TW201625314A - 降低蛋白質及肽之免疫原性之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及經由位點特異性結合載體與蛋白質或肽而增加蛋白質或肽之血清半衰期及降低其免疫原性之方法，及其用途。本發明生理活性蛋白質或肽之共軛物可顯著降低人體內免疫原性及因此減少抗該蛋白質或肽之抗體生成率。因此，本共軛物具有生理活性蛋白質或肽降低臨床效果之現象低之優勢，及其可有效地使用於發展具有針對免疫反應具高安全性的長效配方。

Description

降低蛋白質及肽之免疫原性之方法
本發明涉及經由位點特異性結合載體與蛋白質或肽而增加蛋白質或肽之血清半衰期及降低其免疫原性之方法，及其用途。
非人類及人類衍生蛋白質皆可普遍地誘發對生物治療劑之免疫反應。這些反應可減弱臨床效應，限制效能，及有時導致病理疾病或甚至造成患者死亡。特別地，靶向重組自身蛋白質之中和抗體的生成可誘導與患者體內固有蛋白質之交叉反應而導致嚴重後果(參見，Lim LC.Hematology 2005 10(3)：255-9)。隨著分子生物學的發展，生物藥品諸如單株抗體的問題已大大地減少。然而，許多重組蛋白質藥品與在體內表現之蛋白質序列相同，因此仍然存在造成中和免疫反應之可能性(參見，Namaka M et al,Curr Med Res Opin 2006 22(2)：223-39)。
雖然可能誘導免疫原性的機制並未完全清楚，已知可經由給予患者之產品及經由患者之各種不同因素而打破對自身蛋白質之抗性(評論於Chester,K,Baker, MP and Mayer A.Expert Rev Clin Immunol 2005 1(4)：549-559,Baker MP and Jones TD.Curr.Opin.Drug Disc Dev 2007 10(2)：219-227)。免疫原性的因素包含劑量、給藥頻率及給藥途徑、蛋白質藥物之免疫調控能力、彼等之製備等。誘導免疫反應的最重要因素為是否有可有效刺激CD4+T細胞反應之抗原識別位點(表位)(評論於Baker MP and Jones TD.Curr.Opin.Drug Disc Dev 2007 10(2)：219-227)。
另一方面，促胰島素分泌素-4(exendin-4)為 從希拉毒蜥(Gila monster lizard)唾液腺中發現的天然肽及具有與人類GLP-1(類昇糖素胜肽-1)52%序列相似性。促胰島素分泌素-4與GLP-1具有相似之胰島素分泌功能。然而，GLP-1由於二肽基肽酶-IV(DPP-IV)而很快去活化，因此具有很短的半衰期，然而促胰島素分泌素-4經由在第二胺基酸序列中存在甘胺酸而非丙胺酸而持有對DPP-IV之抗性及因此可較有效的作為第二型糖尿病治療藥劑。此外，亦使用胰島素或其類似物，及GLP-1/昇糖素之雙重致效劑作為糖尿病及肥胖的治療藥劑。然而，這些非人類胺基酸序列之存在可充當T細胞之抗原識別位點。合成促胰島素分泌素-4之艾塞那肽(Exenatide)(降爾糖(Byetta))經批准為第二型糖尿病治療藥劑，臨床試驗上已使超過30%接受艾塞那肽給藥1年之患者產生對艾塞那肽的抗體。最近批准之利西拉來(Lixisenatide)，已使約60-71%患者產生抗體(參見，Zinman,B.et al.,Annals of Internal Medicines.2007 146(7)：477-486；Schnabel CA et al,Peptides 2006 27：1902-1910；DeFronzo,R.A.et al,Diabetes Care 2005 28：1092-1100；Buse,J.B.et al,Diabetes Care 2004 27：2628-2635)。即，認定艾塞那肽為需要被處置之體內的外來物質而產生抗體。因此，普遍增加了難以可靠期望治療效果的問題。
