO-K1-CD64-1重组细胞(来源:神州细胞工程有限公司)分别于96孔板中每孔接种50μL、3×104个细胞,置于CO2培养箱于37℃、5%CO2培养过夜。第二天,96孔细胞培养板中加入不同浓度的COV2-H89Y,REGEN-COV及LY-CoV555+CB6,阴性对照分子H7N9-R1-Fd6-IgG1,抗体以1:5的比例连续稀释,从100000ng/ml开始稀释9个浓度,30μL/孔。然后每孔加入30μL浓度为5×104/mLTCID50的假病毒。混匀后置于37℃、5% CO2培养箱孵育1h。孵育完成后将抗体病毒混合液50μL转入细胞板中后置于37℃、5% CO2培养箱中静置培养24h。培养结束后,每孔加入25μL 5×Passive Lysis Buffer,在摇床上放置5min进行混匀裂解细胞。然后取10μL/孔转入96孔全白化学发光板,每孔加入50μL萤光素酶底物后采用LB960-微孔板式发光检测仪检测发光值(RLU),使用GraphPadPrism 8.0作图。
结果如图19,COV2-H89Y对稳定表达CD32a、CD32b或CD64的CHO细胞几乎无ADE效应,显著低于REGEN-COV分子及LY-CoV555&CB6分子,临床安全性风险大幅降低。6.9人源化抗体H89Y的FcRn结合功能
COV2-H89Y与不同种属的FcRn蛋白结合能力。将浓度为10μg/mL的Avidin包被于96孔板上,每孔100μL,2-8℃包被过夜。次日洗板,室温封闭1小时以上,分别加入100μL,5μg/mL的生物素化人、鼠、猴FCGRT-His+B2M蛋白(来源:北京义翘神州科技有限公司)孵育1-2小时,再加入不同浓度COV2-H89Y抗体孵育1-2小时,抗体以1:4的比例连续稀释,从20000ng/ml开始稀释7个浓度,洗板去除未结合的抗体后加入山羊抗人IgG F(ab)2/HRP二抗。从抗体稀释到二抗孵育的过程都维持在pH 6.0条件下进行。加入底物显色液进行显色,终止后酶标仪检测OD450。
结果如图20所示,COV2-H89Y与重组人、鼠、猴FcRn蛋白均具有很好的结合,EC50汇总于表10。
表10COV2-H89Y与重组人、鼠、猴FcRn蛋白结合EC50
实施例7:人源化抗体H89Y对流行变异株的中和能力检测
Huh-7细胞提前一天按2.5×104,50μL/孔接种于96孔平底板中,过夜。第二天,将不同浓度的相应抗体30μL/孔加入96孔板,抗体以1:4的比例连续稀释,从4000ng/ml开始稀释9个浓度,或以1:4的比例连续稀释,从800ng/ml开始稀释9个浓度,或以1:4的比例连续稀释,从100000ng/ml开始稀释9个浓度,然后30μL/孔加入不同变异株的假病毒(来源:神州细胞工程有限公司,下文同),混匀后置于37℃、CO2培养箱孵育1h。孵育结束后,取50μL抗体病毒混合液加入Huh7细胞孔中,后置于37℃、CO2培养箱中静置培养24h。培养结束后,25μL/孔加入5x Passive lysis buffer,摇床上放置5min进行细胞裂解。上清混匀后,取10μL/孔转入96孔全白化学发光板,采用LB960-微孔板式发光检测仪加入萤光素酶底物并检测发光值(RLU),计算中和率。中和率%=(阳性对照RLUs–样品RLUs)/(阳性对照RLUs–阴性对照RLUs)×100%,阳性对照孔表征细胞与病毒共同孵育孔的RLUs值,阴性对照孔表征只包含细胞的RLUs值,样品孔表征包含细胞、病毒及不同稀释度抗体的RLUs值。利用GraphPadPrism软件分析并绘制量效曲线,横坐标为样品的浓度,纵坐标为中和率,计算IC50值。
COV2-H89Y对D614G流行株、关切的变异株VOC(Variant of Concern),如AlphaB.1.1.7,Beta B.1.351,Gamma P.1;及关注的变异株VOI(Variant of Interest),EpsilonB.1.429,B.1.526,Kappa B.1.617.1,Lambda C.37及其它一些国家地区流行突变株如B.1.618,VOC 20I/484Q,C.36.3,B.1.214.2等均具有较好的中和活性。因此,COV2-H89Y具有广谱高中和活性。COV2-H89Y对不同毒株的假病毒中和IC50汇总于表11。
表11COV2-H89Y对流行突变株假病毒中和IC50(ng/mL)
实施例8:人源化抗体H89Y的耐药突变分析
Vero细胞提前一天按2×105个细胞/孔接种至12孔板。第二天细胞密度为3×105时,将抗体以1:5的比例连续稀释,从100μg/ml开始稀释11个浓度,并设置无抗体对照孔。将500μl复制型重组新冠病毒rVSV-eGFP-WH01△21(来源:中国科学院动物研究所)(1x106FFU/ml)与500μl抗体稀释液混合,室温孵育30分钟。抗体终浓度分别为:50,10,2,0.4,0.08,0.016,3.2e-3,6.4e-4,1.3e-4,2.6e-5,5.1e-6,0μg/mL。孵育结束后,将混合物加入12孔板的Vero细胞中,于CO2培养箱中37℃5% CO2孵育96小时。荧光显微镜观察细胞表达GFP的情况,选择荧光数≥104的最大抗体稀释孔,收取细胞上清用于第二轮筛选,并提取细胞上清RNA用于S蛋白深度测序,测序完成后分析逃逸突变。第二轮筛选与第一轮方法基本相同:取100μl第一轮收取的病毒上清加入到400μl稀释液(含2% FBS的DMEM)中,与500μl不同稀释度的抗体(与第一轮筛选抗体稀释度相同)室温孵育30分钟,然后加入到新的Vero细胞中,后续步骤同第一轮并取上清RNA测序分析逃逸突变。
耐药突变单克隆分离。提前一天将Vero细胞接种至12孔板,使第二天实验时长满单层。P2代上清10倍比稀释,设置4个稀释度(10-2,10-3,10-4,10-5)。在12孔培养板中加入500μl不同稀释的病毒悬液,37℃培养1小时,每隔15min轻轻摇动一次。弃病毒液,每孔加入2ml适当温度(37℃)预热的琼脂盖(4%低熔点琼脂糖:2%FBS,1%PS细胞维持液为1:3的混合液),于CO2培养箱中37℃5% CO2继续培养2天。待可以在光下看到明显的病毒空斑后,标记空斑位置,在生物安全柜中挑取空斑加入新鲜细胞中扩增。扩增之后产生荧光的克隆,从上清中提取RNA做一代测序,分析突变情况。
结果如表12-14所示,结合二代测序和克隆的一代测序结果:COV2-H89Y的耐药突变点为S477F,F486S。
表12COV2-H89Y的耐药P1二代测序结果
表13COV2-H89Y的耐药P2二代测序结果
注:0/0表示纯和且跟REF一致;0/1表示杂合,两个allele一个是ALT一个是REF;1/1表示纯和且都为ALT。百分数表示该位点ALT碱基的reads数在REF与ALT reads数之和中的占比。
表14COV2-H89Y耐药突变单克隆分离一代测序结果
注:粗体突变位于RBD区。
实施例9:人源化抗体H89Y的小鼠药代动力学评价
