ES2330300T3 - Aditivos para alimentos para crustaceos o peces y alimentos. - Google Patents
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Abstract
Un aditivo alimenticio para crustáceos o peces, que se caracteriza por que se prepara a partir de bacterias gram-negativas, que se encuentra básicamente libre de lipopolisacáridos de alto peso molecular, que contiene un lipopolisacárido de bajo peso molecular con un peso molecular de 5000 +/- 2000 como componente eficaz, según el método SDS-PAGE que utiliza un marcador proteínico, y que es capaz de activar la inmunidad o impedir la infección en los crustáceos o peces.
Description
Aditivos para alimentos para crustáceos o peces
y alimentos.
La presente invención se refiere a un aditivo de
los alimentos para crustáceos o peces, y a un alimento que contiene
el aditivo para los alimentos, y más en particular a un aditivo de
los alimentos que presenta efectos significativos en la activación
de la inmunidad y la prevención de infecciones y además se refiere a
un alimento que contiene este aditivo en una proporción
adecuada.
Recientemente se ha desarrollado la acuicultura
de crustáceos y peces. Existe un gran riesgo económico en la
industria del cultivo debido a las explosiones de enfermedades
víricas o bacterianas de los crustáceos y peces. Las enfermedades
más frecuentes de crustáceos y peces incluyen la viremia aguda del
camarón kuruma o langostino japonés (Penaeus japonicus), la
vibriosis del mismo, la seudotuberculosis de las colas amarillas,
las enfermedades por enterococo, la enfermedad por agua fría en
peces dulces (ayu), las enfermedades por seudomonas, la
iridovirosis de los besugos de mar, Seriola dumerili (pez
limón), colas amarillas o similares que han dañado económicamente
la industria del cultivo. De estas enfermedades, las enfermedades
bacterianas han sido tratadas con antibióticos o agentes
antibacterianos sintéticos como agentes curativos. Sin embargo, con
la llegada de las bacterias resistentes a los antibióticos, no se
han conseguido efectos curativos satisfactorios. Además, ha
aparecido un problema de riesgo para la salud pública debido al
producto medicinal que queda en los crustáceos y peces. A
consecuencia de ello, existe una fuerte demanda de medidas
preventivas no dependientes de la quimioterapia. Por otro lado, no
se han desarrollado vacunas y agentes curativos contra las
enfermedades víricas de los crustáceos y peces y todavía existen
enfermedades víricas.
El uso de los polisacáridos es bien conocido
para inmunopotenciar a los crustáceos y peces y para prevenir las
enfermedades infecciosas provocadas por los mismos. Estos
polisacáridos incluyen, por ejemplo, el peptidoglicano derivado de
la Bifidobacterium thermophilum (patente nr. 2547371), el
componente de las bacterias grampositivas que forma la pared celular
como las bacterias del género Bacillus
(JP-B-3-173826) y el
beta-1,3-glucano derivado del
Schizophyllum commune
(JP-B-6-65649). Ya
se ha informado de que los lipopolisacáridos de elevado peso
molecular activan la función inmunitaria de peces y animales
(Salati, F. y R. Kusuda, Society Journal, Japanese Society of
Science of Fisheries, vol. 53, pp.201 a 204, 1987 y Odean, M.J. y
cols., Infection and Immunity, vol. 58, pp.427 a 432, 1990).
Por otro lado, el lipopolisacárido de bajo peso
molecular de la presente invención (al que se hace referencia en
adelante como "LPS de bajo peso molecular") es diferente en la
estructura básica y los componentes del peptidoglicano derivado de
las bacterias gram-positivas, componente formador de
la pared celular y del
\beta-1,3-glucano derivado de una
seta. El LPS de bajo peso molecular de la invención comprende tres
componentes, a saber, un lípido específico A, un oligosacárido con
enlace covalente denominado núcleo R y un polisacárido específico
O. El LPS de bajo peso molecular de la invención se conoce como un
inmunopotenciador para animales debido a su habilidad para
incrementar el efecto que produce el factor de necrosis tumoral
(TNF), pero se desconoce que tenga una actividad de prevención de
las enfermedades infecciosas de crustáceos y peces. Los
lipopolisacáridos de elevado peso molecular (LPSs) utilizados en
las investigaciones aquí mencionadas son aquellos con un peso
molecular extremadamente elevado, tan alto como de 1 millón a 10
millones y presentan una toxicidad elevada.
Como consecuencia de ello, cuando se aplican a
los crustáceos y peces durante un periodo largo de tiempo, el LPS
de elevado peso molecular es incapaz de activar la función
inmunitaria en todo momento. Las sustancias anteriormente
mencionadas tienen un peso molecular elevado y necesitan ser
administradas por vía oral en una gran cantidad debido a su pobre
absorción por el tracto intestinal. A consecuencia de ello, una
ingesta de las mismas durante un largo periodo de tiempo
frecuentemente produce un trastorno de la función inmunitaria.
Tal como se ha descrito antes, a menudo se
producen una serie de enfermedades infecciosas en los crustáceos y
en los peces. Algunas de estas enfermedades son letales y pueden
provocar un gran trastorno económico. El principio que hay que
tener en cuenta es que la función inmunitaria de los crustáceos y
peces se deteriora porque se reproducen en un área superpoblada
dentro de un entorno limitado. Se han utilizado diversas sustancias
para reactivar su sistema inmunitario alterado. Por otro lado, los
crustáceos no son capaces de producir ni un anticuerpo, ni
linfocito, neutrófilo o basófilo como ocurre en un vertebrado. Los
peces tienen una capacidad limitada para producir un anticuerpo y
si producción de anticuerpos se ve afectada enormemente por la
temperatura del agua ya que son animales de sangre fría de manera
que su sistema inmunitario no funciona lo suficientemente bien. En
otras palabras, existe una diferencia sustancial en el mecanismo
defensivo entre estos organismos oceánicos y los mamíferos (Fish
Pathology, 30(2), 141-150, Junio en 1995).