因此，為了治療或預防，長時間將生理活 性蛋白質或肽給藥於體內之情況下，控制免疫原性是重要的。特別地，成人疾病有關之生理活性蛋白質或肽諸如胰島素或促胰島素肽及抗肥胖蛋白質常常被發展成給藥後能夠在體內維持之長效配方。此外，即使非為長效配方，在許多實例中必須在一段長時間內數次給藥。因此，不會誘導免疫反應成為重要課題。
在這些情況下，本發明者等進行眾多研究 及實驗而發展不會誘導免疫反應之蛋白質或肽的藥物配方。結果，發明者等發現，當載體與蛋白質或肽位點特異性結合時，蛋白質或肽之免疫原性與未結合載體之蛋白質或肽相比可降低，因此完成本發明。
本發明之一個目的為提供降低生理活性蛋白質或肽之免疫原性的方法。
本發明之另一個目的為提供組成物，該組成物包括生理活性蛋白質或肽之共軛物其中載體經由非肽基連接物與生理活性蛋白質或肽之非端點、內部殘基結合。
本發明之另一個目的為提供製備生理活性 蛋白質或肽共軛物之方法，該共軛物中載體與生理活性蛋白質或肽之非端點、內部殘基結合。
在一方面，本發明提供與未結合載體之生理活性蛋白質或肽比較，降低生理活性蛋白質或肽之免疫原性之方法，該方法包括結合載體與生理活性蛋白質或肽之非端點、內部殘基。
發明之具體實施例中，上述載體之特徵為其係選自下列者所構成之群組：聚乙二醇、脂肪酸、膽固醇、白蛋白或其片段、白蛋白結合物質、具有特殊胺基酸序列重複單元之聚合物、抗體、抗體片段、FcRn結合物質、體內結締組織或其衍生物、核苷酸、纖網蛋白、運鐵蛋白、類彈性蛋白多肽(ELP)、XTEN多肽、羧基端肽(CTP)、結構誘導探針(SIP)、醣類及高分子量聚合物。
發明之另一個具體實施例中，FcRn結合物質之特徵為其包含免疫球蛋白Fc區。
發明之另一個具體實施例中，生理活性蛋白質或肽及載體之特徵為兩者經由在其間插入連接物而結合。
發明之另一個具體實施例中，連接物之特徵為非肽基連接物。
發明之另一個具體實施例中，非肽基連接物之特徵為其係選自下列者所構成之群組：聚乙二醇、聚 丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸及其組合。
發明之另一個具體實施例中，特徵為生理 活性蛋白質或肽經由非肽基聚合物而結合免疫球蛋白Fc區，而該非肽基聚合物係選自下列者所構成之群組：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸及其組合。
發明之另一個具體實施例中，生理活性蛋 白質或肽之特徵為其係選自下列者所構成之群組：抗肥胖肽、促胰島素肽或其類似物、瘦素、胰島素、胰島素類似物、昇糖素、人類生長激素、生長激素釋放激素、生長激素釋放肽、干擾素、干擾素受體、群落刺激因子、類昇糖素胜肽諸如GLP-1、GLP-1/昇糖素雙重致效劑、抑胃多肽(GIP)、G蛋白偶聯受體、介白素、介白素受體、酵素、介白素結合蛋白、細胞介素結合蛋白、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、過敏抑制因子、細胞壞死醣蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制因子、轉移生長因子、α 1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、脂蛋白-E、紅血球生成因子、高糖基化紅血球生成因子、血管生成素、血紅素、凝血酶、凝血酶受體活化肽、凝血酶調節素、凝血因子VII、VIIa、VIII、IX及XIII、胞漿素原活化因子、血纖維蛋白結合肽、 脲激酶、鏈球菌激酶、水蛭素、蛋白C、C反應蛋白、腎素抑制劑、膠原酶抑制物、超氧化物歧化酶、血小板衍生生長因子、上皮細胞生長因子、表皮細胞生長因子、血管抑制素、血管收縮素、骨生長因子、骨刺激蛋白、降血鈣素、心房肽、軟骨誘導因子、依降鈣素(elcatonin)、結締組織活化因子、組織因子路徑抑制物、濾泡刺激素、黃體激素、黃體激素釋放激素、神經生長因子、副甲狀腺素、鬆弛素、胰泌素、體介素、類胰島素生長因子、腎上腺皮質素、昇糖素、膽囊收縮素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促腎上腺皮質素釋放因子、促甲狀腺激素、自毒素、乳鐵素、肌骨素、受體、受體拮抗劑、細胞表面抗原、病毒衍生疫苗抗原、單株抗體、多株抗體及抗體片段。