选用C57BL/6N小鼠18只,分为3组,每组6只(雌雄各半),单次尾静脉注射给予COV2-H89Y,给药剂量分别为15、50和150mg/kg,给药容积为10mL/kg,于给药前(0h)及给药后15min、1h、2h、6h、24h、48h、72h、96h、120h、168h、240h、336h、504h、672h采集血液并分离血清,利用已建立的ELISA法进行血药浓度检测,并采用Phoenix WinNonlin 8.1软件中非房室模型(NCA)计算药代动力学参数。
结果显示,实验过程中所有小鼠体重均呈上升趋势,临床观察均未见异常。COV2-H89Y分别以15、50、150mg/kg静脉注射给予C57BL/6N小鼠,药时曲线如图21所示,血药浓度随时间降低,各剂量组动物的血药浓度变化趋势一致,血药浓度随剂量增加而增加。单次药代动力学参数如表15所示,COV2-H89Y各剂量组动物的Cmax比值为1:3.31:12.17,AUClast比值为1:3.11:7.96,表明给药后COV2-H89Y的峰浓度和暴露量均与给药剂量呈正相关。各组动物的平均t1/2分别为434.54、454.43、257.45h,半衰期均较长,且系统暴露量较高,显示出良好的药代动力学特征。
表15小鼠单次静脉注射COV2-H89Y的药代动力学参数(0~336h)
实施例10:COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的表位分析
本实施例以SARS-CoV-2RBD-His(SARS-CoV-2标准株)作为模板,使用PCR进行定点突变,并进行测序验证。瞬时转染表达突变型及野生型(WT)SARS-CoV-2RBD蛋白并用ELISA检测抗体COV2-HB27-Fd6-IgG1、COV2-H89Y、REGN10933和REGN10987同各个突变蛋白的结合能力。具体方法详见实施例4。
实验结果显示,COV2-H89Y的高度显著表位包括G476、S477、P479、F486和N487,显著表位包括Y489,T478位于CoV2-H89Y的表位区。同时展示了已获得抗原结合复合物解析结构的抗体COV2-HB27-Fd6-IgG1,SARS-CoV-2RBD中的N439和T500为CoV2-HB27-Fd6-IgG1的高度显著表位。通过结构分析可知,COV2-H89Y的表位区位于RBD中相对于COV2-HB27-Fd6-IgG1表位的另一侧(图22),与竞争结论一致,提示二者具有结构上组合用药的合理性。
实施例11:CoV2-HB27-Fd6-IgG1与COV2-H89Y与SARS-CoV-2标准株RBD、Spike的非竞争结合
检测CoV2-HB27-Fd6-IgG1与COV2-H89Y非竞争性结合SARS-CoV-2Spike蛋白,选用SA sensor,平衡60s,上样1μg/mL生物素标记的Spike蛋白(来源:神州细胞工程有限公司,下文同)600s,再次平衡100s洗去Sensor上未结合的生物素标记的Spike蛋白。一组实验加入50μg/mL的COV2-H89Y结合300s,解离300s,之后加入100μg/mL的CoV2-HB27-Fd6-IgG1或COV2-H89Y结合300s,解离300s;另一组实验,加入50μg/mL的CoV2-HB27-Fd6-IgG1结合300s,解离300s,之后加入100μg/mL的CoV2-HB27-Fd6-IgG1或COV2-H89Y结合300s,解离300s。实验结束后利用Data Analysis 11.1软件对数据进行处理计算得到结合值。
检测COV2-HB27-Fd6-IgG1与COV2-H89Y非竞争性结合SARS-CoV-2RBD蛋白,方法同结合SARS-CoV-2Spike蛋白类似,不同之处在于上样2μg/mL生物素标记的RBD蛋白(来源:神州细胞工程有限公司,下文同)。
实验结果如图23,COV2-HB27-Fd6-IgG1与COV2-H89Y可以非竞争性结合重组SARS-CoV-2Spike和RBD蛋白。
实施例12:COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的抗原结合及中和能力检测12.1COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合抗体同SARS-CoV-2标准株RBD、Spike蛋白的结合
抗体组合与重组蛋白SARS-CoV-2RBD的结合方法与实施例5.1大致相同。不同之处在于包被、封闭后,各孔分别加入100μL不同浓度的COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合、REGEN-COV、LY-CoV555+CB6及阴性对照H7N9-R1-Fd6-IgG1抗体,抗体以1:3的比例连续稀释,从300ng/ml开始稀释8个浓度,孵育1-2小时,设置2个重复孔。其它步骤同前所述。
结果如图24的A所示,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合能与重组SARS-CoV-2RBD蛋白特异性结合(EC50为6.42ng/mL),在一定浓度范围内随抗体浓度升高结合增强,且略强于对照分子REGEN-COV、LY-CoV555+CB6(EC50分别为8.06、8.60ng/mL),阴性对照H7N9-R1-Fd6-IgG1与重组SARS-CoV-2RBD蛋白无结合。抗体与重组SARS-CoV-2RBD的特异性结合EC50汇总见表16。
表16COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合与重组SARS-CoV-2RBD蛋白的特异性结合EC50
抗体组合与重组SARS-CoV-2Spike蛋白的结合方法大致同上(RBD)。不同于上述方法,利用SARS-CoV-2Spike蛋白包被。其余步骤同前。结果如图24的B所示,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体能与重组SARS-CoV-2Spike蛋白特异性结合(EC50为5.77ng/mL),在一定浓度范围内随抗体浓度升高结合增强,且略强于对照分子REGEN-COV、LY-CoV555+CB6(EC50分别为8.17、9.92ng/mL),阴性对照H7N9-R1-Fd6-IgG1与重组SARS-CoV-2Spike蛋白无结合。抗体与重组SARS-CoV-2Spike的特异性结合EC50汇总见表17。
表17COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合与重组SARS-CoV-2Spike蛋白的特异性结合EC50
12.2COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合同SARS-CoV-2标准株RBD、Spike蛋白亲和力检测
抗体组合同SARS-CoV-2标准值RBD、Spike蛋白亲和力检测方法大致同实施例5.2,不同于上述方法,与RBD亲和力检测中,加入不同浓度(0.90,2.07,3.45,6.90,13.8nM)的抗体;与Spike亲和力检测中,加入不同浓度(CoV2-H89Y:0.21,0.41,0.90,2.07,3.45nM或LY-CoV555+CB6:0.21,0.41,0.90,2.07,3.45nM或REGEN-COV:0.41,0.90,2.07,3.45,6.90nM)的抗体及阴性对照分子H7N9-R1-Fd6-IgG1。实验结束后利用Data Analysis11.1软件对数据进行处理计算得到抗体亲和力(KD)、结合常数(kon)、解离常数(kdis)。