Como consecuencia de ello, algunas de las sustancias no son útiles
in situ en la reproducción de organismos oceánicos debido a
la elevada toxicidad como los LPSs convencionales, y la mayoría de
ellas se ven alteradas en el sistema inmunitario por la ingesta de
LPSs durante un periodo de tiempo prolongado.
La WO-A-9623003
revela la existencia de lipopolisacáridos de bajo peso molecular con
actividad inmunomoduladora.
Un objetivo de la presente invención será lograr
un aditivo para alimentos muy seguro para el cultivo o la
reproducción de crustáceos y peces, siendo dicho aditivo capaz de
prevenir las enfermedades infecciosas incluso en una cantidad
pequeña, ya que activará de forma adecuada su función inmunitaria
intrínseca, y además estando exento de problemas que afecten a la
salud pública como los ocasionados por los aditivos que se
encuentran en crustáceos y peces.
La presente invención proporciona un aditivo
para alimentos para crustáceos y peces, que se caracteriza por
que se prepara a partir de bacterias
gram-negativas, es decir tiene un peso molecular de
5000 \pm 2000 de acuerdo con el método de medición
SDS-PAGE que utiliza un marcador proteínico, está
libre básicamente de lipopolisacárido de elevado peso molecular, y
contiene un lipopolisacárido de bajo peso molecular como componente
eficaz y es capaz de activar la inmunidad o de impedir la infección
en crustáceos o peces; y también proporciona un alimento para
crustáceos o peces que se caracteriza por que contiene el
aditivo para alimentos.
La presente invención también proporciona un
aditivo para alimentos para crustáceos o peces que consta de
lipopolisacáridos de bajo peso molecular y un portador aceptable
para crustáceos y peces.
La presente invención también informa sobre el
uso de lipopolisacáridos de bajo peso molecular para la preparación
de un aditivo para alimentos para crustáceos o peces.
La presente invención también proporciona un
método para activar la inmunidad o impedir las infecciones en
crustáceos y peces que comprende la administración de una cantidad
eficaz de lipopolisacárido de bajo peso molecular a crustáceos o
peces.
La presente invención también proporciona un
agente para impedir el deterioro de crustáceos o peces que comprende
el lipopolisacárido de bajo peso molecular como un componente
eficaz.
La presente invención también proporciona un
agente para impedir el deterioro de crustáceos o peces que comprende
el lipopolisacárido de bajo peso molecular y un portador aceptable
para crustáceos y peces.
La presente invención también informa sobre el
uso del lipopolisacárido de bajo peso molecular para preparar un
agente que impida el deterioro de crustáceos o peces.
La presente invención también proporciona un
agente para impedir el deterioro de crustáceos o peces que comprende
la administración de una cantidad efectiva de lipopolisacárido de
bajo peso molecular a crustáceos y peces.
La presente invención también proporciona un
aditivo para alimentos, en el que las bacterias
gram-negativas pertenecen al género Pantoea.
La presente invención también proporciona un
aditivo para alimentos, en el que las bacterias
gram-negativas son Pantoea agglomerans.
La presente invención también proporciona un
alimento para crustáceos o peces que comprende el aditivo para
alimentos.
La presente invención también proporciona un
alimento para crustáceos o peces que comprende el agente para
impedir el deterioro.
La presente invención también proporciona un
método de reproducción de crustáceos o peces que comprende la
administración de alimentos a crustáceos o peces.
El aditivo para los alimentos de la invención se
ha preparado a partir de bacterias gram-negativas
mediante la purificación, por ejemplo, conforme al método publicado
en JP-A-8-198902.
Los actuales inventores han preparado un alimento que contiene un
LPS de bajo peso molecular que tiene un peso molecular de 5000 \pm
2000. Cuando se alimentaban los crustáceos y los peces, se
observaba que dicho alimento impedía la aparición de enfermedades
de tipo infeccioso y ofrecía una protección frente a la muerte por
activación de la función inmunitaria intrínseca. La presente
invención se cumplía en base a este hallazgo.
EL LPS de bajo peso molecular de la presente
invención es, tal como se ha descrito antes, un lipopolisacárido
que tiene un peso molecular de 5000 \pm 2000, que se ha preparado
a partir de bacterias gram-negativas, por ejemplo,
conforme al método revelado en
JP-A-8-198902. El
LPS de la invención se caracteriza por que el LPS es
notablemente más seguro para los crustáceos o peces y puede producir
un efecto significativamente superior al activar la inmunidad y un
efecto superior para prevenir infecciones y la muerte que el LPS
convencional (con un peso molecular de 1 millón a 10 millones).
En la presente invención, el término
"básicamente libre de lipopolisacáridos de elevado peso
molecular" significa "que no contiene lipopolisacáridos que
tengan un peso molecular de al menos 8.000".
Las bacterias gram-negativas
para su uso en la invención incluyen, por ejemplo, las
correspondientes al género Pantoea, Salmonella, Aeromonas, Serratia
y Enterobacter, y además incluyen las descritas en
JP-A-4-99481. Entre
las bacterias gram-negativas útiles, se prefieren
las de Pantoea y las de Pantoea agglomerans son las más
preferidas.
