KR20010071331A

KR20010071331A - 갑각류 또는 어류용 사료첨가제 및 사료

Info

Publication number: KR20010071331A
Application number: KR1020007013326A
Authority: KR
Inventors: 겐이치로 소마; 유키노리 다카하시; 미즈노덴이치
Original assignee: 겐이치로 소마; 고바야시 유키오; 유키노리 다카하시; 다이호야쿠힌고교 가부시키가이샤
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 2000-03-23
Publication date: 2001-07-28
Also published as: AU3325700A; AU757122B2; TWI272914B; CN1306399A; CA2333160C; WO2000057719A1; EP1082908A4; ATE440502T1; ES2330300T3; EP1082908B1; AU757122C; DE60042807D1; KR100400352B1; EP1082908A1; CN100473284C; CA2333160A1

Abstract

그램 음성의 미생물 균체로부터 얻어지고, 단백질 마커를 사용하여 SDS-PAGE법으로 측정한 분자량이 5000±2000으로, 고분자량 지질다당류를 실질적으로 포함하지 않는, 저분자량 지질다당류를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 면역부활, 감염증예방 효과를 갖는 갑각류 또는 어류용 사료첨가제 및 그것을 첨가하는 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류용 사료.

Description

갑각류 또는 어류용 사료첨가제 및 사료{ADDITIVES FOR CRUSTACEAN OR FISH FEEDS AND FEEDS}

근년, 갑각류나 어류의 양식산업이 발전함에 따라 세균병 및 바이러스병이 다발하고, 심대한 경제적 피해를 초래하고 있다. 갑각류나 어류의 질병에 대하여는 보리새우의 급성 바이러스 혈증, 비브리오병, 방어의 유결절증, 장구균증, 은어의 냉수병, 슈우도모나스병, 참돔, 잿방어, 방어 등의 이리드 바이러스 감염증 등의 발생이 많고, 경제적 피해가 크다.

이들의 병중 세균성 질병에 대하여는 치료약으로서 항생물질이나 합성항균제가 사용되고 있지만, 항균성 물질에 대한 내성균이 출현하여, 충분한 치료효과를 얻지 못하고 있다. 또 사용한 약제의 갑각류, 어류의 잔류에 의한 공중위생상의 문제가 생기고 있으므로, 화학요법에 의존하지 않고 예방대책이 강하게 요망되고 있다. 한편, 갑각류 및 어류의 바이러스병에 대하여는 백신이나 치료약이 개발되어 있지않고, 병이 여전히 다발하고 있는 상황에 있다.

갑각류 및 어류의 면역기능의 증강과 감염증의 예방을 목적으로, 비피더스 박테리움·서모필럼 유래의 펩티드글리칸(일본 특허 제2547371호 공보) 바실루스속 등 그램 양성균의 세포벽성분(일본 특공평 3-173826호 공보), 치마버섯 유래의 β-1,3-글루칸(일본 특공평 제6-65649호 공보) 등의 다당류를 이용하는 것은 이미 알려져 있다. 또, 고분자량 지질다당류가 어류의 면역기능을 활성화하는 것은 이미 보고되어 있다(Salati, F. and R. Kusuda 일본 수산학회지, 53권, 201∼ 204면, 1987년)(Odean, M. J. 등, Infection and Immunity, 58권, 427∼432면, 1990년).

본 발명에서 사용되는 저분자량 지질다당류(이하 저분자량 LPS로 약칭함)는 상기의 그램 양성균 유래의 펩티드글리칸, 세포벽성분 및 버섯유래의 β-1,3-글루칸과 기본구조 및 성분이 다르고, 특이한 지질 리피드 A와 그것에 공유결합한 R-코어라 불리우는 올리고당, 더욱더 0 특이다당의 3성분으로 이루어지는 물질이고 종양괴사인자(TNF) 생산효과 증강에 의거한 동물용의 면역기능 활성제로서 공지이지만, 갑각류 및 어류의 감염증예방 작용에 대하여는 전혀 알려져 있지 않았다. 또한, 이미 보고된 기본의 연구에 사용된 고분자량 지질다당류(LPS)는 분자량이 100만∼1000만으로 극히 크고 독성이 강하기 때문에 갑각류 및 어류에 장기간 투여하여 상시 면역기능을 활성화하여 두는 것이 불가능하였다. 더욱더 상술의 기지의 물질은 분자량이 크고 장관으로부터 흡수가 나쁘기 때문에 다량의 경구 투여를 필요로 하고 장기간 투여하면 면역기능이 저하하는 것이 많았다.

