KR100483911B1

KR100483911B1 - 양식어류의 면역증강과 항병력강화 및 증체를 위한 사료첨가제

Info

Publication number: KR100483911B1
Application number: KR10-2001-0026279A
Authority: KR
Inventors: 백남수; 김기홍
Original assignee: 주식회사 메디오젠
Priority date: 2001-05-14
Filing date: 2001-05-14
Publication date: 2005-04-18
Also published as: KR20020087591A

Abstract

어류의 사료첨가제로 사용되는 동충하초 패실로마이세스 자포니쿠스(Paecilomyces japonicus) 배양건조물(이하 MJ100으로 약칭함), 기탁번호 KCCM-10265호의 혼합미생물(이하 MP100으로 약칭함) 및 기탁번호 KCCM-10265호의 혼합미생물과 패실로마이세스 자포니쿠스 배양건조물의 혼합물(이하 MJP100으로 약칭함)은 어류의 면역력 증진으로 항병력을 강화시켜 어류의 질병예방은 물론 치사율을 감소시키고 증체효과에 효용성이 있다.

Description

양식어류의 면역증강과 항병력강화 및 증체를 위한 사료첨가제{Feed Additive Composition for immunopotentiating, antibacterial activity and growth promotion of aquacultured fish}

[산업상 이용분야]

본 발명은 동충하초 제제와 기탁번호 KCCM-10265호의 혼합미생물 및 동충하초 제제에 기탁번호 KCCM-10265호의 혼합미생물를 혼합한 제제 및 이들의 제조방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 어류의 면역력 향상에 의한 항병력 증진으로 양식어류의 폐사를 방지시키고 체중을 증가시키는 동충하초 제제와 여기에 기탁번호 KCCM-10265호의 혼합미생물을 혼합한 제제와 동충하초를 단시간에 고농도로 배양하면서 면역 증강물질이 다량 함유되도록 하는 배양공정을 확립하여 양식어 사료첨가제로 이용할 수 있는 동충하초 제제와 동충하초와 기탁번호 KCCM-10265호의 혼합미생물을 혼합한 제제 및 그 제조방법에 관한 것이다.

[종래기술]

양식어는 고밀도 사육에 의한 폐사율이 대단히 높아 항생제나 백신류를 사용하고 있으나 항생제는 사용이 점차 규제되고 있고 백신류는 투여 및 사용하는데 제한적이어서 어려움이 많다. 따라서 사용하기 편리하고 가격이 저렴하면서 항병력 효과가 뛰어난 제제가 필수적인 상황이다. 사료첨가제 형태의 동충하초 제제 및 동충하초와 기탁번호 KCCM-10265호의 혼합미생물의 혼합제제는 어류의 면역력 증강과 생육촉진 및 항병력 강화로 폐사율이 현저히 감소되고 어획량의 증가와 항생제 남용억제에 따른 항생제 수입 절감 및 항생제 내성균의 발현을 방지할 수 있으며 어류 소비자에게도 매우 유익하다.

본 발명의 목적은 양식어류에 대해 예방차원의 면역력 증강 제제 개발의 일환으로서 인체에서 면역력 증강, 항암, 항당뇨, 위궤양 예방, 운동능력의 향상 등에 효과가 있는 것으로 보고된 동충하초를 액상배양하여 단기간에 대량 수확함으로써 저렴하게 제제화 하는 것과 어류의 장내에 유익세균총을 형성하게 하는 기탁번호 KCCM-10265호의 혼합미생물을 제제화하여 어류에 적용함으로써 면역력 증강에 의한 항병력 강화로 폐사율이 감소되고 생육촉진 및 체중증가 등의 기능을 발휘하는 동충하초 제제와 기탁번호 KCCM-10265호의 혼합미생물 및 동충하초와 기탁번호 KCCM-10265호의 혼합미생물을 혼합한 제제를 제공하기 위한 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 어류의 사료첨가제로 사용되는 동충하초 패실로마이세스 자포니쿠스(Paecilomyces japonicus) 배양건조물(이하 MJ100으로 약칭함), 기탁번호 KCCM-10265호의 혼합미생물(이하 MP100으로 약칭함) 그리고 기탁번호 KCCM-10265호의 혼합미생물과 패실로마이세스 자포니쿠스 배양건조물의 혼합물(이하 MJP100으로 약칭함)을 제공한다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 하기와 같다.