發明之另一個具體實施例中，生理活性蛋 白質或肽之特徵為其係選自促胰島素分泌素-4、促胰島素分泌素-4衍生物、GLP-1致效劑、胰島素及GLP-1/昇糖素雙重致效劑構成之群組。
發明之另一個具體實施例中，促胰島素分 泌素-4衍生物之特徵為其為促胰島素分泌素-4之N端電荷經修飾之促胰島素分泌素-4衍生物，其係選自下列者所構成之群組：促胰島素分泌素-4之N端胺基經刪除之促胰島素分泌素-4衍生物、促胰島素分泌素-4之N端胺基經羥基取代之促胰島素分泌素-4衍生物、促胰島素分泌素-4之N端胺基經羧基取代之促胰島素分泌素-4衍生物、促胰島素分泌素-4之N端胺基經二甲基修飾之促胰島素分泌素-4衍 生物及其中促胰島素分泌素-4之N端組胺酸殘基之α碳經刪除之促胰島素分泌素-4衍生物。
發明之另一個具體實施例中，上述內部殘 基之特徵為其為促胰島素分泌素-4之N端電荷經修飾之促胰島素分泌素-4衍生物之位置12或27上的離胺酸殘基。
發明之另一個具體實施例中，上述內部殘 基之特徵為其為促胰島素分泌素-4之N端電荷經修飾之促胰島素分泌素-4衍生物之位置27上的離胺酸殘基。
發明之另一個具體實施例中，促胰島素分 泌素-4之N端電荷改變之促胰島素分泌素-4衍生物之特徵為其為促胰島素分泌素-4之N端組胺酸殘基之α碳經刪除之促胰島素分泌素-4衍生物。
另一方面，本發明提供組成物，該組成物 包括生理活性蛋白質或肽之共軛物其中載體經由非肽基連接物與生理活性蛋白質或肽之非端點、內部殘基結合，其中與未結合載體之蛋白質或肽相比，該共軛物呈現降低之免疫原性。
發明之具體實施例中，上述共軛物之特徵 為具有降低之免疫原性，而免疫原性為長效製劑之副作用。
發明之另一個具體實施例中，非肽基連接 物之特徵為其為聚乙二醇。
另一方面，本發明提供製備生理活性蛋白 質或肽之共軛物的方法，其中載體與生理活性蛋白質或肽之非端點、內部殘基結合。
本發明之生理活性蛋白質或肽共軛物可顯著地降低人體內之免疫原性而因此降低抗蛋白質或肽之抗體生成率。因此，本共軛物具有生理活性蛋白質或肽降低臨床效果之現象低之優勢，及可有效地使用於發展針對免疫反應具有高安全性的長效配方。
第1圖顯示離體T細胞活性試驗中供體之HLA-DR基因型頻率之比較，與世界、歐洲及北美人口之比較圖示。
本發明涉及與未結合載體之生理活性蛋白質或肽比較，降低生理活性蛋白質或肽之免疫原性之方法，該方法包括結合載體與生理活性蛋白質或肽之非端點、內部殘基之步驟。
於本發明中，發明者等發現降低生理活性蛋白質或肽之免疫原性的方法，其中非肽連接物及Fc片段結合生理活性蛋白質或肽之內部殘基而非端點，因此抑制其中所需蛋白質或肽充當抗原之機制。發明者等確認，使用上述方法之情況，與經由在其他位置諸如肽之N端之修飾而製備共軛物的方法比較，顯著抑制動物之T細胞活化及抗體生成反應。結果，本發明者等發現使用該生理活性蛋白質或肽共軛物作為傳統蛋白質藥物製劑，其具有作為降低生理活性蛋白質或肽之免疫原性之組成物及方法的新 穎用途。
測量身體中的免疫原性之降低可不受已知 方法限制。例如，可經由T細胞離體活性測量方法確定免疫原性之差異，其包括偶合各載體與N端或N端以外包含C端之位點。在低pH下反應活性醛基選擇性地與N端反應，其亦可在高pH之情況，例如pH 9，與離胺酸殘基形成共價鍵。改變反應之pH時進行聚乙二醇化反應，然後可使用離子交換管柱從反應混合物分離位置異構物。