Los LPS de bajo peso molecular de la presente
invención se pueden preparar según un método que comprende la
incubación de bacterias gram-negativas o similares
de un modo convencional, recogiendo las bacterias cultivadas del
medio de cultivo, extrayendo las bacterias recogidas mediante
métodos convencionales, como el método del fenol caliente (editado
por O. Westphal, Methods in Carbohydrate Chemistry, vol. 5, p.83,
Academic Press, 1965) y purificando el extracto con una resina de
intercambio aniónico. Más específicamente, el método comprende la
suspensión de las bacterias en agua destilada, la adición de la
suspensión a una mezcla de agua destilada y un volumen igual de
fenol caliente, la agitación de la mezcla, la centrifugación de la
mezcla para recuperar la capa acuosa, el dializado de la capa
acuosa para retirar el fenol, la concentración de la capa acuosa por
ultrafiltración hasta obtener fracciones crudas de LPS, la
purificación de las fracciones mediante una cromatografía de
intercambio aniónico convencional (por ejemplo, usando mono
Q-sefarosa o Q-sefarosa) y desalando
la misma de un modo convencional.
El LPS así obtenido es básicamente idéntico a
los LPSs que tienen un peso molecular de aproximadamente 5.000 a
unos 6.000, tal como se menciona en
JP-A-4-187640,
JP-A-4-49240,
JP-A-4-99481 y
JP-A-5-155778. El
LPS purificado es sometido a una filtración del gel en presencia de
un agente tensoactivo como el deoxicolato sódico para recuperar
solamente fracciones que contienen LPS de bajo peso molecular, por
lo que solamente se obtiene un LPS de bajo peso molecular altamente
puro al retirar el LPS de elevado peso molecular de las fracciones.
El procedimiento de la filtración en gel en presencia de un agente
tensoactivo se lleva a cabo para purificar los LPSs que tienen un
peso molecular de aproximadamente 5.000 a 6.000 que se muestran en
JP-A-4-187640,
JP-A-4-49240 y
JP-A-5-155778, en
los que el LPS de alto peso molecular se ha retirado totalmente de
las fracciones.
El término "crustáceos" aquí utilizado se
refiere a todos los bogavantes, camarones, langostas, langostinos
como el camarón kuruma (Penaeus japonicus) o langostino tigre
japonés, langostino jumbo (Penadeus monodon), langostino
carnoso (Penaeus chinensis) y langostino banana (Penaeus
morguiensis), y a todos los cangrejos como el Portunus
trituberculatus y al cangrejo Chinese mitten,
preferiblemente bogavantes, langostas o langostinos, más
preferiblemente langostinos. El término "peces" aquí utilizado
incluye todos los peces como los de cola amarilla, los peces globo,
brama, besugo, pargo, dorada, pez plano, anguila y la trucha. Las
enfermedades infecciosas a las que aquí se hace referencia incluyen
la viremia aguda de los crustáceos, la parasitosis como
Bpistylis sp., Zoothamnium sp. o la micosis como
Lagenidium sp., Siropidium sp., enfermedades infecciosas en
los peces causadas por el iridovirus, rhabdovirus, la neuronecrosis,
la necrosis infecciosa del órgano hemopoyético, la
pseudotuberculosis, enfermedades estreptocócicas, enfermedades
debidas al estreptococo, enfermedades por vibrios, enfermedad del
agua fría, enfermedades por la pseudomonas, enfermedades por
bacterias reptantes y enfermedades por la Saprolegnia, y todo tipo
de infecciones causadas por virus, micoplasmas, bacterias, hongos y
parásitos entre las cuales se pueden utilizar de forma eficaz el
aditivo de los alimentos y el propio alimento de la invención para
la viremia de los crustáceos, y enfermedades de peces como las
enfermedades estreptocócicas, las enfermedades por enterococos y
enfermedades por vibrios.
El LPS de bajo peso molecular de la presente
invención se puede utilizar como aditivo alimenticio para
crustáceos y peces, y con esta finalidad, se puede utilizar como
tal o bien mezclado con portadores convencionales, estabilizadores
y similares y opcionalmente con vitaminas, aminoácidos, minerales y
como nutrientes, antioxidantes, antibióticos, agentes
antibacterianos y otros aditivos. El aditivo alimenticio se prepara
de forma adecuada como polvo, gránulos, escamas o suspensiones.
Dicho aditivo se puede administrar a crustáceos y peces sólo o
mezclado con algún tipo de alimento Para prevenir enfermedades, el
aditivo alimenticio se suministra junto con el alimento o bien como
máximo media hora después de su alimentación.
Los alimentos de la presente invención no se
encuentran específicamente limitados pero básicamente son alimentos
en polvo, alimentos sólidos, gránulos, gránulos secos, gránulos
extruidos y cebos o carnada vivos.
La proporción de LPS de bajo peso molecular en
el alimento de la invención se puede seleccionar entre una gama
amplia y se sitúa preferiblemente entre un 0,000001 y un 0,001% en
peso, más preferiblemente entre un 0,00002 y un 0,00005% en peso y
no se encuentra limitada a dicha proporción. La cantidad de LPS de
bajo peso molecular que se utilizará se determina de forma
apropiada. Por ejemplo, el LPS se aplica en una dosis diaria de 1 a
100 \mug, preferiblemente de 10 a 20 \mug, por kilo de peso
corporal de crustáceo o pez, pero esta dosis no está limitada.
La presente invención se describirá con detalle
con los siguientes ejemplos, pero de ningún modo se limita a ellos.
El LPS de bajo peso molecular utilizado en los ejemplos es LPS que
tiene un peso molecular de aproximadamente 5.000 y el LPS de
elevado peso molecular es el LPS que tiene un peso molecular de unos
8.000 a 50.000.
