CN115029267B

CN115029267B - 一种对虾用抗病促生长的复合型饲料添加剂及其应用

Info

Publication number: CN115029267B
Application number: CN202210696699.4A
Authority: CN
Inventors: 汤峰; 骆伟; 李伟; 王江
Original assignee: Juxin Bioengineering Shandong Co ltd; Juxin Bioengineering Co ltd
Current assignee: Juxin Bioengineering Co ltd; Juxin Bioengineering Shandong Co ltd
Priority date: 2022-06-20
Filing date: 2022-06-20
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2042-06-20
Also published as: CN115029267A

Abstract

本发明公开了一种对虾用抗病促生长的复合型饲料添加剂及其应用，该饲料添加剂中包括肉桂醛和铁载体高产菌株。该铁载体高产菌株为泛菌属(Pantoea sp)SDVGh3，该菌株于2021年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20211699。本发明中的饲料添加剂中的植物提取物和益生菌能够相互配合，从而起到改善肠道健康、降低饲料转化率、增强免疫功能、提高生产性能等多重显著功效，且其使用安全、无残留及毒副作用，可减少或替代抗生素的使用，符合绿色健康养殖理念，具有极高的应用前景和实用价值。

Description

一种对虾用抗病促生长的复合型饲料添加剂及其应用

技术领域

本发明属于水产养殖和动物饲料领域，具体涉及一种对虾用抗病促生长的复合型饲料添加剂及其应用。

背景技术

据联合国粮农业组织(FAO)统计数据显示，2018年世界水产养殖总产量为8210万吨，产值约为2500亿美元，其中凡纳滨对虾产量未497万吨，产值约为305亿美元，分别占世界水产养殖总产量的6％和产值的12.2％，可以看出对虾养殖已成为水产养殖业的重要支柱产业之一。但近年来，水产病害问题始终是制约对虾养殖业健康发展的瓶颈问题，对虾病害的发生往往会给对虾养殖业造成了巨大经济损失。相关技术中，对于对虾的病害防治，主要还是依靠化学药物和抗生素。但通过使用化学药物和抗生素预防病原爆发容易导致环境污染、病原生物耐药性增强，而且还会通过食物链直接危害人类健康，具有较大的潜在危害性。

因此，开发一种环境友好型的、消杀效果显著且兼具促生长功效的多功能性对虾用复合型饲料添加剂对于对虾养殖行业的健康发展以及水产领域抗生素替代品的开发均具有极为重要的意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种对虾用抗病促生长的复合型饲料添加剂及其应用。在本发明中，发明人发现并分离得到了一株铁载体高产菌株，并基于该菌株与肉桂醛的组合制备得到了一种环境友好型的、消杀效果显著、免疫保护效果强且兼具促生长功效的多功能性对虾用复合型饲料添加剂。

本发明的第一个方面，提供一株铁载体高产菌株，所述铁载体高产菌株为泛菌属(Pantoea sp)SDVGh3，所述铁载体高产菌株于2021年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 20211699。保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。

在本发明的一些实施方式中，所述铁载体高产菌株被发现并分离于凡纳滨对虾肠道。

在本发明的一些实施方式中，所述铁载体高产菌株的活化条件为：KMB培养基中2～4℃、140～180r/min条件下活化18～24h。

在本发明的一些实施方式中，所述铁载体高产菌株的活化条件为：KMB培养基中2℃、160r/min条件下活化24h。

KMB培养基为本领域中已知的商品化培养基，其成分包括蛋白胨20g，无水氯化镁1.4g，无水硫酸钾10g，琼脂15g，甘油10mL，蒸馏水1L。制备方法为将上述成分加热、溶解，pH调至7.2，118～121℃灭菌15min即可。

当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，合理使用其他培养基用于铁载体高产菌株的活化，包括但不限于KMB培养基。

在本发明的一些实施方式中，所述铁载体高产菌株的培养条件为：24～36℃条件下在盐度为0～30‰且含有0.01～10mmol/L的Fe³⁺的KMB液体培养基(pH为7.5～9.0)。