N末端為體內蛋白質或肽活性之重要位 點，而於N末端以外的位置進行偶合時，可將反應活性硫醇基導入要進行修飾之胺基酸殘基位置，因此在蛋白質或肽與非肽基聚合物之順丁烯二醯亞胺基間形成共價鍵。
N末端為體內蛋白質或肽活性之重要位 點，而於N末端以外之位置進行偶合時，可將胺基導入要進行修飾之胺基酸殘基位置，因此在蛋白質或肽與非肽基聚合物之醛基間形成共價鍵。
保護N末端的方法除了二甲基化外還包含 甲基化、去胺化或乙醯化，但不限於此。
本發明中，"生理活性蛋白質或肽"意指可控 制遺傳表現或生理功能之蛋白質或肽。生理活性蛋白質或肽可包含於本發明之範疇而沒有限制，只要根據本發明結合載體與生理活性蛋白質或肽之非端點、內部殘基，而因此與未結合載體之生理活性蛋白質或肽比較展現降低之免疫原性。如以下所述，載體可經由連接物，具體地非肽基 連接物，而與生理活性蛋白質或肽結合。
此外，除了天然生物活性蛋白質或肽之 外，生理活性蛋白質或肽還包含其衍生物、變異體或片段。
生理活性蛋白質或肽的實例包含抗肥胖 肽、促胰島素肽或其類似物、瘦素、胰島素、胰島素類似物、昇糖素、人類生長激素、生長激素釋放激素、生長激素釋放肽、干擾素、干擾素受體、群落刺激因子、類昇糖素胜肽(GLP-1等)、GLP-1/昇糖素雙重致效劑、抑胃多肽(GIP)、G蛋白偶聯受體、介白素、介白素受體、酵素、介白素結合蛋白、細胞介素結合蛋白、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、過敏抑制因子、細胞壞死醣蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制因子、轉移生長因子、α 1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、脂蛋白-E、紅血球生成因子、高糖基化紅血球生成因子、血管生成素、血紅素、凝血酶、凝血酶受體活化肽、凝血酶調節素、凝血因子VII、VIIa、VIII、IX及XIII、胞漿素原活化因子、血纖維蛋白結合肽、脲激酶、鏈球菌激酶、水蛭素、蛋白C、C反應蛋白、腎素抑制劑、膠原酶抑制物、超氧化物歧化酶、血小板衍生生長因子、上皮細胞生長因子、表皮細胞生長因子、血管抑制素、血管收縮素、骨生長因子、骨刺激蛋白、降血鈣素、心房肽、軟骨誘導因子、依降鈣素(elcatonin)、結締組織活化因子、組織因子路徑抑制物、濾泡刺激素、黃體激素、黃體激素釋放激素、神經生長因子、副甲狀腺素、鬆 弛素、胰泌素、體介素、類胰島素生長因子、腎上腺皮質素、昇糖素、膽囊收縮素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促腎上腺皮質素釋放因子、促甲狀腺激素、自毒素、乳鐵素、肌骨素、受體、受體拮抗劑、細胞表面抗原、病毒衍生疫苗抗原、單株抗體、多株抗體及抗體片段，而無限制。
更具體地，生理活性蛋白質或肽可包含胰 島素、促胰島素肽或GLP-1/昇糖素雙重致效劑，但不限於此。
本發明中，術語"胰島素"包含所有對胰島素 受體具有刺激效應之肽或修飾肽。胰島素可為，例如，天然胰島素、速效胰島素、基礎胰島素、胰島素類似物其中天然胰島素之任何胺基酸經由選自取代、添加、刪除及修飾之任合一種方法或這些方法之組合而改變，或可為其片段。而且，本發明使用之胰島素可為採用長效技術而克服短半衰期之長效胰島素。特別地，胰島素可為每星期給藥1次之長效胰島素或長效胰島素類似物，但不限於此。
根據本發明之胰島素的一些具體實例包含 如Korean Patent No.10-1058290(或International Publication WO 2008-082274)或Korean Patent Application Publication No.2014-0106452(或International Publication WO 2014-133324)揭露之胰島素或胰島素類似物及其長效型，其全部內容以引用方式併入本文，但不限於此。
