CN100473284C - 用于甲壳类或鱼类的饲料添加剂及饲料 - Google Patents

用于甲壳类或鱼类的饲料添加剂及饲料 Download PDF

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Abstract

具有免疫激活、预防感染效果的甲壳类或鱼类用饲料添加剂，其特征在于含有低分子量脂多糖为有效成分，该低分子量脂多糖由革兰氏阴性的微生物菌体得到，用蛋白质标记物并采用SDS-PAGE法测定出的分子量为5000±2000，且实质上不含有高分子量脂多糖；以及添加有它们的甲壳类或鱼类用饲料。

Description

用于甲壳类或鱼类的饲料添加剂及饲料
技术领域
本发明涉及甲壳类或鱼类的饲料添加剂及添加有该饲料添加剂的饲料，特别是涉及对免疫激活、预防感染具有显著效果的饲料添加剂以及以适当比例添加该饲料添加剂的饲料，以及使用它们的预防方法和养殖方法。
背景技术
近年来，伴随着甲壳类和鱼类养殖业的发展，细菌疾病和病毒疾病也大量出现，造成了巨大的经济损失。甲壳类和鱼类的疾病中，主要出现的有：对虾的急性病毒血症、弧菌病，师鱼的类结节病、肠球菌病，香鱼的冷水病、假单胞菌病，真鲷、章雄、师鱼等的虹膜病毒感染症等，经济损失很大。
对于这些疾病中的细菌性疾病，一般使用抗生素和合成抗菌药作为治疗药，但是出现对抗菌物质有耐药性的细菌时，就不能得到充分的治疗效果。另外，由于使用的药物残留在甲壳类、鱼类上，会产生公共卫生方面的问题，所以人们强烈希望有不依赖化学疗法的预防对策。另一方面，对于甲壳类和鱼类的病毒病，由于没有开发出疫苗和治疗药，现况是疾病依然大量出现。
为了增强甲壳类和鱼类的免疫机能和预防感染，已知可以利用来源于嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)的肽聚糖(特许第2547371号公报)、芽胞杆菌属(Bacillus)等革兰氏阳性菌的细胞壁成分(特公平3-173826号公报)、来源于裂褶菌属(Schizophyllum)的β-1，3-聚糖(特公平6-65649号公报)等多糖。另外，也有报告说高分子量的脂多糖能够激活鱼类的免疫机能(Salati，F.and R.Kusuda、日本水产学会志、53卷、201～204页、1987年)(Odean，M.J.等、Infection and Immunity、58卷、427～432页、1990年)。
本发明中使用的低分子量脂多糖(以下简称为LPS)与上述来源于革兰氏阳性菌的肽聚糖、细胞壁成分及来源于扇衣属的β-1，3-聚糖的基本结构和成分不同，它是由特异的脂类A和与其共价结合称作R核的低聚糖、以及0特异多糖3种成分组成的物质，它在增强肿瘤坏死因子(TNF)效果的基础上作为动物用的免疫机能激活剂是公知的，但是关于预防甲壳类和鱼类感染的作用却完全不知道。另外，已经报道的研究中使用的高分子量脂多糖(LPS)的分子量为100万～1000万，具有非常强的毒性，所以长期投给甲壳类和鱼类，通常不可能激活免疫机能。另外，由于上述已知物质的分子量大，难以从肠管吸收，所以必须大量口服给药，如果长时间给药，大多会出现免疫机能低下的现象。
