CN106260507B

CN106260507B - 约氏乳杆菌在诱食中的应用

Info

Publication number: CN106260507B
Application number: CN201510288960.7A
Authority: CN
Inventors: 汪攀; 张军; 孙晓雯; 闫轶洁; 王安如; 朱传忠; 李栋
Original assignee: Changde Dabeinong Feed Co ltd; Fujian Dabeinong Fisheries Science & Technology Co ltd; Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd
Current assignee: Fujian Dabei Nonghuayou Aquatic Technology Group Co ltd; Hunan Dabei Nonghuayou Aquatic Technology Co ltd; Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2035-05-29
Also published as: CN106260507A

Abstract

本发明公开了约氏乳杆菌CGMCC No.4926在对虾诱食方面的应用。本发明的约氏乳杆菌制剂可以增加对虾采食量一倍左右，能显著增加对虾吃料的速度。与现有的诱食剂相比，诱食效率更好。

Description

约氏乳杆菌在诱食中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种约氏乳杆菌在诱食中的应用。

背景技术

约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)属于厚壁菌门(Firmicutes)芽孢杆菌纲(Bacilli)乳杆菌目(Lactobacillales)乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳杆菌属(Lactobacillus)。欧盟食品安全局(EFSA)会分别于2009年和2011年三次发布了针对约氏乳杆菌的健康申明，申明指出约氏乳杆菌具有减少肠道内病原菌的微生物，增强天然防御和免疫系统和保持皮肤健康。并且欧盟对约氏乳杆菌进行了安全资格认定(qualifiedpresumption of safety,QPS)批准其在饲料和食品中使用。2010年我国卫生部办公厅将约氏乳杆菌收录到《可用于食品的菌种名单》中，批准其作为具有益生功能的食品添加剂使用。

在增加南美白对虾诱食剂方面，目前市场相关产品种类多样，但是效果不明显，多以以香味物质“引诱”为主，提高采食量仅在10％以内。市场上相关诱食主要分为如下几种：氨基酸类、动植物提取物、生物碱、含硫化合物、中药类、脂肪酸等等。目前，国家已经明文规定，禁止诸如DMPT等化学诱食剂使用。因此，开发绿色、高效的虾类诱食产品是必要的。乳酸菌用于水产行业已有先例，有的作为饲料添加剂，有的作为水质改良剂，有的作为微生态改良剂，但是用于对虾诱食，尚无先例。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供约氏乳杆菌CGMCC No.4926在对虾诱食方面的应用。

本发明的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，是通过体外耐酸和耐胆盐筛选得到的一株具有益生功能的约氏乳杆菌，命名为约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)YS-12，并于2011年6月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心进行了保藏，保藏号为CGMCC No.4926。

其中，所述的约氏乳杆菌YS-12的筛选过程如下：

(1)收集菌种

截取健康猪结肠后半段，用生理盐水冲洗三次，用牙签多次挂取肠道上皮上的附着物，放入10mL的生理盐水中，作为样品原液，对原液进行10倍梯度稀释。

(2)菌种培养

将每个稀释度，取100微升涂布于MRS平板上，37℃倒置培养24小时。

(3)菌种鉴定

挑取平板上的单菌落进行对其16S rRNA进行菌落PCR鉴定，通过在数据库中进行序列比对，发现其16S序列(GenBank登录号：HQ641209)，进一步通过理化实验证实其为约氏乳杆菌。

(4)菌种筛选

1)将菌体重悬于PBS液后，梯度稀释至10-2，用移液器吸取10-2稀释液100微升分别加入900微升0.3％的胆盐溶液和PBS(对照)中，37℃保温3小时。

2)将菌体重悬于PBS液后，梯度稀释至10-2，用移液器吸取10-2稀释液100微升分别加入900微升pH3.0的缓冲液和PBS(对照)中，37℃保温3小时。

3)将酸处理过的菌液继续稀释至10^-5，取10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度(对照组稀释至10^-6，取10^-4、10^-5、10^-6)各0.1ml涂布MRS平板，37℃倒置培养48小时。挑取耐受性菌株进行反复筛选，得到耐酸和耐胆盐性能优良的约氏乳杆菌。

