KR20020062956A

KR20020062956A - 면역억제제로서 사용하기 위한 뎁시펩티드 및 이의 동류물

Info

Publication number: KR20020062956A
Application number: KR1020027007258A
Authority: KR
Inventors: 스코브소렌
Original assignee: 싸이트 테라피스 인코포레이티드
Priority date: 1999-12-08
Filing date: 2000-12-06
Publication date: 2002-07-31
Also published as: EP1246839A1; JP2013107902A; ATE353663T1; CN1414971A; JP2011084585A; ATE269354T1; WO2001042282A9; ES2225282T3; ES2282751T3; AU762525B2; ES2347284T3; AU2068001A; CA2393682A1; EP1779859A2; DE60033453D1; US6403555B1; DE60044542D1; EP1438966B1; PT1438966E; ATE470447T1

Abstract

화학식 I의 뎁시펩티드와 이의 동류물을 개시한다.

화학식 I

위의 화학식 I에서,

m, n, p, q, X, R₁, R₂및 R₃은 본 명세서에서 정의한 바와 같다.

FR901228을 포함하여 이들 화합물은 면역억제제로서의 활성은 물론, 이식편 대 숙주병을 포함하여 염증, 자가면역 또는 면역계 관련 질환을 앓거나 앓을 위험이 있는 환자의 예방 또는 치료에 대한 활성과 이식 후 이식편/조직 생존을 증진시키는 활성을 가진다. 또한 림프구 활성화, 증식을 억제하는 방법 및/또는 IL-2 분비를 억제하는 방법을 제공한다.

Description

면역억제제로서 사용하기 위한 뎁시펩티드 및 이의 동류물{Depsipeptide and congeners thereof for use as immunosuppressants}

자가면역 반응을 억제하는 것에서부터, 감염질환을 조절하고 이식편/조직 거부반응을 억제하는 것까지 다양한 목적에서 면역계의 조절이 요망된다. 거부반응을 완화시키기 위한 원칙적인 접근법은 수용자의 면역계를 약리학적으로 억제하는 것이다. 이러한 관점에서, 현재 사용되는 대부분의 면역조절 화합물은 면역억제제이다. 1960년대 초부터 이들 면역억제제는 단지 몇몇 약물로 그 응용가능성이 제한되어 왔다. 그러나, 1980년대 초 아자티오프린과 코르티코스테로이드와 함께, 사이클로스포린이 널리 사용되게 되었고 사이클로스포린은 그 이후로 의학적으로 최적인 약이 되었다[참조: Kobashigawa,Trans. Proc. 30:1095-1097, 1998; Isoniemi,Ann. Chi. Gyn. 86:164-170, 1997]. 그러나, 신규한 면역억제제는 수적으로 비교적 몇 안되고 이전의 약물과 관련된 다수의 바람직하지 못한 부작용을 수반한다. 이러한 약물이 이식된 장기의 생존률을 증가시키기 위해 사용되어 왔지만, 단일 약물이나 다른 면역억제제와의 배합물 등 다수가 또한 염증성 질환 및 자가 면역 질환, 지연형 과민증, 이식편 대 숙주병 및 유사 면역계 관련 질환의 치료에도 유용하다.

현재 사용되고 있는 면역억제제는 메토트렉세이트, 아자티오프린 및 사이클로포스파미드 등의 증식억제제를 포함한다. 이들 약물은 유사분열과 세포분열에 영향을 미치기 때문에 골수세포나 위장관 내막 등과 같이 교체속도가 높은 정상세포에 심각한 독성효과를 가진다[참조: Miller,Semin. Vet. Med. Surg. 12(3):144-149, 1997]. 따라서, 골수 억제 및 간장 장애가 흔한 부작용이다.

면역억제를 유도하기 위해 사용되는 항염증 화합물은 덱사메타손과 프레드니솔론 등의 부신코르티코스테로이드를 포함한다. 이러한 화합물을 사용할 때 자주 발견되는 부작용은 흔한 감염, 비정상적 대사, 고혈압 및 당뇨이다.

림프구의 활성화 및 뒤이은 증식을 억제하기 위해 현재 사용되고 있는 다른 면역억제 화합물은 사이클로스포린, FK506 및 라파마이신을 포함한다. 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린을 억제하거나(사이클로스포린 및 FK506), 성장인자에 의해 유도된 신호에 중요한 p70S6 키나제를 억제한다(라파마이신)[참조: Liuet al., Cell 66:807-815, 1991; Hendersonet al., Immun. 73:316-321, 1991; Biereret al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993; Isoniemi(위와 동일)]. 사이클로스포린과 이의 유사물이 가장 흔히 사용되는 면역억제제이다. 사이클로스포린은 전형적으로 신장, 간, 심장, 췌장, 골수 및 심장-폐 이식의 장기거부반응의 예방 또는 치료에 사용되는 것은 물론, 크론병, 재생불량성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 포도막염, 담즙성 간경변증 등의 자가 면역 질환 및 염증성 질환의 치료에도 사용된다. 그러나, 사이클로스포린은 적정 약물 농도 범위가 좁고 신독성, 간독성, 고혈압, 다모증, 암 및 신경독성을 포함하는 심각한 독성효과를 가진다[참조: Philip and Gerson,Clin. Lab. Med. 18(4):755-765, 1998; Hojoet al., Nature 397:530-534, 1999].

또한, OKT3 등의 단일 클론 항체가 이식편 거부반응의 예방 및/또는 치료에 사용되어 왔다. 단일 클론 항체를 환자에게 투여하면, 다수의 생물학적 물질과 같이, 강직 및 호흡곤란과 같은 몇몇 부작용을 유발한다[참조: Richardset al., Cancer Res. 59(9):2096-2101, 1999].

생존을 위협하는 수많은 질환의 경우, 장기 이식이 표준 치료법으로서 고려되고, 많은 경우에 있어서 죽음을 피하는 유일한 대체수단이 된다. 이식 조직이 적합한 제공자 유래이거나, 정상적인 면역반응이 억제되지 않는다면, 주조직적합체(MHC, major histocompatibility complex)에 의해 암호화되고 모든 세포에 존재하는, 이식편 위의 외부 세포 표면 항원에 대한 면역반응으로 인하여, 일반적으로 조직과 장기의 이식이 성공적으로 이루어지지 못한다. 일란성 쌍생아가 아니라면, 최적의 적합성, 즉 장기적인 이식성공률은 MHC가 동일한 자손인 제공자나 MHC가 동일하지만 혈연이 아닌 시체인 제공자를 이용하여 달성한다[참조: Strom,Clin. Asp. Autoimm. 4:8-19, 1990]. 그러나, 이러한 이상적인 결합은 달성되기 힘들다. 게다가, 현재 제공자 장기에 대한 수요는 증가하고 이식되는 장기는 공급이 부족해지고 있다. 따라서, 이종간 이식이 집중적인 연구분야로 떠오르고 있으나, 수용 동물에서의 거부반응과 관련하여 많은 장애에 직면하고 있다[참조: Kaufmanet al., Annu. Rev. Immunol. 13:339-367, 1995].

장기의 동종 이식에 대한 숙주의 반응은 외부 항원을 인식하고 외부 항원에 의해 활성화되는 대식세포 또는 수지상 세포는 물론 T림프구 및 B림프구간의 일련의 복잡한 세포반응을 수반한다[참조: Strom, 위와 동일; Cellular and Molecular Immunology, Abbaset al.(Eds.), WB Saunders Co., Penn., 1994]. 대식세포나 수지상 세포 등의 활성화된 보조세포에 의해 제공되는 주로 사이토카인인 동시 자극성 인자(cosimulatory factor)와 특정 세포-세포 상호작용이 T세포의 증식에 필수적이다. 이들 대식세포와 수지상 세포는 특정 부착 단백질을 통해 T세포에 직접 부착하거나 IL-12 및 IL-15 등의 T세포를 자극하는 사이토카인을 분비한다[참조: Strom, In: Organ Transplantation: Current Clinical and Immunological Concepts, 1989]. 보조세포에 의해 유도된 동시 자극성 신호는 인터루킨-2(IL-2) 유전자의 전사의 활성화와 T세포에서 고친화성 IL-2 수용체의 발현을 자극한다[참조: Pankewyczet al., Transplantation 47:318, 1989; Cantrellet al., Science 224:1312, 1991; Williamset al., J. Immunol. 132:2330-2337, 1984]. 15kDa의 단백질인 IL-2는 항원 자극시 T림프구에 의해 분비되고 정상적인 면역반응에 필요하다. IL-2는 IL-2 특이적 세포 표면 수용체(IL-2R)에 결합함으로써 림프계 세포의 증식과 분화를 자극시킨다. 또한, IL-2는 세포독성 T세포의 보조 T-세포 활성화를 개시하고, 차례로 대식세포의 세포파괴성을 활성화시키는 인터페론(IFN-)의 분비를 촉진한다[참조: Farraret al., J. Immunol. 126:1120-1125, 1981]. 게다가, IFN- 및 IL-4는 또한 이식된 장기에 있어서 MHC 클래스 II 발현의 중요한 활성화제로서 이식된 장기의 면역발현성을 증진시킴으로써 거부반응 케스케이드를 더 확장시킨다[참조: Poberet al., J. Exp. Med. 157:1339, 1983; Kelleyet al., J. Immunol. 132:240-245, 1984].

현재 T세포 매개 반응의 모델은 T세포가 2차 임파성 기관의 T세포 존(zone)에서 주로 수지상 세포에 의해 감작되는 것으로 제안한다. 초기 상호작용은 항원제시세포(APCs, antigen-presenting cells) 위의 항원을 가진 MHC 분자와 T세포 위의 T세포 수용체(TCR)/CD3 복합체와의 세포 대 세포 접촉이 필요하다. TCR/CD3 복합체의 개입은 주로 CD4 T세포 위의 CD154 발현을 유도하여 역으로 CD40 개입을 통해 APC를 활성화시켜 항원제시성을 향상시킨다[참조: Grewalet al., Ann. Rev Immunol. 16:111-135, 1998]. 향상된 항원제시성은 APC 위의 CD80과 CD86 발현이 상향조절된 것에 부분적으로 기인하고 이 둘은 T세포 위의 중요한 CD28 동시 자극성 분자를 위한 리간드이다. 그러나, CD40의 개입이 또한 MHC-항원 복합체의 장기화된 표면 발현, 4-1BB 및 OX-40(활성화된 T세포 위에 발현된 강력한 동시 자극성 분자)를 위한 리간드의 발현을 유도한다. 게다가, CD40의 개입은 APC와 T세포 둘 다의 활성화 및 성숙 중요한 영향을 미치는 각종 사이토카인(예, IL-12, IL-15, TNF-α, IL-1, IL-6 및 IL-8)과 케모카인(예: Rantes, MIP-1α 및 MCP-1)의 분비를 유도한다[참조: Mackeyet al., J. Leukoc. Biol. 63:418-428, 1998].

유사한 메카니즘이 타입 I 당뇨병과 같은 자가 면역 질환의 진행에 수반된다. 인간과 비만이 아닌 당뇨병 마우스(NOD, non-obese diabetic mice)에서, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)은 나이가 들어감에 따라 심해지는 인슐린을 생성하는 췌장의 β세포의 자발적인 T세포 의존성 자가면역 파괴가 원인이 된다. 이 과정은 주로 T림프구로 구성된 단핵세포를 가진 섬(islets)의 침투(췌도염)에 의해 진행된다[참조: Bottazzoet al., J. Engl. J. Med. 113:353, 1985; Miyazakiet al., Clin. Exp. Immunol. 60:622, 1985]. 자가공격형 T세포와 억제형 면역 현상 사이의 미묘한 균형이, 자가면역성의 발현이 췌도염에 국한될 것인가 IDDM으로 진행될 것인가를 결정한다. 인간의 IDDM 모델인 NOD 마우스에서, T세포를 목표로 한 치료 전략이 IDDM을 예방하는 데 성공적이었다[참조: Makinoet al., Exp. Anim. 29:1, 1980]. 이러한 치료 전략은 신생시 흉선적출, 사이클로스포린의 투여 및 항-pan T세포, 항-CD4 또는 항-CD25(IL-2R) 단일클론 항체(mAbs)의 주입을 포함한다[참조: Taruiet al.,Insulitis and Type I Diabetes. Lessons from the NOD Mouse, Academic Press, Tokyo, p.143, 1986]. 다른 모델은 다발성 경화증(EAE 모델), 류마티스성 관절염, 이식편 대 숙주병, 전신성 홍반성 루프스(전신성 자가면역성---NZBxNZWF₁모델) 등의 자가 면역 질환 및 염증성 질환에 전형적으로 사용되는 것들을 포함한다[참조: Theofilopoulos and Dixon,Adv. Immunol. 37:269-389, 1985; Eisenberget al., J. Immunol. 125:1032-1036, 1980; Bonnevilleet al., Nature 344:163-165, 1990; Dentet al., Nature 343:714-719, 1990; Toddet al.,Nature 351:542-547, 1991; Watanabeet al., Biochem Genet. 29:325-335, 1991; Morriset al., Clin. Immunol. Immunopathol. 57:263-273, 1990; Takahashiet al., Cell 76:969-976, 1994; Current Protocols in Immunology, Richard Coico(Ed.), John Wiley & Sons, Inc., Chapter 15, 1998].

모든 거부반응의 예방 및 자가면역성 반전 전략의 목적은 병적 상태와 사망률을 최소화하면서 항원성 조직 또는 작용제에 대한 환자의 면역 반응성을 억제하는 것이다. 따라서, 현재 수많은 약물들이 면역억제제로 사용되고 있고 이들 약물의 면역억제성에 대해 연구되고 있다. 위에 기재한 바와 같이, 가장 널리 사용되는 면역억제제는 사이클로스포린이지만, 사이클로스포린을 사용함으로써 수많은 부작용을 경험한다. 그러므로, 낮은 독성 프로파일과 제어가능한 부작용을 가지는 면역억제에 유효한 약물에 대한 선택의 폭이 비교적 좁기 때문에, 대체적인 면역억제제 발견의 필요성이 당업계에 존재한다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키면서 기타 관련된 장점을 제공한다.

본 발명은 일반적으로는 뎁시펩티드 또는 이의 동류물 및 면역억제제로서의 이들의 용도에 관한 것이며, 보다 상세하게는 FR901228과 같은 뎁시펩티드의 유효량을 동물에게 투여함으로써 자가 면역 질환 또는 염증질환 등의 면역 장애의 치료 및/또는 예방에 관한 것이며, 이식된 물질의 면역거부반응을 감소시키기 위한 용도에 관한 것이다.

도 1은 FR901228과 인큐베이션하고 항-CD3 및 항-CD28 항체가 부착된 비드에 의해 자극시킨 후의 말초 혈액 림프구(PBL, peripheral blood lymphocyte) 증식의 용량 의존성 억제를 나타내는 막대 그래프이다.

도 2는 FR901228과 인큐베이션하고 이오노마이신(Ionomycin)/PMA로 자극시킨 후의 말초 혈액 림프구(PBL) 증식의 용량 의존성 억제를 나타내는 막대 그래프이다

도 3은 FR901228과 인큐베이션하고 항-CD3 및 항-CD28 항체가 부착된 비드에 의해 자극시킨 후의 CD4 양성 T세포 증식의 용량 의존성 억제를 나타내는 막대 그래프이다.

도 4는 FR901228과 인큐베이션하고 시험관내에서 생성된 동종의 수지상 세포로 자극시킨 후의 CD4 양성 T세포 증식의 용량 의존성 억제를 나타내는 막대 그래프이다.

도 5A 내지 도 5D는 다양한 용량의 FR901228의 존재하에서 T세포를 활성화시킨후 (A) CD154의 발현, (B) CD25의 발현, (C) CD69의 발현 및 (D) 세포 생활력(生活力)을 유세포분석에 의해 측정한 것을 나타내는 막대 그래프이다.

도 6은 다양한 용량의 FR901228의 존재하에서 T세포를 3x28 비드(항-CD3 및 항-CD28 콘쥬게이트된 비드)로 자극시키고 24시간 후 ELISA에 의해 측정한 IL-2 발현을 나타내는 막대 그래프이다.

도 7은 다양한 시간점에서 FR901228을 첨가하면서 3x28 비드로 자극시키거나 자극시키지 않고 6일 후 CFDA-SE로 염색된 CD4 세포의 평균 형광강도를 나타내는 막대 그래프이다.

도 8A와 도 8B는 FR901228(20ng/ml)의 존재 또는 부재하에서 3x28 비드로 자극시키거나 자극시키지 않고 (A) CD137w, CD154, CD25, CD62L 및 CD49d 발현, (B) CD11a, CD134, CD26, CD54, CD95 및 CD69 발현을 유세포분석에 의해 측정한 것을 나타내는 막대 그래프이다.

도 9는 IL-2 20유닛의 존재하에서 3x28 비드로 초기 자극을 준 후, FR901228(3일째에 가함) 20ng/ml와 함께 3일 또는 4일째에 3x28 비드, IL-2 20유닛, IL-2 20유닛과 함께 3x28 비드로 후속 자극을 주거나 자극을 주지 않은 경우CD4 세포 위의 CD154의 발현을 나타내는 막대 그래프이다.

도 10A와 도 10B는 FR901228(20ng/ml)과 사이클로스포린(500ng/ml)의 존재하에서 3x28 비드로 자극을 준 후 PBL 세포 상층에 IL-2와 TNF-α의 존재를 도시하는 막대 그래프이다.

도 11은 FR901228 0, 10, 50 및 100ng/ml의 존재하에서 3x28 비드로 자극을 주고 24시간 후, CD154 프로모터의 제어하에 있는 녹색 형광 단백질의 핵산 서열을 함유하는 벡터로 안정하게 트랜스펙션된 유르카트(Jurkat) T세포의 플로우 데이타를 나타낸다.

도 12는 FR901228 0, 1, 10, 50 및 100ng/ml의 존재하에서 3x28 비드로 24시간 동안 자극을 주거나 주지 않은 후 CD4 T세포의 세포내 DNA 염색의 플로우 데이타를 나타낸다.

발명의 상세한 설명

위에서 언급한 바와 같이, 본 발명은 면역 억제에 유용한 화합물, 특히 FR901228 및 이의 동류물에 관한 것이다. FR901228은 육상의 박테리아 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum)으로부터 분리된 뎁시펩티드이다. FR901228은 하-라스(Ha-ras) 트랜스펙션된 마우스의 섬유모세포(NIH-3T3)의 형질전환을 억제할 수 있는 것이 이후에 밝혀졌다. 발린이 글리신-12를 대체한 돌연변이 라스(ras) 단백질은 NIH-3T3 세포에서 형태학상의 변화를 유도할 수 있다. 이러한 세포에서, 형질전환된 표현형은 발암 활성화의 표식이고 종양 발생성의 증가와 관련된다. 최근, 천연물질은 물론 다수의 약물 후보군이 이러한 표현형을 반전시키고 따라서 종양발생성 세포주의 형질전환을 반전시키는 것으로 확인되었다. FR901228은 이러한 노력의 결과로서 확인된 천연물질이고 이후에 동물계 모델에서 활성이 높은 것으로 밝혀졌다. 그 결과, FR901228은 항종양제로서 상당한 주목을 받아왔다.

보다 자세하게, FR901228은 다음 화학식의 이환식 뎁시펩티드(즉, 에스테르 결합과 아미드 결합을 함께 가지는 펩티드)이다.

FR901228의 활성이 분자 수준에서 알려져 있지는 않지만, 디설피드 결합이 환원조절형 입체형태 스위치로써 작용을 할 수 있고 세포 내의 환원 환경이 이 화합물을 단환식 디티올 형태로 변환시킬 수 있는 것으로 생각되어지고 있다[참조: Khanet al., J. Am. Chem. Soc. 118:7237-7238, 1996].

발효공정에 의한 FR901228의 제조는 후지사와 파마슈티칼 캄파니,리미티드(Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.)에 허여된 미국 특허 제4,977,138호(본 출원에 참고자료로써 그 전체가 삽입됨)에 기재되어 있다. 이 특허에서는, 크로모박테리움 비올라세움 WB968의 종에 속하는 박테리아의 균주의 발효물이 호기성 조건의 동화가능한 탄소 및 질소의 공급원을 함유하는 영양 배지에서 자란다. 발효가 끝난 후, FR901228을 회수하고 용매추출, 크로마토그래피 또는 재결정화 등의 통상적인 기법으로 정제한다.

천연물질로서 FR901228의 분리 이외에도, 이 화합물의 전체 합성이 문헌[참조: Khanet al.(위와 동일)]에 현재 보고되어 있다. 이 방법은 14단계의 공정을 수반하는데 FR901228을 총 수율 18%로 제공한다. 간략히, 당해 합성은 먼저 카레이라(Carreira) 촉매 비대칭 알돌 반응을 거쳐 티올 함유 β-하이드록시 산을 수득하는 것을 포함한다. 화합물의 펩티드 부분은 표준의 펩티드 합성방법으로 만들어진다. 이어서 티올 함유 β-하이드록시 산이 펩티드 부분에 커플링되고 단환식 환이 에스테르(뎁시펩티드) 결합의 형성에 의해 생성된다. 이후에 보호된 티올이 디설피드 결합으로 변환되면 FR901228의 이환식 환 시스템이 형성된다.

본 발명의 실시에 있어서, 특정되게 FR901228 또는 일반적으로 화학식 I의 화합물은 면역억제성을 가진 것으로 발견되었다. 결국, 본 발명의 화합물은 FR901228에 추가하여, 다음 화학식 I의 화합물과 약제학적으로 이의 허용되는 염 및 입체이성질체를 포함한다.

화학식 I

위의 화학식에서,

m은 1, 2, 3 또는 4이고,

n은 0, 1, 2 또는 3이고,

p와 q는 독립적으로 1 또는 2이고,

X는 O, NH 또는 NR이고,

R₁, R₂및 R₃은 동일하거나 상이하고 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기 또는 아미노산 측쇄의 유도체이고,

R은 저급 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 잔기이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산 측쇄 잔기"는 아래 표 1에 표기된 천연의 아미노산 측쇄 잔기를 포함하여(그러나 이에 국한되지는 않음), 천연의 단백질에 존재하는 임의의 아미노산 측쇄 잔기를 의미한다. 본 발명의 다른 천연의측쇄 잔기는 페닐글리신, 3,5-디브로모티로신, 3,5-디요오도티로신, 하이드록실리신, 나프틸알라닌, 티엔일알라닌, -카복시글루타메이트, 포스포티로신, 포스포세린, 및 글리코실화 세린, 아스파라긴 및 트레오닌 등의 글리코실화 아미노산의 측쇄 잔기를 포함한다(그러나 이에 국한되지 않음).

아미노산 측쇄 잔기가 프롤린인 경우, R₁, R₂또는 R₃그룹은 이웃한 질소 원자에 결합되어 프롤린의 피롤린딘일 환을 형성하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 화학식 I의 하나의 실시양태에서, m, n, p 및 q가 1인 경우, R₁그룹은 프롤린이 될 수 있고, 이러한 경우, R₁은 다음 화학식 II에서 나타낸 바와 같이 이웃한 질소 원자와 함께 피롤린딘일 환을 형성한다.

천연의 아미노산 측쇄 잔기 이외에도, 본 발명의 아미노산 측쇄 잔기는 또한 이들의 각종 유도체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산 측쇄 잔기 유도체"는 천연의 아미노산 측쇄 잔기에 대한 변형물 및/또는 변종을 포함하고, R₁, R₂및/또는 R₃이 화학식 I의 이원환에 이중결합 또는 삼중결합에 의해 결합되는 경우의 실시양태를 포함한다. 예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐글리신 및 페닐알라닌의 아미노산 측쇄 잔기는 일반적으로 저급 알킬, 아릴 또는 아르알킬 잔기로서 분류될 수 있다. 아미노산 측쇄 잔기의 유도체는 다른 직쇄 또는 측쇄, 환식 또는 비환식, 치환 또는 비치환, 포화 또는 불포화 저급 알킬, 아릴 또는 아르알킬 잔기를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "저급 알킬 잔기"는 탄소수 1 내지 12개를 함유하고, "저급 아릴 잔기"는 탄소수 6 내지 12개를 함유하고, "저급 아르알킬 잔기"는 탄소수 7 내지 12개를 함유한다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 아미노산 측쇄 유도체는 C_1-12알킬, C_6-12아릴 및 C_7-12아르알킬로부터 선택되고, 보다 바람직한 실시양태에서, C_1-7알킬, C_6-10아릴 및 C_7-11아르알킬로부터 선택된다.

화학식 I의 R₁, R₂및 R₃이 이중결합이나 삼중결합에 의해 부착된 경우, 대표적인 실시양태는 R₂가 이중결합에 의해 결합된 화학식 III의 화합물을 포함한다.

화학식 III의 하나의 실시양태에서, R₂는 =CHCH₃, =CHCH₂CH₃등의 불포화 저급 알킬이다. FR901228의 경우, 화학식 III의 R₂가 =CHCH₃이고, m, n, p, q는 각각 1이고, X는 산소이고, 이중결합이 임의로 존재한다(그리고 트랜스 입체배위이다).

더우기, 본 발명의 아미노산 측쇄 유도체는 치환체가 화학 잔기, 즉 -OH, -OR, -COOH, -COOR, -CONH₂, -NH₂, -NHR, -NRR, -SH, -SR, -SO₂R, -SO₂H, -SOR, -PO₃R, -OPO₃R 및 할로겐(F, Cl, Br 및 I 포함){여기서, 각 R은 저급 알킬, 아릴 또는 아르알킬 잔기로부터 독립적으로 선택된다} 중 하나 이상으로부터 선택된(그러나 이에 국한되지 않음) 저급 알킬, 아릴 및 아르알킬 잔기의 치환 유도체를 포함한다. 게다가, 본 발명의 환식 저급 알킬, 아릴 및 아르알킬 잔기는 나프탈렌은 물론 티오펜, 피롤, 푸란, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 피라졸, 3-피롤린, 피롤리딘, 피리딘, 피리미딘, 푸린, 퀴놀린, 이소퀴놀린 및 카바졸 등의 헤테로사이클릭 화합물을 포함한다. 아미노산 측쇄 유도체는 알킬 및 아르알킬 포스포네이트와 실란을 포함하는(그러나 이에 국한되지 않음) 저급 알킬 및 아르알킬 잔기의 알킬 부분의 헤테로알킬 유도체를 추가로 포함한다.

화학식 I의 p와 q에 관하여, 환의 펩티드 부분의 크기는 아미노산 잔기 하나(즉, p 및 q 중의 하나가 2일 때) 또는 둘(즉, p와 q가 둘 다 2일 때)을 첨가함으로써 증가시킬 수 있다는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, p가 2이고 q가 1일 때(X는 산소이다), 본 발명의 화합물은 화학식 IV의 화합물을 포함한다.

위의 화학식 IV에서, 화학식 I의 R₁그룹에 상응하는 아미노산 측쇄 잔기는 이들 아미노산 측쇄 잔기가 동일하거나 상이할 수도 있는 점을 명확히 하기 위해서, 제1의 경우는 R₁'로, 제2의 경우는 R₁"로 표시한다(당해 실시양태에서는 p가 2이기 때문에). 추가의 실시양태에서, p는 1이고, q는 2이거나 p와 q가 둘 다 2이다.

화학식 I에서, ""의 표시는 임의적인 이중결합을 나타낸다. 존재한다면, 이중결합은 시스 또는 트랜스 입체배위일 수 있다. 하나의 실시양태에서 이중결합은 FR901228의 경우처럼, 트랜스 입체배위이다.

X와 Y 잔기의 선택에 따라, 본 발명의 화합물은 X가 산소인 에스테르, X가 NH 또는 NR인 아미드를 포함한다. 예를 들면, p와 q가 둘 다 1인 경우, 본 발명의 대표적인 화합물은 각각 화학식 VI 및 VII로 나타내는 바와 같이 에스테르와 아미드를 포함한다.

본 발명의 화합물은 다음 반응식 1에 따라 제조될 수 있다.

단계 (1)에서, 알데히드 2는 문헌[참조: Kahnet al., J. Am./ Chem. Soc. 118:7237-7238, 1996]에 기재된 3단계의 공정에 의해 디에노에이트 1(여기서, n은 1, 2 또는 3이다)로부터 제조된다. 벤질 에스테르 3은O-벤질,O-TMS 케톤 아세탈을 Ti-(IV) 촉매하에서 알데히드 2(여기서, R'은 H이고 R"은 OH이거나, R'은 OH이고 R"은 H이다)에 가해 생성시킨다. 벤질 에스테르 3을 MeOH/H₂O 속에서 LiOH로 가수분해시키면 하이드록시 산 4를 수득한다.

단계 (2):

단계 (2)에서, 화합물의 펩티드 부분은 적합한 아미노산 메틸 에스테르 5를 출발물질로 하여 표준 펩티드 합성기법으로 제조한다. 메틸 에스테르 5는 BOP 시약을 사용하여 N-보호 아미노산과 반응시켜 디펩티드 6을 수득하고, 이어서 m이 1인 경우, N-Fmoc-시스테인-(S-트리페닐메틸) 또는, m이 2인 경우, 이의 유사물에 커플링시켜 트리펩티드 7을 수득한다. 이어서, 트리펩티드 7을 N-보호 테트라펩티드 8로 변환시킨 후, FMOC 그룹을 탈보호시켜 테트라펩티드 9를 수득한다. 위의 반응식에서, R₁, R₂및 R₃은 동일하거나 상이하고 독립적으로 위에서 정의한 바와 같은 아미노산 측쇄 잔기 또는 이의 유도체를 나타낸다. 위의 기법은 p와 q가 둘 다1인 경우, 화학식 I의 화합물의 합성에 상응하는 것이 인식될 것이다. p 및/또는 q 중 하나 또는 둘 다가 2인 경우의 실시양태에서, 하나 또는 둘의 추가의 아미노산 그룹을 화합물의 펩티드 부분에 삽입시키기 위해서 위의 기법을 사용한다.

단계 (3)

단계 (3)에서 테트라펩티드 9와 하이드록시 산 4를 BOP와 DIEA를 사용하여 커플링시키면 하이드록시 메틸 에스테르 10을 수득한다. 메틸 에스테르 10을LiOH-매개 가수분해시켜 상응하는 카복실산을 제공하고 이어서 카복실산을 DEAD와 PPh₃로 폐환시키면 단환식 락톤 중간체 11로 변환시킬 수 있다. 마지막으로 묽은 MeOH 용액 속에서 요오드로 비스(S-트리페닐메틸)락톤 11을 산화시켜 화학식 I의 본 발명의 화합물을 제공한다.

다른 방법으로, 본 발명의 화합물은 또한 다음 기법으로 합성할 수 있다.

다른 방법의 단계(1):

당해 실시양태에서, 화합물 4'는 위의 공정에 의해 제조된 다음 위의 단계(3)에서 단계(2)에 의해 제조된 펩티드 부분에 가한다. 생성된 중간체를 앞서 기재된 바와 같이 폐환시켜 화학식 I의 화합물을 수득한다.

X가 NH 또는 NR인 경우, 그러한 화합물은 화합물 4의 R' 또는 R"가 각각 NH 또는 NHR인 경우에 제조될 수 있다. 또한, 화학식 I에 임의적 이중결합이 존재하지 않을 때, 동일한 반응기법이 사용될 수 있으나 상응하는 포화 중간체를 사용한다.

본 발명의 화합물은 또한 산 부가염을 포함하는데, 이는 당해 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있고 유기 산 또는 무기 산으로부터 제조될 수 있다. 적합한 유기산은 말레산, 푸마르산, 벤조산, 아스코르브산, 석신산, 메탄설폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 옥살산, 프로피온산, 타르타르산, 살리실산, 시트르산, 글루콘산, 락트산, 만델산, 신남산, 아스파르트산, 스테아르산, 팔미트산, 글리콜산, 글루탐산 및 벤젠설폰산을 포함한다. 적합한 무기 산은 염산, 브롬산, 황산, 인산 및 질산을 포함한다. 여기서 사용되는 용어 화학식 I의 "약제학적으로 허용되는 염"은 임의의 또는 모든 적합한 염 형태를 포괄하는 것으로 의도된다.

입체이성질체에 관하여, 화학식 I의 화합물은 키랄 중심을 가질 수 있고 라세미체, 라세미 혼합물이 될 수 있으며, 거울상 이성질체 또는 부분입체이성질체로서 존재할 수 있다. 모든 이러한 이성질체의 형태는 이들의 혼합물을 포함하여 본 발명 내에 포함된다. 게다가, 화학식 I의 화합물의 몇몇 결정질 형태는 다형체로서 존재할 수 있고 이러한 다형체도 본 발명에 포함된다. 또한, 화학식 I의 몇몇 화합물은 또한 물 또는 다른 유기용매와의 용매화물을 생성시킬 수도 있다. 이러한 용매화물도 동일하게 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명은 조직[예: 이종 이식편 등을 포함하여 심장, 신장, 간, 골수, 피부, 각막, 혈관, 폐, 췌장, 장, 사지, 근육, 신경조직, 십이지장, 소장, 췌장의 섬세포 등]의 모두 또는 그 일부의 기능을 대체하기 위하여 합성 또는 생물 유래의 이식되는 물질, 세포, 기관 또는 조직을 이식한 후 거부반응의 예방 또는 치료하기 위한 목적, 이식편 대 숙주병, 자가 면역 질환[예: 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루프스, 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 타입 I 당뇨병, 유년기 발병 또는 최근 발병한 당뇨병, 포도막염, 그레이브스병, 건선, 아토피성 피부염, 크론병, 궤양성 대장염, 혈관염, 자가항체 매개 질환, 재생불량성 빈혈, 에반 신드롬, 자가면역 용혈성 빈혈 등]을 치료 또는 예방하기 위한 목적, 추가로, 연관되는 면역 반응 및/또는 면역 활성화를 일으키는 감염성 질환[예: B형 및 C형 간염 감염, 황색포도상구균 감염, 바이러스성 뇌염, 패혈증, 상처가 염증 반응에 의해 유도되는 기생충 질병(예: 나병)]을 치료한 목적, 순환기 질환[동맥경화, 죽상경화, 혈관염, 결정성 다발성 동맥염 및 심근염 등]을 예방 또는 치료하기 위한 목적 등의 면역반응 또는 면역 매개 반응 및 질환을 치료 및/또는 예방하기 위하여, 동물 개체(바람직하게는 포유동물이고, 보다 바람직하게는 사람이다)에서 화학식 I의 화합물의 사용에 관련된다. 게다가, 본 발명은 외래의 유전자를 자기 유래의 세포에 도입하고 암호화된 물질을 발현시키는 등의 유전자 치료 요법과 관련된 면역반응의 예방/억제에도 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "면역반응"은 외래의 또는 자기의 항원에 대한 신체의 반응을 가리키는 말로서 외래의 또는 자기의 항원을 중화시키거나 제거한다. 세포 매개 면역반응은 항원에 노출된데 대한 반응으로서 흉선에 의한 림프구(T세포)의 생성을 수반한다. 이 반응은 지연형 과민증, 조직 이식편의 거부반응 및 몇몇 감염에서 중요하다. 체액성 면역 반응에서, 항원에 노출된데 대한 반응으로서 혈장 림프구(B세포)가 생성되고 이어서 항체가 만들어진다. 이 반응은 면역 또는 과민증을 일으킬 수 있다. 비특이적 면역반응 또는 염증은 임의의 원인[예: 외상, 세균, 화학물질, 허혈 등]으로부터의 상해에 대한 체조직 이나 체세포의 반응이다. 임의의 위협에 대한 면역계의 초기 반응은 혈관성, 화학적 및 혈구 작용을 수반한다. 특이적 면역반응은 염증이 세균이나 작용제에 의한 외상 또는 침입을 극복하기에 부적절할 때 필요하다. 이 반응은 T세포 및 B세포에 의해 지배되고 제어된다. 세포성 면역은 T세포 반응을 가리키고, 체액성 면역은 B세포 반응을 가리키는 것으로 이전에 사용된 용어이다. 더우기, 여기서 CD4 또는 CD8 세포 등이 표시하는 것은 세포가 CD4 또는 CD8 세포 표면 마커에 양성인 것을 의미한다.

추가의 용도로서 다음 질병의 치료 및/또는 예방을 포함할 수 있다: 염증성 및 과다증식성 피부 질환과 면역학적으로 매개된 질병의 피부쪽 증상[예: 지루성 피부염, 혈관부종, 홍반, 여드름 및 원형 탈모증 등], 각종 안질환(자가면역성 및 기타), 알레르기성 반응[예: 천식(예: 기관지 천식, 알레르기성 천식, 내인성 천식, 외인성 천식 및 먼지 천식 등), 특히 만성 또는 난치성 천식(예: 지연성 천식 및 기도 과반응증), 기관지염, 알레르기성 비염 등의 증상을 포함하는 화분 알레르기, 가역성 폐쇄성 폐질환 등], 점액성 및 혈관의 염증, 특정 바이러스 감염[예:사이토메칼로 바이러스 감염 및 엡스타인바 바이러스 감염]의 활성.

하나의 실시양태에서, 화학식 I의 화합물 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 림프구의 증식 및/또는 활성화의 감소(예: CD25 및/또는 CD154의 하향 조절)에 의해 영향을 받거나 촉진되는 치료로서 동물에서 증상을 치료하는 방법이 제공된다. 림프구 증식의 억제 및/또는 활성화 마커(예: CD25 및 CD154)의 억제, 면역 기능의 억제에 의해 촉진되는 치료로서, 동물에서 증상(자가면역, 염증, 이식편/조직 거부반응이 될 수 있고, 면역학적으로 유도되거나 악화된 위에서 기재된 바와 같은 임의의 수많은 증상을 포함함)을 치료하는 방법이 제공된다.

따라서, 본 발명의 실시양태는 자가 면역 질환을 치료하는 방법이다. 반면, 본 발명의 또 다른 실시양태는 본 발명의 화합물의 치료학적 유효량을 외래 장기의 이식편에 대한 거부반응의 예방 또는 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 외래 장기의 이식편에 대한 거부반응의 예방 또는 치료 방법이다.

위에서 언급된 바와 같이, 사이클로스포린이 현재 이식된 장기의 거부반응을 예방하기 위해 사용되고 있는 대표적인 약물이다. 이 약물은 림프구의 칼시뉴린의 기능을 억제함으로써 천연의 보호 작용제의 거대한 저장고가 이식편의 외부 단백질을 거부하기 위해 움직이는 것을 신체의 면역계가 방지함으로써 작용한다. 사이클로스포린이 이식편의 거부반응에 대해 대처하는데는 유효하지만 신독성이고 신부전, 간기능의 비정상화, 위장관 불쾌감 및 암유발을 포함하는 몇몇 바람직하지 못한 부작용을 일으키는 것으로 공지되어 있다[참조: Hojoet al., Nature 397:530-534, 1999].

부작용이 감소된 보다 신규하고 안전한 약물을 당해 분야에서 끊임없이 찾고 있다. 본 발명은 특정한 작용기전에 얽메이려 하지 않고 장기간의 면역 내성을 유도하는 것으로 나타내는 그러한 면역억제제를 제공한다. FR901228은 CD4 T세포를 부분적으로 활성화시킨다(예: CD69의 유도, 그러나 CD25, CD137w, CD11a, CD134, CD54, CD95 및 CD154 표면 발현의 감소와 IL-2 및/또는 TNF-α 생성의 감소).

FR901228의 존재하에 활성화된 CD4 T세포는 활성화 유도 세포사(AICD, activation induced cell death)를 겪지는 않지만 이후에 가장 유력하게 IL-2 분비 및/또는 IL-2 수용체 자극의 부족으로 인하여 시험관내에서 아포프토시스를 겪는다. 게다가, 앞서 활성화된 CD4 및 CD8 T세포를 화학식 I에 나타낸 화합물과 같은 FR901228 부류의 화합물로 처리하면 세포성장이 억제되고 단시간내에 아포프토시스가 유도되지만 증식하지 않고 있는 T세포는 명백하게 영향을 받지 않는다. 반응하는 T세포에서 아포프토시스가 유도되면 활성화된 T세포가 제거될 뿐만 아니라 장기적인 면역 내성 상태가 유도된다[참조: Ferguson and Green,Nature Med. 5(11):1231-1232, 1999]. 이러한 특이적 내성의 원인은 잘 밝혀지지 않고 있다. 그럼에도 불구하고, 이식 전에 FR901228의 존재하에서 비분할 공여 세포(예: 수지상 세포 또는 방사선이 조사된 말초 혈액 림프구)로 면역화시키면 추가로 FR901228이 존재하지 않더라도 이후의 숙주 대 이식편 반응에 대한 특이적 내성을 매우 잘 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "내성"은 항원에 대해 반응하는 능력을 가지는 면역계가 항원에 대해 무반응인 상태를 가리킨다. 특정한 기전에 얽메이려 하지않고, 내성은 본 발명의 화합물이 활성화된 T세포의 아포프토시스를 유도함으로써 유도된다고 여겨진다. 예를 들어, T세포가 항원에 의해 활성화되고 이후에 아포프토시스를 겪게 된다면, 그 항원에 대한 후속 면역 반응이 일어나지 않을 것이다. 특정 화합물에 의해 내성이 유도되는 것은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 임의의 방법 및 모델에 의해 시험될 수 있다. 하나의 실례로서, 항원에 의한 1차 및 2차 자극은 본 발명의 화합물의 존재하에서 시험될 수 있다. 간략히, 동물을 항원으로 접종한 뒤 본 화합물로 후속 접종하고, 약 2주 후에 당해 화합물을 접종하지 않고 동일한 항원만을 접종하여 2차 면역 반응을 측정할 수 있다. 따라서, 1차 및 임의의 2차 반응 둘 다가 간단한 혈액분석으로써 측정될 수 있다. 어떠한 2차 면역 반응도 보이지 않는 샘플은 면역억제 화합물에 의해 내성이 유도된 것을 나타낸다. 더우기, CTL 검정 또는 IL-2 분비 시험 등의 표준 시험관내 검정이 T세포의 활성화를 측정하기 위해 사용될 수 있다.

아포프토시스의 유도 이외에도, 수많은 자극원[예: 동시발생의 CD3 및 CD28의 개입, 이오노마이신/포르볼 미리스트산(PMA, Phorbol myristic acid) 자극 및 동종의 수지상 세포의 자극]으로 유도된 CD4 및 CD8 T세포는 자극과 동시에 또는 자극 후 FR901228로 처리하였을 때 성장 억제를 나타낸다. 따라서, 이러한 성질은 활성화 케스케이드의 아주 초기에 CD4 T세포를 억제하는 사이클로스포린 등의 약물 에 비해 크게 향상점을 가진다. 이는 사이클로스포린의 존재하에서 활성화된 CD4 T세포가 사실상 원래의 또는 활성화되지 않은 세포가 되도록 하여 아포프토시스를 겪지 않도록 한다. 따라서, 사이클로스포린 치료가 종료되면, 억제된 면역반응이재개될 것이다. 즉, CD4 세포가 본 발명의 화합물의 존재하에서 활성 상태에 있다면, 이러한 세포는 아포프토시스를 겪을 것이고, 따라서 항원에 대한 지속적인 내성이 생기게 되나, 이러한 동일한 세포를 사이클로스포린으로 처리하면, 면역반응이 단지 사이클로스포린이 존재할 때만 억제된다.

또한, FR901228에 대한 면역 억제는 단지 활성화된 T세포에서만 아네르기 및/또는 아포프토시스가 유도되므로, T세포 및 다른 조혈세포의 일반적인 수준은 유지된다. 반대로, 사이클로스포린 및 FK506 둘 다는 T세포 활성화의 초기 단계를 차단함으로 T세포가 아포프토시스가 유도되기 쉬운 상태로 도입되는 것을 방지한다.

FR901228은 강력한 면역억제제로서 작용하는 그 자체의 능력을 도와주는 수많은 특징을 가진다. 따라서, FR901228을 포함하는 화학식 I에서 열거된 부류의 화합물은 다음의 특징 중 하나 이상을 가질 수 있다: CD3 및 CD28의 개입, 이오노마이신/PMA, 또는 동종의 수지상 세포에 의해 유도된 CD4 및 CD8 T세포의 성장의 억제, 초기 활성화 후에 가해질 때 진행중인 CD4 및/또는 CD8 T세포의 성장의 억제, CD3/CD28 개입과 IL-2 자극 둘 다를 위한 신호전달 경로의 억제, CD4 T세포 위의 CD25, CD134, CD137w, CD154, CD11a, CD54 및 CD95의 유도의 억제, CD69 유도 또는 활성화로 유도된 CD62L의 하향조절에 대한 어떠한 현저한 영향도 없음, 말초 혈액 림프구로부터 IL-2 분비의 감소, 말초 혈액 림프구로부터의 TNF-α 분비의 감소, 활성화된 T세포의 세포 주기가 S상으로 들어가기 전에 세포주기의 억제, 활성화된 T세포에서 p21cip/waf 및 C/EPB-α 유도의 억제, 활성화된 T세포에서 c-myc발현의 억제, 활성화된 T세포에서 IL-2 유도된 증식의 억제 및 전사단계 수준에서 CD154의 억제. 또한, FR901228은 포스포티로신 웨스턴 블롯팅으로 측정한 것으로서 벌크 인산화에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 이러한 결과는 화학식 I의 화합물이 여러 단계에서 T세포의 활성화 경로에 영향을 끼침으로써 활성화가 인산화와 같은 초기 단계로 진행되도록 하지만 활성화 및 증식인 후속 단계를 방지한다.

특정 화합물이 유효한 면역억제제인가를 결정하기 위하여, 당해 기술분야에 공지된 각종 방법론을 수행할 수 있다. 이러한 관점에서, 림프구의 증식 및/또는 활성화는 자극 전이나 후에 또는 자극과 동시에 대상 화합물을 접촉시킨 후 측정할 수 있다. 예를 들면, T세포의 활성화와 후속하는 증식의 유도(염증의 개시도 포함)의 주요한 특징은 IL-2, IFN-γ, CD25, CD69 또는 CD154의 생성인데, 이는 ELISA 및 유세포분석을 포함하는 각종 방법으로 측정할 수 있다. 기타 세포 증식과 사이토카인 분비를 측정하기 위해 널리 사용되는 실험적 방법이 또한 사용될 수 있으며, 이는 요오드화프로피디움 염색을 사용하는 비색 검정, MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일], 2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드), 생체 염색, CFDA-SE(5-(및 6)-카복시플루오레신 디아세테이트-석신이미딜 에스테르), 세포수 측정, 브로모디옥시유리딘 삽입 또는 타이미딘 삽입 검정을 포함한다[참조:Avian Dis. 43(2):172-181, 1999;Anticancer Res. 17(1B):725-728, 1997; Geller,Scand. J. Immunol. 35:327-334, 1992; Levineet al., Int. J. Immun. 7(6):891-904, 1995; Haraet al., J. Exp. Med. 161:1513-1524, 1985; Hardinget al., Nature 356:607-609, 1992; Linsleyet al., Science 257:792-795, 1992; PCT 공개번호 WO제95/33823호].

림프구를 활성화시키는 방법 및 그럼으로써 림프구의 증식을 자극시키는 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있고, 피토헤마글루티닌(PHA, phytohemagglutinin), 콘카나발린 A(ConA, concanavalin A), 항-CD3 항체(항-CD28 항체의 존재 또는 부재하에서), 동종 세포, 초항원(superantigen) 또는 이오노마이신/PMA를 사용하여 IL-2의 존재 또는 부재하에서의 자극을 포함한다[참조: Paul, Fundamental Immunology, Fourth Edition, Lippincott-Raven, 1998].

본 발명의 면역억제 화합물 및 특정 면역계 관련 질병 또는 징후에 대한 이들의 유용성을 시험하고 증명하기 위해 각종 시험관내 또는 동물 모델이 존재한다. 따라서, 당해 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자는 현재 당해 기술분야에 존재하는 것들로부터 적절한 모델을 쉽게 선택할 수 있다. 이러한 모델은 IDDM이 나이가 들어감에 따라 심해지는 인슐린을 생산하는 췌장의 β-세포의 자발적인 T세포 의존성 자가면역 파괴가 원인이 되는 경우인 NOD 마우스를 이용하는 것을 포함한다[참조: Bottazzoet al., J. Engl. J. Med. 113:353, 1985; Miyazakiet al., Clin. Exp. Immunol. 60:622, 1985]. 인간의 IDDM 모델인 NOD 마우스에서, T세포를 목적으로 하는 치료전략은 IDDM을 예방하는 데 성공적이었다[참조: Makinoet al., Exp. Anim. 29:1, 1980]. 이러한 치료전략은 신생시 흉선 적출, 사이클로스포린의 투여 및 항-pan T세포, 항-CD4 또는 항-CD25(IL-2R) 단일클론 항체(mAbs)의 주입을 포함한다[참조: Taruiet al.,Insulitis and Type I Diabetes. Lessons from the NOD Mouse, Academic Press, Tokyo, p.143, 1986]. 다른 모델은, 예를 들면, 다발성 경화증(EAE 모델), 류마티스성 관절염, 이식편 대 숙주병(피부 이식편, 심장 이식편, 랑게르한스 섬의 이식편, 대장 및 소장 이식편 등을 사용하여 이식편 거부반응을 연구하기 위한 이식모델), 천식 모델, 전신성 홍반성 루프스(전신성 자가면역성---NZBxNZWF₁모델) 등의 자가 면역 질환 및 염증성 질환에 전형적으로 사용되는 것들을 포함한다[참조: Takakuraet al., Exp. Hematol. 27(12):1815-821, 1999; Hu et al., Immunology 98(3):379-385, 1999; Blythet al., Am J. Respir. Cell Mol. Biol. 14(5):425-438, 1996; Theofilopoulos and Dixon,Adv. Immunol. 37:269-389, 1985; Eisenberget al., J. Immunol. 125:1032-1036, 1980; Bonnevilleet al., Nature 344:163-165, 1990; Dentet al., Nature 343:714-719, 1990; Toddet al., Nature 351:542-547, 1991; Watanabeet al., Biochem Genet. 29:325-335, 1991; Morriset al., Clin. Immunol. Immunopathol. 57:263-273, 1990; Takahashiet al., Cell 76:969-976, 1994; Current Protocols in Immunology, Richard Coico(Ed.), John Wiley & Sons,Inc., Chapter 15, 1998].

면역계를 억제하는 치료가 필요한 개체는 자가 면역 질환을 가진 개체, 이식시술을 받는 개체, 심혈관질환을 가진 개체, 알레르기 반응을 가진 개체 및 외상 또는 병원체에 의해 유도된 면역조절 이상을 가진 개체를 포함한다. 자가 면역 질환의 예로는 인슐린 의존성 당뇨, 천식, 건선, 궤양성 대장염, 크론병, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루프스 뿐만 아니라 위에서 기재된 다른 것들도 포함한다. 장기 또는 세포/조직 이식편을 가진 개체는 또한 장기 이식 거부반응을 억제하거나 예방하기 위해서 면역계를 억제하는 치료가 필요하다. "장기 이식"은 내부 장기(예; 심장, 폐, 신장, 간, 췌장, 위, 대장 및 소장, 및 골수 등)나 외부 기관(예: 피부)을 제공자로부터 수용자로 이전하거나 "이식"하는 것을 말한다. 여기서 제공자는 이식편을 받는 사람이나 동물과 유전학적으로 별개이다. "장기 이식"은 또한 종간 교차이식(즉, 이종 이식)을 포함한다.

"유효량"은 목적하는 치료 및/또는 예방효과를 달성하는 데 필요한 화합물의 용량이다. 예를 들어, 사람 또는 동물에서 원래의 또는 기억 면역반응을 억제하는 화합물의 용량이나 개체에서 장기 이식 거부반응을 억제하는 화합물의 용량이다. "목적하는 치료효과 및/또는 예방효과"는, 예를 들어, 자가 면역 질환[예: 천식, 건선, 궤양성 대장염, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루프스 등]을 가지거나 가질 수 있는 사람이나 동물의 생존기간을 연장시키거나 증상을 완화시키는 것을 포함한다. 완화될 수 있는 증상의 예로는 당뇨의 고혈당, 관절 통증, 류마티스성 관절염의 경직 및 부동성, 다발성 경화증의 마비, 전신성 홍반성 루프스의 발진 및 피부 병변을 포함한다. 인슐린 의존성 당뇨병에 있어서, "목적하는 치료 또는 예방 효과"는 당해 질환으로 인한 이차성 증상, 예를 들어 혈관계 이상 등을 완화시키거나 예방하는 것을 포함한다. 적합한 용량은 환자의 나이, 건강 및 체중, 질환의 정도, 존재한다면, 동시에 받는 치료의 종류, 치료의 빈도 및 목적하는 효과의 성질에 좌우될 것이다. 예를 들어, 용량은 1일당 약 0.001 내지 100mg이 될 수 있다. 통상, 하나 이상의 목적으로 1일당 0.1 내지 50mg이 목적하는 결과를 얻기에 유효하다. 특정 실시양태에서, 용량을 조절하여 비활성화된 T세포는 유지시키고 활성화된 T세포만을 실질적으로 아포프토시스, 아네르기 및/또는 일시적인 기능성 무반응을 유도할 수 있다(즉, T세포 및/또는 다른 분할 중인 세포의 일반적인 수준은 유지됨). 다른 실시양태에서, 뎁시펩티드 치료는 면역억제 효과를 달성하는 데 반해, 또 다른 실시양태에서는 사용된 용량이 조혈세포의 분할에 영향을 끼치지 않고, 더욱 또 다른 실시양태에서는 용량이 일반적으로 세포 분할에 실질적으로 영향을 끼치지 않는다. 그러나, 유효한 용량은 임상적 시도 동안 쉽게 결정될 수 있으며 표준의 시험 방법론을 당업계에서 적용할 수 있다. 이러한 용량은 자가 면역 질환의 예방 또는 치료, 외래 이식 거부반응 및/또는 관련된 고통, 질환 및 병의 예방 또는 치료를 위한 유효량이다.

"개체"는 사람 등의 포유동물이 바람직하나 수의학적 치료가 필요한 동물, 예를 들어, 가축(예: 개, 고양이 등), 사육 동물(예: 축우, 양, 돼지, 말, 닭 등) 및 실험동물(예: 래트, 마우스, 기니아 피그 등)도 될 수 있다.

화합물은 단독으로 투여할 수도 있고 다른 약리학적 활성제와 함께, 예를 들면 다른 면역억제제와 함께 투여하거나 항생제 및/또는 항바이러스제와 함께 투여할 수 있다. 함께 투여할 수 있는 화합물은 스테로이드(예: 메틸 프레드니솔론 아세테이트), NSAIDs, 및 아자티오프린, 15-디옥시스퍼구알린, 사이클로스포린, 미조리빈, 미코페놀레이트 모페틸, 브리퀴나 소디움, 레플루노마이드, FK-506, 라파마이신 및 관련 화합물 등의 다른 공지된 면역억제제를 포함한다. 이러한 약물의 용량은 또한 치료되는 조건과 개체에 따라 다양할 것이다.

화합물의 유효량을 단일 용량 또는 복합 용량으로 적당한 경로를 통해 투여할 수 있다.

약제학적으로 허용되는 염은 금속(무기) 염 및 유기 염 둘 다를 포함한다. 이러한 염의 리스트는 문헌[참조:Remington's Pharmaceutical Sciences,17th Edition, pg. 1418(1985)]에 기재되어 있다. 적당한 염 형태는 물리적 안정성과 화학적 안정성, 유동성, 흡수성 및 용해도에 기초하여 선택된다는 것이 당해 기술분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 당해 기술분야의 숙련가가 이해할 수 있는 바와 같이, 약제학적으로 허용되는 염은 무기산의 염(예: 염산염, 황산염, 인산염, 이인산염, 브롬화수소염, 질산염 등), 유기산의 염(예: 말레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 석시네이트, 시트레이트, 아세테이트, 락테이트, 메탄설포네이트, p-톨루엔설포네이트 또는 팔모에이트, 살리실레이트 및 스테아레이트 등)을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 유사하게, 약제학적으로 허용되는 양이온은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 알루미늄, 리튬 및 암모늄(특히 2차 아민과의 암모늄염)을 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 위에서 언급한 이유로 본 발명의 바람직한 염은 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 암모늄 염을 포함한다. 본 발명의 화합물의 입체이성질체, 결정 형태, 수화물 및 용매화물이 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.

면역억제제로서, 이들 화합물은 자가 면역 질환의 치료, 외래 장기 이식편의 거부반응 및/또는 관련된 고통, 질환 및 병의 예방에 유용하다.

본 발명의 화합물은 활성 성분 화합물을 온혈동물의 몸 중 작용부위에 접촉시키는 임의의 방법에 의해 본 발명에 따라서 자가 면역 질환의 치료, 외래 장기 이식편의 거부반응 및/또는 관련된 고통, 질환 및 병의 예방의 목적으로 투여될 수있다. 예를 들면, 경구나, 경피, 안내, 바칼, 비강내, 흡입, 질내, 직장내, 수조내(intracisternal)를 포함하는 국소 및 비경구 투여가 될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근육내, 동맥내 주사 또는 주입, 흉골내 또는 복강내 투여를 포함하는 투여의 모드를 가리킨다.

화합물은 각각의 치료제로서나 치료제의 배합물로, 약품과 함께 사용가능한 임의의 통상의 수단으로 투여될 수 있다. 화합물은 단독으로 투여될 수도 있으나, 일반적으로 선택된 투여경로 및 표준 약제학적 관행에 근거하여 선택된 약제학적 담체와 함께 투여된다.

활성 성분은 캅셀, 정제, 트로키, 당의정, 과립제 및 산제 등의 고형 제형 또는 엘릭서, 시럽, 유제, 분산제 및 현탁제 등의 액체 제형으로 경구로 투여될 수 있다[참조: Chanet al., Invest. New Drugs 15:195-206, 1997, FR901228의 경구제형의 생체이용률을 나타냄). 활성 성분은 또한 분산제, 현탁제 또는 용액 등의 무균의 액체 제형으로 비경구적으로 투여될 수도 있다. 다른 제형이 또한 국소투여용 연고, 크림, 점안제, 경피 패치 또는 산제로서, 안내 투여용, 점안 용액 또는 현탁제 제형, 즉 점안약으로서, 흡입용 또는 비강내 투여용 에어로졸 스프레이 또는 파우더 조성물로서, 직장 또는 질내 투여용 크림, 연고, 스프레이 또는 좌제로서 활성 성분을 투여하는 데 사용될 수 있다.

젤라틴 캅셀은 활성 성분과 락토오스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등의 파우다형 담체를 함유한다. 유사한 희석제가 압축 정제를 제조하는 데 사용될 수 있다. 정제와 캅셀 둘 다가 지연 방출제로 제조되어 일정한 시간에 걸쳐서 약품이 연속적으로 방출되게 할 수 있다. 압축 정제는 불쾌한 맛을 매스킹하고 대기로부터 정제를 보호하기 위해 당의로 코팅되거나 필름코팅될 수 있고 위장관에서의 선택적인 붕해를 위해 장용코팅될 수 있다.

경구 투여용 액체 제형은 환자의 순응도를 높이기 위해 착색 및 향미제를 함유할 수 있다.

일반적으로, 물, 적합한 오일, 염수, 수성 덱스트로스(글루코스) 및 관련 당용액 및 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 등의 글리콜이 비경구 용액으로 적합한 담체이다. 비경구 투여용 용액은 바람직하게 활성 성분의 수용성 염, 적합한 안정화제 및 필요에 따라 완충물질을 함유한다. 산성 아황산나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산 등의 항산화제를 단독으로 또는 배합하여 적합한 안정화제로 사용한다. 시트르산 및 이의 염과 나트륨 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA)가 또한 사용된다. 게다가, 비경구 용액은 염화벤잘코늄, 메틸파라벤 또는 프로필파라벤 및 클로로부탄올 등의 보존제를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 프로필렌 글리콜(USP) 속에 20% 에탄올(USP)를 함유하는 용액 2ml로 동결건조된 뎁시펩티드 10mg과 포비돈 20mg(USP)을 희석시켜 제조한다. 이어서 이 용액을 0.9% 염화나트륨 주사액(USP)을 추가로 가하여 희석시켜 0.02 내지 5.0mg/ml의 범위에서 최종 약물 농도를 맞춘다.

흡입 투여용으로, 본 발명은 화합물은 가압식 팩 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 편리하게 송달될 수 있다. 화합물은 또한 제형화될 수 있는 산제로서 송달될 수도 있고 산제 조성물은 취입 파우더 흡입기 장치를 사용하여 흡입될 수 있다. 흡입용으로 바람직한 송달 시스템은 정량식 흡입(MDI, metered-dose inhalation) 에어로졸인데, 이는 플루오로카본 또는 하이드로카본 등의 적합한 추진제 속의 본 발명의 화합물의 현탁제 또는 용액으로서 제형화될 수 있다.

안내 투여용으로, 점안용 제제가 적합한 점안용 비히클 속에서 적합한 중량%의 본 발명의 화합물의 용액 또는 현탁액으로 제형화되어 화합물이 충분한 시간동안 눈의 표면과 접촉하여 점막을 치료하거나 각막과 눈 내부로 침투되도록 할 수 있다.

동일한 제형은 일반적으로 본 발명의 화합물이 단계적으로 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 때 일반적으로 사용될 수 있다.

약물이 물리적으로 배합되어 투여될 때, 제형과 투여경로는 배합된 약물의 양립가능성에 따라 선택되어야 한다. 따라서, 용어 병용 투여는 두 가지의 약물을 동시에 또는 연속적으로 투여하거나 또는 두 가지 활성 성분의 고정 용량 배합물로서 투여하는 것을 포함하는 것으로 이해된다.

앞서 기재한 내용으로부터, 본 발명의 특정 실시양태가 설명의 목적으로 본 명세서의 기재되어 있지만, 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않는 다양한 변경이 이루어질 수 있다는 것이 인식될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구항에 의해 한정되는 것 이외에는 한정되지 않는다. 또한, 본 명세서에서 언급된 모든 특허, 특허출원, 저널 기사 및 참고자료는 그 전체로서 참고자료로서 삽입된다.

실시예

실시예 I

세포성장 및 준비

사람의 혈액으로부터 분리한 세포를 엑스-비보(X-vivo) 배지[미국 메릴랜드주 워커스빌에 소재한 바이오휘테이커 인코포레이티드(Biowhittaker Inc.) 제품]에서, 용도에 따라 IL-2(미국 인디아나주 인디아나폴리스에 소재한 베링거 만하임 제품) 20U/ml를 첨가하거나 첨가하지 않고, 5% 사람의 혈청(바이오휘테이커), 2mM 글루타민(미국 메릴랜드주 록빌에 소재한 라이프 테크날러지즈 제품) 및 20mM HEPES(라이프 테크날러지즈)를 첨가하여 성장시킨다. 유르카트 E6-1 세포[미국 버지니아주 마나사스에 소재한 에이티씨씨(ATCC)]는 10% 소태아혈청(FBS, fetal bovine serum)(바이오휘테이커), 2mM 글루타민(라이프 테크날러지즈), 2mM 페니실린(라이프 테크날러지즈) 및 2mM 스트렙토마이신(라이프 테크날러지즈)을 첨가하여 RPMI 1640(라이프 테크날러지즈)에서 성장시킨다.

건강한 지원자로부터 백혈구연층(buffy coat)을 수득한다(미국 오레건주 포틀랜드 소재의 아메리칸 레드크로스). 말초 혈액 단핵세포(PBMC, peripheral blood mononuclear cells)를 제조자의 지시에 따라서 림포사이트 세퍼레이션 메디아(Lymphocyte Separation Media)[미국 캘리포니아주 코스타 메사 소재의 아이씨앤 파마슈티칼즈(ICN Pharmaceuticals) 제품]를 사용하여 수득한다.

말초 혈액 림프구(PBL)를 배양 플라스크[미국 펜실바니아주 피츠버그 소재의 코스타르(Costar) 제품] 속에서, 또는 코팅되지 않은 디나비드(Dynabeads)[노르웨이 오슬로 소재의 디날(Dynal) 제품]를 사용하여 1x10⁸세포/ml, 2비드/세포로 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여 PBMC 분획으로부터 수득한다. 단핵구와 대식세포는 배양 플라스크에 부착하여 제거되거나 제조자(디날)의 지시에 따라서 자기성 세포 분리에 의해 소모된 상자기성 비드를 식세포화시켜 제거한다. CD4 세포는 CD8(클론 G10-1), CD20(클론 IF5), CD14(클론 F13) 및 CD16[코울터(Coulter)]에 대한 단일클론 항체 10㎍/ml로, 10⁸세포/ml로 4℃에서 20분 동안 인큐베이션시켜 PBL 분획으로부터 정제한다. 세척후, 세포를 양 항-마우스 Ig-커플링된 디나비드(10⁶세포/ml, 6비드/세포, 4℃에서 20분)와 자기성 세포 분리로 2번 소모시킨다. CD4 세포의 정제는 유세포분석에 의해 측정한 것으로서 일정하게 91 내지 95%이었다.

수지상 세포를 배양 플라스크(코스타르)[10⁸세포/ml, 37℃에서 2시간(디나비드 없이)]에 부착하는 PBMC로부터 생성시킨다. 광범위하게 세척한 후, 부착 세포를 GM-CSF(베링거-만하임) 500U/ml과 IL-4(베링거-만하임) 12.5U/ml를 함유하는 배지 속에서 7일 동안 배양한다. 생성된 세포 집단은 약하게 부착하고 수지상 세포의 표면 마커 특성(HLA-DR, CD86, CD83, CD11c에는 양성, CD4에는 음성)을 발현한다[모든 항체는 미국 캘리포니아주의 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)으로부터 수득함].

항 CD3 mAb(OKT3)을 오르토 바이오텍(Ortho Biotec., 미국 뉴 저지주 라리탄에 소재)으로부터 얻을 수 있고 항 CD28 mAb(9.3)를 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb, 미국 코네티컷주 스탬포드에 소재)로부터 얻을 수 있다.

실시예 II

T세포 자극 및 측정

세포를 세 가지의 상이한 방법으로 자극시킨다. 1) 제조자(디날)의 지시에 따라서 항-CD3(OKT-3)과 항-CD28(9.3) 항체에 공유결합된 디나비드(M-450)(3x28 비드), 3비드/세포, 2) 이오노마이신[미국 캘리포니아주 라졸라에 소재한 칼바이오켐(Calbiochem) 제품](100ng/ml) 및 포르볼 12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA, phorbol 12-myristate-13-acetate)(칼바이오켐)(10ng/ml), 3) 동종의 수지상 세포(25,000수지상 세포/200,000 CD4 세포). 모든 세포를 1x10⁶세포/ml의 농도에서 자극시킨다. 세포를 위에서 약술된 바와 같이 자극시키기 전에 1시간 또는 2시간 동안 화학식 I의 화합물(예: FR901228)[미국 메릴랜드주 베데스다에 소재한 엔씨아이(NCI) 제품]과 인큐베이션시킨다. 증식 검정은 96웰 평면 바닥 플레이트에서 4중으로 수행한다. 세포를 최종 부피 200L에서 1x10⁶세포/ml에서 자극시킨다. 증식을 3일째(자극 방법 1 및 2) 또는 6일째(자극 방법 3)에 MTT 검정[MTT 검정 키트, 미국 캘리포니아주 테머쿨라에 소재한 케미콘 인터내셔날 인코포레이티드(Chemicon International Inc.) 제품]으로 측정하고 결과는 4중 시험의 평균값으로 나타낸다. PBL 배양물이나 정제된 CD4 세포배양물은 3x28 비드, 이오노마이신/PMA 또는 동종의 수지상 세포로 자극시킨다. 도 1 내지 도 4에서 도시된 바와 같이, FR901228 10ng/ml 정도의 농도는 3x28 비드나 이오노마이신/PMA로 자극시킨 CD4 세포의 증식을 완전히 억제하지만, FR901228 1ng/ml 이하의 농도에서는 어떠한 현저한 효과를 보이지 않는다(이러한 실험은 자극 전에 FR901228로 2시간 인큐베이션하여 수행한다). 흥미롭게도, 동종의 수지상 세포에 의해 유도된 증식은 1ng/ml 정도의 농도에서 FR901228에 의해 현저하게 억제된다. 더우기, 보다 장기간의 세포 생존은 서브(sub)-G1 DNA 측정과 세포막 보전성으로 평가한 것으로서, FR901228에 의해 영향받지 않는다(도 5D). FR901228이 세포독성이 없는 것이 문헌[Byrdet al., Blood 94(4):1401-1408, 1999; Bateset al.,Clinical Pharmacology, Programs and Proceedings of American Society of Clinical Oncology, Abstract 693, 1999; 및 Chassainget al., J. Chrmatogr. B 719:169-176, 1998]에 기재된 결과와 일치한다.

성장 및 활성화 프로토콜은 위에서 기재한 바와 동일하다.

실시예 III

활성화 마커 검정

FR901228이 CD4 세포 위의 각종 활성화 마커의 유도에 미치는 영향을 연구한다. 이러한 관점에서, 세포를 하나 이상의 다음의 항체로 표지한다: 항-사람 CD4 Ab[미국 캘리포니아주 풀러톤에 소재한 이뮤노테크(Immunotech) 제품], FITC-커플링된 항-사람 CD11a Ab[파민젠(Pharmingen)], FITC-커플링된 항-사람 CD26 Ab[파민젠(Pharmingen)], FITC-커플링된 항-사람 CD49d Ab(코울터), FITC-커플링된 항-사람 CD54 Ab(파민젠 및 벡톤 디킨슨), FITC-커플링된 항-사람 CD95 Ab(파민젠), FITC-커플링된 항-사람 CD134 Ab(파민젠), FITC-커플링된 항-사람 CD25 Ab(미국 캘리포니아주 풀러톤에 소재한 벡톤 디킨슨 제품), FITC-커플링된 항-사람 CD69 Ab(벡톤 디킨슨), FITC- 또는 PE-커플링된 항-사람 CD154 Ab(벡톤 디킨슨) 또는 FITC- 또는 PE-커플링된 IgG1 아이소형 대조용 Ab. 세포(2x10⁵)를 최종 부피 30㎕로 4℃에서 20분 동안 각 항체 2㎕로 표지하고 세척하고 1% 파포름알데히드(미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 제품)에 재현탁시킨다. 흥미롭게도, CD25 및 CD154의 발현이 FR901228 10ng/ml 정도의 농도에서 3x28 비드로 자극한 후에 강하게 억제된다(도 5A 및 도 5B). 반대로, CD69의 유도는 FR901228 100ng/ml에 의해 영향을 받지 않는다(도 5C). 또한, 도 8A와 도 8B는 CD4 T세포 위의 CD25, CD134, CD137w, CD154, CD11a, CD54 및 CD95의 유도는 억제되고 CD69 유도 또는 활성화에 의해 유도된 CD62L의 하향 조절에는 어떠한 현저한 영향도 없는 것을 나타낸다(도 8A 및 도 8B). 이는 FR901228이 인접하는 CD4 세포의 활성화를 완전히는 아니지만 특이적으로 억제하는 것을 제시한다. 더우기, 보다 장기간의 세포 생활력은 표준 유세포분석 방법[참조: Dengleret al., Anticancer Drugs. 6(4):522-532, 1995]을 사용하여 요오드화 프로피디움(PI, propidium iodide) 배제에 의해 측정한 것으로서 FR901228 100ng/ml 이하의 농도에서 크게 영향을 받지 않는다.

FR901228의 억제는 이오노마이신/PMA 활성화에 의해 우회될 수 없으며, 이는 FR901228의 억제가 CD4 세포의 CD3 자극 후에 즉시 관찰된 세포내 칼슘 증가의 하방임을 의미한다.

실시예 IV

IL-2 및 TNF-α의 검정

세포를 위에 기재한 바와 같이 준비한다. 24시간 동안 자극시킨 세포의 상층액을 제조자[미국 캘리포니아주 서니베일에 소재한 바이오소스 인터내셔날(Biosource International)]의 지시에 따라서, IL-2 또는 TNF-α 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA, enzyme linked immunoabsorbant assay)을 적용시킨다.

다른 검정으로서, IL-2를 유세포분석법을 사용하여 CD4 T세포의 세포내 염색으로 측정한다. IL-2 또는 IFN의 세포내 표지를 위해, 검정전 세포를 먼저 모넨신(Monensin)(칼바이오켐) 1g/ml와 함께 4시간 동안 인큐베이션한다. 이어서 세포를 벡톤 디킨슨 세포내 염색 키트를 사용하여 위에 기재된 바와 같이 표면 단백질을 염색시키고 고정시키고 침투시키고 제조자가 설명한 바에 따라 PE 커플링된 항-사람 IL-2 Ab 및 FITC 커플링된 항-사람 IFN 또는 상응하는 대조용 항체로 표지시킨다. 벡톤 디킨슨 FACSCalibur 유세포분석기 상에서 셀퀘스트(Cellquest) 소프트웨어를 제조자(벡톤 디킨슨)의 프로토콜에 따라서 사용하여 데이타를 얻고 유세포분석을 수행한다.

CD4 세포 증식에 대한 FR901228의 억제작용의 기전을 연구하기 위하여, 활성화된 CD4 세포에 의한 IL-2와 TNF-α의 생성을 분석한다. FR901228 10ng/ml의 농도에서, 정제된 CD4 세포를 3x28 비드(항-CD3 및 항-CD28 항체가 커플링된 비드)로 자극시키고 24시간 후 ELISA로 측정한 것으로 IL-2의 생성이 크게 억제된다(도 6). 유사한 억제가 세포내 IL-2를 측정할 때 관찰된다(나타내지 않음). 그러나, IL-2(베링거 만하임) 100U/ml를 첨가해도 증식이 재기되지 않을 것이므로 T세포의 증식 부족은 순전히 IL-2의 생성의 감소 때문이 아니다. FR901228이 IL-2의 생성을 억제하는 점은, FR901228이 A1.1 T세포 하이브리도마에서 CD3이 유도한 IL-2의 생성을 억제하지 않았다고 보고한 왕(Wang) 등에 의해 보고된 이전의 결과[참조:Oncogene 17(12):1503-1508, 1998]에 배치된다. 이러한 차이점에 대한 원인은 현재 알려져 있지 않다.

추가의 실험으로서, FR901228 20ng/ml와 사이클로스포린 500ng/ml의 존재 또는 부재하에서 3x28 비드로 말초 혈액 림프구(PBL)를 24시간 자극시킨 후 IL-2와 TNF-α 둘 다를 ELISA로 측정한다(도 10A 및 도 10B).

실시예 V

증식 억제 검정

말초 혈액 림프구를 위에 기재한 바와 같이 준비하고 3x28 비드로 자극시키고 자극 후 6일째에 카복시플루오레세인 디아세테이트 석신이미딜 에스테르(CFDA-SE)로 염색한다. 세포 자극은 위에서 나타낸 바와 같이 수행하고 세포를 PBS로 2회 세척하고 배지에 재현탁시킨 후 CFDA-SE[미국 오레건주에 소재하는 멀레큘러 프로브스(Molecular Probes) 제품]로 인큐베이션한다. 약 10분의 염색 후, 세포를 배지와 FPS로 세척하고 염색의 삽입을 측정한다. FR901228을 자극 후 다양한 시간점, 즉 0 또는 24, 72 및 120시간에 가한다. 도 7은 CFDA-SE로 염색시켜 수득한 플로우 데이타를 나타낸다. y축은 세포 성장의 역(逆)에 관계되는 평균 형광강도를 나타낸다. 따라서, 데이타는 활성화 T세포의 세포 성장이 FR901228에 의해, 3x28비드로 자극시키기 전이나 후 또는 동시에 FR901228과 세포를 접촉시킴으로써 억제됨을 나타낸다.

실시예 VI

CD4 세포 위의 CD154의 발현

FR901228이 CD4 세포 위의 CD154 활성화 마커의 유도에 미치는 영향을 연구한다. 이러한 관점에서, 세포를 FITC-커플링된 항-사람 CD4 Ab[미국 캘리포니아주 풀러톤에 소재한 이뮤노테크 제품], PE-커플링된 항-사람 CD154 Ab(미국 캘리포니아주 플러톤에 소재한 벡톤 디킨슨 제품) 또는 FITC- 또는 PE-커플링된 IgG1 아이소형 대조용 Ab로 표지한다. 세포(2x10⁵)를 최종 부피 30㎕로 4℃에서 20분 동안 각 항체 2㎕로 표지하고 세척하고 1% 파포름알데히드(미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 제품)에 재현탁시킨다. 세포를 3x28 비드 및/또는 IL-2 20유닛/ml 또는 항 IL-2 항체의 존재하에서 4일 동안 자극시키고 3일째에 FR901228을 20ng/ml의 농도로 배양액에 가한다. 4일째에, 평균 형광강도를 유세포분석으로 측정한다.도 9에 나타낸 바와 같이, IL-2의 존재 또는 부재는 FR901228에 의해 유도된 CD154의 발현의 억제를 보상하지 않았다.

실시예 VII

전사 수준에서 CD154의 억제

이 실험에서는, 녹형광 단백질을 암호화하는 누클레오타이드 서열이 유르카트 세포로부터 클로닝된 CD154 프로모터에 실시가능하게 연결된 벡터 콘스트럭트[p-EGFP1, 클론테크(Clonetech)]로 유르카트 T세포를 안정하게 트랜스펙션시킨다. 목적하는 벡터를 함유하는 세포의 선별 후, 세포를 FR901228의 다양한 농도(0 내지 100ng/ml)의 존재하에서 3x28 비드로 24시간 동안 자극시킨다. 이어서 형광을 유세포분석을 사용하여 검출한다. 도 11에 나타나 있는 바와 같이, FR901228 0ng/ml를 가지는 세포만이 어떠한 자극도 받지 않은 세포에 비하여 GFP 발현이 유도된 것으로 나타났다.

별도의 실험으로서, FR901228의 각종 용량에서 3x28 비드로 자극시키고 18시간 후 CD154 전사물의 RT-PCR을 수행한다. 이들 실험은 FR901228의 용량이 증가할 수록 CD154 발현 수준이 감소됨을 나타낸다(데이타는 나타내지 않음). 또한 c-myc의 안티센스 콘스트럭트와 함께 인큐베이션된 CD4 세포를 사용하여 실험을 수행한다. 3x28 비드로 24시간 동안 자극시킨 후, 안티센스 c-myc 콘스트럭트는 유세포분석에 의해 측정한 것으로서 CD154의 발현을 콘스트럭트가 없는 것, 센스 또는 스크램블된(scrambled) c-myc 콘스트럭트로 트랜스펙션된 것을 포함하는 대조용에 비하여 약 50% 감소시켰다(데이타는 나타내지 않음). 따라서, FR901228 및 유사 화합물의 면역 억제 기전 중 하나의 목표는 c-myc 활성과 c-myc의 CD154 유도에 영향을 미치는 것이다.

실시예 VIII

S-상으로 들어가기 전에 세포주기의 억제

자극시키지 않거나 자극시킨(3x28 비드 자극) CD4 세포를 각종 농도의 FR901228와 함께 인큐베이션시키고 세포내 DNA 함량을 표준 방법을 사용하여 요오드화 프로피디움(PI)으로 염색하여 측정한다. 간략히, 세포를 PI 1㎍/ml와 PBS 중의 0.03% 사포닌의 혼합물로 약 20 내지 30분 동안 염색한다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 자극되지 않은 세포나 FR901228 10 내지 100ng/ml로 인큐베이션된 자극된 세포에서는 DNA 합성이 일어나지 않는다. 따라서, FR901228이 활성화된 T세포의 세포주기를 S상으로 들어가기 전에 억제하는 것으로 보인다.

실시예 IX

방사선 동위원소 T세포 증식 검정

건강한 제공자로부터의 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 피콜-하이파크[ficoll-hypaque, 미국 노스 캐롤라이나주, 두함에 소재한 엘에스엠(LSM), 오가논 테크니카(Organon Teknika) 제품]를 사용하여 밀도차 원심분리로 분리한다. PBMC를 완전배지[5% 사람 혈청, 100mM 글루타민, 1mM 피루브산나트륨, 0.1mM 불필수 아미노산, 2mM 페니실린(라이프 테크날러지즈) 및 2mM 스트렙토마이신(라이프 테크날러지즈)를 가진 RPMI 1640 배지]로 세척한 후, 7,500RADS에서 방사선을 조사하고 완전배지에서 4 내지 4.5x10⁶세포/ml로 재현탁시킨다. PBMC의 또 다른 분취량을 뉴라미니다제를 처리한 양 적혈구(SRBC, sheep red blood cell)로 로제트시킨다. LSM으로 또 한번 원심분리한 후, 이들 로제트된 T세포의 SRBC를 염화암모늄 용해 완충용액(라이프 테크날러지즈)으로 용해시킨다. 완전 배지로 2회 세척한 후, 이들 정제한 T세포를 또한 완전 배지에서 2 내지 2.5x10⁶세포/ml로 재현탁시킨다. 시험 화합물의 각종 희석물을 삼중으로 96-웰 평면 바닥 미세배양 플레이트(미국 메사추세스주 캠브리지 소재의 코스타르 제품)에 50L/웰로 가한다. 이어서 T세포 현탁액을 100L/웰로 웰에 즉시 분배한다. 37℃, 5% CO₂-95% 공기의 습한 대기에서 30분 동안 시험 화합물과 함께 세포를 배양한 후, 항-CD3 Ab[OKT-3, 미국 뉴 저지주 소재의 오르토 다이아그나스틱(Ortho Diagnostic) 제품]를 웰마다 가하고(최종 농도 10ng/ml), 방사선 조사된 PBMC 50L를 가한다. 이어서 배양 플레이트를 72시간 동안 37℃에서 5% CO₂-95% 공기의 습한 대기에서 인큐베이션한다. T 림프구의 증식은 삼중수소(³H) 타이미딘 삽입 측정으로 평가한다. 마지막 18 내지 24시간의 배양 동안, 세포를 삼중수소 타이미딘[미국 메사추세스주 캠브리지 소재의 엔이엔(NEN) 제품] 2Ci/웰로 펄스표지한다. 배양물을 다중 샘플 수거기[미국 메릴랜드주 게티스버그 소재의 웰리스(Wallace) 제품, 마하(MACH)-II]를 사용하여 유리섬유 여과기위에서 수거한다. 각각의 웰에 상응하는 여과기 디스크의 방사선활성을 표준 액체 섬광계수법[웰레이스(Wallace)의 베타플레이트 신트 카운터(Betaplate Scint Counter)]으로 측정한다. 반복 웰의 분당 평균 카운트를 계산하고, 그 결과를 T 세포의 삼중수소 타이미딘 삽입을 50% 저해하는 데 필요한 화합물의 농도로 표현한다.

실시예 X

NOD 또는 NODSCID 마우스에서 당뇨병 발병의 예방 및/또는 지연

본 실시예는 대표적인 뎁시펩티드 화합물인 FR901228의 NOD 및 NODSCID 마우스에서 당뇨병의 발병을 예방하거나 지연시키는 능력을 보여주기 위함이다.

FR901228을 PBS 중의 10% DMSO에 용해시키고 이틀에 한번 NOD 또는 NODSCID 마우스에 복강 투여한다. 대조용은 단지 DMSO 부형물(PBS 중의 10% DMSO)만 함유시킨다. NODSCID 마우스는 자발적으로 당뇨병으로 진행되지 않기 때문에, 당뇨병을 유발시키기 위해서 10주된 NOD 마우스로부터의 30x10⁶NOD 비장 세포를 4주 된 각 NODSCID 마우스에 정맥주사한다. FR901228 0.5mg/kg을 각각의 처리에서 20마리의 동물(NOD 10마리와 NODSCID 10마리)에게 투여한다. 매 2주 마다 각 처리 그룹에서 당뇨병으로 진행된 마우스의 수를 격주로 혈당측정기(glucometer)를 사용하여 혈당 수준을 측정함으로써 평가한다. 2회 연속 관찰한 결과, 혈당이 200mg/dl 이상으로 읽히는 경우를 확실한 당뇨의 지표로 간주한다. 이들 그룹의 평균 글루코스 수를 아래 표 2에 제시한다.

표 2에 나타낸 바와 같이, NODSCID 마우스에서, 확실한 당뇨병의 발병이 단지 부형제만을 처리한 마우스에 비하여 당해 화합물로 처리한 마우스에서 2주 이상 지연되었다. 놀랍게도, NOD 마우스의 결과는 보다 더 극적인데, 화합물로 처리한 어떤 NOD 마우스도 18주의 연구 동안 확실한 당뇨로 진행되지 않았으나 동일한 기간 동안 부형제를 처리한 마우스의 10마리 중 8마리가 확실한 당뇨로 진행되었다. 명백하게, 이러한 데이타는 표현형 당뇨병 발병을 지연시키는 데 있어서 면역억제 효과를 나타낸다.

앞의 것으로부터 본 발명의 특정 실시양태가 본 발명을 설명할 목적으로 본 명세서에서 기재되었으나, 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않는 다양한 변경이 이루어질 수 있다.

발명의 요약

간단히, 본 발명은 면역억제제로서의 활성을 가지는, 뎁시펩티드 및 이의 동류물(또한 본 명세서에서 "화합물"이라고 함)에 관한 것이다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 다음 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 입체이성질체 유효량을 동물에게 투여함으로써 동물의 면역반응을 억제하는 방법을 개시한다.

위의 화학식에서,

m, n, p, q, X, Y, R₁, R₂및 R₃은 아래에서 정의한 바와 같다.

또 다른 실시양태에서, 위의 화학식 I의 화학구조를 가지나 특정한 공지 화합물(즉, FR 901228)을 제외한 신규한 화합물을 개시한다. 추가의 실시양태는 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하여 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물을 포함한다.

본 발명의 방법을 실시하는 데 있어서, 화합물은 동종 이식 또는 이종 이식을 시술받은 동물은 물론 자가 면역 질환, 염증질환 또는 이식편 대 숙주병을 가지는 동물에서 면역반응을 억제하기 위해 투여될 수 있다. 본 발명의 추가의 방법은 림프구의 증식을 억제하기 위해서, 이식 시술(동종 및 이종 이식 포함)의 전이나 후 또는 동시에 투여함으로써 이식 후 이식편의 생존을 증진시키기 위해서, 림프구에서 IL-2의 분비를 감소시키기 위해서, 자극 후 림프구 위의 CD25 또는 CD154의 유도를 억제하기 위해서, 및/또는 총 T세포수를 유지하면서 활성화된 T세포에서 아네르기 또는 아포프토시스를 유도하기 위해서, 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물의 일정 용량을 동물에게 투여함으로써 항원에 대한 면역계의 내성을 유도하기 위한 방법을 제공한다. 또한, 화학식 I의 화합물을 투여함으로써 TNF-α의 분비를 감소시키는 방법과 활성화된 T세포의 세포주기를 S상으로 들어가기 전에 억제시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 이러한 측면과 다른 측면은 다음의 상세한 설명을 참고로 할 때 명백할 것이다. 이 목적으로, 보다 상세한 배경 지식, 과정, 화합물 및/또는 조성물을 설명하는 각종 참고자료가 본 명세서에 언급되어 있고, 각각은 그 전체로서 참고자료로써 본 출원에 삽입된다.

Claims

다음 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 입체이성질체.

화학식 I

위의 화학식 I에서,

m은 1, 2, 3 또는 4이고,

n은 0, 1, 2 또는 3이고,

p와 q는 독립적으로 1 또는 2이고,

X는 O, NH 또는 NR이고,

R₁, R₂및 R₃은 동일하거나 상이하고 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기 또는 아미노산 측쇄 유도체이고,

R은 저급 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 잔기이며, 본 화합물은 FR901228이 아니다.
제1항에 있어서, m이 1이고, n이 0, 2 또는 3인 화합물.
제1항에 있어서, m이 2, 3 또는 4이고, n이 1인 화합물.
제1항에 있어서, p 및 q 중의 하나가 2이거나, p 및 q가 둘 다 2인 화합물.
제1항에 있어서, X가 O인 화합물.
제1항에 있어서, X가 NH 또는 NR인 화합물.
제1항에 있어서, R₁및 R₃이 아미노산 측쇄 잔기인 화합물.
제1항에 있어서, R₂가 아미노산 측쇄 유도체인 화합물.
제1항의 화합물과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
다음 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 입체이성질체 유효량을 동물에게 투여함을 포함하는, 동물의 면역반응 또는 면역 매개 반응의 방지 또는 억제방법.

화학식 I

위의 화학식 I에서,

m은 1, 2, 3 또는 4이고,

n은 0, 1, 2 또는 3이고,

p와 q는 독립적으로 1 또는 2이고,

X는 O, NH 또는 NR이고,

R₁, R₂및 R₃은 동일하거나 상이하고 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기 또는 아미노산 측쇄 유도체이고,

R은 저급 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 잔기이다.
제10항에 있어서, 동물이 자가 면역 질환을 앓고 있거나 앓을 위험이 있는 방법.
제10항에 있어서, 동물이 염증질환을 앓고 있거나 앓을 위험이 있는 방법.
제10항에 있어서, 동물이 이식편 대 숙주병을 앓고 있거나 앓을 위험이 있는 방법.
제10항에 있어서, 동물이 동종 이식을 시술받았거나 시술받을 예정인 방법.
제10항에 있어서, 동물이 이종 이식을 시술받았거나 시술받을 예정인 방법.
다음 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 입체이성질체 유효량을 동물에게 투여함을 포함하는, 림프구 증식의 억제방법.

화학식 I

위의 화학식 I에서,

m은 1, 2, 3 또는 4이고,

n은 0, 1, 2 또는 3이고,

p와 q는 독립적으로 1 또는 2이고,

X는 O, NH 또는 NR이고,

R₁, R₂및 R₃은 동일하거나 상이하고 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기 또는 아미노산 측쇄 유도체이고,

R은 저급 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 잔기이다.
다음 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 입체이성질체 유효량을 이식 시술 전이나 후, 또는 동시에 동물에게 투여함을 포함하는, 이식 후 이식편의 생존 증진방법.

화학식 I

위의 화학식 I에서,

m은 1, 2, 3 또는 4이고,

n은 0, 1, 2 또는 3이고,

p와 q는 독립적으로 1 또는 2이고,

X는 O, NH 또는 NR이고,

R₁, R₂및 R₃은 동일하거나 상이하고 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기 또는 아미노산 측쇄 유도체이고,

R은 저급 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 잔기이다.
제17항에 있어서, 이식이 동종이식인 방법.
제17항에 있어서, 이식이 이종이식인 방법.
다음 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 입체이성질체 유효량을 동물에게 투여함을 포함하여, 림프구로부터 인터루킨-2의 분비를 감소시키는 방법.

화학식 I

위의 화학식 I에서,

m은 1, 2, 3 또는 4이고,

n은 0, 1, 2 또는 3이고,

p와 q는 독립적으로 1 또는 2이고,

X는 O, NH 또는 NR이고,

R₁, R₂및 R₃은 동일하거나 상이하고 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기 또는 아미노산 측쇄 유도체이고,

R은 저급 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 잔기이다.
다음 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 입체이성질체 유효량을 동물에게 투여함을 포함하여, 림프구 자극 후 림프구 위의 CD25 또는 CD154의 유도를 억제하는 방법.

화학식 I

위의 화학식 I에서,

m은 1, 2, 3 또는 4이고,

n은 0, 1, 2 또는 3이고,

p와 q는 독립적으로 1 또는 2이고,

X는 O, NH 또는 NR이고,

R₁, R₂및 R₃은 동일하거나 상이하고 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기 또는 아미노산 측쇄 유도체이고,

R은 저급 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 잔기이다.
다음 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 입체이성질체 일정 용량을 동물에게 투여함을 포함하여, 총 T세포수를 유지하면서 활성화된 T세포에서 아네르기 또는 아포프토시스를 유도하는 방법.

화학식 I

위의 화학식 I에서,

m은 1, 2, 3 또는 4이고,

n은 0, 1, 2 또는 3이고,

p와 q는 독립적으로 1 또는 2이고,

X는 O, NH 또는 NR이고,

R₁, R₂및 R₃은 동일하거나 상이하고 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기 또는 아미노산 측쇄 유도체이고,

R은 저급 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 잔기이다.
다음 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 입체이성질체 일정 용량을 동물에게 투여함을 포함하여, 항원에 면역계 내성을 유도하는 방법.

화학식 I

위의 화학식 I에서,

m은 1, 2, 3 또는 4이고,

n은 0, 1, 2 또는 3이고,

p와 q는 각각 1 또는 2이고,

X는 O, NH 또는 NR이고,

R₁, R₂및 R₃은 동일하거나 상이하고 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기 또는 아미노산 측쇄 유도체이고,

R은 저급 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 잔기이다.
다음 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 입체이성질체 일정 용량을 동물에게 투여함을 포함하여, 종양 괴사 인자-알파의 분비를 감소시키는 방법.

화학식 I

위의 화학식 I에서,

m은 1, 2, 3 또는 4이고,

n은 0, 1, 2 또는 3이고,

p와 q는 독립적으로 1 또는 2이고,

X는 O, NH 또는 NR이고,

R₁, R₂및 R₃은 동일하거나 상이하고 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기 또는 아미노산 측쇄 유도체이고,

R은 저급 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 잔기이다.
다음 화학식 I의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 입체이성질체 일정 용량을 동물에게 투여함을 포함하여, 활성화된 T세포의 세포주기를 S상에 들어가기 전에 억제하는 방법.

화학식 I

위의 화학식 I에서,

m은 1, 2, 3 또는 4이고,

n은 0, 1, 2 또는 3이고,

p와 q는 독립적으로 1 또는 2이고,

X는 O, NH 또는 NR이고,

R₁, R₂및 R₃은 동일하거나 상이하고 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기 또는 아미노산 측쇄 유도체이고,

R은 저급 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 잔기이다.
제10항, 제16항, 제17항, 제20항, 제21항, 제22항, 제23항, 제24항 또는 제25항에 있어서, m이 1인 방법.
제10항, 제16항, 제17항, 제20항, 제21항, 제22항, 제23항, 제24항 또는 제25항에 있어서, m이 2, 3 또는 4인 방법.
제10항, 제16항, 제17항, 제20항, 제21항, 제22항, 제23항, 제24항 또는 제25항에 있어서, n이 1인 방법.
제10항, 제16항, 제17항, 제20항, 제21항, 제22항, 제23항, 제24항 또는제25항에 있어서, n이 0, 2 또는 3인 방법.
제10항, 제16항, 제17항, 제20항, 제21항, 제22항, 제23항, 제24항 또는 제25항에 있어서, p와 q가 둘 다 1인 방법.
제10항, 제16항, 제17항, 제20항, 제21항, 제22항, 제23항, 제24항 또는 제25항에 있어서, p 및 q 중의 하나가 2이거나, p와 q가 둘 다 2인 방법.
제10항, 제16항, 제17항, 제20항, 제21항, 제22항, 제23항, 제24항 또는 제25항에 있어서, X가 O인 방법.
제10항, 제16항, 제17항, 제20항, 제21항, 제22항, 제23항, 제24항 또는 제25항에 있어서, X가 NH 또는 NR인 방법.
제10항, 제16항, 제17항, 제20항, 제21항, 제22항, 제23항, 제24항 또는 제25항에 있어서, R₁및 R₃이 동일하거나 상이하고 독립적으로 아미노산 측쇄 잔기인 방법.
제34항에 있어서, R₁과 R₃이 둘 다 -CH(CH₃)₂인 방법.
제10항, 제16항, 제17항, 제20항, 제21항, 제22항, 제23항, 제24항 또는 제25항에 있어서, R₂가 아미노산 측쇄 유도체인 방법.
제36항에 있어서, R₂가 =CHCH₃인 방법.
제10항, 제16항, 제17항, 제20항, 제21항, 제22항, 제23항, 제24항 또는 제25항에 있어서, 임의적 이중결합이 존재하는 방법.
제38항에 있어서, 이중결합이 트랜스 입체배위인 방법.
제10항, 제16항, 제17항, 제20항, 제21항, 제22항, 제23항, 제24항 또는 제25항에 있어서, 화합물이 FR901228인 방법.