如上所述，甲壳类和鱼类经常出现各种感染，结果导致死亡，造成巨大的经济损失。在这种背景下，可以举出这些甲壳类或鱼类在有限环境中过密地养殖所引起的免疫机能低下。另外，为了激活低下的免疫机能，已经使用了各种物质，但是甲壳类没有产生抗体的能力，确认没有脊椎动物中可见的淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞等，而且鱼类产生抗体的能力有限，同时由于是变温动物，水温对抗体的产生有较大影响，这种免疫机能不可能很充分，两者与哺乳动物在生物体防御机构上存在相当大的差异(Fish Pathology，30(2)，141-150，1995.6)；有时由于以往的LPS毒性强，在养殖现场不能使用；多数情况下与其长时间给药还不如就让其免疫机能低下，因此没有可以满足防止甲壳类或鱼类感染的物质。
本发明的目的是提供一种用极微量就可以确实激活甲壳类和鱼类本来具备的免疫机能，预防感染，不存在药物残留等公共卫生方面的问题，安全的用于养殖甲壳类和鱼类的饲料添加剂，添加有该饲料添加剂的饲料，以及使用它们的预防方法和养殖方法。
发明公开
本发明涉及具有免疫激活、预防感染效果的甲壳类或鱼类用饲料添加剂，其特征在于含有低分子量脂多糖为有效成分，该低分子量脂多糖由革兰氏阴性的微生物菌体得到，用蛋白质标记物并采用SDS-PAGE法测定出的分子量为5000±2000，且实质上不含有高分子量脂多糖。
另外，本发明还涉及甲壳类或鱼类用饲料添加剂，含有上述低分子量脂多糖以及甲壳类和鱼类允许的载体。
另外，本发明还涉及上述低分子量脂多糖在制造甲壳类或鱼类用饲料添加剂中的用途。
另外，本发明还涉及甲壳类或鱼类的免疫激活、预防感染的方法，其特征在于将上述低分子量脂多糖的有效量投给甲壳类或鱼类。
另外，本发明还涉及甲壳类或鱼类的死亡预防剂，其特征在于含有上述低分子量脂多糖作为有效成分。
另外，本发明还涉及甲壳类或鱼类的死亡预防剂，其特征在于含有上述低分子量脂多糖以及药学上允许的载体。
另外，本发明还涉及上述低分子量脂多糖在制造甲壳类或鱼类的死亡预防剂中的用途。
另外，本发明还涉及甲壳类或鱼类的死亡预防方法，其特征在于将上述低分子量脂多糖的有效量投给甲壳类或鱼类。
另外，本发明还涉及甲壳类或鱼类用饲料添加剂，革兰氏阴性的微生物菌体是属于泛菌属(Pantoea)的微生物菌体。
另外，本发明还涉及甲壳类或鱼类用饲料添加剂，革兰氏阴性的微生物菌体是成团泛菌(Pentoea agglomerans)。
另外，本发明还涉及甲壳类或鱼类用饲料，其特征在于添加上述饲料添加剂或死亡预防剂。
另外，本发明还涉及甲壳类或鱼类的养殖方法，其特征在于将上述饲料投给甲壳类或鱼类。
本发明是将按照特开平8-198902号公报中公开的方法由革兰氏阴性的微生物菌体精制得到的物质，即分子量为5000±2000的低分子量LPS添加到饲料中，投给甲壳类或鱼类后，确认可以激活甲壳类或鱼类本来具备的免疫机能，预防病毒或细菌引起的感染，预防死亡，而且安全性非常高，从而完成了本发明。
本发明的低分子量LPS虽说如上所述是由革兰氏阴性的微生物菌体按照特开平8-198902号公报中公开的方法得到的分子量为5000±2000的脂多糖，但是其特征与现有的高分子量LPS(分子量100万～1000万)相比，对甲壳类和鱼类的安全性高，具有显著的免疫激活作用、预防感染的效果以及预防死亡的效果。
本发明中，实质上不含有高分子量脂多糖是指不含有分子量为8000以上的物质。
本发明中，革兰氏阴性的微生物菌体例如属于泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonella)、气单胞菌属(Aeromonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、肠杆菌属(Enterobacter)的微生物菌体，其它特开平4-99481号公报中记载的革兰氏阴性的微生物菌体等。优选的微生物是属于泛菌属(Pantoea)的微生物，更优选成团泛菌(Pentoeaagglomerans)。