본 발명은 어류의 면역활성에 의한 항병력 증강 생성용 특수배지를 사용하여 액상배양한 동충하초 균사체 제제 MJ100과 양식어류의 사육환경 특성을 고려하여 저온 숙성 김치에서 분리된 15∼25℃에서 생육 가능한 유익 미생물인 혼합미생물 MP100 및 MJ100과 MP100을 혼합한 MJP100을 개발하였다. 동충하초 사용균주로는 패실로마이세스 자포니쿠스(Paecilomyces japonicus)가 선정되었으며 선정된 균주의 배양조건, 생리적 특성을 바탕으로 면역 증강 효과가 우수한 동충하초를 속성 대량배양하기 위한 배양공정 기술을 확립하기 위한 실험을 수행하였다. 또한 선정된 동충하초의 분류적, 생리화학적 특성에 의해 면역증강 효과가 우수한 선택배지의 조성과 배양조건은 하기 표 1과 같다. 하기 표 1의 배지조성은 고체성분인 전분, 대두단백, 건조효모, 탄산칼슘, K₂HPO₄, KH₂PO₄ 이외에 잔부의 물을 포함한다.

동충하초 균주를 6ℓ발효조(NBS)에서 면역증강용 생산배지를 사용하여 배양후 배양액 1ℓ당 전분 2Kg을 혼합하여 균질화 시킨 다음 50∼60℃에서 24시간 건조하였다. 건조된 배양건조물을 분쇄하여 분발화 시킨 다음 어류에 섭취시킨 후 면역능을 조사하였다. MJ100의 어류에 대한 면력능 측정은 MJ100을 넙치 치어에 4주간 사료에 첨가하여 투여한 후 트리케인 메탄설포네이트(tricaine methanesulfonate, MS222)로 마취시킨 넙치로부터 두신을 무균적으로 분리한 후 4℃로 냉장한 행크스 밸런스트 염 용액(Hank's balanced salt solution, HBSS)에 넣어 가는 망사를 이용하여 세포들을 분리해 낸다. 분리된 두신세포는 다시 34/51%의 퍼콜 밀도 구배(percoll density gradient)를 이용하여 4℃에서 400×g로 30분간 원심분리한 다음 34%와 51% 사이의 세포층을 가는 파스퇴르 피펫을 이용하여 분리하였다. 최종적으로 분리된 세포는 HBSS로 400×g에서 5분간 2번 세척하였다. 세포의 생존유무는 트리판 블루 스테인(trypan blue stain)을 이용하여 분석하였으며 실험에 사용한 식세포의 세포수는 1×10⁶cells/ml HBSS로 조절하였다. 식세포에서 방출되는 활성 산소 중간체(reactive oxygen intermediates, ROIs)는 케미루미니스센트 응답(chemiluminescent(CL) response) 분석으로 오토매틱 포토루미노메터(automatic photoluminometer, Bio-orbit 1251, Finland)를 사용하여 측정하였다. 즉, 각 측정 큐베트(test cuvette)는 루미놀(luminol) 0.7ml와 세포 분산액 0.4ml를 혼합하여 5분간 실온에서 배양(incubation)한 후 측정직전에 옵소나이즈드 지모산(opsonized zymosan) 0.3ml를 첨가하여 100분간 측정하였다. MJ100을 사료에 0.1%, 0.3%, 0.5%를 첨가하여 4주간 투여 후 각 실험군의 넙치를 무작위로 채취하여 두신 식세포를 분리한 후 CL반응을 측정한 결과 MJ100의 첨가농도가 높아짐에 따라 대조군에 비해 점차 높은 CL값을 나타냈으며 0.5% 첨가시 대조군에 비해 2배 이상의 면역능이 증진되었음을 그림 1에 나타내었다.

그림 1. MJ100의 농도별 첨가에 따른 넙치 두신 식세포의 CL반응 효과 또한 MJP100을 사료에 0.1%, 0.3%, 0.5%를 첨가하여 4주간 투여 후 각 실험군의 넙치를 무작위로 채취하여 두신 식세포를 분리한 후 CL반응을 측정한 결과 대조군에 비하여 0.3%첨가시 2배, 0.5%첨가시 3배의 면역능이 향상 되었음을 그림 2에 나타내었다.