Ejemplo de referencia
1
Una cantidad de 10 g de triptona (producto de
DIFCO CO.), 5 g de extracto de levadura (producto de DIFCO CO.) y
10 g de NaCl (producto de WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD., grado
especial) se añadían a 1 litro de agua destilada. La suspensión se
ajustaba a un pH de 7,5 con NaOH y se esterilizaba en autoclave. Se
separaba solamente una colonia de bacterias que llevan Pantoea
agglomerans mantenida a -80ºC y se inoculaba en un frasco Sakaguchi
de 500 ml de volumen que contiene 100 ml de un medio de cultivo que
contiene glucosa estéril (producto de WAKO PURE CHEMICAL
INDUSTRIES, LTD., grado especial) en una proporción del 0,1%
(conocido de ahora en adelante como medio de cultivo L). Luego las
células se sometían a una agitación durante la noche a 35ºC. Las
células cultivadas se inoculaban en su totalidad en un frasco
Sakaguchi de 3 litros de volumen que contenía 1000 ml de caldo de
cultivo L y se cultivaban de nuevo tal como se ha mencionado.
Las células cultivadas se inoculaban en un
fermentador de sobremesa de 10 litros de volumen (producto de
MARUBISHI BIOENGI CO.) que contenía 7 litros de caldo de cultivo L
y se sometían a un cultivo de aireación en las mismas condiciones.
Se recogían las células y se recuperaban unos 70 g de bacterias
húmedas y se guardaban congeladas. Aproximadamente 70 g de las
células guardadas congeladas se suspendían en 500 ml de agua
destilada. Se añadía a la suspensión un volumen de 500 ml de fenol
caliente al 90%. La mezcla se agitaba a 65ºC hasta 70ºC durante 20
minutos y se enfriaba. La mezcla se centrifugaba a 10.000 G y 4ºC
durante 20 minutos para recuperar la capa acuosa. La capa de fenol
se trataba del mismo modo. Luego las dos capas acuosas así obtenidas
se combinaban y dializaban durante la noche para extraer el fenol.
La solución interna se concentraba por ultrafiltración en nitrógeno
gas usando un dispositivo de ultrafiltración (producto de ADVANTEC
TOYO CO., K-200) con un filtro de membrana.
El producto liofilizado de LPS crudo así
obtenido se disolvía en agua destilada, el filtro se esterilizaba,
se añadía un tampón y la solución se sometía a cromatografía de
intercambio aniónico (producto de PHARMACIA Co., primer flujo de
Q-sefarosa). La solución de muestra se hacía pasar a
través de la columna usando un tampón que contiene
Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) y NaCl 10 mM para eluir una
fracción activa de limulus con Tris-HCl 10 mM/NaCl
200 a 400 mM (pH 7,5). EL eluido se sometía a ultrafiltración en las
mismas condiciones a las de antes para la desalación y
concentración y se liofilizaba para obtener unos 300 mg de LPS
purificado de aproximadamente 70 g de bacterias húmedas.
El LPS purificado obtenido (100 mg) se disolvía
en un tampón solubilizante (que comprende un 3% de deoxicolato
sódico, producto de WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES LTD., cloruro
sódico 0,2M, EDTA-2Na 5 mM y ácido
tris-clorhídrico 20 mM pH 8,3). La solución de LPS
purificada (20 ml) se colocaba suavemente sobre la columna Sephacryl
S-200 HR (producto de PHARMACIA CO.). Luego se
eluían 800 ml (50 horas) de la solución con un tampón eluyente (que
comprende un 0,25% de deoxicolato sódico (producto de WAKO PURE
CHEMICAL INDUSTRIES LTD.), cloruro sódico 0,2M, EDTA 5 mM y ácido
tris-clorhídrico 10 mM, pH 8,3) a una velocidad de
flujo de
16 ml/hr.
16 ml/hr.
El eluido obtenido se fraccionaba mediante un
colector de fraccionamiento (producto de ADVANTEC CO., nombre
comercial SF 2120) controlando la velocidad del flujo usando una
bomba peristáltica PI (producto de PHARMACIA CO.). Se desechaba una
primera proporción de 240 ml (fracción 24). A continuación, el
residuo se fraccionaba en 80 fracciones a 10 ml/fracción. El
sacárido de las fracciones eluidas se determinaba de forma
cuantitativa usando la solución de base o la solución diluida según
el método del fenol/ácido sulfúrico (Sakuzo FUKUI, "Method of
Quantitative Determination of Reducing Sugar", 2nd ed., pp. 50 a
52, Gakkai Suppan Center, 1990) para verificar el estado de la
elución. El modelo de fracción de LPS se investigaba utilizando el
método SDS-PAGE y 0,5 ml de cada una de las
fracciones 37 a 55 entre las fracciones que presumiblemente tienen
LPS (fracciones 30 a 60).
El resultado de la investigación demuestra que
las fracciones 45 a 55 contenían solamente LPS de bajo peso
molecular (p.m. aprox. 5000) y que las fracciones 37 a 44 contenían
tanto LPS de bajo peso molecular como LPS de alto peso molecular.
Las fracciones de LPS de bajo peso molecular o sea las fracciones
45 a 55 se purificaban luego del modo siguiente.