本发明的低分子量LPS可以按照常规方法培养革兰氏阴性的微生物，从培养基收集菌体，按照公知的方法，例如热酚法〔O.Westphal编，Methods in Carbohydrate Chemistry，第5卷，第83页，AcademicPress，1965年〕由收集的菌体提取，再用阴离子交换树脂纯化制造。也就是说，将微生物的菌体悬浊于蒸馏水中，将该悬浊液添加到蒸馏水以及等体积的热酚混合液中搅拌，然后离心分离回收水层，透析该水层，除去酚，采用超滤法浓缩，收集粗LPS部分，采用常规的阴离子交换色谱法(例如使用单Q-琼脂糖或-琼脂糖)将该部分纯化，按照常规方法脱盐。
这样得到的纯化LPS实质上相当于与特开平4-187640号公报、特开平4-49240号公报、特开平4-99481号公报以及特开平5-155778号公报中公开的分子量为5000至6000的LPS。进一步在脱氧胆酸钠等表面活性剂的存在下将得到的纯化LPS凝胶过滤，仅回收含有低分子量LPS的部分，除去混在其中的高分子量LPS，可以得到高度纯化的本发明的低分子量LPS。这种在表面活性剂存在下的凝胶过滤步骤可以将特开平4-187640号公报、特开平4-49240号公报以及特开平5-155778号公报中公开的分子量为5000至6000的LPS进一步高度纯化，通过这一步骤可以完全除去混在其中的高分子量LPS。
成为本发明的对象的甲壳类包括对虾(Penaeus japonicus)、牛虾(Penaeus monodon)、高丽虾(Penaeus chinensis)、香蕉虾(Penaeusmorguiensis)等包括对虾类在内的所有虾类(包括lobster，shrimp，prawn)，上海蟹、蝤蛑等所有的蟹类，优选虾类，更优选对虾类。鱼类包括师鱼、河豚、真鲷、比目鱼、鳗鲡、虹鳟等所有的鱼类。感染是指甲壳类的急性病毒血症、弧菌病、Bpistylis sp.、Zoothamniumsp.等寄生虫病，或Lagenidium sp.、Siropidium sp.等真菌病，鱼类的虹膜病毒感染症、杆状病毒病、神经坏死、传染性造血器官坏死病、类结节病、链球菌症、肠球菌症、弧菌病、冷水病、假单胞菌病、滑走细菌病、水霉病等所有的病毒、支原体、细菌、真菌以及寄生虫引起的感染，优选甲壳类的急性病毒血症，鱼类的链球菌病、肠球菌病、弧菌病。
本发明中，低分子量LPS可以直接或加入公知的载体、稳定剂等，必要时进一步加入维生素、氨基酸类、矿物等各种养分、抗氧化剂、抗生素、抗菌剂以及其它添加剂等，制成甲壳类或鱼类用饲料添加剂，其形状只要制成粉体、颗粒、小丸、悬浊液等适当的形态即可。给予本发明的饲料添加剂时，对于甲壳类或鱼类可以单独给予，也可以与饲料混合后给予。给予的时期可以是为了预防疾病经常给予，也可以是养殖后期添加。
另外，本发明的饲料没有特别的限定，可以是粉末饲料、固体饲料、湿丸饲料、干丸饲料、EP(Extruder Pellet)饲料、生饵等任何一种饲料。
本发明中低分子量LPS在饲料添加剂或饲料中的含量可以在较宽范围内选择，优选相对于饲料添加剂或饲料为0.000001～0.001重量％，特别优选0.00002～0.00005重量％，但是对此并没有限定。低分子量LPS的给饵量可以适当确定，例如相对于甲壳类或鱼类的每1kg体重，1日投给1～100μg，优选10～20μg，但是对此并没有限定。
发明的最佳实施方式
以下结合实施例说明本发明，但是并不受这些实施例的任何限定。另外，实施例中所使用的低分子量LPS是指分子量约5000的LPS，高分子量LPS是指分子量为8000～5万的LPS。