在本发明的一些实施方式中，所述铁载体高产菌株的培养条件为：28℃条件下在盐度为0且含有0.01mmol/L的Fe³⁺的KMB液体培养基(pH为7.5)。

当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，合理调整铁载体高产菌株的培养条件，使其能够实现扩繁，可调整的条件包括但不限于温度、盐度、铁离子含量和pH。

本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的铁载体高产菌株在制备动物饲料或饲料添加剂中的应用。

根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述动物包括水产动物。

在本发明的一些实施方式中，所述动物为虾。

在本发明的一些实施方式中，所述动物为对虾。

本发明的第三个方面，提供一种对虾饲料添加剂，所述饲料添加剂中包括肉桂醛和本发明第一个方面所述的铁载体高产菌株。

在本发明实施例中，发明人发现通过使用肉桂醛与铁载体高产菌株联用能够很好的配合作用，也可以有效克服现有技术中的相关缺陷。其中，肉桂醛作为一种植物提取物，具有多种生物功效，且根据现有技术中的公开情况肉桂醛无明显毒副作用，也不易产生抗药性，能够有效的替代抗生素药物。而铁载体高产菌株作为一株肠道有益菌株，一方面不存在毒性问题，也不会对机体带来有危害的物质，另一方面还能够调节肠道的菌群平衡，促进机体的生长和抗病性能。通过植物提取物和肠道有益菌的双重功效，能显著抑制对虾病害的发生，已成为对虾养殖业替代化学药物和抗生素的新型替代品。

此外，肉桂醛为农业部允许在饲料中长期添加使用的原材料，其于2012年将其纳入食品添加剂国家安全标准(GB 28346-2012)，从而可以表明该原料在饲料领域具有安全性、常规性、易得性的特点。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，按质量分数计，所述饲料添加剂中包括40％～60％的肉桂醛和40％～60％的本发明第一个方面所述的铁载体高产菌株。

在本发明的一些实施方式中，按质量分数计，所述饲料添加剂中包括50％的肉桂醛和50％的本发明第一个方面所述的铁载体高产菌株。

在本发明的一些实施方式中，所述饲料添加剂中还包括辅料。

在本发明的一些实施方式中，所述辅料包括载体、粘合剂、分散剂、溶剂、增稠剂、调味剂、着色剂、酸度调节剂中的至少一种。

当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择其他本领域中的常规辅料，包括但不限于载体、粘合剂、分散剂、溶剂、增稠剂、调味剂、着色剂、酸度调节剂。

在本发明的一些实施方式中，所述铁载体高产菌株的有效菌活数大于等于1×10⁷cfu/g。

在本发明的一些实施方式中，所述铁载体高产菌株的有效菌活数为1×10⁷cfu/g～1×10⁸cfu/g。

在本发明的一些实施方式中，所述饲料添加剂的制备方法为：取铁载体高产菌株进行活化并扩繁后与肉桂醛和基础饲料混合后即可。

本发明的第四个方面，提供本发明第二个方面所述的对虾饲料添加剂在下述(1)～(4)中至少一项中的应用；

(1)制备水产动物免疫增强产品中的应用；

(2)制备水产动物细菌感染预防或抗细菌感染产品中的应用；

(3)制备水产动物促生长产品中的应用；

(4)制备水产动物抗生素替代产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述对虾饲料添加剂在饲料中的添加量为0.5～3g/kg。

