KR101802245B1

KR101802245B1 - 갯지렁이를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101802245B1
Application number: KR1020160106864A
Authority: KR
Inventors: 박찬일; 배진솔; 정지민; 소윤조; 조성환
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2016-08-23
Filing date: 2016-08-23
Publication date: 2017-11-28

Abstract

본 발명의 항균 펩티드의 함량이 증진된 갯지렁이 분말을 사료에 첨가하여 어류에 급이하면, 어류의 혈청 내에 라이소자임 활성을 증가시키며, 스트레스 물질인 코르티졸 함량을 감소시킨다. 또한, 어류의 연쇄구균증(Streptococcal disease) 원인균인 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae)와 에드워드 감염증(Edwardsiellosis)을 유발하는 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda)에 대한 항균 활성을 나타내므로 어류용 사료 첨가제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

갯지렁이를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제 및 이의 용도{Feed additive comprising lugworm as effective component and uses thereof}

본 발명은 갯지렁이를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제 및 이의 용도에 관한 것이다.

오늘날 양식업은 가장 급속히 성장하는 수산업의 한 분야로서 급증하는 수산물의 수요에 따라 세계적으로 경제적 중요성이 인정되고 있다. 우리나라는 삼면이 바다로 이루어져 연안의 거의 모든 면적이 양식업으로 이용되고 있으며, 양식어는 밀도가 높은 사육이나 수질의 악화 등에 의해 면역력이 저하되므로 세균이나 기생충 등의 감염을 받기 쉬운 환경에 처해 있는 경우가 많다.

어류에 발생하는 세균성 질병 중에서 피해규모가 큰 질병은 연쇄구균증(Streptococcal disease), 에드워드 감염증(Edwardsiellosis) 등이 있으며, 연쇄구균증과 관련된 병원체는 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 등 다양한 원인균들이 보고되고 있다. 이러한 원인균 중 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae)는 전 세계의 다양한 어종에 연쇄구균증을 유발하는 전염성 질병의 원인균으로서, 병원성도 강하여 양식어류에 대한 경제적 손실률이 높은 병원체이다. 연쇄구균증의 감염 증상을 보면, 체색흑화(body color darkening), 안구 이상(돌출. 백탁. 충혈), 아가미 퇴색 및 출혈이 나타나며, 중증어(serious illness fish)에서는 복수의 저류에 의한 복부 팽만, 신장과 비장이 종대되어 폐사가 일어난다. 국내에서 이 질병은 해수 어류 양식장에서 수온이 18℃ 이상으로 상승하는 6월에서부터 10월까지의 고수온기에 주로 집단적으로 발병하여 50% 이상의 급성폐사를 일으키며, 치어에서 성어에 이르기까지 연령에 관계없이 감염된다.

에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda)는 다양한 해수 및 담수 어종에서 에드워드 감염증(Edwardsiellosis)을 유발하는 주요한 어류 병원성 세균이며, 특히 넙치 등 우리나라 주요양식 어종에서 발생하는 심각한 질병의 원인균이기도 하다. 에드워드시엘라 타르다(E. tarda)는 해산 어류인 대서양 연어, 넙치, 농어, 숭어, 방어, 참돔 및 감성돔 등과 담수어인 잉어, 금붕어, 무지개송어, 틸라피아, 메기, 뱀장어 등에서 검출되었다. 에드워드시엘라 타르다가 감염된 넙치의 에드워드 감염증은 복부팽만 탈장 등의 증상을 나타내고 간장이나 신장 등에 농창이 형성되어 있으며 때로는 등지느러미 쪽의 근육 내 농이 관찰되기도 한다. 에드워드시엘라 타르다는 식세포에 대한 저항력이 강하므로 백혈구인 호중구 내에서도 증식해 쉽게 치유되지 않으므로 우리나라 넙치양식 산업에 상당한 피해를 주고 있는 실정이다.

이에, 상기와 같은 질병예방 및 치료의 문제점에 대한 대책으로 항생제를 사용하고 있다. 항생제는 세계적으로 대단히 넓은 시장이 있는 반면, 현재 기존의 항생제에 대하여 내성을 가지는 강한 균주의 발생 및 기존 항생제의 부작용 등으로 인하여 새로운 항생제의 개발이 요구된다. 이에, 부작용이 비교적 적은 친환경적인 항생제 대체물질에 대한 관심과 연구가 점차 증가되고 있는 실정이다.

