CN113087771B - 一种南美白对虾dna结合抗菌肽vpdb40及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种南美白对虾DNA结合抗菌肽VPDB40，其氨基酸序列为GITIQCILPGFVVSKLSKLK，抗菌肽的分子量为2144.686道尔顿。本发明抗菌肽，可有效抑制副溶血性弧菌生长，可作为制备预防或抑制副溶血性弧菌感染的药物。本发明为后续进一步研究南美白对虾抗菌肽作为食品防腐剂和防止虾病的饲料添加剂开发奠定了基础。

Description

一种南美白对虾DNA结合抗菌肽VPDB40及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种南美白对虾DNA结合抗菌肽VPDB40及其应用。

背景技术

南美白对虾作为我国主要的对虾养殖品种，具有很高的经济价值。近年来由于养殖环境恶化及养殖密度过大，导致疾病频发，已经严重威胁到了南美白对虾产业的健康发展，造成了巨大的经济损失，因此，开展对虾疾病防控显得尤为重要。

近年来，一种被称为“对虾早期死亡综合症”的神秘疾病使亚洲多国的养殖虾大量死亡，经证实，其元凶是副溶血弧菌。该细菌经口传播并定植在对虾消化道产生毒素引起组织损坏，并造成对虾肝功能紊乱及消化系统障碍，然后引发虾体死亡。该病病情发展十分迅速，死亡率和排塘率极高，从发病少量到排塘，时间最短仅2-3天。副溶血弧菌也对人类健康构成重大威胁，食用被副溶血弧菌污染的生的或未煮熟的海鲜时，会引起急性胃肠炎。虽然土霉素等抗生素药物对该病控制起到了一定的作用，但也会存在由于滥用，而造成了水体环境恶化、微生物赖药性增加变异出致病性更强、危害更大的致病微生物等问题，使得开发能替代抗生素的抗菌肽变得尤为迫切。

天然抗菌肽(AMPs)，也被称为宿主防御肽，可以直接保护动物免受各种细菌、病毒、真菌和原生动物感染。AMPs是由宿主基因组预先安排并经核糖体合成的前体蛋白/肽蛋白水解裂解后以活性形式产生的。AMPs是先天免疫系统的一个普遍和重要的部分，可以调节促进防止微生物感染。无脊椎动物由于缺乏后天免疫，主要依靠先天性免疫来保护身体免受外界病原体感染。与传统的抗生素相比抗菌肽具有针对性强、无污染、不易产生耐药性等问题。

在南美白对虾或者其他甲壳类动物，已经有许多抗菌肽基因被研究报导，但是本发明在研究过程中发现了新型的DNA结合抗菌肽，目前还尚没有关于其核酸序列、重组蛋白的研究以及应用的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种南美白对虾DNA结合抗菌肽VPDB40及其应用，解决了上述背景技术中的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：提供了一种南美白对虾DNA结合抗菌肽VPDB40，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：

GITIQCILPGFVVSKLSKLK

所述抗菌肽VPDB40的分子量为2144.686道尔顿，所带电荷为+3总疏水性比为50％，圆二色谱测定其二级结构为α螺旋。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：提供了一种南美白对虾DNA结合抗菌肽VPDB40在制备抗菌药物中的应用，该抗菌药物用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：提供了一种抗菌药物，其有效成分包括南美白对虾DNA结合抗菌肽VPDB40，所述抗菌肽VPDB40的氨基酸序列为SEQ IDNO：1。

在本发明一较佳实施例中，所述抗菌药物的有效成分为南美白对虾DNA结合抗菌肽VPDB40，所述抗菌肽VPDB40的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

在本发明一较佳实施例中，所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：提供了一种水产饲料添加剂，其有效成分包括南美白对虾DNA结合抗菌肽VPDB40，所述抗菌肽VPDB40的氨基酸序列为SEQID NO：1。

在本发明一较佳实施例中，所述水产饲料添加剂的有效成分为南美白对虾DNA结合抗菌肽VPDB40，所述抗菌肽VPDB40的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