在本发明的一些实施方式中，所述对虾饲料添加剂在饲料中的添加量为0.8～1.6g/kg。

在本发明的一些实施方式中，所述对虾饲料添加剂中，肉桂醛在饲料中的添加量为0.8g/kg，铁载体高产菌株的在饲料中的添加量也为0.8g/kg。

在本发明的一些实施方式中，所述饲料为常规水产饲料。

在本发明的一些实施方式中，所述饲料为常规虾饲料。

在本发明的一些实施方式中，所述饲料中的组分包括：鱼粉、豆粕、花生粕、酵母粉4％、小麦粉、植物油、大豆磷脂、乳酸钙、磷酸二氢钙、复合维生素、复合矿物质。

在本发明的一些实施方式中，以质量分数计，所述饲料中的组分包括：鱼粉33％、豆粕20％、花生粕13.8％、酵母粉4％、小麦粉18％、植物油1.5％、大豆磷脂4％、乳酸钙0.5％、磷酸二氢钙2.6％、复合维生素0.6％、复合矿物质2％。

当然，本领域技术人员也可以采用其他的对虾常规饲料进行配合使用，所使用的对虾饲料类型不影响上述对虾用抗病促生长植物提取物和益生菌复合饲料添加剂的使用效果，因此，本领域技术人员可以理解的是，在本发明中，可采用的配合饲料包括但不限于上述饲料。

本发明的有益效果是：

1.本发明筛选并分离得到了一株铁载体高产菌株，并发现该菌株能明显促进凡纳滨对虾生长、免疫防御能力，增强肠道菌群健康，具有应用于水产养殖中的潜力。

2.本发明提供了一种对虾用抗病促生长植物提取物和益生菌复合饲料添加剂，其由植物提取物和益生菌组成，两者搭配使用时，能够达到协同增效的效果，其中，益生菌对植物提取物代谢有促进作用，其能够加强消化道运动，加快药物吸收；而植物提取物在经肠道菌群反应、代谢后可产生大量具有有效治疗活性的成分，抑制或消除病原微生物，提高机体免疫水平，达到预防疾病的目的。而植物提取物同时还能促进益生菌增殖，并预防病原的侵入，为益生菌的增殖扫清障碍。

3.本发明中的对虾用抗病促生长植物提取物和益生菌复合饲料添加剂具有改善肠道健康、降低饲料转化率、增强免疫功能、提高生产性能等多重显著功效，使用安全、无残留及毒副作用，可减少或替代抗生素的使用，符合绿色健康养殖理念。

附图说明

图1为本发明实施例中的不同实验组对虾血浆抗菌活力的对比图，其中不同字母代表具有显著性，同一字母代表无显著性。

图2为本发明实施例中的不同实验组对虾血浆溶菌活力的对比图，其中不同字母代表具有显著性，同一字母代表无显著性。

图3为本发明实施例中的不同实验组经攻毒后的对虾免疫保护率的对比图，其中不同字母代表具有显著性，同一字母代表无显著性。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

在本发明实施例中，发明人发现了一株铁载体高产菌株SDVGh3，该菌株经鉴定为泛菌属(Pantoea sp)，分类学命名为：Pantoea sp SDVGh3。该铁载体高产菌株SDVGh3已于2021年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。保藏编号为：CCTCC NO:M 20211699。

该菌株分离于凡纳滨对虾肠道，具体获得方法为：

(1)采取Z字划线法在平板上纯化从凡纳滨对虾肠道中分离出的细菌，获得单个菌落。

(2)使用铬天青S(Chromeazurol S,CAS)琼脂平板定性分离出的菌株是否具备产生铁载体的能力，然后采用CAS检测液定量法来定量具有产生铁载体的能力的菌株的铁载体产量，得到铁载体高产菌株。

(3)分析该铁载体高产菌株的16s rRNA基因，并根据GenBank数据库分析测序结果进行分类。

实施例1

一种对虾用抗病促生长植物提取物和益生菌复合饲料添加剂。

在本实施中，对虾用抗病促生长植物提取物和益生菌复合饲料添加剂的制备原料包括：按质量分数计，40％肉桂醛(CAS：104-55-2)和60％上述实施例中的铁载体高产菌株SDVGh3。