한편, 갯지렁이는 갯지렁이과의 환형동물로, 주로 갯벌에 서식하면서 저질의 해수 소통을 원활하게 하고 유기물을 소비하는 등 갯벌의 정화에 주요한 역할을 하고 있다. 이러한 갯지렁이는 보통 낚싯밥으로 많이 사용되는데, 지금까지 자연채취에 의해 생산되었으며, 두토막눈썹참갯지렁이(일명 청충, 청거시 또는 청개비) 또는 바위털갯지렁이(Marphysa sanguinea, 일명 본충 또는 혼무시)가 주 대상이었다. 일반적으로 갯지렁이의 이용은 주로 낚시의 미끼에 한정되고 있으나 바위털갯지렁이와 같은 종은 해삼이나 양식 생물의 먹이로 활용되고 일부 종은 화장품의 원료로도 활용되고 있다.

한편, 한국등록특허 제1433451호에는 갯지렁이를 이용한 물고기 사료 제조방법에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1358617호에는 지렁이 분말을 유효성분으로 하는 뱀장어 양식용 사료조성물에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 갯지렁이를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제 및 이의 용도에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 8종의 면역반응 유도물질들을 갯지렁이에 주사하여 이 중에 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 펩티도글리칸이 항균 펩티드인 아레니신-1(arenicin-1)의 발현량을 가장 많이 증가시키는 것을 확인하였으며, 상기 펩티도글리칸으로 면역유도된 갯지렁이를 분말로 제조한 후 사료 내에 첨가하여 넙치와 조피볼락에 급이한 결과, 넙치와 조피볼락 혈청 내에 면역활성 평가지수로 사용되는 라이소자임 활성 증가로 인해 면역활성 증진효과를 보였으며, 스트레스 물질인 코르티졸 함량도 감소시키는 효과를 나타내었다. 또한, 어류의 연쇄구균증(Streptococcal disease) 원인균인 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae)와 에드워드 감염증(Edwardsiellosis)을 유발하는 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda)에 대한 항균 활성을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 항균 펩티드(antimicrobial peptide)의 함량이 증진된 갯지렁이를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 사료첨가제를 배합한 어류용 사료조성물을 제공한다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 갯지렁이 체내에 총 8종의 면역유도 물질들을 주사하였을 때, 아레니신-1(arenicin-1)의 발현 양상을 나타낸 결과이다. 1은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 펩티도글리칸이며, 2는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래의 펩티도글리칸이며, 3은 메타노박테리움 속(Methanobacterium sp.) 유래의 펩티도글리칸이며, 4는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 펩티도글리칸이며, 5는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 유래의 펩티도글리칸이며, 6은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 펩티도글리칸이며, PBS는 펩티도글리칸 실험군에 대한 음성대조군이며, Sh는 새우 껍질 유래의 키토산이며, Cr은 게 껍질 유래의 키토산이며, 아세트산은 키토산 실험군에 대한 음성대조군을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 펩티도글리칸으로 면역유도된 청개비(청갯지렁이) 추출물의 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae)에 대한 항균 활성을 나타낸 결과이다. Bn은 면역유도된 청개비 추출물을 나타낸 것이며, Ri는 면역유도된 참갯지렁이 추출물을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 넙치(flatfish)에 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 펩티도글리칸으로 면역유도된 청개비 추출물(F-Bi)과 참갯지렁이 추출물(F-Rn)을 처리하였을 때, 용혈 활성을 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 조피볼락(rockfish)에 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 펩티도글리칸으로 면역유도된 청갯지렁이 추출물(R-Bi)과 참갯지렁이 추출물(R-Rn)을 처리하였을 때, 용혈 활성을 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 펩티도글리칸으로 면역유도된 갯지렁이 분말(0.05, 0.1, 0.5 및 1%)이 첨가된 사료를 넙치에 급이한 후 넙치 혈청 내의 면역활성 평가지수로 사용되는 라이소자임 활성을 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 펩티도글리칸으로 면역유도된 갯지렁이 분말(0.05, 0.1, 0.5 및 1%)이 첨가된 사료를 조피볼락에 급이한 후 조피볼락 혈청 내의 면역활성 평가지수로 사용되는 라이소자임 활성을 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 펩티도글리칸으로 면역유도된 갯지렁이 분말(0.05, 0.1, 0.5 및 1%)이 첨가된 사료를 넙치에 급이한 후 넙치 혈청 내의 코르티졸(cortisol) 농도를 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 펩티도글리칸으로 면역유도된 갯지렁이 분말(0.05, 0.1, 0.5 및 1%)이 첨가된 사료를 조피볼락에 급이한 후 조피볼락 혈청 내의 코르티졸(cortisol) 농도를 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 펩티도글리칸으로 면역유도된 갯지렁이 분말(0.05, 0.1, 0.5 및 1%)이 첨가된 사료를 급이한 넙치 복강에 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 병원균을 인위감염시킨 후 10일 동안 누적폐사율을 측정한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따른 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 펩티도글리칸으로 면역유도된 갯지렁이 분말(0.05, 0.1, 0.5 및 1%)이 첨가된 사료를 급이한 조피볼락 복강에 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae) 병원균을 인위감염시킨 후 10일 동안 누적폐사율을 측정한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항균 펩티드(antimicrobial peptide)의 함량이 증진된 갯지렁이를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 항균 펩티드의 함량 증진은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 펩티도글리칸(peptidoglycan)을 갯지렁이 체내에 주입하여 유도된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 항균 펩티드는 아레니신-1(arenicin-1)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 사료첨가제는 면역활성을 증가시키고 스트레스 물질을 감소시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 스트레스 물질은 코르티졸(cortisol)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 사료첨가제는 어류용일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 어류는 우럭, 민어, 숭어, 능성어, 뱀장어, 광어, 넙치 또는 조피볼락일 수 있으며, 바람직하게는 넙치 또는 조피볼락일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 "면역유도" 용어는 면역활성을 증진시키는 것으로, 갯지렁이 체내에 면역유도 물질을 처리하여 면역활성물질을 증가시키는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 사료첨가제는 추가적으로 어류에 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 사료첨가제를 그대로 또는 공지의 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 사료첨가제는 어류용 사료조성물 100 중량부에 대하여 0.01~10 중량부로 배합되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 0.03~5 중량부로 배합되는 것일 수 있으며, 더 바람직하게는 0.1~0.5 중량부로 배합되는 것 일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.