Las fracciones se mezclaban, liofilizaban y
suspendían en etanol. La suspensión se centrifugaba para eliminar
el ácido deoxicólico soluble en etanol y recuperar un LPS de bajo
peso molecular en fracciones insolubles. El tratamiento con etanol
de las fracciones de LPS de bajo peso molecular se repetía dos
veces, seguida de la retirada del ácido deoxicólico. El LPS
obtenido se suspendía de nuevo en etanol del 70%, y el componente
tampón se retiraba mediante centrifugación. El mismo procedimiento
se repetía tres veces para la recuperación del LPS de bajo peso
molecular en las fracciones insolubles, seguido de la liofilización,
de manera que se producían unos 20 mg de LPS de bajo peso molecular
purificados.
Los langostinos japoneses que tienen un peso
medio de 20 g se dividían en 5 grupos de 20 langostinos cada uno.
El LPS de bajo peso molecular de la presente invención se
administraba por vía intramuscular al tercer segmento abdominal de
los langostinos en los grupos 1 y 2 en una dosis de 50 mg y de 100
mg, respectivamente, por kilogramo de peso de langostino. Por otro
lado, se administraba un LPS de elevado peso molecular (derivado
del E. coli, E.coli 0111 fabricado por DIFCO CO.) por
vía intramuscular al tercer segmento abdominal de los langostinos
en los grupos 3 y 4 en una dosis de 10 mg y 20 mg, respectivamente
por kilo de peso de langostino. El grupo 5 recibía una solución
salina fisiológica sin LPS. La vida o muerte de los langostinos se
verificaba hasta 120 horas después de la administración con el fin
de determinar una mortalidad. Los resultados se muestran en la
tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se muestra en la tabla 1, la mortalidad
de los langostinos en los grupos que reciben 10 mg o 20 mg de LPS
de elevado peso molecular era del 65% o del 100%, respectivamente,
mientras que no moría ningún langostino en los grupos que recibían
50 y 100 mg de LPS de bajo peso molecular. Queda claro que los LPS
de bajo peso molecular son muy seguros para los langostinos en
comparación con los LPS convencionales de elevado peso
molecular.
\vskip1.000000\baselineskip
Las carpas negras que tienen un peso medio de 85
g se dividían en 3 grupos de 40 carpas cada uno. Los LPS de bajo
peso molecular de la presente invención se administraban por vía
intramuscular en la región dorsal de las carpas negras en el grupo
1 en una dosis de 100 mg por kilogramo del peso de la carpa. Por
otro lado, un LPS convencional de peso molecular elevado (nombre
comercial E. coli 0111 fabricado por DIFCO CO.) se
administraba por vía intramuscular a la región dorsal de las carpas
negras en el grupo 2 en una dosis de 20 mg por kilogramo del peso
de la carpa. El grupo 3 recibía una solución salina fisiológica
libre de LPS. La vida o muerte de las carpas negras hasta 120 horas
después de la administración se revisaba para determinar una
mortalidad. Los resultados se muestran en la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como muestra la tabla 2, la mortalidad de
las carpas negras era del 85% en el grupo que recibe 20 mg de LPS
de bajo peso molecular, mientras que no moría ninguna carpa negra en
el grupo que recibía 100 mg de LPS de bajo peso molecular. A partir
de estos datos queda claro que el LPS d bajo peso molecular de la
presente invención es bastante seguro para los peces si se compara
con el LPS de elevado peso molecular.
Los langostinos japoneses que tienen un peso
medio de 20 g se dividían en 6 grupos de 20 langostinos cada uno.
Los grupos 1, 2 y 3 recibían los LPSs de bajo peso molecular de la
presente invención mezclados con el alimento en una dosis diaria de
20, 40 y 100 \mug respectivamente por kilogramo de peso de
langostino. Por otro lado, el grupo 4 recibía un LPS de alto peso
molecular mezclado con un alimento en una dosis diaria de 100
\mug, y el grupo 5 recibía lo mismo en una dosis diaria de 1000
\mug por kilo de peso de langostino.
Los alimentos se administraban durante 7 días.
El grupo 6 recibía un alimento sin LPS. El día 0, día 1, día 5 y
día 7 después del suministro de los alimentos, se recogía la sangre
del nicho o cavidad del tórax de los langostinos usando una jeringa
que contenía un medio de cultivo K-199 con
L-cisteina como anticoagulante. Las células de
hemocitos se obtenían por centrifugación. Las células obtenidas
(1x10^{5} células por microlitro de suspensión) se mezclaban con
1x10^{8} perlas de látex (1.986 \mum de diámetro) y reaccionaba
a 25ºC durante 30 minutos. Tras fijar la mezcla de reacción con
glutaraldehido, se secaba al aire. Luego la mezcla se sometía a una
tinción de Giemsa y se fijaba a un portaobjetos de vidrio con
Eukitt. El mismo procedimiento se repetía para obtener cinco
muestras por camarón. Las células de hemocito (200 células por
muestra) se observaban al azar bajo un microscopio
epi-fluorescente con el fin de determinar el índice
de fagocitosis de las perlas látex en los hemocitos y el número de
perlas látex fagocitadas en una célula de hemocito. Luego el índice
de fagocitosis se calculaba según la ecuación siguiente. El cociente
de fagocitosis =
(número de células de hemocito que captan perlas /número total de células de hemocito observadas) x 100.
(número de células de hemocito que captan perlas /número total de células de hemocito observadas) x 100.
Número medio de perlas captadas por las células
de hemocito = número de perlas captadas por las células de hemocito
/número de células de hemocito que captan perlas.
Índice de fagocitosis = (número de células de
hemocitos que captan perlas /número total de células de hemocitos
observadas) x (número de perlas captadas por las células de
hemocito/número total de células de hemocito observadas) x100.
Resultados de la prueba: La biofilaxis de los crustáceos implica a
un factor celular y a un factor líquido. La fagocitosis de las
partículas extrañas en los hemocitos hace referencia a lo
anterior.