具体制备方法为：

(1)铁载体高产菌株SDVGh3的活化与培养：

取铁载体高产菌株SDVGh3接种于KMB培养基(Kings Medium B Agar)中，在2℃、160r/min条件下活化24h，得到活化菌液。然后以1％的接种量接种到盐度为0且含有0.01mmol/L的Fe³⁺的KMB液体培养基(pH为7.5)中，在28℃条件下孵育过夜，得到铁载体高产菌株SDVGh3菌液。

(2)按照上述质量分数比，将肉桂醛和铁载体高产菌株SDVGh3独立或者组合包装即得。

实施例2

在本实施中，对虾用抗病促生长植物提取物和益生菌复合饲料添加剂的制备原料包括：按质量分数计，45％肉桂醛(CAS：104-55-2)和55％上述实施例中的铁载体高产菌株SDVGh3。

制备方法同实施例1

实施例3

在本实施中，对虾用抗病促生长植物提取物和益生菌复合饲料添加剂的制备原料包括：按质量分数计，50％肉桂醛(CAS：104-55-2)和50％上述实施例中的铁载体高产菌株SDVGh3。

制备方法同实施例1

实施例4

在本实施中，对虾用抗病促生长植物提取物和益生菌复合饲料添加剂的制备原料包括：按质量分数计，55％肉桂醛(CAS：104-55-2)和45％上述实施例中的铁载体高产菌株SDVGh3。

制备方法同实施例1

实施例5

在本实施中，对虾用抗病促生长植物提取物和益生菌复合饲料添加剂的制备原料包括：按质量分数计，60％肉桂醛(CAS：104-55-2)和40％上述实施例中的铁载体高产菌株SDVGh3。

制备方法同实施例1

对虾用抗病促生长植物提取物和益生菌复合饲料添加剂的实际使用效果

在本实施例中，发明人上述实施例中制备得到的对虾用抗病促生长植物提取物和益生菌复合饲料添加剂与饲料混合后饲喂凡纳滨对虾，通过分析凡纳滨对虾的生长性能和非特异性免疫指标，验证上述对虾用抗病促生长植物提取物和益生菌复合饲料添加剂对于凡纳滨对虾生长性能和免疫应答的影响。

在本实施例中，实验用凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)购于山东省乳山市对虾养殖厂，体重为3.3±0.17g克。

在本实施例中，采用的对虾饲料为实验用基础饲料，其具体组分为：以质量分数计，鱼粉33％、豆粕20％、花生粕13.8％、酵母粉4％、小麦粉18％、植物油1.5％、大豆磷脂4％、乳酸钙0.5％、磷酸二氢钙2.6％、复合维生素0.6％、复合矿物质2％。

当然，本领域技术人员也可以采用其他的对虾常规饲料进行配合使用，所使用的对虾饲料类型不影响上述对虾用抗病促生长植物提取物和益生菌复合饲料添加剂的使用效果，因此，本领域技术人员可以理解的是，在本发明中，可采用的配合饲料包括但不限于上述实验用基础饲料。

实验用凡纳滨对虾在试验开始前需暂养7天以适应环境。然后将其随机分为4组，每组设置3个重复，每个重复组放养20尾虾。

具体分组情况如表1所示。

表1凡纳滨对虾分组和饲料添加剂使用情况

试验期间，每日投喂3次，日投喂量为体重的5％。试验期间水温、盐度和pH分别为24-25℃、31‰和7.8-8.0，以确保试验的准确性。

持续试验21天后，从各组中分别随机选取10尾虾进行攻毒实验(每个重复组10尾虾，每个实验组共30尾)。

攻毒试验采用哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)菌液进行攻毒，所用哈维氏弧菌为中国海洋大学水产动物环境生理研究室提供。