상기 사료조성물에는 탄수화물, 단백질, 지방, 무기질, 비타민, 광물질 및 물과 같은 사료에 통상적으로 첨가되는 성분들이 포함될 수 있다. 이러한 각 성분의 종류에 있어서 특별히 제한되는 바가 없으며, 당 분야에서 통상적으로 사용되는 것은 모두 사용 가능하다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

실시예 1. 갯지렁이 체내의 항균 펩티드 함량을 증진시키기 위한 면역유도 물질 선정

하기 표 1에 개시한 바와 같이 다양한 미생물로부터 6종의 펩티도글리칸과 새우 및 게의 껍질로부터 2종의 키토산을 분리하여 이를 농도별로 준비하였으며, 이를 어패류에 감염되는 바이러스 등의 질병 감염실험(PCR 기법)을 통해 선발된 SPF(specific pathogens free) 갯지렁이의 체내에 각각 주입하였다. 주입한 후 18시간 동안 갯지렁이의 면역반응을 유도하여 펩티도글리칸 및 키토산의 면역반응 유도효과를 확인하였다. 먼저, 면역유도된 갯지렁이 체액으로부터 총 RNA를 추출한 후, cDNA를 합성하여 NCBI에 등록된 갯지렁이의 항균펩타이드 아레니신-1(arenicin-1)의 mRNA 염기서열에 기초하여 디자인한 프라이머(F: 5´-GCCAGGGCAAATCAGTGT-3´(서열번호 1), R: 5´-GTAACGCACCAG CACACCT-3´(서열번호 2))를 이용하여 real time RT-PCR 분석을 수행하였다. 또한, 면역유도된 갯지렁이의 항균 활성을 측정하기 위해, 면역유도된 갯지렁이 추출물을 0.2μm 필터로 여과한 후, 동결건조 및 농축하여 멸균 2차 증류수로 100㎍/㎕으로 현탁한 후, 페이퍼 디스크(paper disc)에 흡수시켰다. 각 병원균이 평판도말된 BHIA(brain heart infusion agar)에 상기 페이퍼 디스크를 부착한 후 27℃에서 24시간 동안 배양하여 저지대(inhibition zone)를 측정하였다.