Cuando la fagocitosis de las partículas extrañas
en los hemocitos de camarón se examina, se aclara si se ha activado
el mecanismo defensivo de los camarones. (Yukinori TAKAHASHI y
cols., Research of Fish Diseases, 30(2), pp. 141 a 150,
(1995)). A la vista de dicha teoría, el índice de fagocitosis se
determinaba el día 0, el día 1, el día 5 y el día 7 después del
suministro de alimentos para los grupos que recibían LPSs de
elevado peso molecular y para los grupos que reciben los LPSs de
bajo peso molecular. Los resultados se registraban en la tabla
3.
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Tal como se deduce de la tabla 3, los grupos que
reciben los LPSs de bajo peso molecular (presente invención)
presentaban un índice de fagocitosis mayor en los hemocitos de los
camarones que el grupo 6 y una diferencia significativa en este
índice del grupo 6 (P<0,01, P<0,05). El grupo que recibe 100
\mug de LPS convencional de peso molecular elevado era incapaz de
incrementar el índice de fagocitosis en los hemocitos de los
camarones al cabo de 1, 5 y 7 días. Sin embargo, el grupo que
recibe 1000 \mug de LPS de elevado peso molecular presentaba un
índice de fagocitosis bastante superior en los hemocitos de los
camarones (P<0,05) al del grupo 6 al cabo de 5 y 7 días.
Los datos anteriores demuestran que los LPSs de
bajo peso molecular de la presente invención pueden activar el
mecanismo de defensa como la fagocitosis en los hemocitos de los
camarones incluso cuando se utilizan en una cantidad extremadamente
inferior a la de los LPSs de elevado peso molecular.
Los langostinos japoneses que tienen un peso
medio de 20 g se dividían en 6 grupos de 20 langostinos cada uno.
Los grupos 1, 2 y 3 recibían los LPSs de bajo peso molecular de la
presente invención mezclados con el alimento en una dosis diaria de
20, 40 y 100 \mug respectivamente por kilogramo de peso de
langostino. Por otro lado, el grupo 4 recibía un LPS de alto peso
molecular mezclado con un alimento en una dosis diaria de 100
\mug, y el grupo 5 recibía lo mismo en una dosis diaria de 1000
\mug por kilo de peso de langostino. Los alimentos se
administraban durante 7 días. El grupo 6 recibía un alimento sin
LPS. El día 0, día 1, día 5 y día 7 después del suministro de los
alimentos, se recogía la sangre del nicho o cavidad del tórax de los
langostinos usando una jeringa que contenía un medio de cultivo KHE
con EDTA. Las células de hemocitos se obtenían por centrifugación
de la sangre recogida. Las células obtenidas se suspendían en un
medio de cultivo Ca-Mg Hepes hasta una
concentración de 1x10^{6} células/ml. Las células se trituraban
por congelación y ondas supersónicas. El sobrenadante se separaba
mediante centrifugación y se filtraba con un filtro de membrana. El
filtrado obtenido (900 \mul) se mezclaba con 100 \mul de
solución L-DOPA como una solución de sustrato. A
continuación, la mezcla se hacía reaccionar a una temperatura de
60ºC durante 60 minutos. Luego se medía la absorbancia a 490 nm
mediante un espectrofotómetro para evaluar la actividad de la
oxidasa del fenol (actividad de PO).
Resultados de la prueba: La biofilaxis de los
crustáceos incluye un factor celular y un factor líquido. La
actividad de la PO en los hemocitos hace mucha referencia a estos
factores. Por tanto, analizando la actividad de la PO se aclara si
se activa el mecanismo defensivo de los camarones. La actividad de
la PO de los camarones se determinaba el día 0, día 1, día 5 y día
7 tras la alimentación de los grupos que recibían LPSs de bajo peso
molecular (presente invención) y de los grupos que recibían LPSs de
alto peso molecular. Los resultados se recogían en la tabla 4.
Tal como se puede deducir de la tabla 4, los
grupos que reciben los LPSs de bajo peso molecular (presente
invención) presentaban una actividad de PO superior que el grupo 6 y
una diferencia significativa en esta actividad del grupo 6
(P<0,01, P<0,05). El grupo que recibe los 100 \mug de LPS
convencional de elevado peso molecular no incrementaba en lo que se
refiere a su actividad de PO en los hemocitos de los camarones
hasta los 7 días. El grupo que recibe los 1000 \mug de LPS
convencional de elevado peso molecular presentaba una actividad en
PO notablemente superior en los hemocitos de los camarones
(P<0,05) que el grupo 6 después de 5 y 7 días.
Los datos mostrados indican que los LPSs de bajo
peso molecular de la presente invención pueden activar el mecanismo
defensivo como la actividad del PO en los hemocitos de los camarones
incluso cuando se utilizan en una cantidad extremadamente inferior
a los LPSs de elevado peso molecular.
Los langostinos japoneses que tienen un peso
medio de 14 g se dividían en 7 grupos de 20 langostinos cada uno.
Los grupos 1, 2 y 3 recibían los LPSs de bajo peso molecular de la
presente invención mezclados con el alimento en una dosis diaria de
20, 40 y 100 \mug respectivamente por kilogramo de peso de
langostino. Por otro lado, el grupo 4 recibía un LPS de alto peso
molecular mezclado con un alimento en una dosis diaria de 1000
\mug por kilo de peso de langostino. El grupo 5 recibía
peptidoglicano (PG) derivado del Bifidobacterium thermophilum
(patente nr. 2547371) mezclado con alimento en una dosis diaria de
0,2 mg (200 \mug), por kilo de peso del langostino. El grupo 6
recibía \beta-1,3-glucano
(1,3-G) derivado de Schizophyllum commune
(JP-B-6-65649)
mezclado con un alimento en una dosis diaria de 50 mg (50000 \mug)
por kilogramo de peso de langostino. El suministro de alimento
continuaba durante 18 días. El grupo 7 (grupo de control) recibía un
alimento sin LPS.