参考例1(低分子量LPS的制备)
将胰蛋白胨(Difuco公司生产)10g、酵母提取物(Difuco公司生产)5g、NaCl(和光纯药工业社生产，特级)10g添加到蒸馏水1升中，用NaOH调节为pH7.5，用高压釜灭菌，按照0.1％的比例添加另外灭菌的葡萄糖(和光纯药工业社生产，特级)得到培养基(以下记作L-肉汤培养基)，由保存在-80℃的成团泛菌(Pantoeaagglomerans)保存菌株分离单一菌落，接种在装有100ml该培养基的500ml坡口烧瓶中，在35℃下振荡1夜培养，将其全量直接接种在装有L-肉汤培养基1000mL的3升坡口烧瓶中，同样进行培养。
再将培养得到的菌体接种在装有7升L-肉汤培养基的10升台式发酵器(丸菱生物工程社生产)中，在相同条件下通气培养，之后集菌，回收约70g的湿菌体，将其冷冻保存。将冷冻保存的菌体约++70g悬浊于500ml蒸馏水中，添加500ml的90％热酚，在65～70℃下搅拌20分钟，冷却，在4℃下以10000G离心处理20分钟，回收水层，对于酚层再重复1次与上述相同的操作，合并2次回收的水层，透析1夜除去酚，使用超滤装置(Adovandeck Toyo公司生产，UK-200)通过分子量为20万的断流膜在2个大气压的氮气下，将透析内液超滤浓缩。
将得到的粗LPS冷冻干燥物溶解于蒸馏水，过滤器灭菌，添加缓冲液，用阴离子交换色谱法(Pharmasia公司生产，Q-琼脂糖·快速·流动)处理，用含有10mM Tris-HCl(pH7.5)以及10mM NaCl的缓冲液使试样溶液在柱中通液，用200～400mM NaCl/10mM Tris-HCl(pH7.5)洗脱出鲎活性部分。在与上述相同的条件下，将该洗脱液超滤，脱盐并浓缩，冷冻干燥，由约70g的湿菌体得到约300mg的纯化LPS。
将得到的纯化LPS 100mg以5mg/ml的浓度溶解于可溶化缓冲液〔由3％脱氧胆酸钠(和光纯药社生产)0.2M氯化钠、5mM EDTA-2Na和20mM Tris-盐酸构成，pH8.3〕，将纯化LPS溶液20ml在SephakurylS-200HR柱(Pharmasia公司生产)的上部静静地分为多层，用洗脱缓冲液〔由0.25％脱氧胆酸钠(和光纯药社生产)、0.2M氯化钠、5mM EDTA以及10mM Tris-盐酸构成，pH8.3〕以16ml/小时的流速洗脱出800ml(50小时)。
使用蠕动移液泵PI(Pharmasia公司生产)控制流速，同时用馏分收集器(Adobanteck公司生产，SF2120)分离得到的洗脱液，弃掉最初的240ml(24馏分)，之后以10ml/馏分分馏至80馏分。对于洗脱出的各馏分，用原液或稀释液，通过酚/硫酸法(福井作藏，“还原糖果的定量法·第2版”，第50～52页，学会出版中心，1990年)对糖进行定量，考察洗脱状态。根据所得洗脱状态的结果预测存在LPS的馏分(馏分30～60)中，使用馏分37～55各馏分0.5ml进行SDS-PAGE，考察LPS馏分图形。
结果，确认馏分45～55仅为低分子量(分子量约5000)LPS，馏分37～44包括高分子量和低分子量两种LPS，因此对馏分45～55的低分子量LPS部分如下所述进一步纯化。
将各部分混合，冷冻干燥，悬浊于乙醇中，离心分离除去可溶于乙醇的脱氧胆酸，将低分子量LPS回收至不溶性部分。再反复用乙醇处理低分子量LPS部分2次，除去脱氧胆酸，再次悬浊于70％乙醇中，离心分离除去缓冲液成分，该操作再反复进行3次，将低分子量LPS回收至不溶性部分，冷冻干燥，得到纯化的低分子量LPS约20mg。