结果如图25,表18A-C所示,COV2-H89Y+COV2-HB27-Fd6-IgG1抗体组合与重组RBD蛋白的亲和力为7.8E-12M,结合常数为3.9E+05Ms-1,解离常数为3.1E-06s-1;REGEN-COV与重组RBD蛋白的亲和力为6.0E-11M,结合常数为3.3E+05Ms-1,解离常数为2.0E-05s-1;LY-CoV555+CB6与重组RBD蛋白的亲和力为2.4E-11M,结合常数为3.7E+05Ms-1,解离常数为9.0E-06s-1。COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的抗原结合亲和力略优于REGEN-COV及LY-CoV555+CB6,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合及对照分子与重组RBD蛋白的亲和力数据汇总如表18。
表18 COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合与重组RBD蛋白结合亲和力
检测重组Spike蛋白与COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合及对照分子亲和力的具体方法大致同前,不同于上述方法,上样1μg/mL生物素标记的Spike蛋白600s,然后继续上述步骤。
结果如图10D-F,表19所示,COV2-H89Y+COV2-HB27-Fd6-IgG1抗体组合与重组Spike蛋白的亲和力为9.2E-11M,结合常数为1.0E+06Ms-1,解离常数为9.7E-05s-1。REGN-COV与重组Spike蛋白的亲和力为1.6E-10M,结合常数为8.5E+05Ms-1,解离常数为1.4E-04s-1。LY-CoV555+CB6与重组Spike蛋白的亲和力为1.4E-10M,结合常数为1.3E+06Ms-1,解离常数为1.8E-04s-1。COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的抗原结合亲和力略优于REGEN-COV及LY-CoV555+CB6。
表19 COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合与重组Spike蛋白结合亲和力
COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合竞争ACE2受体同SARS-CoV-2标准株蛋白RBD、Spike的结合
抗体组合竞争ACE2受体同重组SARS-CoV-2RBD蛋白的结合方法参见实施例5.3,不同于上述方法,加入100μL 0.05μg/mL带his标签的ACE2蛋白后同时加入100μL不同浓度的COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合、对照分子REGEN-COV、LY-CoV555+CB6及阴性对照分子H7N9-R1-Fd6-IgG1,竞争同RBD结合检测中,抗体以1:3的比例连续稀释,从900ng/ml开始稀释8个浓度;竞争同Spike结合检测中,抗体以1:2的比例连续稀释,从6000ng/ml开始稀释9个浓度,共同孵育,设置2个重复孔。抑制率(PI%)的评价方法详见11.2。
如图26所示,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合能有效地竞争ACE2蛋白与SARS-CoV-2RBD蛋白的结合,阴性对照分子不能封闭重组RBD蛋白与ACE2蛋白的结合。COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合及对照分子REGEN-COV、LY-CoV555+CB6竞争ACE2受体结合重组SARS-CoV-2RBD蛋白的IC50分别为382.9ng/mL、392.7ng/mL、891.2ng/mL,IC50汇总见表20。
表20COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合竞争重组SARS-CoV-2RBD蛋白与重组ACE2蛋白结合IC50
抗体组合竞争ACE2受体同重组SARS-CoV-2Spike蛋白的结合方法大致同上。不同于上述方法,利用SARS-CoV-2Spike蛋白包被,且抗体与ACE2蛋白共同孵育后,洗板去除未结合抗体,加入0.5μg/mL Streptavidin/HRP孵育后重复洗板,最后加入显色液进行显色,终止后检测OD450。抑制率的计算方法同上所述。
结果如图26所示,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合能有效地竞争ACE2蛋白与SARS-CoV-2Spike蛋白的结合,竞争结合能力相似且在一定浓度范围内随抗体浓度升高抑制率升高。阴性对照分子不能封闭重组Spike蛋白与ACE2蛋白的结合。COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合及对照分子REGEN-COV、LY-CoV555+CB6竞争重组SARS-CoV-2Spike蛋白与重组ACE2蛋白结合IC50分别为33.42ng/mL、32.78ng/mL、47.44ng/mL,其半数抑制浓度IC50汇总见表21。
表21COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合竞争重组SARS-CoV-2Spike蛋白与重组ACE2蛋白结合IC50
12.4COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合中和SARS-CoV-2标准株假病毒能力检测
293FT-ACE2细胞上假病毒中和能力检测方法与实施例2.3大致相同。
293FT-ACE2细胞上假病毒中和能力检测结果如图27A、B,表22,阴性对照无中和作用。COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合对SARS-CoV-2标准株假病毒的中和作用优于REGEN-COV和LY-CoV555+CB6,相对活性分别为378%和1162%。COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y的IC50平均值为2.4ng/mL,REGEN-COV和LY-COV555+CB6的IC50平均值分别为8.7ng/mL和30.2ng/mL。
表22COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合中和SARS-CoV-2假病毒IC50