그림 2. MJP100의 농도별 첨가에 따른 넙치 두신 식세포의 CL반응효과

( a ; MJ100 0.1%+ MP100 0.1%, b ; MJ100 0.3%+ MP100 0.3%, c ; MJ100 0.5%+ MP100 0.5% )

MP100과 해수어 병원세균의 혼합배양에 의한 해수어 병원세균의 생육저해 작용을 조사하기 위하여 MP100은 4종의 균이 각각 g당 10⁸의 생균수를 함유한 접종시료를 만들고 병원균중 에드워드시엘라 타다(Edwardsiellar tarda)균은 트립톤과 대두분이 함유된 액상배지(Tryptic soy broth), 슈도모나스 풀루리센스(Pseudomonas fluorescens) 및 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)균은 NaCl이 2.5%함유된 젖당 부이온(Lactose broth)배지를 사용하여 25℃에서 24시간 배양 후 10⁶cells/ml의 생균수가 되도록 생리식염수로 단계 희석하여 접종 시료액을 만든 다음 MP100과 함께 에드워드시엘라 타다균은 트립틱 소이 브로쓰(tryptic soy broth)배지, 슈도모나스 풀루리센스 및 비브리오 콜레라균은 NaCl이 2.5%함유된 젖당 부이온(Lactose broth)배지 각각 1%씩 접종하여 25℃에서 배양하였다. 각각의 혼합배양액을 6시간 간격으로 채취하여 멸균 생리 식염수로 희석한 후 생균수를 측정하였다. 에드워드시엘라 타다균과 MP100 함유균의 생균수 측정은 트립틱 소이 브로쓰(tryptic soy agar) 배지와 MRS 배지(Pancreatic digest of gelatin 10.0g, Beef extracr 8.0g, Dextrose 20.0g, Dipotassium phosphate 2.0g, Polysorbate 80 1.0g, Sodium acetate 5.0g, Ammonium citrate 2.0g, Magnesium sulfate 0.2g, Manganese sulfate 0.05g)에 도말하여 25℃에서 24시간 배양 후 각각의 균에 대한 생균수를 측정하였으여, 슈도모나스 풀루리센스 및 비브리오 콜레라균은 NaCl이 2.5% 함유된 LB 평판배지와 브로모크레졸 퍼플(BCP) 배지(Yeast Extract 2.5g, Peptone 5.0g, Dextrose 1.0g, Tween 80 1.0g, L-Cysteine 0.1g, Agar 15.0g)에 각각 도말하여 25℃에서 24시간 배양후 병원균과 MP100 함유균의 생균수를 측정하였다. MP100의 비브리오 콜레라균에 대한 증식 저해능 및 항균력을 측정하기 위하여 25℃에서 NaCl 2.5%가 함유된 LB 배지를 사용하여 비브리오 콜레라균 단독 및 MP100과 48시간 혼합 배양한 결과 그림 3에서 보는 바와 같이 비브리오 콜레라균을 단독배양한 경우에는 정상적인 성장을 하였으나 혼합 배양의 경우 접종 후 12시간 이후부터 균수가 감소하기 시작하여 30시간 후에는 비브리오 콜레라균의 증식을 완전히 저해하였다.

그림 3. MP100에 의한 비브리오 콜레라균의 생육 저해효과

● ; 비브리오 콜레라 단독배양에 의한 비브리오 콜레라균의 생균수

■ ; MP100과 혼합 배양시 MP100함유 균주의 생균수

▲ ; MP100과 혼합 배양시 비브리오 콜레라균의 생균수

MP100의 에드워드시엘라 타다균에 대한 증식 저해능 및 항균력을 측정하기 위하여 25℃에서 트립틱 소이 브로쓰(tryptic soy broth) 배지를 사용하여 에드워드시엘라 타다균 단독 및 MP100과 48시간 혼합 배양한 결과 그림 4에서 보는 바와 같이 에드워드시엘라 타다균을 단독배양한 경우에는 정상적인 성장을 하였으나 혼합 배양의 경우 접종 후 12시간 이후부터 균수가 감소하기 시작하여 24시간 후에는 에드워드시엘라 타다균의 증식을 완전히 저해하였다.

그림 4. MP100에 의한 에드워드시엘라 타다균의 생육 저해효과

● ; 에드워드시엘라 타다 단독배양에 의한 에드워드시엘라 타다균의 생균수

■ ; MP100과 혼합 배양시 MP100함유 균주의 생균수

▲ ; MP100과 혼합 배양시 에드위드시엘라 타다균의 생균수

MP100의 슈도모나스 풀루리센스균에 대한 증식 저해능 및 항균력을 측정하기 위하여 25℃에서 젖당부이온배지(LB배지)를 사용하여 슈도모나스 풀루리센스 단독 및 MP100과 48시간 혼합 배양한 결과 그림 5에서 보는 바와 같이 슈도모나스 풀루리센스균을 단독배양한 경우에는 정상적인 성장을 하였으나 혼합 배양의 경우 접종 후 12시간 이후부터 균수가 감소하기 시작하여 18시간 후에는 슈도모나스 풀루리센스균의 증식을 완전히 저해하였다.