实施例1(低分子量LPS对甲壳类的安全性)
将平均体重为20g的对虾分为5组，每组20尾，由第3腹节肌肉内给药，将本发明的低分子量LPS(分子量约5000)投给第1、2组虾，相对于虾的1kg体重第1组投给50mg，第2组投给100mg，另外将现有高分子量LPS(来源于大肠菌的LPS，E.coli 0111，DIFCO公司生产，分子量约8000～5万)投给第3、4组虾，第3组投给10mg，第4组投给20mg。第5组投给不含有LPS的生理盐水。确认直到给药后120小时的虾的生死，求出死亡率。结果如表1所示。
表1
 
试验组 死亡尾数/供试尾数 死亡率(％)
第1组低分子量LPS50mg/kg 0/20 0
第2组低分子量LPS100mg/kg 0/20 0
第3组高分子量LPS10mg/kg 13/20 65
第4组高分子量LPS20mg/kg 20/20 100
第5组生理盐水组 0/20 0
由表1可知，高分子量LPS的10mg以及20mg组的死亡率分别为65、100％，与此相对低分子量LPS的50mg以及100mg组均没有出现死亡的个体。因此，本发明的低分子量LPS与现有的高分子量LPS相比，是对虾安全性极高的物质。
实施例2(低分子量LPS对鱼类的安全性)
将平均体重为85g的真鲷分为3组，每组40条，由背部肌肉内给药，将低分子量LPS投给第1组，相对于真鲷的1kg体重投给100mg，将高分子量LPS(E.Coli 0111，DIFCO公司生产)投给第2组，投给20mg。第3组投给不含有LPS的生理盐水。确认直到给药后120小时的真鲷的生死，求出死亡率。结果如表2所示。
表2
 
试验组 死亡尾数/供试尾数 死亡率(％)
第1组低分子量LPS100mg/kg 0/40 0
第2组高分子量LPS20mg/kg 34/40 85
第3组生理盐水组 0/40 0
由表2可知，高分子量LPS 20mg组的死亡率为85％，与此相对低分子量LPS 100mg组根本没有出现死亡的个体。因此，本发明的低分子量LPS与现有的高分子量LPS相比，是对鱼类安全性极高的物质。
实施例3(对甲壳类中血细胞的吞食能力的激活作用)
将平均体重为20g的对虾分为6组，每组20尾，对于本发明组的1、2、3组，相对于虾的每1kg体重1日分别给予混有20、40、100μg低分子量LPS的饲料，另外对于第4组给予混有高分子量LPS 100μg的饲料，对于第5组给予混有高分子量LPS 1000μg的饲料，给予7天。对于第6组给予不含有LPS的饲料。给药开始0、1、5、7天后，使用装有含L-半胱氨酸作为抗凝固剂的K-199培养基的注射器，由虾的胸洞取血，离心分离得到血细胞。将每1μl悬浊液中1×105细胞的血细胞与1×108个的乳胶颗粒(直径1.986μm)混合，在25℃下反应30分钟后，用戊二醛固定后风干。风干后，用吉姆萨液(Giemsa)染色，用优试剂盒(Eukit)固定在载玻片上，每1尾虾制作5片这种标本，使用反射荧光显微镜，随机观察每1片标本上的200个血细胞，考察血细胞的乳胶颗粒吞食率、每1个血细胞摄取的颗粒数，按照下式求出吞食指数。
吞食率＝〔摄取颗粒的血细胞数/观察的血细胞总数〕×100
平均摄取数＝摄入到血细胞中的颗粒数/摄取颗粒的血细胞数
吞食指数＝〔摄取颗粒的血细胞数/观察的血细胞总数〕×〔摄入到血细胞中的颗粒数/观察的血细胞总数〕×100
试验结果：甲壳类的生物体防御机构由细胞性因子和液性因子构成，前者与血细胞对异物的吞食能力关系密切，因此是否激活了虾的生物体防御能力可以通过考察血细胞对异物的吞食活性得知〔高桥幸则等，鱼病研究30(2)，141～150(1995)〕。因此，观察本发明的低分子量LPS组与高分子量LPS组在给药开始0、1、5、7天后的吞食指数，如表3所示。