Vero-E6细胞上SARS-CoV-2标准株假病毒中和能力检测结果如图27C、D,表23所示,阴性对照没有中和作用。COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的中和效果与REGEN-COV相似,相对活性为192%,但略好于LY-CoV555+CB6组合,相对活性为356%。COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的平均IC50为3.4ng/mL。REGEN-COV和LY-COV555+CB6的平均IC50分别为6.5ng/mL和12.0ng/mL。
表23COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合中和SARS-CoV-2假病毒作用
参照实施例5.4检测Huh-7细胞上抗体组合中和SARS-CoV-2假病毒能力。结果如图27E、F,表24,阴性对照分子无中和作用。COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合对SARS-CoV-2标准株假病毒的中和作用优于REGEN-COV和LY-CoV555+CB6,相对活性分别为393%和524%。COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y的IC50平均值为1.8ng/mL,REGEN-COV和LY-COV555+CB6的IC50平均值分别为5.5ng/mL和11.0ng/mL。
表24COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合中和SARS-CoV-2假病毒IC50
12.5COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合中和SARS-CoV-2分离株活病毒能力检测
使用细胞病变效应(CPE)测定抗体对新冠病毒活病毒的中和活性,方法与实施例5.5类似,结果如表25显示,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合可抑制SARS-CoV-2感染Vero细胞所致的细胞病变。COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合对SARS-CoV-2分离株活病毒的中和活性(IC50为49ng/ml)略优于或与REGEN-COV分子(IC50为98ng/ml)相近,优于LY-CoV555+CB6分子组合(IC50为293ng/ml)。
表25COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合中和SARS-CoV-2活病毒IC50
综上,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合具有高SARS-CoV-2病毒中和活性。
实施例13:COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的Fc功能
13.1COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的CD16a结合功能
COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的CD16a结合功能评价方法与实施例6.1大致相同。结果如图28所示,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合及阴性对照分子H7N9-R1-Fd6-IgG1几乎均不与重组CD16a蛋白结合,对照分子REGEN-COV、LY-CoV555+CB6与重组CD16a蛋白有明显结合,且结合随抗体浓度升高而增强。
13.2COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的CD32a、CD32b结合功能
COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的CD32a、CD32b结合功能评价方法与实施例6.2大致相同。不同之处在于室温封闭后加入100μL 5μg/mL生物素化重组CD32a(或CD32b)蛋白进行室温孵育,其余步骤同上。
COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的CD32a蛋白结合功能检测结果如图29所示,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y及阴性对照H7N9-R1-Fd6-IgG1均不与重组CD32a蛋白结合,对照分子REGEN-COV、LY-CoV555+CB6与重组CD32a蛋白结合随抗体浓度升高而增强。
COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的CD32b蛋白结合功能检测结果如图30所示,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y及阴性对照H7N9-R1-Fd6-IgG1均不与重组CD32b蛋白结合,对照分子REGEN-COV、LY-CoV555+CB6与重组CD32b蛋白结合随抗体浓度升高而增强。
13.3COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的CD64结合功能
COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的CD64结合功能的具体评价方法与实施例6.3大致相同。结果如图31所示,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y及阴性对照H7N9-R1-Fd6-IgG1均不与重组CD64蛋白结合,对照分子REGEN-COV、LY-CoV555+CB6与重组CD64蛋白结合随抗体浓度升高而增强。
13.4COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的C1q结合功能
将不同浓度的COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y、对照分子REGEN-COV、LY-CoV555+CB6及阴性对照H7N9-R1-Fd6-IgG1包被于96孔板上,抗体以1:3的比例连续稀释,从30000ng/ml开始稀释5个浓度,每孔100μL,设置2个重复孔,2-8℃包被过夜。次日洗板,室温封闭1小时以上,分别加入100μL的5μg/mL重组C1q蛋白,孵育1-2小时后洗板去除未结合C1q蛋白,加入5μg/mL的anti C1q/HRP二抗100μL,孵育1-2小时后重复洗板,加入底物显色液进行显色,终止后酶标仪检测OD450。以抗体包被浓度为横坐标,OD450为纵坐标,利用Origin8.0软件拟合S型曲线并分析抗体与重组C1q蛋白的结合。