이미 설명한 바와 같이 갑각류 및 어류에는 여러가지 감염증이 다발하고, 그결과 폐사에 이르는 것도 있고, 심대한 경제적 피해를 초래하고 있다. 이 배경에는 이들의 갑각류 또는 어류가 한정된 환경에서 과밀하게 사육되는 것으로 인한 면역기능의 저하를 들 수 있다. 또, 저하한 면역기능을 활성화할 목적으로 이미 여러가지 물질이 사용되고 있지만, 갑각류는 항체를 생산하는 능력이 없고, 척추동물에서 볼수있는 림프구, 호중구, 호염기구 등을 인정할 수 없는 등, 또는 어류는 항체를 생산하는 능력이 한정되어 있고, 더욱더 변온동물이기 때문에 항체 생산이 수온에 크게 영향되어 이와같은 면역기능은 충분히 기능하고 있지 않는 등, 양자는 포유동물과는 생체방어기구에 상당한 차가 있는 것(Fish Pathology, 30(2), 141-150, 1995. 6), 기왕의 LPS와 같이 독성이 강하기 때문에 양식현장에서는 사용할 수 없는 경우가 있는 것, 장기간 투여하면 오히려 면역기능이 저하하는 것이 많은 것 등에 의하여 갑각류 및 어류의 감염증 방지에 만족할 수 있는 것은 없었다.

본 발명의 목적은 갑각류 및 어류가 본래적으로 구비하고 있는 면역기능을 극히 미량으로 확실히 활성화하여 감염증을 예방하고, 약물 잔류등의 공중위생상의 문제가 없는 안전한 갑각류 및 어류를 육성하기 위한 사료첨가제, 이 사료첨가제를 첨가한 사료 및 이것을 사용한 예방방법 및 사육방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명은 갑각류 또는 어류의 사료첨가제 및 그 사료첨가제를 첨가한 사료에 관한 것이고, 특히 면역부활, 감염증예방에 현저한 효과를 나타내는 사료첨가제와, 이 사료첨가제를 적당한 비율로 첨가한 사료 및 이들을 사용한 예방방법 및 사육 방법에 관한 것이다.

본 발명은 그램 음성의 미생물 균체로부터 얻어지고, 단백질 마아커를 사용하여 SDS-PAGE법으로 측정한 분자량이 5000±2000으로, 고분자량 지질다당류를 실질적으로 포함하지 않는, 저분자량 지질다당류를 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 면역부활, 감염증 예방효과를 갖는 갑각류 또는 어류용 사료첨가제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 저분자량 지질다당류 및 갑각류 및 어류에 허용되는 담체를 함유하는 갑각류 또는 어류용 사료첨가제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 갑각류 또는 어류용 사료첨가제를 제조하기 위한 상기 저분자량 지질다당류의 사용에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 저분자량 지질다당류의 유효량을 갑각류 또는 어류에 투여하는 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류의 면역부활 감염증예방 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 저분자량 지질다당류를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류의 폐사예방제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 저분자량 지질다당류 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 갑각류 또는 어류의 폐사예방제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 갑각류 또는 어류의 폐사예방제를 제조하기 위한 상기 저분자량 지질다당류의 사용에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 저분자량 지질다당류의 유효량을 갑각류 또는 어류에 공급하는 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류의 폐사 예방방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 그램 음성의 미생물 균체가 판토에어속에 속하는 미생물 균체인 갑각류 또는 어류용 사료첨가제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 그램음성의 미생물 균체가 판토에어·아글로메란스인 갑각류 또는 어류용 사료첨가제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 사료첨가제 또는 폐사예방제를 첨가한 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류용 사료에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 사료를 갑각류 또는 어류에 부여하는 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류의 사육 방법에 관한 것이다.

본 발명은 그램 음성의 미생물 균체로부터, 예를 들면 일본 특개평 8-198902호 공보에 개시된 방법에 의하여 정제된 물질로 분자량이 5000±2000의 저분자량 LPS를 사료에 첨가하여 갑각류 또는 어류에 투여한 즉, 갑각류·어류가 본래적으로 구비하고 있는 면역기능이 활성화되고 바이러스나 세균에 의한 감염증이 방어되고, 폐사가 예방되고, 게다가 안전성이 매우 높은 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 저분자량 LPS는 상기한 바와 같이 그램 음성의 미생물 균체로부터, 예를 들면 일본 특개평 제8-198902호 공보에 개시된 방법에 의하여 얻어진 분자량이 5000±2000의 지질다당류를 말하지만, 그 특징은 종래의 고분자량 LPS(분자량 100만∼1000만)에 비하여 갑각류 또는 어류에 대한 안전성이 높고, 현저한 면역활성화작용 및 감염증예방효과 및 폐사예방효과를 갖는 것에 있다.

본 발명에 있어서, 실질적으로 고분자량 지질다당류를 포함하지 않는다는 것은 8000 이상의 분자량의 것을 포함하지 않는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 그램 음성의 미생물 균체로서는 예를 들면 판토에어속, 살모넬라속, 아에로모나스속, 세라티아속, 엔테로바크로속 등에 속하는 미생물 균체, 기타 일본 특개평 제4-99481호 공보에 기재된 그램 음성의 미생물 균체 등을들수가 있다. 바람직한 미생물은 판토에어속에 속하는 미생물이고, 보다 바람직하게는 판토에어·아글로메란스(Pantoea agglomerans)이다.