表3
Figure C00800398D00131
Figure C00800398D00132
*1：与第6组之间存在显著差异(P<0.05)
*2：与第6组之间存在显著差异(P<0.01)
由表3可知，投给低分子量LPS的虾的血细胞吞食指数任何本发明组均比第6组高，存在显著差异(P<0.01、0.05)。但是，投给100μg现有高分子量LPS的虾的血细胞的吞食指数在给药1、5、7天后均未上升，1000μg组在给药5、7天后也比第6组显著升高(P<0.05)。由以上可知，本发明的低分子量LPS与高分子量LPS相比，即使极微量也可以激活虾血细胞的吞食活性等生物体防御能力。
实施例4(对甲壳类中血细胞的酚氧化酶的激活作用)
将平均体重为20g的对虾分为6组，每组20尾，对于本发明组的1、2、3组，相对于虾的每1kg体重1日分别给予混有20、40、100μg低分子量LPS的饲料，另外对于第4组给予混有高分子量LPS 100μg的饲料，对于第5组给予混有高分子量LPS 1000μg的饲料，给予7天。对于第6组给予不含有LPS的饲料。给药开始0、1、5、7天后，使用装有含EDTA的KHE培养基的注射器，由虾的胸洞取血，离心分离得到血细胞。将得到的血细胞悬浊在Ca-Mg Hepes培养基中，达到1×106细胞/ml后，通过冷冻融解和超声波破坏，离心分离，用膜滤器过滤得到的上清液。将该液900μl与作为基质溶液的L-DOPA溶液100μl混合后，在60℃下反应60分钟，用分光光度计测定490nm处的吸光度，作为酚氧化酶(PO)的活性。
试验结果：甲壳类的生物体防御机构由细胞性因子和液性因子构成，后者与血细胞的PO活性关系密切，因此是否激活了虾的生物体防御能力可以通过考察PO活性得知。因此，观察本发明的低分子量LPS组与高分子量LPS组在给药开始0、1、5、7天后的PO活性，如表4所示。
表4
*1：与第6组之间存在显著差异(P<0.05)
*2：与第6组之间存在显著差异(P<0.05)
由表4可知，投给低分子量LPS的虾的血细胞PO活性任何本发明组均比第6组高，存在显著差异(P<0.01、0.05)。但是，投给100μg现有高分子量LPS的虾的血细胞P活性直到给药7天后都没有上升，1000μg组在给药5、7天后也比第6组显著升高(P<0.05)。由以上可知，本发明的低分子量LPS与高分子量LPS相比，即使极微量也可以激活虾血细胞的吞食活性等生物体防御能力。
实施例5(对于对虾急性病毒血症的预防效果)
将平均体重为14g的对虾分为7组，每组20尾，对于本发明组的1、2、3组，相对于虾的每1kg体重1日分别给予混有20、40、100μg低分子量LPS的饲料，另外对于第4组给予混有高分子量LPS 1000μg的饲料，给予18天.对于第5组给予混有特许第2547371号公报记载的来源于嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)的肽聚糖(PG)达到0.2mg/kg(200μg/kg)的饲料，对于第6组给予混有特公平6-65649号公报记载的来源于裂褶菌属(Schizophyllum)的β-1，3-聚糖(1，3-G)达到50mg/kg(50000μg/kg)的饲料，给予18天。对于第7组的对照组给予不含有LPS的饲料。