如图32所示,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y及阴性对照H7N9-R1-Fd6-IgG1几乎均不与重组C1q蛋白结合,对照分子REGEN-COV、LY-CoV555+CB6与重组C1q蛋白结合随抗体浓度升高而增强。
13.5COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合介导的ADCC功能
COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合介导的ADCC功能的具体评价方法与实施例6.5大致相同。
结果如图33所示,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合无介导ADCC的作用;阳性对照分子具有介导ADCC的作用,且呈剂量相关性,作用的半数有效浓度(EC50)为1.1ng/mL,作用的最大诱导倍数为144.8;REGEN-COV具有ADCC作用,EC50为3.9ng/mL,作用的最大诱导倍数为64.4;LY-CoV555+CB6具有ADCC作用,相对较弱,作用的最大诱导倍数为36.1。
13.6COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合介导的ADCP功能
COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合介导的ADCP功能的具体评价方法与实施例6.6大致相同。
结果如图34所示,在Jurkat-NFAT-Luc2p-CD64效应细胞上,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y无ADCP作用;阳性对照(CoV2-mhF38-IgG1(o))具有介导ADCP作用且呈剂量相关性,作用的半数有效浓度(EC50)为10.1ng/mL,作用的最大诱导倍数为52.8;REGEN-COV具有ADCP作用,其作用的EC50为5.8ng/mL,作用的最大诱导倍数为13.6;LY-CoV555+CB6具有ADCP作用,作用的EC50为15.7ng/mL,最大诱导倍数为8.3。
13.7 COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合介导的CDC功能
用含0.1% BSA的RPMI 1640培养基重悬293FT-SARS-CoV-2-S细胞(Spike:SARS-CoV-2标准株),50μL,5×104/孔均匀接种于96孔板,随后50μL/孔加入不同浓度的样品,抗体以1:4的比例连续稀释,从50000ng/ml开始稀释9个浓度,然后50μL/孔加入1:4稀释的补体。37℃、5% CO2作用3小时后,每孔加入15μL的WST-8显色液,显色稳定后置酶标仪上于450nm、630nm处测定吸光度。设置检测空白孔B(无细胞)和阴性对照组M(接种细胞,不加样品)。结果以吸光度值(OD450-OD630),并减去检测空白孔B的读值来计算,杀伤率(%)=(阴性对照M组OD值-样品OD值)/阴性对照M组OD值×100%。
如图35所示,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y及对照分子均无CDC作用。
13.8 COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合介导的ADE作用
人源化抗体COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y介导的ADE作用的具体评价方法与实施例6.8大致相同。如图36,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y组合对稳定表达CD32a、CD32b或CD64的CHO细胞几乎无ADE效应,显著低于再生元REGEN-COV分子及礼来的LY-CoV555&CB6分子,临床安全性风险大幅降低。
实施例14:COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合对流行突变株的假病毒中和能力
COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y对流行突变株的假病毒中和能力的检测方法与实施例7大致相同。假病毒中和试验结果表明,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y组合对D614G流行株、关切的变异株VOC(Variant of Concern),如Alpha B.1.1.7,Beta B.1.351,Gamma P.1,Delta B.1.617.2;及关注的变异株VOI(Variant of Interest),EpsilonB.1.429,纽约株B.1.526,Kappa B.1.617.1,Lambda C.37及其它一些国家地区流行突变株如B.1.618,VOC20I/484Q,C.36.3,B.1.214.2等均具有较好的中和活性。因此,COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y组合具有广谱高中和活性。COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y组合对不同毒株的假病毒中和IC50汇总于表26。
表26 COV2-HB27-Fd6-IgG1&COV2-H89Y组合对流行突变株假病毒中和IC50(ng/mL)
实施例15:COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的耐药突变分析
COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的耐药突变分析方法与实施例8大致相同。耐药突变单克隆的分离方法详见实施例8。
结果如表27-29所示,COV2-H89Y&COV2-HB27-Fd6-IgG1组合未产生抗体耐药诱发的突变(RBD区的突变),与阴性对照类似。
表27COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的耐药P1二代测序结果
表28COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合的耐药P2二代测序结果
注:0/0表示纯和且跟REF一致;0/1表示杂合,两个allele一个是ALT一个是REF;1/1表示纯和且都为ALT。百分数表示该位点ALT碱基的reads数在REF与ALT reads数之和中的占比。
表29COV2-HB27-Fd6-IgG1+COV2-H89Y抗体组合耐药突变单克隆分离一代测序结果
序列清单
参考文献
[1].Garcia-Beltran,W.F.,et al.,Circulating SARS-CoV-2variants escapeneutralization by vaccine-induced humoral immunity.medRxiv,2021.