El día 8 tras el inicio del suministro de LPS,
se realizaba la prueba sobre la infección usando PRDV (penaeid
rod-shaped DNA virus) como un patógeno inductor de
una viremia aguda en los langostinos. Se retiraban los caparazones
del cefalotórax de tres camarones que habían muerto de viremia
aguda. El intestino de los camarones se machacaba y homogeneizaba
en 40 ml de agua de mar estéril. El residuo sobrenadante (10 ml) se
separaba por centrifugación (10.000 x g, 10 minutos, 4ºC) y se
añadía a 20 litros de agua de mar. El día 8 tras el inicio del
suministro de LPS, los camarones se infectaban con viremia aguda al
sumergirlos en el sobrenadante durante 2 horas. La vida o muerte de
los camarones se observaba durante 10 días después de la infección.
Los camarones muertos se examinaban patológicamente mediante el
método de la RCP (reacción en cadena de la polimerasa) para
confirmar si los camarones se habían muerto de la infección con
PRDV.
Resultados de la prueba: Las tablas 5 y 6
muestran el número total de camarones muertos y una mortalidad
después de la infección con PRDV en los grupos receptores de los
LPSs de bajo peso molecular de la presente invención, el grupo
receptor de LPS de alto peso molecular y el grupo receptor de
alimento sin LPS.
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Todos (100%) los camarones morían en el grupo de
control que recibía un alimento sin LPS hasta 9 días después de la
infección con PRDV. Por otro lado, un 20%, 35% y 40% de los
camarones moría en los grupos que recibían 20, 40 y 100 \mug,
respectivamente, de LPS de bajo peso molecular (presente invención).
En otras palabras, en estos grupos la mortalidad era baja y existe
una diferencia significativa (P<0,01) entre estos grupos y el
grupo de control. En contraste con ello, el 55% de los camarones se
moría en el grupo que recibía 1000 \mug de LPS de elevado peso
molecular, lo que significa que se morían más camarones en este
grupo que en los grupos que reciben el LPS de bajo peso molecular.
Los datos anteriores demuestran que los LPSs de bajo peso molecular
de la presente invención pueden impedir la infección vírica de los
camarones y que los LPSs de bajo peso molecular son más eficaces
que los LPSs convencionales de elevado peso molecular.
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Las colas amarillas de 230 g de peso más o menos
se dividían en 6 grupos de 20 colas amarillas cada uno. Los grupos
1,2 y 3 recibían los LPSs de bajo peso molecular de la presente
invención mezclados con gránulos húmedos en una dosis diaria de 20,
40 y 100 \mug, respectivamente por kilo de peso de la cola
amarilla. El grupo 4 recibía un LPS de elevado peso molecular
mezclado con gránulos húmedos en una dosis diaria de 1000 \mug,
por kilogramo de peso de la cola amarilla. Los peces eran
alimentados los 7 días. El grupo 6 recibía gránulos húmedos sin
LPS. El día 0, 1, 5 y 7 tras la alimentación, se cortaba un
pronefros de 5 colas amarillas. Luego se separaban las células de
hemocito en una placa de petri de plástico que contenían un medio de
cultivo RPMI-1640-HAH con un 0,25%
de NaCl. Las células se hacían pasar a través de un filtro celular
para lograr una suspensión celular. La suspensión se colocaba sobre
un gradiente de densidad Percoll discontinuo. A continuación se
formaba una capa de leucocitos por centrifugación (1600 rpm, a 4ºC
durante 20 minutos).
Se recogía la capa de leucocitos y se sometía a
un lavado centrífugo después del cual las células se volvían a
suspender en un medio de cultivo
RPMI-1640-H que incluye 0,25% de
NaCl y que contiene 10% de FBS (suero bovino fetal). EL número de
células de leucocito en la suspensión se ajustaba a 1x10^{6}
células/ml. La suspensión de leucocitos (500 \mul) y 500 \mul
de una suspensión (1x10^{8} células/ml) de hongos opsonizados con
suero de cola amarilla se colocaba en un tubo de ensayo de vidrio
tratado con silicona y se incubaba a 25ºC durante 60 minutos
agitando cada 10 minutos. Después de la incubación, se preparaban 5
frotis por cola amarilla, se sometían a una tinción de Wright y se
adjuntaban con Eukitt. Las células de hemocitos (200 células por
frotis) se observaban al azar bajo un microscopio óptico. Luego se
contaba el número de células de hongos fagocitadas en los
leucocitos. El índice de fagocitosis viene dado por la misma
ecuación que en el ejemplo 3. Los resultados se muestran en las
tablas 7 y 8.
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Tal como muestran las tablas 7 y 8, cualquier
grupo de colas amarillas que recibe los LPSs de bajo peso molecular
(presente invención) presentaba un índice de fagocitosis superior en
los leucocitos de las colas amarillas que el grupo 6 y una
diferencia significativa (P<0,01, P<0,05) en este índice del
grupo 6. Si embargo, el grupo que recibe 100 \mug de LPS
convencional de elevado peso molecular no presenta un incremento en
el índice de fagocitosis en los leucocitos de las colas amarillas
después de 7 días. El grupo que recibe 1000 \mug de LPS
convencional de elevado peso molecular mostraba un índice de
fagocitosis significativamente superior (P<0,01) en los
leucocitos de las colas amarillas que el grupo 6 después de 5 días.