开始给予LPS8天后，使用引起对虾急性病毒血症的病毒PRDV(penaeid rod-shaoed DNA virus)急性感染试验。感染方法是将患这种病死亡的3尾对虾的头胸部甲皮剥掉后，在40ml的灭菌海水中匀化，离心分离(10000×g，10分钟，4℃)，将得到的上清液10ml加入到20升海水中。通过将开始给予LPS8天后的虾在其中浸渍2小时的方法使之感染。观察感染后10天的死亡状况，对于死亡的虾进行病理学以及采用PCR(Polymerase chain reaction)法的检查，确认PRDV引起的死亡。
试验结果：本发明的低分子量LPS组、高分子量LPS组以及LPS未添加组在PRDV感染后对虾的累积死亡尾数和死亡率如表5～6所示。
表5
*数字表示累积死亡只数(其它相同)
表6
Figure C00800398D00162
**与第7组之间有显著差异(P<0.05)
***与第7组之间有显著差异(P<0.01)
被PRDV感染后，投给未添加LPS饲料的对照组的虾在9天以内100％的死亡，与此相对本发明组的死亡率是低分子量LPS 20μg组为20％、40μg组为35％、100μg组为40％，都很低，与对照区之间有显著差异(P<0.01)。另一方面，投给高分子量LPS 1000μg的虾的死亡率为55％，投给0.2mg PG的虾的死亡率为50％，投给50mg1，3-G的虾的死亡率为60％，与投给低分子量LPS的各组相比，大多数虾死亡。从以上结果可以看出，本发明的低分子量LPS能够预防虾被病毒感染，其效果比现有高分子量LPS优良。
实施例6(对鱼类免疫机能的激活作用)
将平均体重为230g的师鱼分成6组，每组20条，对于本发明组的1、2、3组，相对于师鱼的每1kg体重1日分别给予混有20、40、100μg低分子量LPS的湿丸，另外对于第4组给予混有高分子量LPS100μg的湿丸，对于第5组给予混有高分子量LPS 1000μg的湿丸，给予7天。对于第6组投给不含LPS的湿丸。在投给后的0、1、5、7天分别摘除5条师鱼的头肾，在装有添加了0.25％ NaCl的RPMI-1640-HAH培养基的塑料培养皿内分离血细胞，通过细胞过滤器，得到细胞悬浊液。将该液体在percoll不连续密度梯度上分成多层，以1600rpm的速度，离心分离20分钟(4℃)，得到白细胞层。
收集该层后，离心洗涤，悬浊在含有10％ FBS(Fetal Boyire Serum)添加了0.25％ NaCl的RPMI-1640-H培养基中，将白细胞的细胞数调整至1×106细胞/ml。将该白细胞悬浊液500μl和在师鱼血清中调理素化的酵母悬浊液(1×108细胞/ml)500μl装入硅处理的玻璃试管中，每隔10分钟搅拌1次，同时在25℃下培养60分钟。培养结束后，每个师鱼制作5片涂抹标本，进行瑞特氏染色，用优试剂盒(Eukit)密封。再通过光学显微镜随机观察每片标本的200个血细胞，研究白细胞的酵母吞食数，按照与实施例3同样的计算公式求出吞食指数。结果如表7～8所示。
表7
Figure C00800398D00181
*1：与第6组之间有显著差异(P<0.05)
*2：与第6组之间有显著差异(P<0.01)
表8
*1：与第6组之间有显著差异(P<0.05)
*2：与第6组之间有显著差异(P<0.01)
由表7～8可以看出，投给低分子量LPS的师鱼的白细胞的吞食指数，任何发明组都比第6组高，并且有显著差异(P<0.01、P<0.05)。但是，投给现有高分子量LPS 100μg的师鱼的白细胞的吞食指数直到投给7天后都没有上升，1000μg组在投给5天以后比6组显著增高(P<0.01)。从以上可以看出，本发明的低分子量LPS与高分子量LPS相比，即使极微量也可以激活白细胞的吞食作用等鱼类的免疫机能.