[2].Liu,H.,et al.,The basis of a more contagious 501Y.V1 variant ofSARS-COV-2.bioRxiv,2021.[3].Wibmer,C.K.,et al.,SARS-CoV-2 501Y.V2 escapesneutralization by COVID-19donor plasma.2021.27(4):p.622-625.
[4].Cele,S.,et al.,Escape of SARS-CoV-2 501Y.V2 from neutralizationby convalescent plasma.2021.
[5].Wang,P.and M.S.Nair,Antibody resistance of SARS-CoV-2variantsB.1.351and B.1.1.7.2021.
[6].Wu,K.,et al.,Serum Neutralizing Activity Elicited by mRNA-1273Vaccine.New England Journal of Medicine,2021.384(15):p.1468-1470.
[7].Wang,P.,Increased Resistance of SARS-CoV-2Variant P.1to AntibodyNeutralization.2021.
[8].Greaney,A.J.,et al.,Comprehensive mapping of mutations in theSARS-CoV-2receptor-binding domain that affect recognition by polyclonal humanplasma antibodies.Cell Host Microbe,2021.29(3):p.463-476.e6.
[9].Rachael Pung et al.,Serial intervals observed in SARS-CoV-2B.1.617.2variant cases.MedRxiv 2021
[10].Deng X,Garcia-Knight MA,Khalid MM,et al.Transmission,infectivity,and antibody neutralization of an emerging SARS-CoV-2variantcarrying a L452R spike protein mutation.MedRxiv 2021.
[11].Annavajhala MK,et al.Emergence and Expansion of the SARS-CoV-2Variant B.1.526.MedRxiv 2021
[12].Edara VV,Lai L,Sahoo MK,et al.Infection and vaccine-inducedneutralizing antibody responses to the SARS-CoV-2B.1.617.1variant.BioRxiv2021.
[13].Takuya Tada et al.,The Spike Proteins of SARS-CoV-2B.1.617andB.1.618Variants Provide Partial Resistance to Vaccine-elicited andTherapeutic Monoclonal Antibodies.bioRxiv 2021.05.14.444076
[14]Kabat,E.A.,et al.,Sequences of proteins of immunologicalinterest.1992:DIANE publishing.[15]Jones,P.T.,et al.,Replacing thecomplementarity-determining regions in a human antibody with those from amouse.Nature,1986.321(6069):p.522.
[16]Verhoeyen,M.and L.Riechmann,Engineering of antibodies.BioEssays,1988.8(2-3):p.74-78.
[17]叶鑫,et al.,Cd47 antibody,antigen-binding fragment and medicaluse thereof.2018,Google Patents.