(5)菌种保藏

将筛选得到的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)YS-12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，获得保藏号为CGMCC No.4926。

将本发明的约氏乳杆菌CGMCC No.4926发酵液以适当的剂量与饲料混合，可增加对虾采食量和加快虾吃料速度。

在本发明的一个实施方案中，将所述的约氏乳杆菌制剂与饲料混合，优选的，每公斤饲料拌入约氏乳杆菌制剂25ml～50ml。

在一个优选的实施方案中，所述的约氏乳杆菌制剂可为本领域常规制剂，优选为约氏乳杆菌发酵液。

优选的，所述的约氏乳杆菌发酵液中约氏乳杆菌的活菌数为10¹⁰cfu/ml。

其中，所述约氏乳杆菌发酵液的制备培养基为MRS液体培养基。

其中，所述的饲料为对虾饲料。

其中，所述饲料由鱼粉、豆粕、膨化大豆、花生粕、玉米蛋白粉、血球蛋白粉、面粉、虾壳粉、啤酒酵母、鱿鱼膏、鱼油、磷脂油、氯化胆碱、磷酸二氢钙、防霉剂、抗氧化剂、脱壳素、预混料制成，优选地，所述饲料由鱼粉16％、豆粕20.3％、膨化大豆4％、花生粕21.05％、玉米蛋白粉3％、血球蛋白粉3％、面粉19.87％、虾壳粉2％、啤酒酵母5％、鱿鱼膏1.5％、鱼油0.8％、磷脂油2.4％、氯化胆碱0.3％、磷酸二氢钙1％、防霉剂0.05％、抗氧化剂0.03％、脱壳素0.01％、预混料5％制成。

其中，预混料为本领域常规的对虾预混料，可市售获得。

其中，所述约氏乳杆菌发酵液的制备方法如下：

1)将冷冻保存的约氏乳杆菌CGMCC No.4926在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于10mL深层MRS液体试管，37℃培养10小时后，以1％接种量转接于250mL MRS液体培养基，培养8～10小时后作为种子液；

2)以5％～10％的接种量将步骤1)所得的种子液接种于5L的发酵罐中培养；

3)发酵过程中维持发酵液pH值为6.0～6.5，当pH超过设定值时，补加料液；当pH低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水、KOH、NaOH中的任一种；在温度37～39℃、转速100rpm条件下发酵10～14小时，发酵过程不通气或通入N₂，维持溶氧小于1％；

4)当补加料液pH不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值(即OD600)不再增加时，终止发酵，即得约氏乳杆菌活菌数达10¹⁰cfu/ml以上的发酵液。

本发明还提供一种促进对虾采食量和加快对虾吃料速度的方法，其将约氏乳杆菌CGMCC No.4926制剂拌饲料，每升约氏乳杆菌拌饲料30kg～50kg，更优选以每升约氏乳杆菌发酵液拌40kg饲料。

与未拌约氏乳杆菌CGMCC No.4926的对照相比，约氏乳杆菌制剂可以增加对虾采食量一倍左右，能显著增加对虾吃料的速度。与现有的诱食剂相比，诱食效率更好。

本发明中的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)YS-12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)保藏，保藏日期为2011年6月8日，保藏号为CGMCC No.4926。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1约氏乳杆菌CGMCC No.4926发酵液的制备

1)将冷冻保存的约氏乳杆菌CGMCC No.4926在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于10mL深层MRS液体试管，37℃培养10小时后，以1％接种量转接于250mL MRS液体培养基，培养10小时后作为种子液；

2)以5％的接种量将步骤1)所得的种子液接种于5L的发酵罐中培养；

3)发酵过程中维持发酵液pH值为6.0，当pH超过设定值时，补加料液；当pH低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水；在温度37℃、转速100rpm条件下发酵14小时，发酵过程通入N₂，维持溶氧小于1％；

4)当补加料液pH不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值(即OD600)不再增加时，终止发酵，即得约氏乳杆菌活菌数达10¹¹cfu/ml以上的发酵液。