그 결과, 도 1에 개시한 바와 같이 총 8종의 면역유도 물질 중 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)로부터 분리한 펩티도글리칸(하기 표 1의 No.6)을 갯지렁이 체내에 주사하였을 때, 아레니신-1(arenicin-1)의 발현량이 가장 많이 증가하였으며, 어류의 연쇄구균증(Streptococcal disease) 원인균인 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae)에 대한 항균 활성을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명의 최적의 면역반응 유도물질로 선정하였다(도 2).

본 발명에 사용된 면역반응 유도물질

No.	면역반응 유도물질	유래	용매
1	펩티도글리칸	바실러스 서틸리스 (Bacillus subtilis)	PBS
2	펩티도글리칸	스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)	PBS
3	펩티도글리칸	메타노박테리움 속 (Methanobacterium sp.)	PBS
4	펩티도글리칸	사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae)	PBS
5	펩티도글리칸	스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.)	PBS
6	펩티도글리칸	마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus)	PBS
7	키토산	새우 껍질	0.1M 아세트산
8	키토산	게 껍질	0.1M 아세트산

실시예 2. 면역유도된 갯지렁이 추출물의 어류 혈구 용혈성( hemolysis activity) 분석

넙치(Paralichthys olivaceus) 및 조피볼락(Sebastes schlegelii)의 미부정맥으로부터 헤파린(heparin)을 처리한 주사기로 채혈한 후, RPMI 1640 배지(Invitrogen, Caelsbad, USA)에 첨가하여 원심분리(400g 및 20분)하였으며, 적혈구만을 수거하여 1×PBS로 1회 세척한 후 재현탁(10% in 1×PBS)하였다. 면역유도된 갯지렁이 추출물 20㎕을 PBS에 2배씩 단계적으로 희석하여 사용하였으며, 음성대조군으로 PBS(0% 용혈) 20㎕, 양성대조군으로 0.2% Triton-X(100% 용혈) 20㎕를 사용하였다. 상기 재현탁된 적혈구 80㎕와 갯지렁이 추출물(또는 대조군) 20㎕를 96 웰-플레이트에서 혼합하여 37℃에서 30분 동안 배양하였으며, 배양액을 원심분리한 후 상층액만을 수거하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 용혈률은 대조군과 비교하여 백분율(%)로 나타내었다.

넙치의 적혈구에 대한 갯지렁이 추출물의 용혈성을 분석한 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 면역유도된 청개비(청갯지렁이) 추출물의 경우, 0.5mg까지 100%의 용혈률을 보였으며, 점차 감소하여 0.063mg 이하에서는 용혈을 일으키지 않았다. 또한, 면역유도된 홍거시(참갯지렁이) 추출물의 경우에도 0.5mg까지는 100%의 용혈률을 보였으며, 점차 감소하여 0.031mg 이하에서는 용혈을 일으키지 않았다. 넙치 적혈구에 대한 2종의 갯지렁이 추출물의 용혈 활성은 유사한 것으로 보였으며, 0.031~0.063mg 이상의 갯지렁이 추출물이 넙치에 투여될 경우 세포독성을 일으킬 가능성이 있는 것으로 판단된다.

또한, 조피볼락의 적혈구에 대한 갯지렁이 추출물의 용혈능을 분석한 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 면역유도된 청개비(청갯지렁이) 추출물은 0.125mg까지 100%의 용혈률을 보였으며, 점차 감소하여 0.008mg 이하에서는 용혈을 일으키지 않았다. 면역유도된 홍거시(참갯지렁이) 추출물도 마찬가지로 0.125mg까지는 100%의 용혈률을 나타내었으며, 0.008mg 이하에서는 용혈을 나타내지 않았다. 조피볼락에 대한 2종의 갯지렁이 추출물의 용혈 활성은 유사한 것으로 보였으며, 0.008~0.031mg 이상의 추출물이 조피볼락 체내로 투여될 시 세포독성을 일으킬 가능성이 있는 것으로 판단된다.

하지만, 이 용혈 활성 분석에 사용된 면역 유도된 갯지렁이의 추출물은 농축된 물질이며, 사료에 첨가할 것은 면역 유도된 갯지렁이를 동결건조시켜 제작된 분말이므로 어류의 체내에서 독성은 나타내지 않을 것으로 판단된다.