본 발명의 저분자량 LPS는 그램 음성의 미생물 등을 통상의 방법에 의하여 배양하고, 배지로부터 균체를 모으고, 모은 균체로부터 공지의 방법, 예를 들면 열페놀법「오·웨스트 팔(O. Westphal)편, 메소드·인·카보하이드레이트·케미스트리 (Methods in Carbohydrate Chemistry) 제5권, 제83면, 아카데미·프레스(Academic Press), 1965년)에 의하여 추출하고 더욱더 음이온 교환수지에 의하여 정제하여 제조할 수 있다. 즉, 미생물의 균체를 증류수에 현탁하고 이 현탁액을 증류수 및 등용량의 열페놀의 혼합액에 첨가하여 교반하고, 뒤이어 원심분리하여 수층을 회수하고, 이 수층을 투석하여 페놀을 제거하고, 한외여과법에 의하여 농축하여 조 LPS 획분을 채취하고, 이 획분을 통상의 방법의 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, 모노 Q-세파로스 또는 Q-세파로스를 사용한다)에 의하여 정제하고, 통상의 방법에 의하여 탈염한다.

이와같이하여 얻어진 정제 LPS는 일본 특개평 4-187640호 공보, 일본 특개평 4-49240호 공보, 일본 특개평 4-99481호 공보 및 일본 특개평 5-155778호 공보에 개시되는 분자량 5,000 내지 6,000 정도의 LPS와 실질적으로 같다. 더욱더, 얻어진 정제 LPS를, 예를 들면 데옥시콜산나트륨 등의 계면활성제의 존재하에 겔여과하고, 저분자량 LPS를 함유하는 획분만을 회수하고, 혼재하는 고분자량 LPS를 제거하므로서, 고도로 정제된 본 발명의 저분자량 LPS를 얻을 수가 있다. 이 계면활성제 존재하에서의 겔 여과의 공정은 일본 특개평 4-187640호 공보, 일본 특개평 4-49240호 공보 및 일본 특개평 5-155778호 공보에 개시되는 분자량 5,000 내지 6,000 정도의 LPS를 다시 고도로 정제하기 위한 것이고, 이 공정에 의하여 혼재하는 고분자량 LPS가 완전히 배제되는 것이다.

본 발명의 대상으로 되는 갑각류란 보리새우(Penaeus japonicus), 페나에우스 모노돈(Penaeus monodon), 대하(Penaeus chinensis), 피나에우스 모르기엔시스(Penaeus morguiensis) 등의 보리새우류를 포함하는 모든 새우류(lobster, shrimp prawn를 포함함), 상해 게, 꽃게 등의 모든 게류를 포함하고, 바람직하게는 새우류이고, 더욱더 바람직하게는 보리새우류이다. 어류란, 방어, 복어, 참돔, 넙치, 뱀장어, 옥새송어 등의 모든 어류를 포함한다. 감염증이란, 갑각류의 급성 바이러스 혈증, 비브리오병, Bpistylis sp., Zoothamnium sp. 등의 기생증, 혹은 Lagenidium sp., Siropidium sp. 등의 진균증, 어류의 이리도 바이러스 감염증, 라브도 바이러스 병, 신경괴사증, 전염성 조혈기 괴사증, 유결절증, 연쇄 구균증, 장구균증, 비브리오병, 냉수병, 슈우도모나스병, 활주 세균증, 물곰팡이병의 모든 바이러스, 마이고 플라스마, 세균, 진균 및 기생충에 기인하는 감염증을 말하고, 바람직하게는 갑각류의 급성 바이러스 혈증, 어류의 연쇄구균증, 장구균증, 비브리오증이다.

본 발명에 있어서는 저분자량 LPS를 그대로 혹은 공지의 담체, 안정제 등을 가하여 더욱더 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가하여 갑각류 또는 어류용의 사료첨가제로 하여도 좋고, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태로조제하면 좋다. 본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우는 갑각류 또는 어류에 대하여 단독으로 공급하여도 좋고, 사료에 혼합하여 공급하여도 좋다. 공급시키는 질환 예방을 위하여 상시 공급하여도 또 사양 후반에 첨가하여도 좋다.

또한, 본 발명의 사료는 특히 한정되는 것은 아니고, 분말사료, 고형사료, 모이스트 펠릿사료, 드라이 펠릿사료, EP(Extruder Pellet) 사료, 날먹이 등 어떠한 사료라도 좋다.