实施例7(对师鱼肠球菌症的预防效果)
将平均体重为63g的师鱼分成5组，每组30条，对于本发明组的1、2、3组，相对于师鱼的每1kg体重1日分别给予混有20、40、100μg低分子量LPS的湿丸，另外对于第4组给予混有高分子量LPS 1000μg的湿丸，每天都给予。对于第5组的对照区，投给不含LPS的湿丸。在投给开始7天后，向每条师鱼腹腔内接种4.0×106个引起师鱼肠球菌症的Enterococcus seriolicida，求出接种后15天的死亡率。结果如表9～10所示。
表9
Figure C00800398D00191
*数字表示累积死亡条数(其它也相同)
表10
Figure C00800398D00192
**与第5组之间有显著差异(P<0.05)
***与第5组之间有显著差异(P<0.01)
接种E.Seriolicida 15天后，投给未添加LPS的饲料的对照区的师鱼73.3％死亡，与此相对本发明组的死亡率是低分子量LPS 20μg组为13.3％、40μg组为26.7％、100μg组为23.3％，都很低，与对照区之间有显著性差异(P<0.05)。另一方面，投给高分子量LPS 1000μg的师鱼的死亡率为36.7％，与低分子量LPS的各组相比显示较高的死亡率。从以上结果可以看出，本发明的低分子量LPS能够预防鱼类被细菌感染，其效果比现有高分子LPS优良。
工业实用性
按照本发明，可以提供一种以极微量即可激活甲壳类和鱼类的免疫机能，预防感染症，并且预防甲壳类和鱼类死亡，没有药物残留等公共卫生发明的问题，安全的用于养殖甲壳类和鱼类的饲料添加剂和饲料。

Claims (16)

1、具有免疫激活、预防感染效果的甲壳类或鱼类用饲料添加剂，其特征在于含有低分子量脂多糖为有效成分，该低分子量脂多糖由革兰氏阴性的微生物菌体得到，用蛋白质标记物并采用SDS-PAGE法测定出的分子量为5000±2000，且实质上不含有高分子量脂多糖。
2、甲壳类或鱼类用饲料添加剂，含有如权利要求1所述的低分子量脂多糖以及甲壳类和鱼类允许的载体。
3、如权利要求1所述的甲壳类或鱼类用饲料添加剂，革兰氏阴性的微生物菌体是属于泛菌属的微生物菌体。
4、如权利要求3所述的甲壳类或鱼类用饲料添加剂，革兰氏阴性的微生物菌体是成团泛菌。
5、如权利要求1所述的甲壳类或鱼类用饲料添加剂，感染症是甲壳类的急性病毒血症、弧菌病、寄生虫病、真菌病，鱼类的杆状病毒病、神经坏死、传染性造血器官坏死病、类结节病、链球菌症、肠球菌症、弧菌病、冷水病、假单胞菌病、滑走细菌病、水霉病。
6、如权利要求1所述的甲壳类或鱼类用饲料添加剂，高分子量脂多糖是具有8000以上的分子量的物质。
7、权利要求1所述的低分子量脂多糖在制造甲壳类或鱼类用饲料添加剂中的用途。
8、权利要求1所述的低分子量脂多糖用于制备甲壳类或鱼类的免疫激活、预防感染的制品的用途。
9、甲壳类或鱼类的死亡预防剂，其特征在于含有权利要求1所述的低分子量脂多糖作为有效成分。
10、甲壳类或鱼类的死亡预防剂，其特征在于含有权利要求1所述的低分子量脂多糖以及药学上允许的载体。
11、权利要求1所述的低分子量脂多糖在制造甲壳类或鱼类的死亡预防剂中的用途。
12、权利要求1所述的低分子量脂多糖用于制备预防甲壳类或鱼类死亡的制品的用途。
13、甲壳类或鱼类用饲料，其特征在于添加权利要求1所述的饲料添加剂。
14、甲壳类或鱼类用饲料，其特征在于添加权利要求9所述的死亡预防剂。
15、甲壳类或鱼类的养殖方法，其特征在于将权利要求13所述的饲料投给甲壳类或鱼类。
16、甲壳类或鱼类的养殖方法，其特征在于将权利要求14所述的饲料投给甲壳类或鱼类。
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