Los datos mencionados indican que los LPSs de bajo peso molecular
de la presente invención pueden activar el sistema inmunitario de
los peces como la fagocitosis en los leucocitos en una cantidad
extremadamente inferior que los LPSs convencionales de elevado peso
molecular.
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Las colas amarillas con un peso de 63 g en
promedio se dividían en 5 grupos de 30 colas amarillas cada uno.
Los grupos 1, 2 y 3 recibían los LPSs de bajo peso molecular de la
presente invención mezclados con gránulos húmedos en una dosis
diaria de 20, 40 y 100 \mug, respectivamente, por kilogramo de
peso de cola amarilla. El grupo 4 recibía un LPS de elevado peso
molecular mezclado con los gránulos húmedos en una dosis diaria de
1000 \mug por kilogramos de peso de cola amarilla. El grupo 5
(control) recibía gránulos húmedos sin LPS. El día 7 después de la
alimentación, las colas amarillas eran inoculadas por vía
intraabdominal con Enterococo Seriolicida como un patógeno causante
de la enfermedad del enterococo de la cola amarilla en una cantidad
de 4.0x10^{6} células por cola amarilla. Se establecía una
mortalidad 15 días después de la inoculación. Los resultados se
muestran en las tablas 9 y 10.
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El día 15 después de la inoculación de
E.Seriolicida, un 73,3% de las colas amarillas se moría en el grupo
de control que recibía alimento sin LPS. En contraste con ello, una
mortalidad baja aparece en los grupos que reciben los LPSs de bajo
peso molecular de la presente invención, es decir, un 13,3% del
grupo receptor de 20 \mug, un 26,7% del grupo receptor de 40
\mug y un 23,3% del grupo receptor de 100 \mug. En otras
palabras, existe una diferencia significativa (P<0,05) en la
mortalidad entre estos grupos y el grupo de control. Por otro lado,
una mortalidad del 36,7% era el resultado del grupo que recibía 100
\mug de LPS de elevado peso molecular. Este grupo mostraba una
mortalidad superior que los grupos receptores de LPSs de bajo peso
molecular. Los resultados mencionados demuestran que los LPSs de
bajo peso molecular de la presente invención pueden proteger a los
peces de una infección vírica y son más eficaces que los LPSs
convencionales de elevado peso molecular.
De acuerdo con la presente invención, se dispone
de un aditivo alimenticio seguro para el crecimiento de crustáceos
y peces, que es capaz de prevenir las enfermedades infecciosas ya
que activa de forma apropiada su función inmunitaria intrínseca
incluso cuando se emplea en una pequeña cantidad, siendo capaz de
prevenir la muerte de crustáceos y peces, y sin ningún tipo de
problemas de riesgo para la salud pública como los ocasionados por
algunos aditivos que son ingeridos por los crustáceos y peces.
Claims (11)
1. Un aditivo alimenticio para crustáceos o
peces, que se caracteriza por que se prepara a partir de
bacterias gram-negativas, que se encuentra
básicamente libre de lipopolisacáridos de alto peso molecular, que
contiene un lipopolisacárido de bajo peso molecular con un peso
molecular de 5000 +/- 2000 como componente eficaz, según el método
SDS-PAGE que utiliza un marcador proteínico, y que
es capaz de activar la inmunidad o impedir la infección en los
crustáceos o peces.
2. Un aditivo alimenticio para crustáceos o
peces que comprende el lipopolisacárido de bajo peso molecular de
la reivindicación 1 y un portador aceptable para crustáceos y
peces.
3. Uso de lipopolisacáridos de bajo peso
molecular de la reivindicación 1 para la preparación de aditivos
alimenticios para crustáceos o peces
4. Un agente para prevenir el peligro de
crustáceos o peces que comprende el lipopolisacárido de bajo peso
molecular de la reivindicación 1 como un componente efectivo.
5. Un agente para prevenir el peligro de
crustáceos o peces conforme a la reivindicación 4 que comprende
además un portador aceptable para crustáceos y peces.
6. Uso de lipopolisacáridos de bajo peso
molecular de la reivindicación 1 para la preparación de un agente
para prevenir el peligro de crustáceos o peces.
7. Un aditivo alimenticio conforme a la
reivindicación 1, en el que las bacterias
gram-negativas son las que pertenecen al género
Pantoea.
8. Un aditivo alimenticio conforme a la
reivindicación 7, en el que las bacterias
gram-negativas son las Pantoea agglomerans.
9. Un alimento para crustáceos o peces que
comprende el aditivo alimenticio de la reivindicación 1.
10. Un aditivo alimenticio conforme a la
reivindicación 1, en el que la enfermedad infecciosa es una viremia
aguda de crustáceos, sus enfermedades por vibrios, la parasitosis o
micosis; las enfermedades infecciosas de los peces causadas por el
iridovirus, las enfermedades provocadas por el rhabdovirus, la
neuronecrosis, la necrosis infecciosa del órgano hemopoyético, la
pseudotuberculosis, las enfermedades estreptocócicas, enfermedades
por enterococos, enfermedades por vibrios, enfermedad del agua fría,
enfermedades por pseudomonas, enfermedades por bacterias reptantes
o enfermedades por Saprolegnia.
11. Un aditivo alimenticio conforme a la
reivindicación 1, en el que el lipopolisacárido de alto peso
molecular es uno que tiene un peso molecular de al menos 8.000.
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