본 발명에 있어서 저분자량 LPS의 사료첨가제 또는 사료 등에의 배합량은 넓은 범위로부터 선택할 수 있지만, 바람직하게는 사료첨가제 또는 사료에 대하여 0.000001∼0.001 중량%, 특히 바람직하게는 0.00002∼0.00005중량%이지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 저분자량 LPS의 공급량은 적당히 결정하면 좋지만, 예를 들면 갑각류 또는 어류의 체중 1kg당 1일량으로서 1∼100㎍, 바람직하게는 10∼20㎍을 투여하는 것이 좋지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하 실시예를 들어 본 발명에 대하여 설명하지만, 이들 실시예에 하등 한정되는 것은 아니다. 더욱이 실시예에 사용된 저분자량 LPS란 분자량 약 5,000의 LPS이고, 고분자량 LPS란 분자량 8,000∼5만의 LPS이다.

참고예 1(저분자량 LPS의 제조)

트립톤(디흐고사제) 10g, 효모엑스(디흐고사제) 5g, NaCl (와코 쥰야쿠 고교샤제, 특급) 10g을 증류수 1리터에 첨가하고, NaOH로 pH를 7.5로 조정하고, 오토클레이브로 멸균하여, 별도로 멸균한 글루코오스(야코 쥰야쿠 고교샤제, 특급)를0.1%의 비율로 첨가한 배지(이하, L-육즙배지로 기재함) 100㎖가 들어있는 500㎖ 용량의 판구 플라스크에, -80℃에서 보존되고 있는 판토에어·아글로메란스 (Pantoea agglomerans) 보존 균주로부터 단일 콜로니를 분리하여 접종하고, 35℃에서 하룻밤 진탕 배양하고, 그대로 전량을 1,000㎖의 L-육즙 배지가 들어있는 3리터 용적의 판구 플라스크에 접종하고, 동일하게 배양하였다.

더욱더, 7리터의 L-육즙배지가 들어있는 10리터 용적의 탁상형 퍼멘터(마루비시 바이오엔지사제)에 배양한 균체를 접종하고, 같은 조건으로 통기 배양하고, 후에 집균하고 약 70g의 습균체를 회수하고 이것을 동결 보존하였다. 동결 보존 균체 약 ++70g을 500㎖의 증류수에 현탁하고, 500㎖의 90% 열페놀을 첨가하여 65∼70℃에서 20분간 교반하고, 냉각하고 10,000G, 4℃에서 20분간 원심처리하고, 수층을 회수하였다. 페놀층을 다시 1회 상기와 동일한 조작을 반복하고, 회수한 2회의 수층을 합하여 하룻밤 투석하여 페놀을 제거하고, 투석내액을 한외여과장치(아도반테크·도요사제 UK-200)를 사용하여 분자량 20만 컷오프막에 의하여 2기압의 질소가스하에 한외여과 농축하였다.

얻어진 조 LPS 동결 건조물을 증류수에 용해하고, 필터 멸균하고 완충액을 첨가하고 음이온 교환 크로마토그래피(팔마시아사제, Q-세파로스·패스트·플로우)에 걸어, 10mM 트리스-HCl (pH 7.5) 및 10mM의 NaCl을 포함하는 완충액으로 사료용액을 컬럼에 통액하고, 200∼400mM NaCl 10mM 트리스-HCl(pH 7.5)로 LAL 활성획분을 용출시켰다. 이 용출액을 상기와 동일조건으로 한외여과하여 탈염 및 농축하고, 동결건조하고 약 70g의 습균체로부터 약 300mg의 정제 LPS를 얻었다.

얻어진 정제 LPS 100mg을 5mg/㎖의 농도로 가용화 완충액[3% 데옥시콜산나트륨(와코 쥰야쿠샤제) 0.2M 염화나트륨, 5mMEDTA-2Na 및 20mM 트리스-염산으로 이루어지고 pH8.3]에 용해하고 정제 LPS 용액 20㎖를 세파크릴 S-200HR컬럼(팔마시아 사제)의 상부에 조용히 중층하고, 용출완충액[0.25% 데옥시콜산나트륨(와코 쥰야쿠샤제), 0.2M 염화나트륨, 5mMEDTA 및 10mM 트리스-염산으로 이루어지고 pH8.3]에 의하여 유속 16㎖/시로 800㎖(50시간) 용출하였다.

페리스타 펌프 PI (팔마시아사제)를 사용하여 유속을 제어하면서, 얻어진 용출액을 프랙션콜렉터(아도반테크사제, SF2120)에 의하여 분획하고, 최초의 240㎖(24프랙션분)를 폐기하고, 그 후 10㎖/프랙션으로 80프랙션까지 분획하였다. 용출한 각 획분에 대하여 원액 또는 희석액으로 페놀/황산법(후쿠이 삭조,「환원당의 정량법·제2판」 제50∼52면, 학회출판센터, 1990년)에 의하여 당의 정량을 행하고, 용출상태로 조사하였다. 얻어진 용출상태의 결과로부터 LPS의 존재가 예상되는 분획(프랙션 30∼60) 중, 프랙션 37∼55의 각 프랙션 0.5㎖를 사용하여 SDS-PAGE를 행하고, LPS의 분획 패턴을 조사하였다.