실시예 3. 본 발명의 항균 펩티드 함량이 증진된 갯지렁이 분말의 사료 내 첨가에 따른 넙치 및 조피볼락 사육

경남 통영시에 위치한 해연수산에서 넙치 치어 및 조피볼락 치어를 구입하여 유수식 아크릴 1톤 수조에 수용한 후 사육실험 환경에 약 3주일 동안 적응시켰다. 적응기간 동안에 상업용 넙치 및 조피볼락 배합사료(CJ사료)를 어체의 2~4% 가량 1일 2회 매일 공급하였으며, 사육실험 환경에 적응시킨 이후 비슷한 크기의 치어를 15개의 250L 원형 유수식 플라스틱 수조에 80마리(넙치: 마리당 개체 평균무게±SD: 6.7±0.38g, 조피볼락: 마리당 개체 평균무게±SD: 19.2±0.90g)씩 임의로 각각 분산 수용하였으며, 각 수조에 충분한 포기를 해주었다. 넙치 및 조피볼락 사육을 위한 배합사료에서 총 5개의 실험군을 두었으며, 어분과 발효대두박을 실험용 사료 내 주요 단백질원으로, 소맥분을 주요 탄수화물원으로, 오징어 간유와 대두유를 주요 지질원으로 공급하였다.

본 발명의 항균 펩티드 함량이 증진된 갯지렁이 분말의 사료 내 첨가에 따른 효과를 확인하기 위해, 항균 펩티드 함량이 증진된 갯지렁이 분말을 0.05, 0.1, 0.5 및 1%로 사료 내에 각각 첨가하여 사료로 사용하였으며, 대조군으로 상기 항균 펩티드 함량이 증진된 갯지렁이 분말을 첨가하지 않은 사료를 사용하였다. 갯지렁이 분말이 포함된 사료원료 혼합물과 물을 3:1의 비율로 잘 혼합하여 실험사료를 제조하였으며, 실험은 3번 반복 실시하였다. 사료는 1주일에 7일 동안 1일 2회(09:00 및 16:00)씩 만복 시까지 각각의 사료를 공급하였으며, 사육실험은 총 8주간 실시하여 폐사한 개체는 관찰 즉시 무게 측정 후 제거하였다. 유수량은 각 수조 당 1.44 L/min이었고, 1일 2회 전량 환수를 통하여 배설물을 깨끗하게 제거하고, 실험기간 동안의 사육 수온은 18∼24.1℃(mean±SD: 21.2±1.60℃)으로 설정하였다.

실시예 4. 본 발명의 항균 펩티드 함량이 증진된 갯지렁이 분말의 사료 내 첨가에 따른 효과 및 안전성 검증

본 발명의 항균 펩티드 함량이 증진된 갯지렁이 분말이 첨가된 사료를 급이한 각 실험군의 수조로부터 1, 3, 5 및 8주차에 실험군 개체 3마리씩 수거한 후 증중량 및 체장을 측정하였으며, 수거된 실험군 개채로부터 채혈하여 상온에서 1시간 방치한 후 원심분리(7000g 및 20분)하여 혈청을 분리한 후 하기 실험에 사용하였다.

(1) 혈청화학 성분 측정

본 발명의 항균 펩티드 함량이 증진된 갯지렁이 분말(0.05, 0.1, 0.5 및 1%)을 첨가한 사료가 실험군의 체내에 미치는 독성 영향을 평가하기 위해, 혈장화학성분으로서 GLU(glucose), AST(aspartate aminotransferase, 아스파르테이트 아미노전이요소, GOT, glutamic oxalacetic transaminase), ALT(alanine aminotransferase, 알라닌 아미노전이요소, GPT, glutamic pyruvate transaminase) 및 TCHO(total cholesterol)의 성분을 DRI-CHEM 4000i(Fujifilm, Japan) 및 FUJI DRI-CHEM SLIDE(Fujifilm, Japan)를 이용하여 측정하였다. 넙치와 조피볼락의 혈청화학성분을 측정한 결과, 하기 표 2 및 3에 개시한 바와 같이 GLU, AST, ALT 및 TCHO 모든 혈장화학성분이 대조군(Con, 0%)과 비교하여 유의한 차이를 나타내지 않았다. 이러한 결과를 통해 각 농도별로 준비한 면역유도된 갯지렁이 분말을 사료에 첨가하였을 때, 실험군 개체의 혈장화학성분 변화에 영향을 미치지 않은 것으로 판단된다.