Claims (30)
1.一种分离的、封闭SARS-CoV-2刺突蛋白同ACE2受体的结合抗体或其抗原结合片段,其包含
i)重链可变区,其重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3域分别包含SEQ ID NO:13、14和15,和/或
ii)轻链可变区,其轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3域分别包含SEQ ID NO:10、11和12。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其包含:
i)重链可变区,其序列包含SEQ ID NO:22或与其具有至少85%、88%、90%、95%、98%或99%序列同一性;和/或
ii)轻链可变区,其序列包含SEQ ID NO:23或与其具有至少85%、88%、90%、95%、98%或99%序列同一性。
3.如权利要求1-2之任一所述的抗体或其抗原结合片段,其为人源化抗体、嵌合或鼠源抗体。
4.如权利要求1-3之任一所述的抗体或其抗原结合片段,其抗体恒定区为IgG,IgM,IgA亚型,优选地,
为IgG1、IgG2或IgG4亚型抗体;更优选地
为因其Fc区的氨基酸序列改变造成其与Fc受体和/或C1q补体结合功能降低的IgG1、IgG2或IgG4亚型抗体。
5.如权利要求1-4中任一所述的抗体或其抗原结合片段,其表位包含SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的G476、S477、P479、F486、N487、Y489或T478,优选地,表位包含G476、S477、P479、F486或N487。
6.如权利要求1-5之任一所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体进一步包含:
i)重链恒定区,优选地,其序列包含SEQ ID NO:24或与其具有至少90%、92%、95%、98%或99%序列同一性;和/或
ii)轻链恒定区,优选地,其序列包含SEQ ID NO:25或与其具有至少90%、92%、95%、98%或99%序列同一性。
7.权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段,其耐药突变位点为S477F和/或F486S。
8.权利要求1-6之任一所述的抗体或其抗原结合片段,
a)其与重组SARS-CoV-2RBD的结合亲和力KD平均值为2.2E-12~15.6E-12M,优选3.4E-12~9.3E-12M,更优选为6.8E-12M;和/或
b)其与重组SARS-CoV-2Spike蛋白的结合亲和力KD平均值为0.5E-12~6.6E-11M,优选1.6E-12~4.5E-11M,更优选为2.2E-11M。
9.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段,其经单次静脉注射不同组剂量给予小鼠后,各剂量组动物的Cmax比值为1:3.31:12.17,AUClast比值为1:3.11:7.96,平均半衰期t1/2分别为434.54h、454.43和257.45h。
10.如权利要求1-6的抗体或其抗原结合片段,其
同CD16a几乎不结合;
同CD32a和CD32b不结合;
同CD64不结合;
同C1q不结合;
无ADCC作用;
无ADCP作用;
无CDC作用;
几乎无ADE效应。
11.如权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其为单克隆抗体。
12.如权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗原结合片段包含Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fd片段、Fd'片段、单链抗体分子或单域抗体;其中
单链抗体分子优选包含scFv、di-scFv、tri-scFv、双体抗体或scFab。
13.一种改构抗体-药物分子,其包含如权利要求1-12任一项所述的抗体或其抗原结合片段和与之共价或非共价连接的小分子或生物大分子,优选地通过接头连接。
14.一种核酸,其编码根据权利要求1-12任一项的抗体或其抗原结合片段,其为mRNA和/或DNA。
15.如权利要求14所述的核酸,其包含
i)分别如SEQ ID NO:30所示的重链可变区核苷酸序列和/或如SEQ ID NO:31所示的轻链可变区核苷酸序列;和任选地
ii)分别如SEQ ID NO:32所示重链恒定区核苷酸序列和/或如SEQ ID NO:33所示的轻链恒定区核苷酸序列;
或i)和ii)的变体。
16.一种表达载体,其包含如权利要求14或15所述的核酸。
17.一种宿主细胞,其包含如权利要求14或15所述的核酸或如权利要求16所述的表达载体。
18.一种用于产生如权利要求1-12任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法,其包括在适合于抗体表达的条件下培养如权利要求17所述的宿主细胞,和从培养基中回收表达的抗体。
19.一种药物组合物,其包含
如权利要求1-12任一项所述的抗体或其抗原结合片段或如权利要求13所述的改构抗体-药物分子或如权利要求14-15任一项所述的核酸或如权利要求16所述的表达载体;
药学上可接受的载体;任选地
一种或多种其他治疗剂,优选地,其他治疗剂选自抗病毒药物或炎性因子抑制剂、其他机制的小分子化学药;优选地,抗病毒药物选自包含不限于I型干扰素药物、抗体类、蛋白酶抑制剂类、RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)抑制剂类、靶向宿主的抗病毒类药物。
20.一种药物组合物,其包含两种或两种以上分离的、封闭SARS-CoV-2刺突蛋白同ACE2受体的结合抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段分别包含
i)重链可变区,其重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3域分别包含SEQ ID NO:13、14和15,和/或
轻链可变区,其轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3域分别包含SEQ ID NO:10、11和12;或
ii)重链可变区,其重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3域分别包含SEQ ID NO:43、44和45,和/或
轻链可变区,其轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3域分别包含SEQ ID NO:40、41和42;
以及,药学上可接受的载体;
任选地一种或多种其他治疗剂,优选地,其他治疗剂选自抗病毒药物或炎性因子抑制剂、其他机制的小分子化学药;优选地,抗病毒药物选自包含不限于I型干扰素药物、抗体类、蛋白酶抑制剂类、RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)抑制剂类、靶向宿主的抗病毒类药物。
21.如权利要求20所述的药物组合物,所述两种或两种以上抗体或其抗原结合片段分别包含
i)重链可变区,其序列包含SEQ ID NO:22或与其具有至少85%、88%、90%、95%、98%或99%序列同一性,和/或
轻链可变区,其序列包含SEQ ID NO:23或与其具有至少85%、88%、90%、95%、98%或99%序列同一性;或
ii)重链可变区,其序列包含SEQ ID NO:46或与其具有至少85%、88%、90%、95%、98%或99%序列同一性,和/或
轻链可变区,其序列包含SEQ ID NO:47或与其具有至少85%、88%、90%、95%、98%或99%序列同一性。
22.如权利要求20或21所述的药物组合物,所述两种或两种以上抗体或其抗原结合片段进一步包含
重链恒定区,其序列包含SEQ ID NO:24或与其具有至少90%、92%、95%、98%或99%序列同一性,和/或
轻链恒定区,其序列包含SEQ ID NO:25或与其具有至少90%、92%、95%、98%或99%序列同一性。
23.权利要求20-22任一项所述的药物组合物,
a)其与重组SARS-CoV-2RBD的结合亲和力KD为2.5E-12~16.1E-12M,优选4.5E-12~10.6E-12M,更优选为7.8E-12M;和/或
b)其与重组SARS-CoV-2Spike蛋白的结合亲和力KD为2.2E-11~15.6E-11M,优选7.2E-11~11.4E-11M,更优选为9.2E-11M。