그 결과 프랙션 45∼55는 저분자량(분자량 약 5,000) LPS만이 인정되고, 프랙션 37∼44는 고분자량 및 저분자량의 양방의 LPS가 인정되었으므로 프랙션 45∼55의 저분자량 LPS 분획을 다음과 같이 다시 정제하였다.

각 획분을 혼합하여 동결건조하고, 에탄올에 현탁하고 원심분리에 의하여 에탄올에 가용한 데옥시콜산을 제거하고, 저분자량 LPS를 불용성 획분으로 회수하였다. 저분자량 LPS 획분의 에탄올 처리를 더욱더 2회 반복하고, 데옥시콜산을 제거하고, 다음에 70% 에탄올에 재차 현탁하고, 원심분리로 완충액 성분을 제거하고 이 조작을 더욱더 3회 반복하고 저분자량 LPS를 불용성 획분으로 회수하고, 동결건조하고 정제한 저분자량 LPS를 약 20mg을 얻었다.

실시예 1(갑각류에 대한 저분자량 LPS의 안전성)

평균 체중 20g의 보리새우를 20마리씩 5군으로 나누고, 본 발명의 저분자량 LPS(분자량 약 5,000)를 새우의 체중 1kg당 1구에는 50mg, 2구에는 100mg을, 또 종래의 고분자량 LPS(대장균 유래 LPS, E. coli 0111, DIFCO사제, 분자량 약 8,000∼5만)를 3구에는 10mg, 4구에는 20mg이 되도록 제3복절근육내에 투여하였다. 5구에는 LPS를 포함하지 않는 생리 식염수를 투여하였다. 투여후 120시간 까지의 새우의 생사를 확인하고, 폐사율을 구하였다. 결과를 표 1에 표시한다.

표 1 로부터 명백한 바와 같이 고분자량 LPS 10mg 및 20mg구의 폐사율이 각각 65, 100%인데 대하여 저분자량 LPS 50mg 구 및 10mg구의 어느 것에도 폐사하는 개체는 전혀 볼수 없었다. 이 사실로부터 본 발명의 저분자량 LPS는 종래의 고분자량 LPS에 비하여 새우에 대한 안전성이 극히 높은 물질인 것이 명백하다.

실시예 2(어류에 대한 저분자량 LPS의 안전성)

평균 체중 85g의 보통 잉어를 40마리씩 3군으로 나누고, 보통 잉어의 체중 1kg당 1구에는 저분자량 LPS 100mg을, 2구에는 고분자량 LPS(E. coli 0111, DIFCO사제) 20mg을 어느것이나 등부근육내에 투여하였다. 3구에는 LPS를 포함하지 않는 생리식염수를 투여하였다. 투여후 120시간까지의 보통 잉어의 생사를 확인하고 폐사율을 구하였다. 결과를 표 2에 표시하였다.

표 2 로부터 명백한 바와 같이 고분자량 LPS 20mg구의 폐사율이 85%인데 비하여 저분자량 LPS 100mg 구는 폐사하는 개체는 전혀 볼수 없었다. 이 사실로부터 본 발명의 저분자량 LPS는 종래의 고분자량 LPS에 비하여 어류에 대한 안전성이 극히 높은 물질인 것이 명백하다.

실시예 3(갑각류에 있어서 혈구의 탐식능에 대한 활성화작용)

평균 체중 20g의 보리새우를 20마리씩 6군으로 나누고, 본 발명구의 1,2,3구에는 저분자량 LPS를 새우의 체중 1kg당 1일량으로서 각각 20,40,100㎍을, 또 고분자량 LPS를 4구에는 100㎍, 5구에는 1000㎍이 되도록 사료에 혼합하여 7일간 투여하였다. 6구에는 LPS를 포함하지 않는 사료를 부여하였다. 투여개시 0,1,5,7일후에 항응고제로서의 L-시스틴을 포함하는 K-199 배지를 넣은 주사기를 사용하여 새우의 흉동에서 채혈하고, 원심분리에 의하여 혈구를 얻었다. 현탁액 1㎕당 1×10⁵세포의 혈구와 1×10⁸개의 라텍스비즈(직경 1.986㎛)를 혼합하고, 25℃에서 30분간 반응시킨후, 글루타르알데히드로 고정후, 풍건하였다. 풍건후, 김사액으로 염색하고, 오이키트를 사용하여 슬라이드 유리상에 고정하였다. 이 표본을 새우 1마리당 5매 제작하고, 낙사형광현미경을 사용하여 표본 1매당 200개의 혈구를 무작위로 관찰하고, 혈구의 라텍스비즈 탐식율, 혈구 1세포당의 비즈 거두어들임 수를 조사하여 아래식에 의하여 탐식지수를 구하였다.