具体操作为：

取哈维氏弧菌菌液(浓度约为1×10⁷cell/mL)在试验用凡纳滨对虾尾节末端进行肌肉注射(注射量为50μL/尾)，攻毒7天后进行取样检测。

分别在试验第21天和攻毒7天后进行采样，采样前需停食24h，每个重复组随机取凡纳滨对虾10尾，称量对虾的体重，并统计每组攻毒前后的存活率。

其中，采用的具体操作为：

使用消过毒的5号针头和1mL注射器直接插入对虾头胸甲后缘围心腔内3mm左右进行采血。抽血前，注射器内需预先留有0.3mL预冷的凡纳滨对虾抗凝剂(其组分为：0.34MNaCl，0.01M KCl，0.01M EDTA-Na2，0.01M HEPES，pH 7.45，渗透压为780mOsm.kg^-1)，抽血时使抗凝剂和抽取出的血淋巴的比例为1:1。将上述操作获得的血淋巴样品于4℃下800g离心10min，取蓝色上清，即为血浆样品。

对血浆样品进行抗菌活力及溶菌活力的测定。根据收集的体重等数据分别计算存活率、增重率、特定生长率和饲料转化率。

其中，存活率、特定生长率和饲料转化率的计算公式分别为：

抗菌活力、溶菌活力的测定方法按照现有文献的方法操作，具体可参考：DanHULTMARK et al.,Insect Immunity.,Purification and Properties of ThreeInducible Bactericidal Proteins from Hemolymph of Immunized Pupae ofHyalophora cecropia,European Journal of Biochemistry,1980.DOI：10.1111/j.1432-1033.1980.tb05991.x.。计算免疫保护率。

其中，免疫保护率的计算公式为：

结果如表2和图1～3所示。

表2上述对虾用抗病促生长饲料添加剂对于凡纳滨对虾生长性能的影响

项目	对照组	实验组1	实验组2	实验组3
					初体重(g)	3.35±0.06<sup>a</sup>	3.35±0.06<sup>a</sup>	3.35±0.06<sup>a</sup>	3.35±0.06<sup>a</sup>
末体重(g)	5.63±0.72<sup>a</sup>	6.24±0.34<sup>ab</sup>	7.24±0.42<sup>b</sup>	7.61±0.75<sup>b</sup>
					存活率(％)	95.6±0.03<sup>a</sup>	97.8±0.03<sup>a</sup>	93.3±0.03<sup>a</sup>	97.8±0.03<sup>a</sup>
增重率(％)	80.23±25.38<sup>a</sup>	101.66±12.14<sup>ab</sup>	136.76±14.96<sup>b</sup>	149.77±26.43<sup>b</sup>
					特定生长率(％)	2.44±0.61<sup>a</sup>	2.96±0.26<sup>ab</sup>	3.67±0.27<sup>ab</sup>	3.88±0.48<sup>b</sup>
饲料转化率(％)	2.46±0.79<sup>a</sup>	1.91±0.23<sup>ab</sup>	1.82±0.08<sup>b</sup>	1.80±0.28<sup>b</sup>

其中上标中不同字母代表有显著性

1.存活生长：

从表1中的数据可以发现，在投喂上述实施例中的对虾用抗病促生长的植物提取物和益生菌复合饲料添加剂21天后，实验组1、实验组2和实验组3的对虾末体重、增重率和饲料转化率均高于对照组。其中，实验组2和实验组3的对虾末体重、增重率，饲料转化率均显著高于对照组(P<0.05)，而实验组1和对照组无显著差异。各实验组之间存活率无显著差异，说明上述实施例中的对虾用抗病促生长的植物提取物和益生菌复合饲料添加剂对于对虾没有显著的毒副作用，可以安全的用于对虾的使用。特定生长率是指生长率与生长天数的比值，是衡量生长状况的一个常用指标，特定生长率越大，代表每天体重增长越快。对比特定生长率可以发现，实验组3的特定生长率显著高于对照组(P<0.05)，而实验组1和实验组2与对照组之间无显著差异。

2.抗菌活性：

抗菌活性测定结果如图1所示。

可以发现，在投喂上述实施例中的对虾用抗病促生长的植物提取物和益生菌复合饲料添加剂21天后，实验组1、实验组2和实验组3中的对虾血浆抗菌活性均升高。其中，实验组3的对虾抗菌活性显著高于其他实验组(P<0.05)，而实验组1和实验组2中的对虾抗菌活性与对照组无显著差异。上述结果说明，只有在肉桂醛和铁载体高产菌株SDVGh3配合使用的情况下，该对虾用抗病促生长的植物提取物和益生菌复合饲料添加剂才能发挥出显著的抗菌效果。