24.如权利要求1-12任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求13所述的改构抗体-药物分子、如权利要求14-15任一项所述的核酸、如权利要求16所述的表达载体、如权利要求19-23之任一项所述的药物组合物,其用于预防和治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病。
25.如权利要求1-12任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求13所述的改构抗体-药物分子、如权利要求14-15任一项所述的核酸、如权利要求16所述的表达载体、如权利要求19-23之任一项所述的药物组合物在用于制备用于预防和治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病的药物中的应用。
26.一种药物组合,其包含
如权利要求1-12任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求14所述的改构抗体-药物分子、如权利要求14-15任一项所述的核酸、如权利要求16所述的表达载体、如权利要求19-23之任一项所述的药物组合物;以及
一种或多种另外的治疗剂。
27.一种试剂盒,其包含
如权利要求1-12任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求13所述的改构抗体-药物分子、如权利要求14-15任一项所述的核酸、如权利要求16所述的表达载体、如权利要求19-23之任一项所述的药物组合物;优选地,
还进一步包含给药的装置。
28.一种预防和治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病的方法,其包含给予受治疗者如权利要求1-12任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求13所述的改构抗体-药物分子、如权利要求14-15任一项所述的核酸、如权利要求16所述的表达载体、如权利要求19-23之任一项所述的药物组合物、如权利要求26所述的药物组合、或如权利要求27所述的试剂盒。
29.一种分离的、封闭SARS-CoV-2刺突蛋白同ACE2受体的结合抗体或其抗原结合片段,其结合表位包含SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的G476、S477、P479、F486、N487、Y489或T478,优选地,表位包含G476、S477、P479、F486或N487。
30.一种SARS-CoV-2刺突蛋白的结合表位,其包含SARS-CoV-2刺突蛋白的G476、S477、P479、F486、N487、Y489或T478,优选地,表位包含G476、S477、P479、F486或N487。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2022100711188 | 2022-01-21 | ||
CN202210071118 | 2022-01-21 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116478281A true CN116478281A (zh) | 2023-07-25 |
Family
ID=87216095
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310088822.9A Pending CN116478281A (zh) | 2022-01-21 | 2023-01-17 | SARS-CoV-2变异株中和抗体的制备及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116478281A (zh) |
-
2023
- 2023-01-17 CN CN202310088822.9A patent/CN116478281A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3134111B1 (en) | Middle east respiratory syndrome coronavirus neutralizing antibodies and methods of use thereof | |
EP4342911A1 (en) | Novel antibodies specifically binding to zika virus epitopes and uses thereof | |
CN110016079B (zh) | 抗呼吸道合胞病毒的中和抗体及其应用 | |
CN110317267B (zh) | 针对狂犬病病毒的双特异性抗体及其用途 | |
JP2019516348A (ja) | 重症熱性血小板減少症候群ウイルスの外膜糖タンパク質に結合する抗体及びその用途 | |
WO2021218879A1 (zh) | Sars-cov-2中和抗体及其制备和应用 | |
WO2021212785A1 (zh) | 一种全人源单克隆抗体及其应用 | |
US20220289828A1 (en) | Human monoclonal antibodies to enterovirus d68 | |
JP2024506315A (ja) | コロナウイルスのスパイクタンパク質を標的とする抗体 | |
EP3110844B1 (en) | Broadly neutralizing monoclonal antibodies against hiv-1 v1v2 env region | |
US20230065377A1 (en) | Human antibodies to alphaviruses | |
CN110088131A (zh) | 抗chikv抗体及其用途 | |
WO2021260532A1 (en) | Stereotypic neutralizing vh clonotypes against sars-cov-2 rbd in covid-19 patients and the healthy population | |
Tsui et al. | Isolation of a neutralizing human RSV antibody from a dominant, non-neutralizing immune repertoire by epitope-blocked panning. | |
EP2731970B1 (en) | Antibodies that are cross-reactive for macrophage migration inhibitory factor (mif) and d-dopachrome tautomerase (d-dt) | |
JP2007014267A (ja) | B型肝炎ウイルスのHBs抗原に対するモノクローナル抗体、それに関連する遺伝子およびペプチド、並びにB型肝炎ウイルスの検定方法、B型肝炎の診断方法、治療方法 | |
WO2022210830A1 (ja) | 抗SARS-CoV-2抗体 | |
CN114072422B (zh) | SARS-CoV-2病毒的中和抗体及其应用 | |
JP2024522670A (ja) | 呼吸器合胞体ウイルスに対する抗体及びその使用 | |
EP2374816B1 (en) | Binding molecules against Chikungunya virus and uses thereof | |
CN116478281A (zh) | SARS-CoV-2变异株中和抗体的制备及应用 | |
RU2803082C2 (ru) | Антитела против вируса гепатита в и их применение | |
US20220251173A1 (en) | Anti-hepatitis b virus antibodies and use thereof | |
WO2021190500A1 (zh) | SARS-CoV-2和SARS-CoV交叉中和抗体的制备及应用 | |
EP4442276A1 (en) | Combined antibodies against sarbecoviruses and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |