PT1438966E - Uso de depsipéptidos e seus congéneres como imunosupressores para tratamento de doenças infecciosas, como uma doença autoimune, reacções alérgicas ou doença hiperproliferativa da pele. - Google Patents

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Descrição EPÍGRAFE: "USO DE DEPSIPÉPTIDOS E SEUS CONGÉNERES COMO IMUNOSUPRESSORES PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS INFECCIOSAS, COMO UMA DOENÇA AUTOIMUNE, REACÇÕES ALÉRGICAS OU DOENÇA HIPERPROLIFERATIVA DA PELE"

Campo Técnico 0 presente invento relaciona-se de modo geral com depsipéptidos ou seus congéneres e com o seu uso como imunosupressores e, mais especificamente, no tratamento e/ou prevenção de um distúrbio imune como uma doença autoimune ou inflamatória, e na redução da imunorejeição a material transplantado por administração a um animal de uma quantidade eficaz de um depsipéptido tal como o FR901228.

Antecedentes do Invento A modulação do sistema imunológico torna-se desejável em diversos contextos, desde a inibição de uma resposta autoimune até ao controlo de uma doença infecciosa e à inibição da rejeição de enxertos pelos tecidos. A abordagem principal aplicada à supressão da rejeição tem sido a supressão farmacológica do sistema imunológico do paciente. Como tal, a maioria dos compostos imunomoduladores actualmente utilizados são imunosupressores. Do inicio dos anos 60 até aos anos 80, o arsenal de agentes imunosupressores esteve limitado a um pequeno número de fármacos. No entanto, no início da década de 1 80, para além da azatioprina e dos corticosteróides, a ciclosporina conheceu uma larga difusão e tornou-se no fármaco de eleição até ao presente (Kobashigawa, Trans. Proc. 30:1095-1097, 1998; Isoniemi, Ann. Chi. Gyn. 80:164-170, 1997). No entanto, os agentes imunosupressores mais recentes são em número relativamente restrito e manifestam igualmente muitos dos efeitos secundários indesejáveis que se associam aos agentes mais antigos. Além da aplicação destes fármacos no prolongamento dos tempos de sobrevivência de orgãos transplantados, tanto como agentes isolados como em combinação com outros imunosupressores, muitos exibem igualmente utilidade no tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes, hipersensibilidade retardada, doença de enxerto versus hospedeiro e outras doenças similares associadas ao sistema imunológico.

Os fámacos imunosupressores actualmente usados incluem agentes antiproliferativos, tais como metotrexato, azatioprina e ciclofosfamida. Uma vez que tais fármacos afectam a mitose e a divisão celular, estes exercem efeitos tóxicos graves sobre as células normais com uma elevada taxa de renovação celular, tais como as células da medula óssea e as células do revestimento do tracto gastrointestinal (Miller, Semin. Vet. Med. Surg. 12 (3):144-149, 1997). Deste modo, a depressão medular e a lesão hepática constituem efeitos secundários comuns.

Os compostos anti-inflamatórios usados para induzir a imunosupressão incluem os corticosteróides das supra-renais tais como a dexametasona e a prednisolona. Como efeitos secundários mais comuns observados em associação a estes compostos encontram-se infecções frequentes, anomalias metabólicas, hipertensão e diabetes. 2

Outros compostos imunosupressores actualmente utilizados para inibir a activação dos linfócitos e sua proliferação subsequente incluem a ciclosporina, FK506 e rapamicina. Estes fármacos actuam através da inibição da calcineurina fosfatase cálcio-dependente (ciclosporina e FK506) ou da inibição da quinase p70S6 que é importante para a sinalização induzida pelo factor de crescimento (rapamicina) (Liu et al., Cell 55:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993; Isoniemi (supra)). A ciclosporina e compostos relacionados encontram-se entre os imunosupressores mais vulgarmente usados. A ciclosporina é tipicamente usada para prevenir ou tratar a rejeição de orgãos em transplantes de rim, figado, coração, pâncreas, medula óssea e coração-pulmões, assim como para o tratamento de doenças auto-imunes e inflamatórias tais como doença de Crohn, anemia aplástica, esclerose múltipla, miastenia gravis, uveite, cirrose biliar, etc. No entanto, as ciclosporinas apresentam uma janela de dose terapêutica estreita e efeitos tóxicos graves que incluem nefrotoxicidade, hepatotoxicidade, hipertensão, hirsutismo, cancro e neurotoxicidade (Philip e Gerson, Clin. Lab. Med. 18(4):755-765, 1998; Hojo et al., Nature 397:530-534, 1999).

Adicionalmente, têm sido usados anticorpos monoclonais, como ο OKT3, para prevenir e/ou tratar a rejeição de enxertos. A introdução de anticorpos monoclonais num paciente, tal como se verifica com numerosos materiais biológicos, induz diversos efeitos secundários, tais como rigores e dispneia (Richards et al., Câncer Res. 59(9):2096-2101, 1999).

No contexto de numerosas doenças potencialmente fatais, o transplante de orgãos é considerado um tratamento-padrão e, em muitos casos, a única alternativa à morte. A resposta imune a antigénios de superfície celular estranhos presentes no 3 enxerto, os quais são codificados pelo complexo major de histocompatibilidade (MHC) e se encontram presentes em todas as células, impede geralmente a transplantação bem sucedida de tecidos e orgãos a menos que os tecidos transplantados provenham de um dador compatível e que a resposta imune normal seja suprimida. Não contando com a situação de gémeos idênticos, a melhor compatibilidade e, deste modo, as melhores taxas de sobrevivência de enxertos a longo prazo são atingidas usando como dadores irmãos com MHC idêntico ou cadáveres dadores não aparentados com MHC idêntico (Strom, Clin. Asp. Autoimm. 4:8-19, 1990). No entanto, tais correspondências ideais são difíceis de atingir. Adicionalmente, a acompanhar o acréscimo de necessidade de doações de órgãos verifica-se uma redução de orgãos transplantados. Deste modo, o xenotransplante tem emergido como uma área intensamente estudada mas que se mantém, todavia, condicionada a numerosas dificuldades relacionadas com a rejeição por parte do animal receptor (Kaufman et al., Annu. Rev. Immunol. 13:339-367, 1995). A resposta do hospedeiro ao aloenxerto de um orgão envolve uma série complexa de interacções celulares entre linfócitos T e B, assim como macrófagos ou células dendríticas que reconhecem e são activados pelo antigénio estranho (Strom, supra; Celular and Molecular Immunology, Abbas et al. (eds.), WB Saunders Co., Penn., 1994). Para a proliferação das células T é essencial a acção de factores co-estimuladores, primariamente citocinas, e interacções célula-célula específicas, proporcionadas por células acessórias activadas tais como macrófagos ou células dendríticas. Estes macrófagos e células dendríticas poderão aderir directamente às células T através de proteínas de adesão específicas ou secretar citocinas que estimulam as células T, tais como a IL-12 e a 4 IL-15 (Strom, em: Organ Transplantation: Current Clinicai and Immunological Concepts, 1989) . Os sinais co-estimuladores derivados das células acessórias estimulam a activação da transcrição do gene da interleucina-2 (IL—2) e a expressão de receptores de elevada afinidade para a IL-2 a nível das células T (Pankewycz et al., Transplantation 47:318, 1989; Cantrell et al., Science 224:1312, 1991; Williams et al., J. Immunol. 132:2330-2337, 1984). A IL-2, uma proteína com 15 kDa, é secretada pelos linfócitos T em resultado de estimulação antigénica e é necessária para que se verifique uma resposta imune normal. A IL-2 estimula a proliferação e a diferenciação das células linfóides ao ligar-se aos receptores da superfície celular específicos para a IL-2 (IL-2R) . A IL-2 inicia igualmente a activação das células T citotóxicas por parte das células T helper e estimula a secreção de interferão- (IFN-), o qual activa por seu turno as propriedades citodestruidoras dos macrófagos (Farrar et al., J. Immunol. 126:1120-1125, 1981). Adicionalmente, o interferão- e a IL-4 constituem igualmente activadores importantes da expressão de moléculas de classe II do MHC a nível do orgão transplantado, deste modo expandindo ainda mais a cascata da rejeição através do aumento da imunogenicidade do orgão enxertado (Pober et al., J. Exp. Med. 157:1339, 1983; Kelley et al., J. Immunol. 132:240-245, 1984). O modelo actual de uma resposta mediada por células T sugere que as células T são activadas na zona de células T dos orgãos linfóides secundários, primariamente através de células dendríticas. A interacção inicial requer o contacto célula-a-célula entre as moléculas de MHC carregadas de antigénio nas células apresentadoras de antigénio (APC) e o complexo de receptor de células T (TCR)/CD3 nas células T. O envolvimento do complexo TCR/CD3 induz a expressão de CD154 5 predominantemente a nível das células T CD4, as quais activam por seu turno as APC através do envolvimento do CD40, conduzindo a uma apresentação melhorada do antigénio (Grewal et al., Ann. Rev. Immunol. 16:111-135, 1998). Tal é causado parcialmente pela regulação positiva da expressão de CD80 e CD86 a nível das APC, ambos os quais constituem ligandos para a importante molécula co-estimuladora CD28 nas células T. No entanto, o envolvimento do CD40 conduz igualmente a uma expressão prolongada à superfície de complexos de MHC-antigénio, a expressão de ligandos para 4-1BB e OX-40 (potentes moléculas co-estimuladoras expressas a nível das células T activadas). Adicionalmente, o envolvimento do CD40 conduz à secreção de diversas citocinas (p.ex., IL-12, IL-15, TNF-α, IL-1, IL-6 e IL-8) e de quimiocinas (p.ex., Rantes, ΜΙΡ-Ια e MCP-1), sendo que todas estas moléculas exercem efeitos importantes sobre as APC e sobre a activação e maturação das células T (Mackey et al., J. Leukoc. Biol. 63:418-428, 1998) . 0 desenvolvimento de uma doença autoimune, tal como a diabetes de tipo I, obedece a mecanismos semelhantes. No homem e em ratinhos diabéticos não obesos (NOD), a diabetes mellitus insulinodependente (IDDM) resulta de uma destruição autoimune espontânea, dependente de células T, das células β pancreáticas produtoras de insulina, sendo que este processo se intensifica com a idade. 0 processo é precedido por infiltração dos ilhéus com células mononucleares (insulite), principalmente compostas por linfócitos T (Botazzo et al., J. Engl. J. Med. 113:353, 1985; Miyazaki et al., Clin. Exp. Immunol. 60:622, 1985). Um equilíbrio delicado entre as células T auto-agressivas e os fenómenos imunes de tipo supressor determina se a expressão da autoimunidade se limitará à insulite ou se progredirá até IDDM. Nos ratinhos 6 NOD, um modelo para a IDDM humana, as estratégias terapêuticas dirigidas para as células T têm evidenciado sucesso na prevenção da IDDM (Makino et al., Exp. Anim. 29:1, 1980). Estas estratégias incluem a timectomia neonatal, administração de ciclosporina, e infusão de anticorpos monoclonais (mAcs) anti-pan células T, anti-CD4 ou anti-CD25 (IL-2R) (Tarui et al., Insulitis and Type I Diabetes. Lessons from the NOD Mouse, Academic Press, Tóquio, p. 143, 1986) . Outros modelos incluem os tipicamente utilizados para as doenças autoimunes e inflamatórias, tal como a esclerose múltipla (modelo EAE), artrite reumatóide, doença de enxerto versus hospedeiro, lúpus eritematoso sistémico (modelo de autoimunidade sistémica-NZBxNZWFi), e semelhantes (ver, por exemplo, Theofilopoulos e Dixon, Adv. Immunol. 37:269-389, 1985; Eisenberg et al., J. Immunol. 125:1032-1036, 1980; Bonneville et al., Nature 344:163-165, 1990; Dent et al., Nature 343:714-719, 1990; Todd et al., Nature 351:542-547, 1991; Watanabe et al., Biochem. Genet. 29:325-335, 1991; Morris et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 57:263-273, 1990; Takahashi et al., Cell 76:969-976, 1994; Current Protocols in Immunology, Richard Coico (ed.), John Wiley & Sons, Inc., Capítulo 15, 1998). A Patente dos EUA N° 5.294.603 apresenta derivados de didemnina estruturalmente diferentes dos depsipéptidos do presente pedido de patente. Os derivados de didemnina expostos na patente dos EUA N° 5.294.603 possuem propriedades citotóxicas, antivirais e imunosupressoras. O objectivo de todas as estratégias de prevenção da rejeição e de regressão de doenças autoimunes consiste em suprimir a reactividade imune do paciente ao tecido ou agente antigénico, com um minimo de morbilidade e de mortalidade. Deste modo, estão actualmente em uso ou em investigação diversos fármacos com propriedades imunosupressoras. Tal como 7 acima se expôs, o imunosupressor mais frequentemente usado é a ciclosporina, mas a utilização da ciclosporina está associada a numerosos efeitos secundários. Assim, tendo em conta a relativa escassez de agentes eficazes na imunosupressão com perfis de baixa toxicidade e efeitos secundários controláveis, existe a necessidade, neste campo técnico, de identificar agentes imunosupressores alternativos. 0 presente invento pretende fazer face a esta necessidade e proporciona outras vantagens relacionadas.

Resumo do Invento

No âmbito do presente invento, é fornecido um composto possuindo a seguinte estrutura:

Φ ou um seu sal ou estereoisómero farmaceuticamente aceitáveis, em que m corresponde a 1, 2, 3 ou 4; n corresponde a 0, 1, 2 ou 3; p e q correspondem independentemente a 1 ou 2; X corresponde a O, NH ou NR;

Ri, R2 e R3 são idênticos ou diferentes e correspondem independentemente a uma porção molecular de cadeia 8 lateral de aminoácido ou a um derivado de cadeia lateral de aminoácido; e R corresponde a uma porção molecular de alquilo, arilo ou arilalquilo de cadeia inferior; para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença infecciosa, sendo a doença infecciosa seleccionada a partir do qrupo que consiste em infecção pelo virus da hepatite B, infecção pelo virus da hepatite C, infecção por Staphylococcus aureus, encefalite virai e sépsis; e para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença autoimune num animal, sendo a dita doença autoimune seleccionada a partir do grupo que consiste em artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, tiroidite, tiroidite de Hashimoto, esclerose múltipla, miastenia gravis, diabetes de tipo I, uveite, doença de Graves, psoriase, dermatite atópica, doença de Crohn, colite ulcerativa, vasculite, anemia aplástica, síndroma de Evans, anemia hemolítica autoimune e cirrose biliar; e para o fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de reacções alérgicas num animal; e para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença hiperproliferativa da pele num animal, sendo a dita doença hiperproliferativa da pele seleccionada a partir do grupo que consiste em dermatite seborreica, angioedemas, eritemas, acne e alopécia areata.

Outras características preferidas para este invento são apresentadas nas Reivindicações dependentes 4, 5, 6 e 7.

Abreviadamente, o invento é dirigido ao uso de depsipéptidos e seus congéneres (também aqui referidos como "compostos") para a preparação de um medicamento para tratamento e/ou profilaxia na supressão de uma resposta imune 9 de um animal, a administrar a esse animal. Os compostos possuem a seguinte estrutura (I) :

«ó em que m, n, Pf q, X, Y, Ri, R2 e R3 são tal como abaixo definido e se encontram incluídos os seus sais e estereoisómeros farmaceuticamente aceitáveis. São apresentados novos compostos possuindo a estrutura (I) acima, mas excluindo um composto conhecido especifico (i.e., FR901228). São expostas composições contendo um composto deste invento em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Na colocação em prática dos métodos expostos, os compostos poderão ser administrados para suprimir a resposta imune em animais com doença autoimune, doença inflamatória ou doença de enxerto versus hospedeiro, assim como em animais que foram submetidos a um transplante alogénico ou xenogénico. Outros métodos expostos incluem a administração de um composto para a inibição da proliferação de linfócitos, para aumentar a sobrevivência de um enxerto após o transplante através da administração anterior a, ou concomitante a, ou subsequente a um procedimento de transplante (incluindo transplantes alogénicos ou xenogénicos), para reduzir a secreção de IL-2 pelos linfócitos, para inibir a indução de CD25 ou CD154 a nivel dos linfócitos após estimulação, e/ou para induzir 10 anergia ou apoptose das células T activadas mantendo inalteradas as contagens de células T totais. São igualmente expostos métodos para a indução de tolerância do sistema imune face a um antigénio através da administração a um animal de uma dosagem de um composto com a estrutura (I) . São ainda apresentados métodos para a redução da secreção de TNF-α e para a inibição do ciclo celular de uma célula T activada antes da sua entrada na fase S, recorrendo à administração de um composto com a estrutura (I) .

Estes e outros aspectos deste invento tornar-se-ão evidentes quando relacionados com a descrição detalhada que se segue. Com este fim, são aqui apresentadas várias referências que expõem em maior detalhe algumas informações, procedimentos, compostos e/ou composições de suporte.

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 corresponde a um gráfico de barras que representa a inibição dose-dependente da proliferação dos linfócitos do sangue periférico (PBL) após a incubação com FR901228 e a estimulação por esferas às quais se encontram ligados anticorpos anti-CD3 e anti-CD28. A Figura 2 corresponde a um gráfico de barras que representa a inibição dose-dependente da proliferação dos linfócitos do sangue periférico (PBL) após a incubação com FR901228 e a estimulação com Ionomiocina/PMA. A Figura 3 corresponde a um gráfico de barras que representa a inibição dose-dependente da proliferação de linfócitos T CD4-positivos após a incubação com FR901228 e a estimulação por esferas às quais se encontram ligados anticorpos anti-CD3 e anti-CD28. 11 A Figura 4 corresponde a um gráfico de barras que representa a inibição dose-dependente da proliferação de linfócitos T CD4-positivos após a incubação com FR901228 e a estimulação com células dendriticas alogénicas geradas in vitro.

As Figuras 5A-5D correspondem a gráficos de barras que apresentam medições por citometria de fluxo da (A) expressão de CD154, (B) expressão de CD25, (C) expressão de CD69, e (D) viabilidade celular, no seguimento da activação de células T na presença de concentrações variáveis de FR901228. A Figura 6 corresponde a um gráfico de barras representando a expressão de IL-2 tal como medida por ELISA 24 horas após a estimulação com esferas 3x28 (esferas conjugadas com anti-CD3 e anti-CD28) de células T na presença de concentrações variáveis de FR901228. A Figura 7 corresponde a um gráfico de barras representando a intensidade média da fluorescência das células CD4 coradas com CDFA-SE ao dia 6 após a estimulação com esferas 3x28, ou sem estimulação, em combinação com a adição de FR901228 a diferentes pontos de tempo.

As Figuras 8A-8B correspondem a gráficos de barras que representam medições por citometria de fluxo da (A) expressão de CD137w, CD154, CD25, CD62L e CD49d e (B) expressão de CDlla, CD134, CD26, CD54, CD95 e CD69, após estimulação ou sem estimulação com esferas 3x28, na presença ou ausência de FR901228 (20 ng/ml). A Figura 9 corresponde a um gráfico de barras que representa a expressão de CD154 em células CD4 após uma estimulação inicial com esferas 3x28 na presença de 20 unidades de IL-2 e uma estimulação subsequente entre os dias 3 e 4 com esferas 3x28, 20 unidades de IL-2, esferas 3x28 com 20 12 unidades de IL-2, ou sem estimulação e com 20 ng/ml de FR901228 (adicionado ao dia 3).

As Figuras 10A-10B correspondem a gráficos de barras gue representam a presença de IL-2 e de TNF-α em sobrenadantes de células PBL após estimulação com esferas 3x28 na presença de FR901228 (20 ng/ml) e de ciclosporina (500 ng/ml). A Figura 11 apresenta os dados de fluxo relativos a células T Jurkat estavelmente transfectadas com um vector que contém a sequência de ácido nucleico codificando para a proteína verde fluorescente sob o controlo do promotor do CD154, 24 horas após estimulação com esferas 3x28 na presença de 0, 10, 50 e 100 ng/ml de FR901228. A Figura 12 apresenta os dados de fluxo relativos à coloração do DNA intracelular de células T CD4 com ausência de estimulação ou após estimulação com esferas 3x28 durante 24 horas na presença de 0, 1, 10, 50 e 100 ng/ml de FR901228.

Descrição Detalhada do Invento

Tal como acima se referiu, são aqui apresentados compostos, especificamente o composto FR901228 e seus congéneres, que exibem utilidade no contexto da imunosupressão. O composto FR901228 corresponde a um depsipéptido isolado a partir da bactéria terrestre Chromobacterium violaceum. Verificou-se subsequentemente que o FR901228 tinha a capacidade de inibir a transformação de fibroblastos de ratinho (NIH-3T3) transfectados com Ha-ras. A proteína ras mutante, na qual a glicina-12 é substituída por valina, tem a capacidade de induzir alterações morfológicas nas células NIH-3T3. Nestas células, o fenotipo transformado é indicativo de activação oncogénica e correlaciona-se com uma tumorigenicidade aumentada. Recentemente, foram identificados 13 numerosos fármacos candidatos, assim como produtos naturais, que revertem este fenótipo, revertendo deste modo a transformação em linhas celulares tumorigénicas. 0 composto FR901228 é um dos produtos naturais identificados na sequência deste esforço, tendo-se subsequentemente evidenciado como altamente activo em modelos baseados em animais. Como resultado disto, o composto FR901228 tem sido alvo de atenção considerável no contexto dos agentes antitumorais.

Mais especificamente, o composto FR901228 corresponde a um depsipéptido biciclico (i.e., um péptido contendo ligações éster assim como ligações amida) possuindo a seguinte estrutura:

S- FR90I228

Se bem que a base molecular explicativa da actividade do composto FR901228 não seja conhecida, pressupôs-se que a digação dissulfureto poderá possibilitar uma alteração conformacional redox-controlada, e que o meio redutor no interior de uma célula poderá converter este composto na sua forma de di-tiol monociclico (Khan et al., J. Am. Chem. Soc. 118:7237-7238, 1996) . A produção de FR901228 através de um processo de fermentação é exposta na Patente dos EUA N° 4.977.138, atribuída à Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. (aqui incorporada para fins de referência na sua totalidade). Nesta 14 patente, a fermentação da estirpe bacteriana WB968 pertencente ao género Chromobacterium violaceum é cultivada num meio nutritivo contendo fontes assimiláveis de carbono e de azoto, e sob condições de aerobiose. Após a conclusão da fermentação, o composto FR901228 é recuperado e purificado por meio de técnicas convencionais, tais como extracção por solventes, cromatografia ou recristalização.

Para além do isolamento de FR901228 como produto natural, a sintese total deste composto foi agora reportada por Khan et al. (supra). Este procedimento envolve um processo em 14 passos que fornece o composto FR901228 com um rendimento global de 18%. Em resumo, a sintese envolve inicialmente a reacção catalítica de aldol assimétrico de Carreira, a qual fornece um β-hidroxiácido contendo tiol. A porção peptídica do composto foi reunida através de métodos convencionais de síntese de péptidos. 0 β-hidroxiácido contendo tiol foi então acoplado à porção peptídica, gerando-se um anel monocíclico através da formação da ligação éster (depsipéptido). O sistema de anel bicíclico do composto FR901228 foi então formado por conversão dos tióis protegidos a uma ligação dissulfureto. São igualmente apresentados: especificamente, o composto FR901228, e genericamente, compostos com a estrutura (I), possuindo propriedades imunosupressoras. Com este fim, são apresentados, para além do composto FR901228, compostos possuindo a seguinte estrutura (I) : 15

incluindo os seus sais e estereoisómeros farmaceuticamente aceitáveis, em que m corresponde a 1, 2, 3 ou 4; n corresponde a 0, 1, 2 ou 3; p e q correspondem independentemente a 1 ou 2; X corresponde a O, NH ou NR;

Ri, R2 e R3 são idênticos ou diferentes e correspondem independentemente a uma porção molecular de cadeia lateral de aminoácido ou a um derivado de cadeia lateral de aminoácido; e R corresponde a uma porção molecular de alquilo, arilo ou arilalquilo de cadeia inferior.

Tal como aqui é usado, o termo "porção molecular de cadeia lateral de aminoácido" pretende indicar qualquer porção molecular de cadeia lateral de aminoácido que se encontre presente em proteínas de ocorrência natural, incluindo (mas de forma não limitativa) as porções moleculares de cadeia lateral de aminoácido identificadas na Tabela 1, abaixo. Outras porções moleculares de cadeia lateral de ocorrência natural de acordo com este invento incluem (de modo não limitativo) as porções moleculares de cadeia lateral da fenilglicina, 3,5-dibromotirosina, 3,5-diiodotirosina, hidroxilisina, 16 naftilalanina, tienilalanina, carboxiglutamato, fosfotirosina fosfoserina e aminoácidos glicosilados tal como serina asparagina e treonina glicosiladas.

Tabela 1

Porções Moleculares de Cadeia Lateral de Aminoácido Representativas Porção Molecular de Cadeia Lateral de Aminoácido Aminoácido -H Glicina -ch3 Alanina -CH(CH3)2 Valina -ch2ch (CH3) 2 Leucina -CH(CH3)CH2CH3 Isoleucina - (CH2)4NH2 Lisina - (CH2) 3NHC (=NH)NH2 Arginina F 0 1 Histidina HN^N -ch2cooh Ácido aspártico -ch2ch2cooh Ácido glutâmico -ch2conh2 Asparagina -ch2ch2conh2 Glutamina Fenilalanina tr—\ ^^5/OH Tirosina "ÇÍÒ' « Triptofano -ch2sh Cisteina -ch2ch2sch3 Metionina -ch2oh Serina Prolina -CH(OH)CH3 Treonina 17

Quando a porção molecular de cadeia lateral de aminoácido corresponde a prolina, deverá entender-se que o grupo Ri, R2 ou R3 se encontra unido ao átomo de azoto adjacente para formar o anel pirrolindinilo da prolina. Por exemplo, é apresentada a estrutura (I), em que m, n, p e q correspondem a 1, 0 grupo Ri poderá corresponder a prolina - isto é, Ri juntamente com o átomo de azoto adjacente forma um anel pirrolindinilo tal como representado pela estrutura (II) que se segue:

(!í)

Para além das porções moleculares de cadeia lateral de aminoácido que ocorrem na natureza, as porções moleculares de cadeia lateral de aminoácido expostas neste invento incluem igualmente vários derivados. Tal como aqui é usado, o termo "derivado de porção molecular de cadeia lateral de aminoácido" inclui modificações e/ou variações relativamente às porções moleculares de cadeia lateral de aminoácido de ocorrência natural, e inclui formas de realização em que Rx, R2 e/ou R3 se encontram unidos ao anel biciclico da estrutura (I) através de uma ligação dupla ou tripla. Por exemplo, as porções moleculares de cadeia lateral de aminoácido da alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilglicina e fenilalanina poderão em geral ser classificadas como porções moleculares de alquilo, arilo ou aralquilo de cadeia inferior. Os derivados de porções moleculares de cadeia lateral de aminoácido incluem outras porções moleculares de cadeia linear ou ramificada, cíclica ou não cíclica, substituída ou não substituída, 18 saturada ou não saturada de alquilo, arilo ou aralquilo de cadeia inferior.

Tal como aqui são referidas, as "porções moleculares de alquilo de cadeia inferior" contêm entre 1-12 átomos de carbono, as "porções moleculares de arilo de cadeia inferior" contêm entre 6-12 átomos de carbono e as "porções moleculares de aralquilo de cadeia inferior" contêm entre 7-12 átomos de carbono. Assim, numa das formas de realização do invento, o derivado de cadeia lateral de aminoácido é seleccionado a partir de um Ci-i2alquilo, um C6-i2arilo e um C7-i2aralquilo, e, numa forma de realização preferida, a partir de um Ci-7alquilo, um C6-ioarilo e um C7-naralquilo.

Quando Ri, R2 e R3 , tal como apresentado na estrutura (I), se encontram ligados através de uma ligação dupla ou de uma ligação tripla, uma forma de realização representativa incluirá compostos com a estrutura (III) em que R2 se encontra ligado por meio de uma ligação dupla:

É apresentada a estrutura (III) em que R2 corresponde a um alquilo insaturado de cadeia inferior, tal como =CHCH3, =CHCH2CH3 e semelhantes. No caso do composto FR901288, o grupo R2 da estrutura (III) corresponde a =CHCH3, m, n, p, q correspondem a 1, X corresponde a oxigénio e a ligação dupla opcional encontra-se presente (e na configuração trans). 19

Os derivados de cadeia lateral de aminoácido expostos neste invento incluem ainda derivados substituídos de porções moleculares de alquilo, arilo e aralquilo de cadeia inferior, em que o substituinte é seleccionado (mas de modo não limitativo) entre uma ou mais das porções moleculares que se seguem: -OH, -0R, -COOH, -COOR, -CONH2, -NH2, -NHR, -NRR, -SH, -SR, -S02R, -SO2H, -SOR, -PO3R, -OPO3R e halogéneo (incluindo F, Cl, Br e I), sendo que cada ocorrência de R é seleccionada de modo independente para corresponder a uma porção molecular de alquilo, arilo ou aralquilo de cadeia inferior. Adicionalmente, as porções moleculares cíclicas de alquilo, arilo e aralquilo de cadeia inferior expostas neste invento incluem 0 naftaleno, assim como compostos heterocíclicos tais como tiofeno, pirrol, furano, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, 3-pirrolina, pirrolidina, piridina, pirimidina, purina, quinolina, isoquinolina e carbazol. Os derivados de cadeia lateral de aminoácido incluem ainda derivados heteroalquílicos da parte de alquilo das porções moleculares de alquilo e aralquilo de cadeia inferior, incluindo (mas de modo não limitativo) fosfonatos e silanos de alquilo e de aralquilo.

Em relação aos componentes p e q da estrutura (I), deverá ter-se em conta que a dimensão da porção peptídica do anel poderá ser aumentada pela adição de uma (i.e., quando p ou q corresponde a 2) ou duas (i.e., quando tanto p como q correspondem a dois) porções moleculares de aminoácidos. Por exemplo, quando p corresponde a 2 e q corresponde a 1 (e X corresponde a oxigénio), os compostos apresentados neste invento incluem os que possuem as seguintes estruturas (IV): 20

Na estrutura (IV) acima, a porção molecular de cadeia lateral de aminoácido correspondendo ao grupo Ri da estrutura (I) é designado por R/ no primeiro caso e por Ri'' no segundo caso (uma vez que p corresponde a 2 nesta forma de realização) de modo a clarificar que estas porções moleculares de cadeia lateral de aminoácido poderão ser iguais ou diferentes. Em outras situações expostas, p corresponde a 1 e g a 2, ou tanto p como q correspondem a 2.

Na estrutura (I), a designação ----- representa uma ligação dupla opcional. Quando presente, a ligação dupla poderá encontrar-se na configuração cis ou em trans. Em uma das situações expostas, a ligação dupla encontra-se na configuração trans, tal como acontece no caso do composto FR901288.

Dependendo da escolha das porções moleculares X e Y, os compostos do presente invento incluem ésteres, quando X corresponde a oxigénio, e amidas, quando X corresponde a NH ou NR. Por exemplo, quando p e q correspondem a 1, os compostos representativos deste invento incluem ésteres e amidas tal como as representadas pelas estruturas (VI) e (VII), respectivamente: 21

Os compostos deste invento poderão ser preparados seguindo o Esquema de Reacção 1, abaixo:

Esquema de Reacção 1

Passo (1):

No passo (1), o aldeído 2 é preparado a partir do dienoato 1 (em que n=1, 2 ou 3), recorrendo ao procedimento em três passos descrito por Kahn et al., J. Am. Chem. Soc. 118:1231-7238, 1996. 0 benziléster 3 é formado pela adição, catalizada por Ti-(IV), de cetenoacetal de O-benzilo, O-TMS ao aldeído 2 (em que R'=H e R''=OH, ou R'=OH e R''=H). A hidrólise do benziléster 3 com LiOH em Me0H/H20 fornece o hidroxiácido 4. 22

Passo (2): h2n

5 OCIb NHFraoc OCHj 6 T«

m

No passo (2) , a porção peptídica do composto é preparada por meio de técnicas convencionais de síntese de péptidos, começando com um metiléster de aminoácido apropriado, 5. 0 metiléster 5 é colocado em reacção com um aminoácido N-protegido utilizando o reagente BOP para fornecer o dipéptido 6, seguindo-se o acoplamento a N-Fmoc-cisteína- (S-trifenilmetilo) quando m corresponde a 1, ou a um análogo deste quando m corresponde a 2, para fornecer o tripéptido 7. 0 tripéptido 7 é então convertido no tetrapéptido N-protegido 8, seguindo-se a desprotecção do grupo FMOC para fornecer o tetrapéptido 9. No esquema de reacção acima, Ri, R2 e R3 são idênticos ou diferentes e representam de modo independente uma porção molecular de cadeia lateral de aminoácido ou um seu derivado, tal como acima se definiu. Deve ter-se em conta que a técnica acima corresponde à síntese de compostos com a estrutura (I) em que p e q correspondem ambos a 1. Nas formas de realização em que p e/ou q correspondem a 2, a técnica acima é utilizada para incorporar um ou dois grupos adicionais de aminoácidos na porção peptídica do composto. 23

Passo 3

No passo 3, o acoplamento do tetrapéptido 9 e do hidroxiácido 4 com BOP e DIEA fornece o hidroximetiléster 10. A hidrólise, mediada por LiOH, do metiléster 10 fornece o ácido carboxilico correspondente, o qual poderá então ser convertido no composto intermediário de lactona monociclica 11 através de ciclização com DEAD e PPh3. Por fim, a oxidação da bis(S-trifenilmetil)lactona 11 com iodo numa solução diluída de MeOH fornece compostos do presente invento que possuem a estrutura (I) .

Alternativamente, os compostos apresentados poderão igualmente ser sintetizados utilizando a técnica seguinte:

Passo Alternativo (1):

24 Lí0, NHíca, EtOH jbs

, 2. MsC],py.___ 3. TritylCh py. 4, FmocCÍ

NHFbioc

1. BCOaCl, NMM, THF 2. CH2N2.EÍ2O S.CiHsCOOAgrtBuOH, H2O

Nesta situação, o composto 4' é produzido usando os procedimentos acima e é então adicionado, no Passo (3) acima, à porção peptidica produzida no Passo (2) . 0 composto intermediário resultante é ciclizado tal como anteriormente referido para fornecer compostos com a estrutura (I).

No caso de X corresponder a NH ou NR, tais compostos poderão ser produzidos quando R' ou R'' do composto 4 correspondem a NH ou a NHR, respectivamente. Ainda, quando a ligação dupla opcional da estrutura (I) não se encontra presente, poderão ser utilizadas as mesmas técnicas de reacçâo, mas utilizando os compostos intermediários saturados correspondentes.

Os compostos expostos incluem igualmente sais de adição ácida, os quais poderão ser preparados através de métodos bem conhecidos neste campo, podendo ser formados a partir de ácidos orgânicos e inorgânicos. Como ácidos orgânicos adequados incluem-se os ácidos maleico, fumárico, benzóico, ascórbico, succinico, metanosulfónico, acético, trifluoroacético, oxálico, propiónico, tartárico, salicilico, cítrico, glucónico, láctico, mandélico, cinâmico, aspártico, esteárico, palmítico, glicólico, glutâmico e benzenosulfónico. Entre os ácidos inorgânicos adequados encontram-se os ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico, fosfórico e nítrico. Tal 25 como aqui é usado, o termo "sal farmaceuticamente aceitável" da estrutura (I) pretende englobar todas as formas de sal adequadas, e qualquer destas.

No que diz respeito aos estereoisómeros, os compostos da estrutura (I) poderão possuir centros quirais e poderão ocorrer como pares racémicos, misturas racémicas e como enantiómeros e diastereoisómeros individuais. Todas estas formas isoméricas são abrangidas pelo presente invento, incluindo as misturas destas. Adicionalmente, algumas das formas cristalinas dos compostos da estrutura (I) poderão existir sob a forma de compostos polimórficos, os quais se encontram igualmente abrangidos pelo presente invento. Ainda, alguns dos compostos com a estrutura (I) poderão também formar solvatos com água ou outros solventes orgânicos. Tais solvatos são igualmente incluídos no âmbito deste invento. 0 presente invento relaciona-se com o uso de compostos com a estrutura (I) num animal (preferencialmente um mamífero e mais preferencialmente um ser humano) para o tratamento e/ou prevenção de uma resposta imune e/ou de respostas e doenças mediadas pelo sistema imunológico, tal como a prevenção ou o tratamento da rejeição após o transplante de materiais de enxerto sintéticos ou orgânicos, células, orgãos ou tecidos, de modo a repôr o todo ou parte da função dos tecidos, tais como o coração, rim, fígado, medula óssea, pele, córnea, vasos sanguíneos, pulmão, pâncreas, intestino, membros, músculos, tecido nervoso, duodeno, intestino delgado, células dos ilhéus pancreáticos, incluindo xenotransplantes, etc.; para a prevenção ou tratamento da doença de enxerto versus hospedeiro, doenças autoimunes, tais como artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, tiroidite, tiroidite de Hashimoto, esclerose múltipla, miastenia gravis, diabetes de tipo I, diabetes mellitus juvenil ou do adulto, uveíte, doença 26 de Graves, psoríase, dermatite atópica, doença de Crohn, colite ulcerativa, vasculite, doenças mediadas por auto-anticorpos, anemia aplástica, síndroma de Evans, anemia hemolítica autoimune e semelhantes; e ainda para o tratamento de doenças infecciosas causando uma resposta e/ou activação imune inapropriada, tal como uma desregulação imune induzida por trauma ou por patogénios, incluindo, por exemplo, a causada por infecção com os vírus da hepatite B e C, infecção por Staphylococcus aureus, encefalite virai, sépsis, doenças parasíticas em que a lesão é causada por uma resposta inflamatória (p.ex., lepra); e na prevenção ou tratamento de doenças circulatórias, tais como arteriosclerose, aterosclerose, vasculite, poliarterite nodosa e miocardite. Adicionalmente, o presente invento poderá ser usado na prevenção/supressão de uma resposta imune associada a um tratamento de terapia genética, tal como a introdução de genes estranhos em células autólogas para expressão do produto codificado.

Tal como aqui é usado, o termo "resposta imune" refere-se à reacção do organismo a antigénios estranhos ou do self, de modo a neutralizá-los e/ou eliminá-los. A resposta imune mediada por células envolve a produção de linfócitos pelo timo (células T) em resposta à exposição ao antigénio. Esta reacção é importante na hipersensibilidade retardada, na rejeição aos transplantes de tecidos e em algumas infecções. Na resposta imune humoral são produzidos plasmócitos (células B) em resposta à exposição ao antigénio com subsequente formação de anticorpos. Esta resposta poderá produzir imunidade ou hipersensibilidade. A resposta imune inespecífica, ou inflamação, constitui a resposta das células e tecidos do organismo a uma lesão de qualquer origem (p.ex., trauma, organismos, produtos químicos, isquémia, etc.). A resposta 27 inicial do sistema imune a qualquer ameaça envolve actividades vasculares, químicas e das células sanguíneas. A resposta imune específica é requerida quando a inflamação se mostra inadequada para fazer face à lesão ou à invasão por um organismo ou agente. Esta resposta é dirigida e controlada por células T e B. A imunidade celular refere-se à resposta das células T; a imunidade humoral é o termo anteriormente usado para referir as respostas das células B. Adicionalmente, a referência aqui feita às células CD4, ou CD8, ou semelhantes, pretende indicar que as células são positivas para o marcador de superfície celular CD4 ou CD8.

Outros usos poderão incluir o tratamento e/ou profilaxia de: doenças inflamatórias e hiperproliferativas da pele e manifestações cutâneas de doenças mediadas pelo sistema imune, como dermatite seborreica, angioedemas, eritemas, acne e alopécia areata; várias doenças oculares (autoimunes e outras); reacções alérgicas, tais como alergias ao pólen, doença obstrutiva reversível das vias aéreas, incluindo patologias como a asma (por exemplo, asma brônquica, asma alérgica, asma intrínseca, asma extrínseca e asma ao pó) , particularmente a asma crónica ou incoercível (por exemplo, asma de desenvolvimento tardio e hiperreactividade das vias aéreas), bronquite, rinite alérgica e semelhantes; inflamação das mucosas e dos vasos sanguíneos; actividade de certas infecções virais, tais como a infecção por citomegalovírus e a infecção pelo vírus de Epstein-Barr.

Numa das formas de realização do invento, é proporcionado o uso de um composto com a estrutura (I) para o fabrico de um medicamento para o tratamento de um distúrbio num animal, sendo este tratamento afectado ou facilitado pela redução da proliferação e/ou activação dos linfócitos (p.ex., regulação negativa de CD25 e/ou CD154). É proporcionado o uso do 28 composto no tratamento de um distúrbio de um animal, sendo este tratamento facilitado pela inibição da proliferação de linfócitos e/ou pela inibição de marcadores de activação (p.ex., CD25 e CD154), e pela inibição da função imune, podendo o distúrbio corresponder a autoimunidade, inflamação, rejeição de um enxerto por um tecido ou incluir qualquer das indicações aqui descritas que são induzidas ou exacerbadas por via imunológica.

Deste modo, uma das formas de realização do invento prevê o uso de um composto com a estrutura (I) para o fabrico de um medicamento para o tratamento de doenças autoimunes, enquanto que outra das formas de realização do invento corresponde ao uso do composto para a prevenção ou tratamento da rejeição de transplantes de orgãos estranhos.

Tal como acima se referiu, a ciclosporina constitui presentemente o principal fármaco usado na prevenção da rejeição de orgãos transplantados. 0 fármaco actua inibindo a função da calcineurina nos linfócitos, deste modo evitando que o sistema imune do organismo mobilize o seu vasto arsenal de agentes de protecção naturais para rejeitar as proteínas estranhas do transplante. Apesar de a ciclosporina ser eficaz no combate à rejeição de transplantes, é nefrotóxica e conhecem-se-lhe diversos efeitos secundários indesejáveis, os quais incluem insuficiência renal, anomalias da função hepática, desconforto gastrointestinal e indução de cancro (Hojo et al., Nature 397:530-534, 1999). A busca de novos fármacos mais seguros, com um perfil melhorado de efeitos secundários, tem sido constante neste campo técnico. O presente invento proporciona agentes imunosupressores que, sem que se pretenda aqui vinculá-los a qualquer mecanismo de acção em particular, parecem induzir uma tolerância imunológica de longa duração. O composto FR901228 29 permite a activação parcial das células T CD4 (p.ex., indução de CD69, mas com redução da expressão à superfície de CD25, CD137w, CDlla, CD134, CD54, CD95 e CD154, assim como redução da produção de IL-2 e/ou de TNF-α). As células T CD4 activadas na presença de FR901228 não atravessam o processo de morte celular induzida por activação (AICD); no entanto, estas células sofrem subsequentemente apoptose in vitro, muito provavelmente devido à falta de secreção de IL-2 e/ou de estimulação dos receptores para IL-2. Adicionalmente, o tratamento de células T CD4 e CD8 previamente activadas com compostos da classe de FR901228, tais como os representados pela estrutura (I), inibe o seu crescimento e induz a apoptose num curto espaço de tempo, sendo as células T em repouso aparentemente não afectadas. A indução de apoptose nas células T responsivas não só elimina as células T activadas, como também induz um estado de tolerância imunológica a longo prazo (Ferguson e Green, Nature Med. 5(11):1231-1232, 1999). A razão para esta tolerância específica não é bem compreendida. Assim mesmo, a imunização com células dadoras que não se encontrem em divisão (p.ex., células dendriticas ou linfócitos do sangue periférico irradiados) na presença de FR901228 antes do transplante poderá muito possivelmente conferir tolerância específica a futuras respostas de hospedeiro-versus-enxerto sem que seja necessário repetir a presença de FR901228. 0 termo "tolerância", tal como aqui é usado, refere-se a um estado de não reactividade do sistema imune relativamente a um antigénio contra o qual este tem a capacidade de reagir. Apesar de não se pretender estabelecer um vínculo a qualquer mecanismo de acção em particular, crê-se que a tolerância é induzida pelos compostos do presente invento através da indução de apoptose nas células T activadas. Por exemplo, se as células T forem activadas por um antigénio e em 30 consequência de tal sofrerem apoptose, não ocorrerá subsequentemente uma resposta imune contra este antigénio. A indução de tolerância por um composto em particular poderá ser testada recorrendo a quaisquer métodos e modelos conhecidos dos peritos na técnica. Como exemplo, a estimulação primária e secundária por um antigénio poderá ser testada na presença dos compostos do presente invento. Abreviadamente, um animal é inoculado com um antigénio, seguindo-se uma inoculação subsequente com o composto; cerca de duas semanas mais tarde, o animal poderá ser inoculado com o mesmo antigénio na ausência do composto, medindo-se então a resposta imune secundária. Deste modo, tanto a resposta primária como qualquer resposta secundária que possa surgir poderão ser medidas por uma simples análise ao sangue. Uma amostra que não evidencie o desenvolvimento de uma resposta imune secundária demonstra a indução de tolerância por parte do composto imunosupressor. Adicionalmente, poderão utilizar-se ensaios in vitro padronizados para determinar a activação das células T, tal como ensaios de CTL ou a avaliação da secreção de IL-2.

Para além da indução da apoptose, as células T CD4 e CD8 induzidas por meio de diversos estímulos, tais como o envolvimento concomitante de CD3 e CD28, a estimulação com ionomicina/ácido forbol-mirístico (PMA) e a estimulação de células dendriticas alogénicas, exibem uma inibição do crescimento quando tratadas com FR901228, tanto em simultâneo com a estimulação como no seguimento da estimulação. Deste modo, tais composições constituem um grande melhoramento face a fármacos como a ciclosporina, que inibem as células T CD4 muito precocemente na cascata de activação. Isto faz com que as células T CD4 activadas na presença da ciclosporina sejam células "ingénuas" ou não activadas de facto, pelo que não sofrem apoptose. Assim, se terminar o tratamento com 31 ciclosporina a resposta imune inibida voltará a desenvolver-se. Por outras palavras, se as células T CD4 se encontram num estado activo em presença dos compostos do invento, estas células sofrerão apoptose, verificando-se deste modo uma tolerância duradoura ao antigénio, enquanto que quando as mesmas células são tratadas com ciclosporina a resposta imune é inibida apenas enquanto a ciclosporina se encontra presente.

Adicionalmente, a imunosupressão com FR901228 conduz à indução de anergia e/ou apoptose apenas em células T activadas; assim, a contagem geral de células T e das outras células hematopoiéticas é mantida. Por contraste, tanto a ciclosporina como o composto FK506 bloqueiam os eventos mais precoces da activação das células T, não permitindo deste modo que as células T atinjam um estado no qual se tornam susceptiveis à indução de apoptose. 0 composto FR901228 possui diversas caracteristicas adjuvantes da sua capacidade de actuar como um potente imunosupressor. Deste modo, os compostos da classe representada pela estrutura (I), incluindo o FR901228, poderão possuir uma ou mais das caracteristicas seguintes: inibição da proliferação de células T CD4 e CD8 induzida pelo envolvimento de CD3 e CD28, ionomicina/PMA ou células dendriticas alogénicas; inibição da proliferação já em decurso de células CD4 e/ou CD8, quando adicionados após a activação inicial; inibição das vias de transdução de sinal para o envolvimento de CD3/CD28 e a estimulação de IL-2; inibição da indução de CD25, CD134, CD137w, CD154, CD 11a, CD54 e CD95 em células T CD4; ausência de alteração significativa da indução de CD69 ou de regulação negativa, induzida por activação, de CD62L; redução da secreção de IL-2 pelos linfócitos do sangue periférico; redução da secreção de TNF-α pelos linfócitos do sangue periférico; inibição do ciclo celular antes da entrada 32 na fase S para as células T activadas; inibição da indução de p21cip/waf e de C/EPB-a em células T activadas; inibição da expressão de c-myc em células T activadas; inibição da proliferação de células T activadas induzida por IL-2; e inibição de CD154 ao nível da transcrição. Para além disto, o composto FR901228 não afecta o processo global de fosforilação, tal como medido por Western Blots usando fosfotirosina. Assim, estas observações indicam que os compostos com a estrutura (I) afectam a via de activação das células T em múltiplos pontos, permitindo que a activação se processe a nível dos passos iniciais, tal como a fosforilação, mas evitando os eventos subsequentes de activação e proliferação.

Para determinar se um determinado composto possui eficácia como imunosupressor, poderão utilizar-se diversas metodologias conhecidas neste campo técnico. Deste modo, a proliferação e/ou activação de linfócitos poderá ser medida após o contacto com o composto de interesse antes, durante ou após a estimulação. Por exemplo, um indicador-chave da activação de células T e da subsequente indução da proliferação (e também um iniciador da inflamação) corresponde à produção de IL-2, IFN-γ, CD25, CD69 ou CD154, a qual pode ser medida por meio de diversos métodos, incluindo ELISA e citometria de fluxo. Poderá igualmente recorrer-se a outros métodos experimentais vulgarmente utilizados para medir a proliferação celular e a secreção de citocinas, incluindo um ensaio colorimétrico com coloração por iodeto de propídio, MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-ilo]-2,5-difeniltetrazólio), colorações vitais, CFDA-SE (5— (e 6-)-diacetato de carboxifluoresceína-succinimidiléster), contagem celular, incorporação de bromodesoxiuridina, ou um ensaio de incorporação de timidina (ver, p.ex., Avian Dis. 43(2):172-181, 1999; Anticancer Res. 33 17(1Β):725-728, 1997; Geller, Scand. J. Immunol. 35:327-334, 1992; Levine et al., Int. J. Immun. 7(6):891-904, 1995; Hara et al., J. Exp. Med. 161:1513-1524, 1985; Harding et al., Nature 355:607-609, 1992; Linsley et al., Science 257:792-795, 1992; Publicação PCT N° WO 95/33823).

Os métodos para activar os linfócitos e, deste modo, estimular a proliferação destes são bem conhecidos neste campo e incluem a estimulação na presença e na ausência de IL-2 com fitohemaglutinina (PHA), concanavalina A (ConA), anticorpos anti-CD3 (na presença ou na ausência de anticorpos anti-CD28), células alogénicas, superantigénios ou ionomicina/PMA (Paul, Fundamental Immunology, 4a Edição, Lippincot-Raven, 1998) .

Existem diversos modelos animais e in vitro que podem ser usados para testar e validar os compostos imunosupressores do presente invento e a sua aplicabilidade a uma determinada doença ou alteração relacionada com o sistema imune. Deste modo, um técnico de pericia média poderá facilmente escolher o modelo apropriado a partir dos modelos actualmente disponíveis neste campo. Tais modelos incluem o uso de ratinhos NOD, nos quais a IDDM resulta de uma destruição autoimune espontânea, dependente de células T, das células β pancreáticas produtoras de insulina, processo que se intensifica com a idade (Botazzo et al., J. Engl. J. Med. 113:353, 1985; Miyazaki et al., Clin. Exp. Immunol. 60:622, 1985). Nos ratinhos NOD, um modelo para a IDDM humana, as estratégias terapêuticas dirigidas para as células T têm evidenciado sucesso na prevenção da IDDM (Makino et al., Exp. Anim. 29:1, 1980). Estas estratégias incluem a timectomia neonatal, administração de ciclosporina, e infusão de anticorpos monoclonais (mAcs) anti-pan células T, anti-CD4 ou anti-CD25 (IL-2R) (Tarui et al., Insulitis and Type I Diabetes. Lessons from the NOD Mouse, Academic Press, Tóquio, p. 143, 1986) . Outros modelos incluem os tipicamente 34 utilizados para as doenças autoimunes e inflamatórias, tal como a esclerose múltipla (modelo EAE), artrite reumatóide, doença de enxerto versus hospedeiro (modelos de transplante para estudar a rejeição de enxertos usando enxertos de pele, transplante de coração, transplantes de ilhéus de Langerhans, transplantes de intestino grosso e delgado e semelhantes), modelos de asma, lúpus eritematoso sistémico (modelo de autoimunidade sistémica-NZBxNZWFi), e semelhantes (ver, por exemplo, Takahura et al., Exp. Hematol. 27(12):1815-1821, 1999; Hu et al., Immunology 98(3):379-385, 1999; Blyth et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14(5):425-438, 1996; Theofilopoulos e Dixon, Adv. Immunol. 37:269-389, 1985; Eisenberg et al., J. Immunol. 125:1032-1036, 1980; Bonneville et al., Nature 344:163-165, 1990; Dent et al., Nature 343:714-719, 1990; Todd et al., Nature 351:542-547, 1991; Watanabe et al., Biochem. Genet. 29:325-335, 1991; Morris et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 57:263-273, 1990; Takahashi et al., Cell 76:969-916, 1994; Current Protocols in Immunology, Richard Coico (ed.), John Wiley & Sons, Inc., Capitulo 15, 1998) .

Os indivíduos que necessitam de tratamento para supressão do sistema imune incluem indivíduos com doença autoimune; indivíduos que vão ser submetidos a transplante; e indivíduos com doença cardiovascular; indivíduos com reacções alérgicas; e indivíduos com trauma ou desregulação imune induzida por agentes patogénicos. Os exemplos de doenças autoimunes incluem diabetes mellitus insulinodependente, asma, psoríase, colite ulcerativa, doença de Crohn, artrite reumatóide, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistémico, assim como outros distúrbios acima referidos. Os indivíduos com um transplante de orgão ou célula/tecido necessitam igualmente de um tratamento para supressão do sistema imune de modo a conseguir 35 a supressão, ou prevenção, da rejeição num transplante de orgão. 0 termo "transplante de orgão" refere-se à transferência ou "transplante" de um orgão interno (p.ex., coração, pulmão, rim, fígado, pâncreas, estômago, intestino delgado e intestino grosso e medula óssea) ou de um orgão externo (p.ex., pele) de um dador para um receptor, sendo o dador geneticamente distinto do indivíduo ou animal que recebeu o transplante. Um "transplante de orgão" inclui igualmente transplantes inter-espécies (i.e., xenotransplantes) .

Uma "quantidade eficaz" corresponde à dosagem do composto que é necessária para atingir o efeito terapêutico e/ou profiláctico desejado; por exemplo, a dosagem do composto que resulta na supressão de uma resposta imune "ingénua" ou de memória no indivíduo ou animal, ou que resulta na supressão da rejeição de um transplante de orgão no indivíduo. Um "efeito terapêutico e/ou profiláctico desejado" inclui, por exemplo, o aumento da duração da vida ou a melhoria dos sintomas de um indivíduo ou animal sofrendo, ou que virá provavelmente a sofrer, de uma doença autoimune, tal como asma, psoríase, colite ulcerativa, artrite reumatóide, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistémico e semelhantes. Os exemplos de sintomas que podem ser melhorados incluem: hiperglicémia na diabetes; dores nas articulações; rigidez e imobilidade na artrite reumatóide; paralisia na esclerose múltipla; e rash e lesão da pele no lúpus eritematoso sistémico. No que diz respeito à diabetes mellitus insulinodependente, um "efeito terapêutico ou profiláctico desejado" inclui a melhoria ou prevenção de complicações secundárias resultantes da doença, tal como distúrbios vasculares. As doses adequadas dependerão da idade, estado de saúde e peso do receptor, extensão da doença, tipo de tratamento concomitante, se existir, 36 frequência do tratamento e natureza do efeito desejado. Por exemplo, as doses poderão encontrar-se entre cerca de 0,001 -100 miligramas por dia. De modo geral, uma dose de entre 0,1 a 50 miligramas por dia em uma ou mais aplicações é eficaz para obter os resultados desejados. Em certas formas de realização, a dose poderá ser ajustada de modo a que as células T não activadas sejam mantidas e que substancialmente apenas as células T activadas sejam dirigidas para a apoptose, anergia e/ou não reactividade funcional temporária (i.e., a contagem geral de células T e/ou de outras células em divisão é mantida) . Em outras formas de realização, o tratamento com depsipéptidos proporciona um efeito imunosupressor, enquanto que em outras formas de realização a dose utilizada não afecta a divisão das células hematopoiéticas, e ainda em outras formas de realização a dose não afecta substancialmente a divisão celular de modo geral. No entanto, os intervalos de dose eficaz poderão facilmente ser determinados no decurso de ensaios clínicos, recorrendo às metodologias padronizadas disponíveis neste campo. Estas doses correspondem às quantidades eficazes na prevenção ou tratamento de doenças autoimunes, na prevenção ou tratamento da rejeição de transplantes e/ou em outros distúrbios, doenças e estados patológicos relacionados.

Um "indivíduo" corresponde preferencialmente a um mamífero, tal como um ser humano, mas poderá também corresponder a um animal que necessite de um tratamento veterinário, p.ex., animais domésticos (p.ex., cães, gatos e semelhantes), animais de quinta (p.ex., vacas, ovelhas, porcos, cavalos, galinhas e semelhantes) e animais de laboratório (p.ex., ratos, ratinhos, porquinhos-da-índia e semelhantes) . 37 0 composto poderá ser administrado isoladamente ou em conjunção com outros agentes farmacologicamente activos, p.ex. juntamente com outros agentes imunosupressores ou com antibióticos e/ou agentes antivirais. Os compostos que poderão ser coadministrados incluem esteróides (p.ex., acetato de metilprednisolona), AINEs e outros imunosupressores conhecidos, tal como azatioprina, 15-desoxispergualina, ciclosporina, mizoribina, micofenolato de mofetil, brequinar sódico, leflunomida, FK-506, rapamicina e compostos relacionados. As doses destes fármacos variarão igualmente segundo o distúrbio e o indivíduo a ser tratado. A quantidade eficaz do composto poderá ser administrada por uma via apropriada em dose única ou em doses múltiplas.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem tanto sais metálicos (inorgânicos) como sais orgânicos; uma lista destes sais é apresentada em Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a Edição, pág. 1418 (1985) . Os peritos na técnica estão cientes de que uma forma de sal apropriada é escolhida com base na sua estabilidade física e química, escoabilidade, higroscopicidade e solubilidade. Tal como reconhecerão estes peritos, os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, de modo não limitativo, sais de ácidos inorgânicos, tais como cloridrato, sulfato, fosfato, difosfato, bromidrato e nitrato, ou sais de ácidos orgânicos, tais como malato, maleato, fumarato, tartarato, succinato, citrato, acetato, lactato, metanosulfonato, p-toluenosulfonato ou palmoato, salicilato e estearato. De forma similar, os catiões farmaceuticamente aceitáveis incluem, de modo não limitativo, sódio, potássio, cálcio, alumínio, lítio e amónio (especialmente sais de amónio com aminas secundárias) . Os sais preferidos para este invento, pelas razões acima citadas, incluem os sais de potássio, sódio, cálcio e amónio. Encontram-se igualmente abrangidos pelo 38 âmbito deste invento os estereoisómeros, formas cristalinas, hidratos e solvatos dos compostos do presente invento.

Como imunosupressores, estes compostos exibem utilidade no tratamento de doenças autoimunes, na prevenção da rejeição de transplantes de orgãos e/ou em outros distúrbios, doenças e estados patológicos relacionados.

Os compostos poderão ser administrados para tratamento de doenças autoimunes, prevenção da rejeição de transplantes de orgãos estranhos e/ou outros distúrbios, doenças e estados patológicos relacionados, como previsto neste invento, recorrendo-se a qualquer meio que efectue o contacto entre o composto como ingrediente activo e o local de acçâo no organismo de um animal de sangue quente. Por exemplo, a administração poderá ser oral, tópica, incluindo a administração transdérmica, ocular, bucal, intranasal, por inalação, intravaginal, rectal, intracisternal e parentérica. 0 termo "administração parentérica", tal como aqui é usado, refere-se a modos de administração que incluem as vias subcutânea, intravenosa, intramuscular, de injecção ou infusão intra-articular, intraesternal ou intraperitoneal.

Os compostos poderão ser administrados por quaisquer meios convencionais disponíveis para uso em conjunção com produtos farmacêuticos, tanto como agentes terapêuticos individuais como numa combinação de agentes terapêuticos. Estes compostos poderão ser administrados isoladamente, mas serão geralmente administrados em associação a um veículo farmacêutico seleccionado com base na via de administração escolhida e na prática farmacêutica instituída. 0 ingrediente activo poderá ser administrado oralmente em formas de dosagem sólidas, tais como cápsulas, comprimidos, pastilhas, drageias, grânulos e pós, ou em formas de dosagem líquidas, tais como elixires, xaropes, emulsões, dispersões e 39 suspensões (ver, p.ex., Chan et al., invest. New Drugs 15:195— 206, 1997, em que é demonstrada a biodisponibilidade das dosagens orais de FR901228). O ingrediente activo poderá ainda ser administrado por via parentérica, sob a forma de dosagem de líquidos estéreis, tais como dispersões, suspensões ou soluções. Poderão ainda utilizar-se outras formas de dosagem para administrar o ingrediente activo, como as formas de unguento, creme, gotas, penso transdérmico ou pó para administração tópica, como solução oftálmica ou suspensão, i.e., gotas oculares, para administração ocular, como um spray de aerosol ou composição em pó para inalação ou administração intranasal, ou como creme, unguento, spray ou supositório para administração vaginal ou rectal.

As cápsulas de gelatina contêm o ingrediente activo e veículos em pó, tais como lactose, amido, derivados de celulose, estearato de magnésio, ácido esteárico e semelhantes. Poderão usar-se diluentes semelhantes para o fabrico de comprimidos. Tanto as cápsulas como os comprimidos poderão ser fabricados sob a forma de produtos para libertação prolongada, que possibilitem a libertação contínua de medicamento ao longo de algumas horas. Os comprimidos poderão ser revestidos por açúcar ou por uma película para mascarar qualquer gosto desagradável e proteger o comprimido da atmosfera, ou formulados com um revestimento entérico para que se dê a sua desintegração selectiva a nível do tracto gastrointestinal.

As formas de dosagem líquidas para administração oral poderão conter corantes e aromatizantes para melhorar a aceitação por parte do paciente.

De modo geral, água, um óleo adequado, soro fisiológico, dextrose aquosa (glucose) e soluções de açúcar semelhantes, e glicóis como o propilenoglicol e polietilenoglicóis, 40 constituem veículos adequados para soluções parentéricas. As soluções para administração parentérica conterão preferencialmente um sal solúvel em água do ingrediente activo, agentes estabilizantes adequados, e, se necessário, substâncias-tampão. Os agentes antioxidantes como o bissulfito de sódio, sulfito de sódio ou ácido ascórbico, isolados ou em combinação, constituem agentes estabilizantes adequados. Poderão igualmente usar-se o ácido cítrico e seus sais e etilenodiaminotetraacetato de sódio (EDTA). Adicionalmente, as soluções parentéricas poderão conter conservantes, tais como cloreto de benzalcónio, metil- ou propilparabeno e clorobutanol. Em certas formas de realização, a composição é preparada diluindo 10 mg de depsipéptido liofilizado e 20 mg de povidona USP em 2 ml de uma solução contendo etanol USP a 20% em propilenoglicol USP. A solução é então de novo diluída com cloreto de sódio a 0,9% para injecção, USP, até uma concentração final no intervalo de 0,02 a 5,0 mg/ml.

Para administração por inalação, os compostos do presente invento poderão ser administrados de forma conveniente como sprays de aerosol a partir de embalagens ou nebulizadores pressurizados. Os compostos poderão igualmente ser libertados sob a forma de pós que serão formulados e a composição de pó poderá ser inalada com a ajuda de um dispositivo para inalação de pó por insuflação. O sistema de libertação preferido para inalação corresponde a um aerosol para inalação de dose medida (MDI), o qual poderá ser formulado como uma suspensão ou uma solução de um composto do presente invento em propulsores adequados, tais como fluorocarbonetos ou hidrocarbonetos.

Para administração ocular, poderá formular-se uma preparação oftálmica a partir de uma solução ou suspensão contendo uma quantidade apropriada, em p%, dos compostos do presente invento num veículo oftálmico apropriado, de modo a 41 que o composto seja mantido em contacto com a superfície ocular durante um período de tempo suficiente para permitir que o composto trate a superfície da mucosa ou penetre a córnea e a região interna do olho.

De modo geral, poderão usar-se as mesmas formas de dosagem quando os compostos deste invento são administrados de modo faseado ou em conjunção com outro agente terapêutico.

Quando os fármacos são administrados em combinação física, a forma de dosagem e a via de administração deverão ser seleccionadas de acordo com a compatibilidade dos fármacos combinados. Deste modo, o termo "coadministração" pretende incluir a administração dos dois agentes de modo concomitante ou sequencial, ou alternativamente como uma combinação de dose fixa dos dois componentes activos. A partir do acima exposto é possível compreender que, tendo embora aqui sido descritas algumas formas específicas de realização do invento com objectivos ilustrativos, será possível introduzir diversas modificações sem que se abandone o âmbito deste invento. Deste modo, o invento não se encontra limitado de outra forma que não a indicada pelas reivindicações anexas.

EXEMPLOS

Exemplo I

Cultura Celular e Preparação São cultivadas células isoladas a partir de sangue humano em meios ex-vivo (Biowhittaker Inc., Walkersville, MD) suplementados, dependendo do uso pretendido, com ou sem 20 U/ml de IL-2 (Boehringer Manheim, Indianapolis, IN) e suplementado com 5% de soro humano (Biowhittaker), glutamina 2 42 mM (Life Technologies, Rockville, MD) e HEPES 20 mM (Life Technology). São cultivadas células Jurkat E6-1 (ATCC,

Manassas, VA) em RPMI 1.640 (Life Technologies) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Biowhittaker), glutamina 2 mM (Life Technologies), penicilina 2 mM (Life Technologies) e estreptomicina 2 mM (Life Technologies). São obtidas camadas de glóbulos brancos a partir de voluntários humanos saudáveis (American Red Cross, Portland, OR) . São obtidas células mononucleares do sangue periférico (PBMC) usando Meio para Separação de Linfócitos (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) de acordo com as instruções do fabricante. São obtidos linfócitos do sangue periférico (PBL) a partir da fracção de PBMC recorrendo a incubação num frasco de cultura (Costar, Pittsburgh, PA) ou com Dynabeads (esferas paramagnéticas) não revestidas (Dynal, Oslo, Noruega), 1 x 108 células/ml, 2 esferas/célula, 2h a 37°C. Os monócitos e os macrófagos são removidos por aderência ao frasco de cultura ou por fagocitose das esferas paramagnéticas que são removidas por separação magnética de células de acordo com as instruções do fabricante (Dynal). As células CD4 são purificadas a partir da fracção de PBL através de incubação com 10 yg/ml de anticorpos monoclonais anti-CD8 (clone G10-1), CD20 (clone IF5), CD14 (clone F13) e CD16 (Coulter), 108 células/ml, 20 min a 4°C. Após lavagem, as células são tratadas por duas vezes com Dynabeads acopladas a Ig de ovelha anti-ratinho (106 células/ml, 6 esferas/célula, 20 min a 4°C) e é efectuada a separação magnética de células. A pureza em células CD4 corresponde normalmente a 91-95%, tal como medido por citometria de fluxo. São geradas células dendriticas a partir das PBMC aderentes ao frasco de cultura (Costar), 108 células/ml, 2 h a 43 37°C (sem Dynabeads) . Após um extenso passo de lavagem, as células aderentes são cultivadas durante 7 dias em meio contendo 500 U/ml de GM-CSF (Boehringer-Manheim) e 12,5 U/ml de IL-4 (Boehringer-Manheim) . A população celular resultante é fracamente aderente e expressa marcadores de superfície característicos das células dendríticas (positivas para HLA-DR, CD86, CD83, CDllc e negativas para CD4) (nota: todos os anticorpos foram obtidos a partir da empresa Becton Dickinson, CA) . O mAc anti-CD3 (OKT3) poderá ser obtido a partir da empresa Ortho Biotec. (Raritan, NJ) e o mAc anti-CD28 (9.3) poderá ser fornecido pela empresa Bristol-Meyers Squibb (Stamford, Conn.).

Exemplo II

Estimulação das Células T e sua Medição

As células são estimuladas por três metodologias diferentes: 1) Dynabeads (M-450) covalentemente ligadas a anticorpos anti-CD3 (OKT-3) e anti-CD28 (9.3) (esferas 3x28) de acordo com as instruções do fabricante (Dynal), 3 esferas/célula, 2) ionomicina (Calbiochem, La Jolla, CA) (100 ng/ml) e 12-miristato-13-acetato de forbol (PMA) (Calbiochem) (10 ng/ml), 3) células dendríticas alogénicas (25.000 células dendríticas/200.000 células CD4). Todas as células são estimuladas a uma concentração de 1 x 106 células/ml. As células são incubadas com compostos com a estrutura (I) (p.ex., FR901228) (NCI, Bethesda, MD) durante 1 a 2 horas antes da estimulação acima exposta. Os ensaios de proliferação são efectuados em quadruplicado, em placas com 96 poços de fundo plano. As células são estimuladas a 1 x 106 células/ml, num volume final de 200 1. A proliferação é medida através de 44 um ensaio MTT (kit de ensaio MTT, Chemicon International Inc., Temecula, CA) ao dia 3 (método de estimulação 1 e 2) ou ao dia 6 (método de estimulação 3), e os resultados são apresentados sob a forma de valores médios dos quadruplicados. As culturas de PBL ou as culturas de células CD4 purificadas são estimuladas com esferas 3x28, ionomicina/PMA ou células dendriticas alogénicas. Tal como se demonstra nas Figuras 1-4, concentrações de FR901228 tão baixas como 10 ng/ml inibem completamente a proliferação de células CD4 estimuladas com esferas 3x28 ou com ionomicina/PMA, enquanto que as concentrações de 1 ng/ml de FR901228 ou inferiores não manifestam um efeito significativo (estas experiências são efectuadas usando uma incubação de 2 horas com FR901228 antes da estimulação). Curiosamente, a proliferação induzida pelas células dendriticas alogénicas é significativamente inibida pelo composto FR901228 a concentrações tão baixas como 1 ng/ml. Adicionalmente, a superior sobrevivência celular não é afectada pelo composto FR901228, tal como se avaliou por medição do DNA sub-Gl e por avaliação da integridade da membrana celular (Figura 5D). A ausência de toxicidade do composto FR901228 está de acordo com os resultados descritos por Byrd et al., Blood 94(4):1401-1408, 1999; Bates et al.,

Clinicai Pharmacology, Programs and Proceedings of the

American Society of Clinicai Oncology, Abstract 693, 1999; e

Chassaing et al., J. Chromatogr. B 719:169-176, 1998.

Os protocolos de cultura e activação são idênticos aos acima descritos. 45

Exemplo III

Ensaios para os Marcadores de Activagão

Estudou-se o efeito do composto FR901228 sobre a indução de diversos marcadores de activação nas células CD4. Para este fim, as células são marcadas com um ou mais dos seguintes anticorpos: Ac anti-CD4 humano (Immunotech, Fullerton, CA), Ac anti-CDlla humano acoplado a FITC (Pharmingen), Ac anti-CD26 humano acoplado a FITC (Pharmingen), Ac anti-CD49d humano acoplado a FITC (Coulter), Ac anti-CD54 humano acoplado a FITC (Pharmingen e Becton Dickinson), Ac anti-CD95 humano acoplado a FITC (Pharmingen), Ac anti-CDl34 humano acoplado a FITC (Pharmingen), Ac anti-CD25 humano acoplado a FITC (Becton Dickinson, Fullerton, CA) , Ac anti-CD69 humano acoplado a FITC (Becton Dickinson), Ac anti-CD154 humano acoplado a FITC ou a PE (Becton Dickinson), ou Ac-controlo de isotipo IgGl acoplado a FITC ou PE. As células, 2 x 105, são marcadas durante 20 minutos a 4 o C com 2 μΐ de cada anticorpo num volume final de 30 μΐ, lavadas e ressuspensas em paraformaldeido a 1% (Sigma, St. Louis, MO). Curiosamente, a expressão de CD25 e de CD154 é fortemente suprimida após estimulação com esferas 3x28 a concentrações de FR901228 tão baixas como 10 ng/ml (Figuras 5A e 5B) . Por contraste, a indução de CD69 não é afectada pela concentração de 100 ng/ml de FR901228 (Figura 5C). Adicionalmente, as Figuras 8A-8B demonstram ocorrer a inibição da indução de CD25, CD134, CD137w, CD154, CDlla, CD54 e CD95 em células T CD4, sem que se verifique um efeito significativo sobre a indução de CD69 ou a regulação negativa de CD62L induzida pela activação (Figuras 8A-8B). Tal sugere que o composto FR901228 impõe uma inibição especifica, embora incompleta, da activação das células CD4 proximais. Adicionalmente, a superior viabilidade celular não 46 é afectada por concentrações de até 100 ng/ml do composto FR901228, tal como medido por exclusão com iodeto de propídio (PI) usando técnicas padronizadas de citometria de fluxo (ver Dengler et al., Anticancer Drugs 6(4):522-532, 1995). A inibição exercida pelo composto FR901228 não pode ser revertida pela activação por ionomicina/PMA, o que implica que o processo de inibição por FR901228 ocorre a jusante do processo de aumento do cálcio intracelular que se observa imediatamente após a estimulação de CD3 a nivel das células CD4.

Exemplo IV

Ensaios para IL-2 e TNF-g

As células são preparadas tal como acima descrito. Os sobrenadantes das células que foram estimuladas durante 24 h são submetidos a um ensaio de ELISA para IL-2 ou TNF-a realizado de acordo com as instruções do fabricante (Biosource International, Sunnyvale, CA) .

Num ensaio alternativo, a IL-2 é medida por coloração intracelular de células T CD4 usando citometria de fluxo. Para a marcação intracelular de IL-2 ou IFN-, as células são inicialmente incubadas com 1 g/ml de Monensin (Calbiochem) durante 4 horas antes da realização do ensaio. As células são subsequentemente submetidas a coloração das proteínas de superfície tal como acima descrito, fixadas e permeabilizadas usando o kit de coloração intracelular da Becton Dickinson, marcadas com Ac anti-IL-2 humana acoplado a PE e Ac anti-IFN-humano acoplado a FITC ou com os Acs de controlo correspondentes, tal como descrito pelo fabricante. A aquisição de dados e a análise por citometria de fluxo são efectuadas num citómetro de fluxo FACSCalibur da Becton 47

Dickinson usando o software Cellquest de acordo com o protocolo do fabricante (Becton Dickinson).

Para o estudo do mecanismo subjacente à inibição da proliferação de células CD4 induzida pelo composto FR901228, foi analisada a produção de IL-2 e TNF-α por parte de células CD4 activadas. 0 composto FR901228, a concentrações tão baixas como 10 ng/ml, inibe de forma marcada a produção de IL-2, tal como medido por ELISA após 24 h de estimulação por esferas 3x28 (esferas acopladas a anticorpo anti-CD3 e anti-CD28) de células CD4 purificadas (Figura 6) . Observou-se uma inibição semelhante ao medir a IL-2 intracelular (dados não apresentados). No entanto, a diminuição da produção de IL-2 não é exclusivamente responsável pela ausência de proliferação das células T, uma vez que a adição de 100 U/ml de IL-2 (Boehringer Manheim) não restaura a proliferação. A observação de que o composto FR901228 inibe a produção de IL-2 contrasta com resultados anteriores reportados por Wang et al., que referiram que o composto FR901228 não inibia a produção de IL-2 induzida por CD3 a nivel do hibridoma Al. 1 de células T (Oncogene 17(12):1503-1508, 1998). A explicação para esta diferença é actualmente desconhecida.

Em outras experiências, as concentrações de IL-2 e de TNF-α foram medidas por ELISA após 24 horas de estimulação de linfócitos do sangue periférico (PBL) com esferas 3x28 na presença ou na ausência de 20 ng/ml de FR901228 e de 500 ng/ml de ciclosporina (Figuras 10A e 10B).

Exemplo V

Ensaios de Inibição da Proliferação

Prepararam-se linfócitos do sangue periférico tal como acima descrito, os quais foram estimulados com esferas 3x28 e corados com diacetato de carboxifluoresceina-succinimidiléster 48 (CFDA-SE) ao dia 6 após a estimulação. A estimulação celular foi efectuada tal como acima se referiu e as células foram lavadas por duas vezes com PBS, ressuspensas em meio e incubadas com CFDA-SE (Molecular Probes, OR) . Após cerca de 10 minutos de coloração, as células foram lavadas com meio e FPS e a incorporação do corante foi medida. O composto FR901228 foi adicionado a vários pontos de tempo após a estimulação, ao tempo 0 ou a 24, 72 e 120 horas após estimulação. A Figura 7 apresenta os dados de fluxo gerados pela coloração com CFDA-SE. O eixo dos y apresenta as intensidades médias da fluorescência, que se correlacionam com a inversa da proliferação celular. Deste modo, os dados indicam que o crescimento celular das células T activadas é inibido pelo composto FR901228 quando as células são postas em contacto com FR901228 antes, durante ou após a estimulação com esferas 3x28.

Exemplo VI

Expressão de CD154 em Células CD4 É estudado o efeito do composto FR901228 sobre a indução do marcador de activação CD154 em células CD4. Com este fim, as células são marcadas com Ac anti-CD4 humano acoplado a FITC (Immunotech, Fullerton, CA), Ac anti-CD154 humano acoplado a PE (Becton Dickinson, Fullerton, CA) ou Ac-controlo de isotipo IgGl acoplado a FITC ou PE. As células, 2 x 105, são marcadas durante 20 minutos a 4°C com 2 μΐ de cada anticorpo num volume final de 30 μΐ, lavadas e ressuspensas em paraformaldeido a 1% (Sigma, St. Louis, MO) . As células são estimuladas durante 4 dias na presença de esferas 3x28 e/ou 20 unidades/ml de IL-2 ou de um anticorpo anti-IL-2; ao dia 3, o composto FR901228 é adicionado à cultura numa concentração de 20 ng/ml. Ao dia 4, é medida a intensidade média da fluorescência por citometria 49 de fluxo. Tal como apresentado na Figura 9, a presença ou ausência de IL-2 não compensou a supressão da expressão de CD154 induzida pelo composto FR901228.

Exemplo VII

Repressão de CD154 ao Nivel da Transcrição

Nesta experiência, transfectaram-se células Jurkat de modo estável com uma construção de vector (p-EGFPl, Clonetech) em que a sequência nucleotidica codificando para a proteína verde fluorescente foi operativamente ligada ao promotor de CD154 clonado a partir de células Jurkat. Após a selecção das células que continham o vector de interesse, as células foram submetidas a estimulação durante 24 horas com esferas 3x28 na presença de concentrações variáveis (0 a 100 ng/ml) de FR901228. A fluorescência foi então detectada por citometria de fluxo. Tal como demonstra a Figura 11, apenas as células com 0 mg/ml de FR901228 exibiram uma indução da expressão de GFP que ultrapassou a das células não submetidas a estimulação.

Em experiências separadas, foi efectuada uma análise por RT-PCR do produto de transcrição de CD154 após 18 horas de estimulação com esferas 3x28 e diversas quantidades de FR901228. Estas experiências evidenciaram a redução dos níveis de expressão de CD154 com o aumento das quantidades de FR901228 (dados não apresentados). Foram igualmente efectuadas experiências usando células CD4 incubadas com construções anti-senso de c-myc. Após estimulação com esferas 3x28 durante 24 horas, a construção anti-senso de c-myc reduziu a expressão de CD154, medida por citometria de fluxo, em cerca de 50%, por comparação com controlos que incluíram: ausência de construção, sequência de senso ou transfecção com uma construção de c-myc alterada (dados não apresentados). Assim, 50 um dos mecanismos da imunosupressão exercida pelo composto FR901228 e outros compostos semelhantes poderá ter por alvo a actividade de c-myc e a indução de CD154 por este exercida.

Exemplo VIII

Inibição do Ciclo Celular antes da Entrada na Fase S

Incubaram-se células CD4 não estimuladas e estimuladas (estimulação por esferas 3x28) com concentrações variáveis de FR901228 e o conteúdo em DNA intracelular foi medido através de coloração com iodeto de propidio (PI) usando procedimentos padronizados. Abreviadamente, as células foram coradas com uma mistura de 1 pg/ml de PI e 0,03% de saponina em PBS durante cerca de 20 a 30 minutos. Tal como indica a Figura 12, a síntese de DNA não se realiza em células não estimuladas ou em células estimuladas incubadas com 10 a 100 ng/ml de FR901228. Deste modo, o composto FR901228 parece inibir o ciclo celular das células T activadas antes da sua entrada na fase S.

Exemplo IX

Ensaios de Proliferação de Células T usando Radioisótopos

Foram separadas células mononucleares do sangue periférico (PBMC) provenientes de dadores saudáveis recorrendo a centrifugação em gradientes de densidade Ficoll-Hypaque (LSM, Organon Teknika Durham, North Carolina). Após lavagem, as PBMC com meio completo (meio RPMI 1640 com 5% de soro humano, glutamina 100 mM, piruvato de sódio 1 mM, aminoácido não essencial 0,1 mM, penicilina 2 mM (Life Technologies) e estreptomicina 2 mM (Life Technologies)) são então irradiadas com 7.500 rads e ressuspensas a 4 - 4,5 x 106 células/ml em meio completo. Uma outra alíquota de PBMC é submetida a formação de rosetas com eritrócitos de carneiro (SRBC) tratados com neuraminidase. Após outra centrifugação com LSM, 51 os SRBC destas células T em rosetas são então lisados usando tampão de lise de cloreto de amónio (Life Technologies). Após lavagem por duas vezes com meio completo, estas células T purificadas são igualmente ressuspensas a 2 - 2,5 x 106 células/ml em meio completo. As várias diluições do composto em teste são adicionadas em triplicado a 50 1/poço numa placa de microcultura de 96 poços de fundo plano (Costar, Cambridge, Massachusetts). A suspensão de células T é então imediatamente distribuída pelos poços, a 100 I/poço. Após a incubação das células com o composto em teste durante 30 min a 37°C, numa

atmosfera húmida de 5% de C02 - 95% de ar, é adicionado Ac anti-CD3 (OKT-3, Ortho Diagnostics, New Jersey) a cada poço (conc. final de 10 ng/ml) , seguindo-se 50 1 das PBMC irradiadas. A placa de cultura é então incubada a 37°C numa atmosfera húmida de 5% de C02 - 95% de ar durante 72 horas. A proliferação de linfócitos T é avaliada através da medição da incorporação de timidina tritiada (3H) . Durante as últimas 18-24 horas de cultura, as células são marcadas por pulsos de timidina tritiada a 2 Ci/poço (NEN, Cambridge, Massachusetts). As culturas foram recolhidas em filtros de fibra de vidro usando um colector de amostras múltiplas (MACH-II, Wallace, Gaithersburg, Maryland). A radioactividade dos discos de filtro correspondentes aos poços individuais é medida por métodos padronizados de contagem de cintilações em meio liquido (Betaplate Scint Counter, Wallace). São calculadas as médias das contagens por minuto de poços em duplicado e os resultados são expressos sob a forma de concentração de composto que é necessária para inibir em 50% a incorporação de timidina tritiada pelas células T. 52

Exemplo X

Prevenção e/ou Retardamento do Inicio de Manifestação da Diabetes em Ratinhos NOD ou NODSCID

Este Exemplo ilustra a capacidade evidenciada por um composto depsipeptidico representativo, FR901228, na prevenção ou retardamento do inicio de manifestação de diabetes em ratinhos NOD ou NODSCID. 0 composto FR901228 foi dissolvido em DMSO a 10% em PBS e foi administrado i.p. a ratinhos NOD ou NODSCID em dias alternados. Os controlos continham apenas o excipiente de DMSO (DMSO a 10% em PBS) . Uma vez que os ratinhos NODSCID não desenvolvem diabetes de forma espontânea, foram injectados 30 x 106 esplenócitos NOD de um ratinho NOD com 10 semanas de idade em cada ratinho NODSCID (i.v.) às 4 semanas de idade para induzir diabetes. Administrou-se uma dose de 0,5 mg/kg de FR901228 em cada tratamento a vinte animais (dez animais NOD e dez animais NODSCID) . De duas em duas semanas, o número de ratinhos em cada grupo de tratamento em que se havia desenvolvido diabetes foi avaliado por medição dos níveis de glicémia usando um glucómetro a intervalos bi-semanais. Uma leitura de glicémia superior a 200 mg/dl em duas observações consecutivas foi considerada como indicativa de diabetes franca. As glicémias médias encontradas nestes grupos são apresentadas na Tabela 2, abaixo.

Tal como mostra a Tabela 2, em ratinhos NODSCID, o início da manifestação de diabetes franca foi retardado em pelo menos 2 semanas nos ratinhos que foram tratados com o composto, quando em comparação com os ratinhos que foram tratados apenas com o excipiente. Curiosamente, os resultados dos ratinhos NOD foram ainda mais marcados, já que nenhum dos ratinhos NOD tratados com o composto desenvolveu uma diabetes franca durante as 18 semanas de estudo, enquanto que 8 dos 10 53 ratinhos tratados apenas com o excipiente desenvolveram diabetes franca durante o mesmo período. Claramente, tal demonstra um efeito imunosupressor no retardamento do início de manifestação do fenotipo de diabetes.

Tabela 2A

Ratinhos NODSCID injectados com FR901228 versus injecção com o veículo DMSO

Idade (sem. Dador genot. sexo Inj ecção Data Receptor Cartão da gaiola ID genot. sexo Idade (sem.) origem @ DOB injecção 5/9 6 5/23 6/6 6/20 7/4 7/18 8/1 8/15 idade (sem.) 8 10 12 14 16 18 20 10 NOD 3/27/00 30χ10Λ6 esplenócitos NOD FR901228 518374 2659 NODSCID F BSLC 4 regist. 482 Alta 536 Sacrif.por sangr. _ _ - - 2660 - - - 22-Mar - 547 526 566 402 Sacrif.por sangr. _ _ - - 2661 - - " " 0 - - 343 596 Morte - - 2662 - “ - - 4-6 sem. - ” 317 568 Morte _ _ - - 2663 - - - - - - 299 539 494 Sacrif.por sangr. . . - 518375 2654 - - - - - - 412 338 Morte _ _ - - 2655 - - - - - - 441 240 Morte . . - 2656 - - - - 261 527 494 Morte - 2657 - - - - - - 399 Alta Morte - - - - 2658 - - - - - - 285 576 558 571 Morte 10 NOD 3/27/00 30χ10Λ6 esplenócitos NOD (veículo DMSO apenas) 518376 2675 NODSCID F BLSC 4 regist. 383 Morte 5/25 - - - - 2676 - - - 22-Mar - 439 428 Morte 6/13 - - - - 2677 - - - e - 254 377 Alta 337 Sacrif.7/12-sangr. - - - 2678 ” - - 4-6 sem. ” 223 448 Alta 523 Sacrif.7/12-sangr. _ _ - - 2679 - - - 287 Alta Alta Morte 6/8 _ _ - 518377 2381 - - - - - 311 Sacrif.por sangr. - 2382 - - - - 447 516 - - 2383 - - - - 324 405 - - 2384 - - - - - 456 - - - - - 2385 - - - - 423 463 - 54

Ratinhos NOD injectados com FR901228 versus injecção com veiculo DMSO

55 A partir do acima exposto tornar-se-á evidente que, se bem que aqui tenham sido descritas diversas formas de realização especificas para o invento com o propósito de o ilustrar, será possível efectuar diversas modificações a estas sem que se abandone o espírito do invento.

Lisboa, 14 de Maio de 2007 56

Claims (8)

1. Reivindicações 1. 0 uso de um composto possuindo a seguinte estrutura:

   ou um seu sal ou estereoisómero farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por m corresponder a 1, 2, 3 ou 4; n corresponder a 0, 1, 2 ou 3; p e q corresponderem independentemente a 1 ou 2; X corresponder a O, NH ou NR; Ri, R2 e R3 serem idênticos ou diferentes e corresponderem independentemente a uma porção molecular de cadeia lateral de aminoácido ou a um derivado de cadeia lateral de aminoácido; e R corresponder a uma porção molecular de alquilo, arilo ou arilalquilo de cadeia inferior; para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença infecciosa, sendo a doença infecciosa seleccionada a partir do grupo que consiste em infecção pelo virus da hepatite B, infecção pelo virus da hepatite C, infecção por Staphylococcus aureus, encefalite virai e sépsis.
2. 2. O uso de um composto possuindo a seguinte estrutura: 1

   ou um seu sal ou estereoisómero farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por m corresponder a 1, 2, 3 ou 4; n corresponder a 0, 1, 2 ou 3; p e q corresponderem independentemente a 1 ou 2; X corresponder a O, NH ou NR; Ri, R2 e R3 serem idênticos ou diferentes e corresponderem independentemente a uma porção molecular de cadeia lateral de aminoácido ou a um derivado de cadeia lateral de aminoácido; e R corresponder a uma porção molecular de alquilo, arilo ou arilalquilo de cadeia inferior; para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença autoimune num animal, sendo a dita doença autoimune seleccionada a partir do grupo que consiste em artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, tiroidite, tiroidite de Hashimoto, esclerose múltipla, miastenia gravis, diabetes de tipo I, uveite, doença de Graves, psoriase, dermatite atópica, doença de Crohn, colite ulcerativa, vasculite, anemia aplástica, síndroma de Evans, anemia hemolítica autoimune e cirrose biliar.
3. 3. O uso de um composto possuindo a seguinte estrutura: 2

   ou um seu sal ou estereoisómero farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por m corresponder a 1, 2, 3 ou 4; n corresponder a 0, 1, 2 ou 3; p e q corresponderem independentemente a 1 ou 2; X corresponder a O, NH ou NR; Ri, R2 e R3 serem idênticos ou diferentes e corresponderem independentemente a uma porção molecular de cadeia lateral de aminoácido ou a um derivado de cadeia lateral de aminoácido; e R corresponder a uma porção molecular de alquilo, arilo ou arilalquilo de cadeia inferior; para o fabrico de um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de reacções alérgicas num animal.
4. 4. O uso, de acordo com a Reivindicação N°.3, caracterizado por o animal sofrer, ou estar em risco de sofrer, de alergias ao pólen.
5. 5. O uso, de acordo com a Reivindicação N°.3, caracterizado por o animal sofrer, ou estar em risco de sofrer, de asma.
6. 6. O uso, de acordo com a Reivindicação N°.3, caracterizado por o animal sofrer, ou está em risco de sofrer, de bronquite.
7. 7. 0 uso, de acordo com a Reivindicação N°.3, caracterizado por o animal sofrer, ou estar em risco de sofrer, de rinite alérgica.
8. 8. O uso de um composto, possuindo a seguinte estrutura: 3

   ou um seu sal ou estereoisómero farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por m corresponder a 1, 2, 3 ou 4; n corresponder a 0, 1, 2 ou 3; p e q corresponderem independentemente a 1 ou 2; X corresponder a O, NH ou NR; Ri, R2 e R3 serem idênticos ou diferentes e corresponderem independentemente a uma porção molecular de cadeia lateral de aminoácido ou a um derivado de cadeia lateral de aminoácido; e R corresponder a uma porção molecular de alquilo, arilo ou arilalquilo de cadeia inferior; para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma doença hiperproliferativa da pele num animal, sendo a dita doença hiperproliferativa da pele seleccionada a partir do grupo que consiste em dermatite seborreica, angioedemas, eritemas, acne e alopécia areata. Lisboa, 14 de Maio de 2007 4