在本发明一较佳实施例中，所述水产饲料添加剂用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌。

本发明根据DNA结合蛋白的电荷性、疏水性、二级结构等相关结构特点，以南美白对虾DNA结合为目标寻找其序列中的抗菌肽存在可行的理论依据。我们首先将南美白对虾进行制样，将400只健康南美白对虾分为高强度超声组、中强度超声组、低强度超声组和对照组各100只。每只虾注射0.1mL副溶血弧菌(1.0×10^5-6cfu/mL)或等量的氯化钠。在感染24小时后收集活虾，并立即用PBS缓冲液绞碎。取100g离心15min后取上清液，过3000Da滤膜。于-20℃保存，作进一步分析。接着使用高效液相色谱-质谱联用，将样品进行蛋白质序列分析。然后利用APD3和CAMP两个在线服务器根据抗菌肽的电荷性和疏水性对南美白对虾蛋白序列筛选，然后通过Swiss-model服务器对南美白对虾的DNA结合蛋白结构进行预测，发现了对副溶血弧菌具有很强抗菌作用的抗菌肽序列GITIQCILPGFVVSKLSKLK，命名VPDB40，分子量为2144.686Da。圆二色谱测定其二级结构为α螺旋。

抗菌肽VPDB40将从以下作用对细菌造成破坏：抗菌肽VPDB40可以穿透细胞膜的脂质双分子层，然后与细菌基因组DNA相结合，抑制细菌DNA的合成，从而导致细菌死亡。

本发明的抗菌肽可以采用本领域技术人员已知的方法合成，例如固相合成，并采用本领域技术人员已知的方法进行纯化，例如高效液相色谱法。

实施本发明，具有如下有益效果：

本发明通过筛选，发现一个全新氨基酸序列的多肽VPDB40。研究VPDB40对副溶血弧菌的抑菌活性。实验结果表明，该肽对副溶血弧菌具有强烈的抑制作用。它的抑菌机理是首先穿透细菌的细胞膜，然后与细菌基因组DNA相结合，抑制细菌DNA的合成，从而导致细菌死亡。本发明抗菌肽VPDB40可被制成抗菌药物或水产饲料添加剂用于预防或治疗副溶血弧菌病。

附图说明

图1为本发明抗菌肽VPDB40的质谱分析图。

图2为本发明抗菌肽VPDB40对副溶血弧菌最低抑制浓度(MIC)测定测定对照图。

其中，A：抗菌肽浓度0μg/mL；

B：抗菌肽浓度125μg/mL；

C：抗菌肽浓度62.5μg/mL；

D：抗菌肽浓度31.25μg/mL；

E：抗菌肽浓度15.6μg/mL；

F：抗菌肽浓度1.95μg/mL。

图3为本发明抗菌肽VPDB40对副溶血弧菌时间-杀伤曲线(Time kill)图。

在0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液中稀释至10^6-7CFU/mL，抗菌肽浓度为1.95μg/mL。

图4为本发明抗菌肽VPDB40圆二色谱图。

肽VPDB40溶于25mM十二烷基硫酸钠(SDS)中，最终浓度为0.20mg/mL。

图5为本发明抗菌肽VPDB40与副溶血弧菌DNA结合电泳图。

其中，条带7为空白对照；

条带1-6：分别是抗菌肽VPDB40与DNA质量比为100/1，50/1，25/1，25/2，25/4，25/8。抗菌肽VPDB40浓度为62.5μg/mL，DNA浓度为17.982ng/μL。

图6为本发明抗菌肽VPDB40的预测模型结构视图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1南美白对虾DNA结合抗菌肽的质谱分析

首先将南美白对虾进行制样，将400只健康南美白对虾分为高强度超声组、中强度超声组、低强度超声组和对照组各100只。每只虾注射0.1mL副溶血弧菌(1.0×10^5-6cfu/mL)或等量的氯化钠。在感染24小时后收集活虾，并立即用PBS缓冲液绞碎。取100g离心15min后取上清液，过3000Da滤膜。于-20℃保存，作进一步分析。

然后使用色谱Nano Aquity UPLC system(Waters Corp.)仪器进行。进样量为5.0μl，流动相分别是0.1％甲醇水溶液和乙腈。洗脱梯度如表1所示。

表1.本发明抗菌肽洗脱梯度条件表

时间(min)	流速(ml/min)	A(％)	B(％)
				00.00	0.25	98	2
01.00	0.25	98	2
				55.00	0.25	70	30
55.10	0.25	10	90
				60.00	0.25	10	90
60.10	0.25	98	2
				70.00	0.25	98	2

质谱仪器名：Thermo Scientific Q-Exactive，

翘气速率：40mL/min，辅助气速率：10mL/min，

喷雾电压：3.0kV，毛细管温度：300℃，S-lens：50％。

HCD：27％，扫描模式：正离子Full ms→ddms2 Top5。

扫描范围：一级扫描：分辨率70000，范围350～1600m/z。

二级扫描：分辨率17500，fixed first mass 120m/z，Dynamic exclusion:10.0s。

搜库软件：MAXQUANT v1.6.5.0。

数据库：uniprot白脚虾蛋白库Penaeus vannamei(Whiteleg shrimp)(Litopenaeus vannamei)[6689]。

共分析出了如下84个蛋白质序列(表2)。然后利用APD3和CAMP两个在线服务器对南美白对虾蛋白序列筛选，然后通过Swiss-model服务器对南美白对虾的DNA结合蛋白结构进行预测，发现了对副溶血弧菌具有很强抗菌作用的抗菌肽序列GITIQCILPGFVVSKLSKLK，命名VPDB40，分子量为2144.686Da，该肽质谱图见图1。

表2.筛选出的蛋白质信息表

实施例2最低抑制浓度(MIC)测定

将副溶血弧菌在37℃培养12h至对数生长期，在0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液中稀释至10^6-7CFU/mL。将肽溶于磷酸盐缓冲中，37℃等体积与菌混合2h。最低抑菌浓度(MIC)是指在37℃孵育后，从微量滴定板上看不到细菌生长的抗菌肽最低浓度。如图2所示，VPDB40对副溶血弧菌的最低抑菌浓度(MIC)为1.95μg/mL。

实施例3时间-杀菌曲线(Time kill)测定

使用平板菌落计数法测定肽VPDB40的时间-杀菌曲线。将副溶血弧菌在37℃培养12h至对数生长期，在0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液中稀释至10^6-7CFU/mL。将肽溶于磷酸盐缓冲中，并稀释至3.91μg/mL，等体积与菌混合，在37℃孵育。在不同的时间点(即0.5、1、1.5、2、2.5和3时)，获得0.2mL细菌悬液，并在37℃的营养肉汤平板上培养24小时后计数菌落。如图3所示。

实施例4 VPDB40的圆二色谱测定

用Jasco810光谱偏振仪(Jasco，东京)CD在25℃下以100nm/min的扫描速度测定了肽的平均残基摩尔椭圆度。将肽VPDB40溶于25mM十二烷基硫酸钠(SDS)中，最终浓度为0.20mg/mL，然后将肽VPDB40溶液加到1mm石英比色皿中，用两次扫描从190-250nm扫描其光谱，扫描速度为100nm/min。数据以1nm间隔记录。如图4所示。

实施例5 VPDB40与细菌DNA的相互作用

采用DNA凝胶阻滞法研究了VPDB40与副溶血弧菌基因组DNA的相互作用。将副溶血弧菌在37℃的50mL营养肉汤培养基(NB)中培养12h，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA。在260和280nm的光密度比(OD₂₆₀/OD₂₈₀≥1.90)评价提取的基因组DNA的纯度。接下来，将3μL DNA(100ng/μL)与连续量的肽VPDB40在25℃下混合10min，将混合物在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳。使用GelDoc XR凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)在紫外线照射下观察凝胶阻滞，如图5所示。

实施例6 VPDB40的3D结构预测

利用在线结构预测服务器Swiss-model，对南美白对虾DNA结合抗菌肽VPDB40的结构进行预测，并利用Pymol软件进行编辑和修改，得到抗菌肽VPDB40的结构及其在南美白对虾DNA结合蛋白中的空间位置，如图6所示。

综上，本发明提供了一种全新的抗菌肽VPDB40,抗菌肽VPDB40对副溶血弧菌的最低抑菌浓度(MIC)为1.95μg/mL，对副溶血弧菌具有强烈的抑制作用。本发明抗菌肽VPDB40可穿透细菌的细胞膜，与细菌基因组DNA相结合，抑制细菌DNA的合成，从而导致细菌死亡。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

序列表

<110> 集美大学

<120> 一种南美白对DNA结合抗菌肽VPDB40及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 南美对虾(Litopenaeus Vannamei )

<400> 1

Gly Ile Thr Ile Gln Cys Ile Leu Pro Gly Phe Val Val Ser Lys Leu

1 5 10 15

Ser Lys Leu Lys

20

Claims (6)

1.一种南美白对虾DNA结合抗菌肽VPDB40，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的南美白对虾DNA结合抗菌肽VPDB40在制备抗菌药物中的应用,其特征在于：所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌。

3.一种抗菌药物，其特征在于：其有效成分为南美白对虾DNA结合抗菌肽VPDB40，所述抗菌肽VPDB40的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

4.一种水产饲料添加剂剂，其特征在于：其有效成分为南美白对虾DNA结合抗菌肽VPDB40，所述抗菌肽VPDB40的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

5.如权利要求3所述的抗菌药物，其特征在于：所述抗菌药物用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌。

6.如权利要求4所述的水产饲料添加剂，其特征在于：所述水产饲料添加剂用于抑制和/或杀灭副溶血性弧菌。

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