탐식율 = [비즈를 거두어들인 혈구수/관찰한 혈구의 총수] × 100

평균 거두어들임 수 = 혈구에 거두어진 비즈수/비즈를 거두어들인 혈구수

탐식지수 = [비즈를 거두어들인 혈구수/관찰한 혈구의 총수] × [혈구에 거두어진 비즈수/관찰한 혈구의 총수] × 100

시험결과: 갑각류의 생체방어기구는 세포성인자와 액성인자에 의하여 구성되어 있고, 전자에는 이물질에 대한 혈구의 탐식능이 깊이 관여하고 있는 것으로, 새우의 생체 방어능이 활성화하여 있는가 여부는 이물질에 대한 혈구의 탐식활성을 조사함으로서 명백하게 된다[다카하시 고소구 등; 어병연구 30(2), 141∼150(1995)]. 그래서, 본 발명의 저분자량 LPS구 및 고분자량 LPS구에 있어서 투여개시 0,1,5,7일후의 탐식지수를 조사하여 표 3에 표시하였다.

표 3에서 명백한 바와 같이 저분자량 LPS를 투여한 새우에 있어서 혈구의 탐식지수는 본 발명구의 어느 것 모두 6구에 비하여 높고, 유의한 차를 볼 수 있다(P<0.01, 0.05). 그러나 종래의 고분자량 LPS를 100㎍을 투여한 새우에 있어서 혈구의 탐식지수는 투여 1,5,7일후 모두 상승하지 않고, 1000㎍의 구에 있어서는 투여 5,7일후에 6구보다도 유의하게 높게 되어있다(P<0.05). 이상의 사실로부터 본 발명의 저분자량 LPS는 고분자량 LPS보다도 극히 미량으로 새우 혈구의 탐식활성 등의 생체방어능을 활성화 하는 것이 명백하다.

실시예 4(갑각류에 있어서 혈구의 페놀옥시다제에 대한 활성화작용)

평균 체중 20g의 보리새우를 20마리씩 6군으로 나누고, 본 발명구의 1,2,3구에는 저분자량 LPS를 새우의 체중 1kg당 1일량으로서 각각 20,40,100㎍을, 또 고분자량 LPS를 4구에는 100㎍, 5구에는 1000㎍이 되도록 사료에 혼합하여 7일간 투여하였다. 6구에는 LPS를 포함하지 않는 사료를 부여하였다. 투여개시 0,1,5,7일후에 EDTA를 포함하는 KHE배지를 넣은 주사기를 사용하여 새우의 흉동에서 채혈하고 원심분리에 의하여 혈구를 얻었다. 얻어진 혈구를 Ca-Mg Hepes 배지에 1×10⁶세포/㎖로 되도록 현탁한 후, 동결 융해와 초음파에 의하여 파괴하고 원심분리에 의하여 얻어진 상청액을 멤브레인 필터로 여과하였다. 이 액 900㎕와 기질용액으로서의 L-DOPA 용액 100㎕를 혼합한 후, 60℃ 온도하에서 60분간 반응시켜 분광광도계를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하고, 페놀옥시다제(PO) 활성으로 하였다.

시험결과: 갑각류의 생체방어기구는 세포성인자와 액성인자로 구성되어 있고, 후자에는 혈구의 PO활성이 깊이 관여하여 있으므로 새우의 생체 방어능이 활성화하여있는가의 여부는 PO 활성을 조사함으로서도 명백하다. 그래서, 본 발명의 저분자량 LPS구 및 고분자량 LPS구에 있어서 투여개시 0,1,5,7일후의 PO활성을 조사하여 표 4에 표시하였다.

표 4로부터 명백한 바와 같이 저분자량 LPS를 투여한 새우에 있어서 혈구의 PO활성은 본 발명구의 어느 것 모두 6구에 비하여 높고, 유의한 차를 볼 수 있다(P<0.01, 0.05). 그러나 종래의 고분자량 LPS를 100㎍ 투여한 새우에 있어서 혈구의 PO활성은 투여 7일후까지 상승하지 않고, 1000㎍의 구에 있어서는 투여 5,7일후에 6구보다도 유의하게 높게 되어있다(P<0.05). 이상의 사실로부터 본 발명의 저분자량 LPS는 고분자량 LPS보다도 극히 미량으로 새우 혈구의 PO활성 등의 생체방어능을 활성화하는 것이 명백하다.

실시예 5(보리새우 급성 바이러스 혈증에 대한 예방효과)

평균 체중 14g의 보리새우를 20마리씩 5군으로 나누고, 본 발명구의 1,2,3구에는 저분자량 LPS를 새우의 체중 1kg당 1일량으로서 각각 20,40,100㎍을, 또 4구에는 고분자량 LPS를 1000㎍이 되도록 사료에 혼합하여 18일간 투여하였다. 5구에는 특허 제2547371호 공보 기재의 비피더스·서모필럼 유래의 펩티드 글리칸(PG)을 0.2mg/kg (200㎍/㎏)이 되도록 6구에는 일본 특공평 6-65649호 공보기재의 치마버섯 유래의 β-1, 3-글루칸 (1,3-G)를 50mg/kg (50000㎍/㎏)이 되도록 사료에 혼합하여 18일간 투여하였다. 7구의 대조구에는 LPS를 포함하지 않는 사료를 부여하였다.