3.溶菌活性：

溶菌活性测定结果如图2所示。

可以发现，在投喂上述实施例中的对虾用抗病促生长的植物提取物和益生菌复合饲料添加剂21天后，实验组1、实验组2和实验组3中的对虾血浆溶菌活性均高于对照组，但无显著差异。上述结果说明，实施例中的对虾用抗病促生长的植物提取物和益生菌复合饲料添加剂虽然会有效的提高对虾血浆溶菌活性，但其与肉桂醛或铁载体高产菌株SDVGh3单独使用一样，并不会对虾的身体机能和理化性质造成实质的影响，不易带来溶菌活性残留或其他问题，对于消费者是安全的。

4.免疫保护效果：

免疫保护效果对比图如图3所示。

可以发现，在投喂上述实施例中的对虾用抗病促生长的植物提取物和益生菌复合饲料添加剂21天后，对试验对虾进行体内注射哈维氏弧菌攻毒7天，对照组中的对虾的免疫保护率极低，仅能达到8％左右，而实验组1、实验组2和实验组3中的配方均能有效提高对虾免疫保护率，且均显著高于对照组(P<0.05)。其中，实验组3中的对虾用抗病促生长的植物提取物和益生菌复合饲料添加剂对于对虾的免疫保护效果最佳，且显著高于实验组1和实验组2(P<0.05)。从而说明单一性的使用肉桂醛或铁载体高产菌株SDVGh3虽然也能在一定程度上提高对虾的免疫能力，但总体来看，其略显不足，而对于使用了上述实施例中的对虾用抗病促生长的植物提取物和益生菌复合饲料添加剂的对虾来说，其免疫保护效果显著提升至约50％，从而极大程度上的实现了对于对虾的免疫保护效果。

而采用其他配比的实施例中的对虾用抗病促生长的植物提取物和益生菌复合饲料添加剂经测试后也发现具有同样的效果。

综上所述，可以发现，上述实施例中的对虾用抗病促生长的植物提取物和益生菌复合饲料添加剂不仅能够有效促进对虾的生长发育，还能显著提高对虾对于饲养环境中的细菌抗性，并展示出极强的免疫保护效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株铁载体高产菌株，其特征在于，所述铁载体高产菌株为泛菌属（Pantoeasp.）SDVGh3，所述铁载体高产菌株于2021年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 20211699。

2.权利要求1所述的铁载体高产菌株在制备动物饲料或饲料添加剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述动物包括水产动物。

4.一种对虾饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂中包括肉桂醛和权利要求1所述的铁载体高产菌株。

5.根据权利要求4所述的饲料添加剂，其特征在于，按质量分数计，所述饲料添加剂中包括40%~60%的肉桂醛和40%~60%的权利要求1所述的铁载体高产菌株。

6.根据权利要求4或5所述的饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂中还包括辅料。

7.根据权利要求6所述的饲料添加剂，其特征在于，所述辅料包括载体、粘合剂、分散剂、溶剂、增稠剂、调味剂、着色剂、酸度调节剂中的至少一种。

8.根据权利要求4或5所述的饲料添加剂，其特征在于，所述铁载体高产菌株的有效菌活数大于等于1×10⁷ cfu/g。

9.权利要求4~8任一项所述的对虾饲料添加剂在下述（1）~（4）中至少一项中的应用；

（1）制备水产动物免疫增强产品中的应用；

（2）制备水产动物细菌感染预防或抗细菌感染产品中的应用；

（3）制备水产动物促生长产品中的应用；

（4）制备水产动物抗生素替代产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述对虾饲料添加剂在饲料中的添加量为0.5~3g/kg。