그림 5. MP100에 의한 슈도모나스 플루리센스균의 생육 저해효과

● ; 슈도모나스 플루리센스 단독배양에 의한 슈도모나스 플루리센스균의 생균수

■ ; MP100과 혼합 배양시 MP100함유 균주의 생균수

▲ ; MP100과 혼합 배양시 슈도모나스 플루리센스균의 생균수

[실시예]

본 발명은 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 나타내는 본 발명의 일 실시예 일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 MJ100과 MP100 및 MJP100을 넙치 치어에 투여하는 실험을 수행하였고 어체의 증체율과 치사율을 조사하였다. 양식실험은 수온 20℃를 유지시킨 실험수조에서 넙치 치어 720마리를 30마리씩 무작위로 나누어 24개의 수조에 배치하여 2주간 순치 후 MJ100, MP100 및 MJP100을 사료에 0.1%, 0.3%, 0.5%, 1.0% 함유시켜 투여 하였으며 대조군은 순수 사료만 투여하였다. 각각의 실험군은 2반복구로 하였으며 4주간 실험사료를 투여 후 증체율과 치사율을 분석하였다. 어체량은 각 실험군에서 임의로 10마리를 채취하여 측정하였으며 이러한 방법을 2회 반복하여 어체의 평균 증체량을 계산하였다. 폐사율 측정은 1톤 수조에 각 실험군별로 망으로 격리한 후 해수어 병원성 세균인 에드워드시엘라 타다(Edwardsiella tarda)를 해수 리터(L)당 3.4×10⁷의 균수로 분산시켜 자연적인 감염경로와 같은 환경을 조성한 후 각 실험군별 누적폐사율을 조사하였다.

MJ100를 사료에 첨가하여 4주간 넙치 치어에 투여한 후의 증체량은 대조군에 비해 MJ100을 0.5%와 1.0% 첨가한 군에서 각각 28% 및 17% 높은 증가율을 보여 0.5%의 첨가가 가장 효과적인 것으로 관찰되었으며 이를 표 2에 나타내었다.

MP100를 사료에 첨가하여 4주간 넙치 치어에 투여한 후의 증체량은 대조군에 비해 MP100을 0.3%와 0.5% 첨가한 군에서 대조군에 비해 각각 4% 및18%의 증체율을 보여 0.5%의 첨가가 가장 효과적인 것으로 관찰되었으며 이를 표 3에 나타내었다.

또한, MJP100을 0.1%, 0.3%, 0.5%로 사료에 첨가하여 2주간 투여한 후의 증체율은 대조군에 비해 각각 1.6배, 2.9배, 2.1배로 높은 증체 효과를 보여 0.3%의 첨가가 가장 효과적인 것으로 관찰되었으며 이를 표 4에 나타내었다.

해수 병원균인 에드워드시엘라 타다를 수조에 분산시킨 후 사료투여를 중지한 상태에서 MP100 투여군에 대한 항병력을 조사한 결과 대조군은 해수 병원균을 투여 후 7일 동안의 누적 폐사율이 80%인 반면 MP100 0.3% 투여군은 40%, 0.5% 투여군은 30%, 1.0% 투여군은 57%의 폐사율을 보여 MP100 0.5%를 사료에 첨가한 것이 가장 우수한 항병력을 보이는 것으로 나타났으며 이를 표 5에 나타내었다.

또한, MJP100를 투여한 경우 대조군은 해수 병원균을 투여 후 사료급여를 중지한 상태에서 7일 동안의 누적 폐사율이 80%인 반면 MJP100을 0.1%, 0.3%, 0.5%를 투여한 결과 누적 폐사율은 각각 35%, 10%, 20%로 MJP100을 0.3% 투여한 군이 대조군에 비해 8배 이상의 매우 높은 생존율을 보였으며 이를 표 6에 나타내었다.

본 발명의 동충하초 패실로마이세스 자포니쿠스(Paecilomyces japonicus) 배양건조물, 기탁번호 KCCM-10265호의 혼합미생물 및 기탁번호 KCCM-10265호의 혼합미생물과 패실로마이세스 자포니쿠스 배양건조물의 혼합물 제제를 포함하는 사료조성물은 어류의 면역능을 향상시키고 항병력 증진과 생육촉진으로 폐사율 감소와 어획량 증가 및 항생제 대체용으로 효용성이 높다.

도 1은 본 발명에 따른 제제화 방법의 흐름도

Claims

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양식어류용 사료첨가제에 있어서, 패실로마이세스 자포니쿠스의 균사체를 포함한 배양건조물의 분말을 함유함을 특징으로 하는 양식어류용 사료첨가제