LPS를 투여개시 8일후에 보리새우 급성 바이러스 혈증의 원인 바이러스인 PRDV(penaeid rod-shaped DNA virus)를 사용하여 감염시험을 행하였다. 감염방법은 본 병에 의하여 폐사한 3마리의 보리새우의 두흉부 갑피를 벗긴후, 40㎖의 멸균해수중에서 호모디나이즈하고, 원심분리(10,000Xg, 10분간, 4℃)에 의하여 얻어진 상청액 10㎖를 20리터의 해수에 가하였다. 이중에 LPS 투여개시 8일후의 새우를 2시간 침지하는 방법에 의하여 감염시켰다. 감염 후 10일간의 폐사상황을 관찰하고, 폐사한 새우에 대하여는 병리학적 및 PCR(Polymerase chain reaction)법에 의하여 검사를 행하여 PRDV에 의한 폐사인 것을 확인하였다.

시험결과: 본 발명의 저분자량 LPS구, 고분자량 LPS구 및 LPS 무첨가구의 PRDV감염 후에 있어서 보리새우의 누적 폐사 마리수와, 폐사율을 표 5 및 표 6에 표시하였다.

PRDV에 의한 감염 후에 LPS 무첨가 사료를 부여한 대조구의 새우는 9일 이내에 100%가 폐사한데 대하여, 본 발명구의 폐사율은 저분자량 LPS 20㎍ 구가 20%, 40㎍구가 35%, 100㎍구가 40%로 어느것이나 낮고, 대조구와의 사이에 유의한 차를 볼수 있다(P<0.01). 한편, 고분자량 LPS를 100㎍ 투여한 새우의 폐사율은 55%, PG를 0.2mg 투여한 새우의 폐사율은 50%, 1,3-G를 50mg 투여한 폐사율은 60%이고, 저분자량 LPS를 투여한 각구에 비하여 다수의 새우가 폐사하였다. 이상의 결과로부터 본 발명의 저분자량 LPS는 새우의 바이러스에 의한 감염을 방어하고, 그 효과는 종래의 고분자량 LPS보다도 우수한 것이 명백하다.

실시예 6(어류의 면역기능에 대한 활성화작용)

평균 체중 230g의 방어를 20마리씩의 6군으로 나누고, 본 발명의 1,2,3,구에는 저분자량 LPS를 방어의 체중 1kg당 1일량으로 각각 20,40,100㎍을, 또 고분자량 LPS를 4구에는 100㎍, 5구에는 1000㎍이 되도록 모이스트 펠릿에 혼합하여 7일간 투여하였다. 6구에는 LPS를 포함하지 않는 모이스트 펠릿을 부여하였다. 투여개시 0,1,5,7일후에 5마리씩의 방어로부터 두신(頭腎)을 적출하여, 0.25% NaCl 첨가 RPMI-1640-HAH배지를 넣은 플라스틱샬레내에서 혈구세포를 분리하고, 세포 여과기에 통하여 세포현탁액을 얻었다. 이 액을 percoll 불연속밀도 구배상에 중층한후, 1600rpm, 20분간(4℃)의 원심분리를 행하여 백혈구층을 얻었다.

이 층을 채취후, 원심 세정하여 10% FBS (Fetal Bovine Serum)를 포함하는 0.25% NaCl첨가 RPMI-1640-H 배지에 현탁하고, 백혈구의 세포수를 1×10⁶세포/㎖ 로조정하였다. 이 백혈구 현탁액 500㎕와, 방어혈청으로 옵소닌화하여 둔 효모의 현탁액(1×10⁸세포/㎖) 500㎕를 실리콘 처리한 유리 시험관에 넣어, 10분 간격으로 교반하면서 25℃에서 60분간 인큐베이트하였다. 인큐베이트 종료후, 방어 1개체당 5매의 도말표본을 제작하고, 라이트 염색을 실시하여 오이키트로 봉입하였다, 더욱더, 광학현미경에 의하여 1 표본당 200세포의 혈구를 무작위로 관찰하고, 백혈구의 효모탐식수를 조사하여 실시예 3과 동일한 계산식에 의하여 탐식지수를 구하였다. 결과를 표 7 및 표 8에 표시하였다.