넙치의 혈청화학 성분 측정 결과

	Con	사료 내의 면역유도된 갯지렁이 분말 함량(%)
GLU	Con	0.05%	0.1%	0.5%	1%
1주	2.8±0.6	2.8±0.6	3.0±0.5	2.8±0.4	3.2±0.6
3주	4.0±0.7	3.8±0.4	3.1±0.3	3.8±0.7	3.4±0.5
5주	3.6±0.5	4.2±0.7	3.6±0.5	3.8±0.7	3.8±0.4
8주	3.3±0.5	3.5±0.5	3.9±0.6	3.2±0.4	3.6±0.5
GPT	Con	0.05%	0.1%	0.5%	1%
1주	6.5±1.1	7.0±1.6	7.3±1.4	7.1±1.8	6.9±1.4
3주	5.4±0.5	5.3±0.5	6.1±0.6	5.2±1.1	5.4±1.0
5주	5.8±1.0	5.5±0.5	5.8±0.6	5.0±0.8	6.4±0.5
8주	5.3±0.7	5.7±0.7	5.7±0.8	5.8±0.7	5.9±0.6
GOT	Con	0.05%	0.1%	0.5%	1%
1주	13.3±1.5	16.8±1.5	11.5±1.7	14.8±0.7	13.5±2.3
3주	7.5±1.5	8.8±2.0	9.5±1.7	8.6±1.6	9.8±2.7
5주	11.2±1.9	10.0±0.0	12.2±1.1	10.3±2.2	12.3±1.5
8주	7.1±1.2	7.6±0.8	8.3±1.5	7.5±1.0	7.5±1.3
TCHO	Con	0.05%	0.1%	0.5%	1%
1주	17.6±1.6	17.3±0.5	14.4±1.4	14.1±1.9	14.9±1.7
3주	21.4±1.8	24.2±1.2	25.4±0.5	21.3±1.6	19.1±2.0
5주	19.7±1.2	15.7±2.1	19.7±4.2	12.0±2.4	19.0±1.6
8주	19.6±2.0	20.0±1.9	18.4±1.3	23.3±0.9	20.0±1.6

조피볼락의 혈청화학 성분 측정 결과

	Con	사료 내의 면역유도된 갯지렁이 분말 함량(%)
GLU	Con	0.05%	0.1%	0.5%	1%
1주	2.9±0.6	3.0±1.1	2.9±0.9	2.9±0.6	2.7±0.7
3주	3.0±0.9	2.8±0.6	3.7±1.1	3.1±0.9	3.2±0.8
5주	2.1±0.3	3.0±0.7	2.9±1.0	3.2±1.1	2.9±1.0
8주	3.1±0.6	2.8±0.6	2.6±0.5	3.7±1.2	3.3±1.4
GPT	Con	0.05%	0.1%	0.5%	1%
1주	6.4±1.5	5.4±1.3	5.3±1.3	6.9±1.2	5.8±1.3
3주	6.1±1.0	7.3±1.6	7.8±1.3	6.7±1.7	7.4±1.9
5주	5.9±0.7	9.0±1.8	6.4±0.9	7.4±1.8	8.3±1.6
8주	5.8±0.8	5.8±0.8	6.4±1.0	6.4±0.9	7.7±1.2
GOT	Con	0.05%	0.1%	0.5%	1%
1주	20.0±4.5	19.0±2.4	18.0±7.4	18.0±2.8	15.3±5.2
3주	20.0±2.4	20.3±5.4	26.3±4.2	20.4±3.6	51.4±3.3
5주	18.4±3.4	17.3±2.9	18.4±4.1	25.5±4.4	25.5±1.8
8주	16.0±1.6	19.6±2.1	26.9±6.2	25.7±5.2	25.7±3.9
TCHO	Con	0.05%	0.1%	0.5%	1%
1주	17.8±1.9	19.5±1.7	21.0±1.7	17.6±1.2	19.5±1.5
3주	18.2±1.7	18.6±1.6	24.0±1.4	19.3±1.3	17.9±1.8
5주	18.9±1.7	21.2±2.8	19.7±1.2	18.4±1.9	17.0±1.1
8주	18.8±1.9	17.0±1.6	20.7±0.5	13.8±0.7	15.1±2.0

(2) 혈청 내의 라이소자임 ( lysozyme ) 변화 분석

본 발명의 항균 펩티드 함량이 증진된 갯지렁이 분말(0.05, 0.1, 0.5 및 1%)을 첨가한 사료가 실험군 개체의 선천적 면역(innate immunity)에 미치는 영향을 분석하기 위해, 면역활성 평가지수로 사용되는 혈청 내의 라이소자임(lysozyme) 활성 변화를 분석하였다. 라이소자임 활성 측정은 랭에 등의 방법(Lange et al., 2001., Fish&Shellfish immunol., 11, 523-535)에 따라 실시하였으며, 마이크로코커스 라이소데익티커스(Micrococcus lysodeikticus)를 PBS에 0.4mg/ml로 현탁한 후, 샘플링된 혈청과 혼합하여 1시간 동안 5분 간격으로 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 도 5에 개시한 바와 같이 본 발명의 항균 펩티드 함량이 증진된 갯지렁이 분말이 첨가된 사료를 급이한 후 3주차에 항균 펩티드 함량이 증진된 갯지렁이 분말이 0.1%, 0.5% 및 1% 첨가된 실험군에서 각각 라이소자임 활성이 1.43, 1.43 및 1.20으로 대조군(0.59)과 비교하여 유의적으로 높게 나타났으며, 특히 0.1%의 실험군에서는 8주차(1.86)에서도 유의적으로 높은 활성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 하기 조피볼락의 병원체 인위감염 시 누적폐사율을 확인한 결과와 일치하며, 0.1%의 면역유도된 갯지렁이 분말이 첨가된 사료 급이가 넙치 혈청 내의 라이소자임 활성을 향상시킬 수 있고, 선천면역에 긍정적 영향을 미칠 수 있을 것으로 판단된다.

또한, 조피볼락 혈청 내의 라이소자임을 측정한 결과, 도 6에 개시한 바와 같이 면역유도된 갯지렁이 분말이 0.5% 첨가된 사료를 급이한 실험군에서 3주차 및 5주차에 각각 혈청 내 라이소자임 활성이 1.16 및 2.34로서 대조군(3주차, 5주차 각각 0.53, 0.80)과 비교하여 유의적으로 높게 나타났으며, 특히 0.5%의 실험군에서는 5주차(2.25)에서도 유의적으로 높은 활성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 그 외에 다른 실험군에서는 대조군과 비교하여 유의적인 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 하기 조피볼락의 병원체 인위감염 시 누적폐사율을 확인한 결과와 일치하며, 0.5%의 면역유도된 갯지렁이 분말이 첨가된 사료 급이가 조피볼락 혈청 내의 라이소자임 활성을 향상시킬 수 있고, 선천면역에 긍정적 영향을 미칠 수 있을 것으로 판단된다.

(3) 혈청 내 코르티졸 ( cortisol ) 변화 분석

본 발명의 항균 펩티드 함량이 증진된 갯지렁이 분말(0.05, 0.1, 0.5 및 1%) 첨가 사료를 급이한 실험군에게 미치는 스트레스 영향을 분석하기 위해, 혈청 내의 코르티졸 변화를 분석하였다. 그 결과, 도 7에 개시한 바와 같이 넙치의 경우 0.1%의 갯지렁이 분말이 첨가된 사료를 급이한 실험군의 5주차와 8주차에서 코르티졸 함량이 각각 0.005 및 0.003ng/ml로 대조군(0.012 ng/ml)과 비교하여 현저하게 낮은 반면, 1%의 갯지렁이 분말이 첨가된 사료를 급이한 실험군에서는 8주차의 혈청 내 코르티졸 농도가 0.032ng/ml로 대조군과 비교하여 유의적으로 높게 측정되었다. 따라서 0.1%의 면역유도된 갯지렁이 분말이 첨가된 사료가 넙치의 스트레스를 감소시킬 수 있을 것으로 판단되지만, 1%의 면역유도된 갯지렁이 분말을 첨가한 사료를 8주 이상 장기간 급이할 시 대상 어류의 스트레스를 증가시킬 것으로 판단된다.

조피볼락의 경우, 0.5%의 면역유도된 갯지렁이 분말이 첨가된 사료를 급이한 실험군에서 8주차에 혈청 내 코르티졸의 농도가 0.333ng/ml로서 대조군(0.828)과 비교하여 매우 낮았으며, 그 외에 8주차에 0.05%, 0.1% 및 1% 실험군에서의 혈청 내 코르티졸 농도는 각각 0.486, 0.512 및 0.587ng/ml로 대조군보다 낮게 측정되었다. 본 발명의 면역유도된 갯지렁이 분말의 첨가가 조피볼락의 혈청 내 코르티졸 농도를 감소시키는데 크게 기여할 수 있을 것이며, 특히 0.5%로 사료 내에 첨가하는 것이 가장 적합하다고 판단된다.

(4) 병원균 인위감염 후 누적폐사율 조사

본 발명의 항균 펩티드 함량이 증진된 갯지렁이 분말(0.05, 0.1, 0.5 및 1%) 첨가 사료를 8주간 공급받으며 성장한 넙치와 조피볼락에 병원균을 인위감염시킨 후 실험군 개체의 누적폐사율을 조사하고 항균펩타이드의 면역성 개선효과를 분석하였다. 50마리의 넙치 복강에 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda , 6×10⁵cfu/ml)를 100㎕씩 주사하였으며, 30마리의 조피볼락 복강에 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae , 5×10⁶cfu/ml)를 100㎕씩 주사하였다. 그리고 10일간 누적폐사율을 확인하였다. 그 결과, 도 9에 개시한 바와 같이 넙치의 경우 0.1%의 면역유도된 갯지렁이 분말이 첨가된 사료를 급이한 실험군에서 10일차 누적폐사율이 62.22%로 대조군(81.85%)과 비교하여 유의적으로 낮게 나타났으며, 1%의 면역유도된 갯지렁이 분말을 첨가한 사료를 급이한 실험군에서는 10일차 누적폐사율이 82.22%로 유의적인 차이는 없었지만, 대조군보다 더 높은 폐사율을 나타내었다. 0.1%를 제외한 다른 실험군에서는 0.05% 및 0.5%의 실험군에서 10일차 누적폐사율이 각각 71.1% 및 74.44%로 대조군과 유의적인 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과를 통해, 면역유도된 갯지렁이 분말을 0.1% 첨가한 사료 급이 시, 에드워드시엘라 타르다(E. tarda) 감염에 대한 넙치의 폐사를 감소시킬 수 있을 수 있으며, 그 이상의 농도로 첨가할 시 오히려 병원체감염에 대한 폐사율을 증가시킬 것으로 판단된다.

조피볼락의 경우, 0.5%의 면역유도된 갯지렁이 분말이 첨가된 사료를 급이한 실험군에서 10일차 누적폐사율이 58.97%로 대조군(79.24%)과 비교하여 유의적으로 낮게 측정된 반면, 0.1%의 면역유도된 갯지렁이 분말이 첨가된 사료를 급이한 실험군에서는 10일차 누적폐사율이 84.57%로 대조군보다 높았다. 그 외에 0.05% 및 1%의 실험군에서 10일차 누적폐사율은 각각 70.68% 및 77.80%를 보였다. 상기 결과를 통해, 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae) 감염에 대한 조피볼락의 폐사를 감소시킬 수 있는 면역유도된 갯지렁이 분말의 농도는 0.5%가 적합하다고 판단된다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Feed additive comprising lugworm as effective component and uses thereof <130> PN16251 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gccagggcaa atcagtgt 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gtaacgcacc agcacacct 19

Claims

항균 펩티드(antimicrobial peptide)의 함량이 증진된 갯지렁이를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제로서, 상기 항균 펩티드의 함량 증진은 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 유래의 펩티도글리칸(peptidoglycan)을 갯지렁이 체내에 주입하여 유도된 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
삭제
제1항에 있어서, 상기 항균 펩티드는 아레니신-1(arenicin-1)인 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제1항에 있어서, 상기 사료첨가제는 면역활성을 증가시키고, 스트레스 물질을 감소시키는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제4항에 있어서, 상기 스트레스 물질은 코르티졸(cortisol)인 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제1항에 있어서, 상기 사료첨가제는 어류용인 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제1항, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 사료첨가제를 배합한 어류용 사료조성물.
제7항에 있어서, 상기 사료첨가제는 어류용 사료조성물 100 중량부에 대하여 0.01~10 중량부로 배합되는 것을 특징으로 하는 어류용 사료조성물.