实施例2约氏乳杆菌在南美白对虾诱食中的应用

1、试验材料

基础饲料：由鱼粉16％、豆粕20.3％、膨化大豆4％、花生粕21.05％、玉米蛋白粉3％、血球蛋白粉3％、面粉19.87％、虾壳粉2％、啤酒酵母5％、鱿鱼膏1.5％、鱼油0.8％、磷脂油2.4％、氯化胆碱0.3％、磷酸二氢钙1％、防霉剂0.05％、抗氧化剂0.03％、脱壳素0.01％，预混料5％组成，经饲料加工设备制成颗粒料。

诱食物质：约氏乳杆菌制剂、DMPT(二甲基-β-乙酸噻亭)、甘氨酸

2、试验设计

2个玻璃水族箱(1.0m×0.5m×0.5m)并排放置,相互之间以暗色隔板相隔,使其相互没有干扰。每个箱中放大约240L水，水温保持在25℃，NH₃-N<0.5mg/L，DO>5mg/L，12小时光照,每个水族箱的光度一致。正式试验前24h,在每个水族箱中随机放入20尾南美白对虾，使其能够完全适应周围的环境,操作时没有惊跳反应。

(1)约氏乳杆菌制剂与DMPT、甘氨酸诱食效果对比：

诱食物质均用蒸馏水提前配制成溶液，以基础饲料为对照组，在基础饲料中分别拌料添加50mL/kg约氏乳杆菌制剂、DMPT、甘氨酸作为试验组。在每个水族箱左右两边分别放置1000粒对照饵料和试验饵料,且两箱中饲料互换位置。在距水族箱中央1.5m处设置摄像机,记录南美白对虾对饲料的反应时间。从第一次反应时间开始计时,记录10min内南美白对虾啄咬并吞食的饲料颗粒数,以此作为评定指标。每个试验试剂重复4次。试验结束后,将试验水槽清洗干净,用酒精擦洗一遍,以保证不受其他试验液的干扰,等酒精挥发干净后注入蓄水池新水。换另一批虾重新试验。依次循环。

(2)约氏乳杆菌制剂不同添加量对南美白对虾的诱食效果：

以基础饲料为对照组，在基础饲料中分别拌料添加20、35、50、65mL/kg约氏乳杆菌发酵液。试验方法与1.2.1的方法相同，记录南美白对虾对饲料的反应时间和10min内对虾啄咬并吞食的饲料颗粒数。

3、试验结果

(1)约氏乳杆菌制剂与DMPT、甘氨酸诱食效果

由表1可以看出，3种诱食物质对南美白对虾的诱食效果差异很大，对南美白对虾的促摄食作用也有所不同。其中约氏乳杆菌制剂的作用最强烈，表现出最短的第一反应时间和最多的吞食颗粒数。DMPT、甘氨酸的作用次之。

表1、约氏乳杆菌制剂与DMPT、甘氨酸诱食效果

(2)约氏乳杆菌制剂不同添加量对南美白对虾的诱食效果

表2约氏乳杆菌制剂不同添加量对南美白对虾的诱食效果

有表2可以看出添加量在50ml/kg以下时，随着约氏乳杆菌制剂添加量的增加，第一反应时间依次减少，吞食数量依次增加，诱食效果逐渐增强。当添加量超过50ml/kg时，诱食效果增加不明显。因此约氏乳杆菌制剂在南美白对虾诱食中的最适剂量为50ml/kg。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种约氏乳杆菌制剂在对虾诱食中的应用，其特征在于，所述的约氏乳杆菌制剂为约氏乳杆菌发酵液；所述的约氏乳杆菌发酵液中约氏乳杆菌的活菌数不低于10¹⁰ CFU/mL；用所述的约氏乳杆菌制剂拌饲料，每公斤饲料拌入约氏乳杆菌制剂20 mL～80 mL；所述约氏乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.4926。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用所述的约氏乳杆菌制剂拌饲料，每公斤饲料拌入约氏乳杆菌制剂50 mL。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述约氏乳杆菌发酵液的制备培养基为MRS液体培养基。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述饲料为对虾饲料。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述饲料由鱼粉、豆粕、膨化大豆、花生粕、玉米蛋白粉、血球蛋白粉、面粉、虾壳粉、啤酒酵母、鱿鱼膏、鱼油、磷脂油、氯化胆碱、磷酸二氢钙、防霉剂、抗氧化剂、脱壳素、预混料制成。