표 7 및 표 8로부터 명백한 바와 같이 저분자량 LPS를 투여한 방어에 있어서 백혈구의 탐식지수는 어느쪽의 발명구나 모두 6구에 비하여 높고, 유의한 차가 보여졌다(P<0.01, 0.05). 그러나, 종래의 고분자량 LPS를 100㎍ 투여한 방어에 있어서 백혈구의 탐식지수는 투여 7일후까지 상승하지 않고, 1000㎍구에 있어서는 투여 5일후에 6구보다도 유의하게 높게 되었다(P<0.01). 이상의 사실로부터 본 발명의 저분자량 LPS는 고분자량 LPS보다도 극히 미량으로 백혈구의 탐식 작용 등의 어류의 면역기능을 활성화하는 것이 명백하다.

실시예 7(방어의 장구균증에 대한 예방효과)

평균 체중 63g의 방어를 30마리씩의 5군으로 나누고, 본 발명의 1,2,3,구에는 저분자량 LPS를 새우의 체중 1kg당 1일량으로 각각 20,40,100㎍을, 또 4구에는 고분자량 LPS를 1000㎍으로 되도록 모이스트 펠릿에 혼합하여 매일 투여하였다. 5구의 대조구에는 LPS를 포함하지 않는 모이스트 펠릿을 부여하였다. 투여개시 7일 후에 방어의 장구균증의 원인균 Enterococcus seriolicida를 방어 한마리당 4.0×10⁶세포로 되도록 복강내 접종하고, 접종후 15일간의 폐사율을 구하였다. 결과를 표 9 및 표 10에 표시하였다.

E. Seriolicida를 접종하여 15일후에, LPS 무첨가 사료를 부여한 대조구의 방어의 73.3%가 폐사한데 대하여 본 발명구의 폐사율로 저분자량 LPS 20㎍구가 13.3%, 40㎍구가 26.7%, 100㎍구가 23.3%로 어느쪽이나 낮고, 대조구와의 사이에 유의한 차를 볼수 있다(P<0.05). 한편, 고분자량 LPS를 1000㎍ 투여한 방어의 폐사율은 36.7%이고, 저분자량 LPS의 각구에 비하여 높은 폐사율을 나타낸다. 이상의 결과로부터 본 발명의 저분자량 LPS는 어류의 세균에 의한 감염을 방어하고 그 효과는 종래의 고분자 LPS보다도 우수한 것이 명백하게 되었다.

본 발명에 의하면, 갑각류 및 어류의 면역기능을 극히 미량으로 확실히 활성화하여 감염증을 예방하고, 또 갑각류 및 어류의 폐사를 예방하고, 약물잔류등의 공중위생상의 문제가 없는 안전한 갑각류 및 어류를 육성하기 위한 사료첨가제 및 사료를 제공할 수가 있다.

Claims

그램 음성의 미생물 균체로부터 얻어지고, 단백질 마커를 사용하여 SDS-PAGE법으로 측정한 분자량이 5000±2000으로, 고분자량 지질다당류를 실질적으로 포함하지 않는, 저분자량 지질다당류를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 면역부활, 감염증예방 효과를 갖는 갑각류 또는 어류용 사료첨가제.
제 1 항에 있어서, 저분자량 지질다당류 및 갑각류 및 어류에 허용되는 담체를 함유하는 갑각류 또는 어류용 사료첨가제.
갑각류 또는 어류용 사료첨가제를 제조하기 위한 제 1 항의 저분자량 지질다당류의 사용.
제 1 항의 저분자량 지질다당류의 유효량을 갑각류 또는 어류에 투여하는 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류의 면역부활, 감염증예방 방법.
제 1 항의 저분자량 지질다당류를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류의 폐사예방제.
제 1 항의 저분자량 지질다당류 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 갑각류 또는 어류의 폐사예방제.
갑각류 또는 어류의 폐사예방제를 제조하기 위한 제 1 항의 저분자량 지질다당류의 사용.
제 1 항의 저분자량 지질다당류의 유효량을 갑각류 또는 어류에 투여하는 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류의 폐사예방방법.
제 1 항에 있어서, 그램 음성의 미생물 균체가 판토에어속에 속하는 미생물 균체인 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류용 사료첨가제.
제 9 항에 있어서, 그램음성의 미생물 균체가 판토에어·아글로메란스인 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류용 사료첨가제.
제 1 항의 사료첨가제를 첨가한 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류용 사료.
제 5 항의 폐사예방제를 첨가한 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류용 사료.
제 11 항의 사료를 갑각류 또는 어류에 부여하는 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류의 사육방법.
제 12 항의 사료를 갑각류 또는 어류에 부여하는 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류의 사육방법.
제 1 항에 있어서, 감염증이 갑각류의 급성바이러스 혈증, 비브리오병, 기생증, 진균증, 어류의 이리도 바이러스 감염증, 라브도 바이러스 병, 신경괴사증, 전염성 조혈기 괴사증, 유결절증, 연쇄구균증, 장구균증, 비브리오병, 냉수병, 슈우도모나스병, 활주세균증, 물곰팡이병인 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류용 사료첨가제.
제 1 항에 있어서, 고분자량 지질다당류가 8000 이상의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 갑각류 또는 어류용 사료첨가제.