本文中所使用，術語"胰島素類似物"意指具 有如天然胰島素在體內控制血糖濃度之相同功能的物質。 具體地，胰島素類似物包含天然胰島素序列中之一個或多個胺基酸經修飾者。胰島素類似物可為天然胰島素之A鏈或B鏈胺基酸經改變之胰島素類似物。其天然胰島素胺基酸序列如下。
A鏈：
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO：1)
B鏈：
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO：2)
具體地，天然胰島素中至少1個胺基酸可具有選自取代、添加、刪除、修飾及其組合所構成之群組之修飾，但不限於此。
胺基酸的取代或添加中，可使用人類蛋白質中正常觀測到的20種胺基酸以及非典型或非自然發生的胺基酸。非典型胺基酸的商業來源可包含Sigma-Aldrich、ChemPep及Genzymepharmaceuticals。可合成或從商業肽合成公司，例如，American peptide company Inc.，及Bachem(USA)，或Anygen(Korea)購買包含此類胺基酸之肽及典型肽序列。
具體地，上述胰島素類似物包含倒置胰島 素、胰島素變異體、胰島素片段、胰島素致效劑、胰島素衍生物等，且其製備方法包含基因重組以及固相方法，但不限於此。
術語"胰島素衍生物"顯示與天然胰島素之 A鏈及B鏈同源性之胺基酸序列，而保有控制體內血糖濃度之功能，及包含在胺基酸殘基上具有化學上取代(如，α-甲基化、α-羥基化)、刪除(如，去胺化)或修飾(如，N-甲基化)之一些基團的肽形式。此外，胰島素衍生物包含可結合胰島素受體而控制體內血糖濃度之肽模擬物，及低分子或高分子化合物，而甚至與天然胰島素及胺基酸序列不同源性。
本文中所使用，術語"胰島素片段"意指在胰 島素中添加或刪除一個或多個胺基酸之片段。添加之胺基酸可為非存在於天然狀態之胺基酸(如，D-型胺基酸)。此種胰島素片段保有控制體內血糖濃度之功能。
本文中所使用，術語"胰島素變異體"為具有 一種或多種與胰島素不同胺基酸序列之肽，且保有控制體內血糖濃度之功能。
分別製備本發明胰島素致效劑、衍生物、 片段及變異體的方法，可單獨使用或組合使用。例如，本發明包含具有一種或多種與天然胰島素不同胺基酸序列之肽，在端點胺基酸殘基去胺化，且保有控制體內血糖濃度之功能，可包含在內。
致效劑、衍生物、片段及變異體的說明甚 至可應用於其他類型之蛋白質或肽。
具體地，胰島素類似物可為其中一個或多 個選自下列者構成之群組之胺基酸經其他胺基酸取代者：B鏈之位置1胺基酸、位置2胺基酸、位置3胺基酸、位置5胺基酸、位置8胺基酸、位置10胺基酸、位置12胺基酸、位置16胺基酸、位置23胺基酸、位置24胺基酸、位置25胺基酸、位置26胺基酸、位置27胺基酸、位置28胺基酸、位置29胺基酸、位置30胺基酸；A鏈之位置1胺基酸、位置2胺基酸、位置5胺基酸、位置8胺基酸、位置10胺基酸、位置12胺基酸、位置14胺基酸、位置16胺基酸、位置17胺基酸、位置18胺基酸、位置19胺基酸、位置21胺基酸，及更具體地，為其中一個或多個選自下列者構成之群組之胺基酸經其他胺基酸取代者：B鏈之位置8胺基酸、位置23胺基酸、位置24胺基酸、位置25胺基酸；A鏈之位置1胺基酸、位置2胺基酸、位置14胺基酸及位置19胺基酸。
具體地，上述胺基酸中，可使用其中一個 或多個、2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多個、11個或更多個、12個或更多個、13個或更多個、14個或更多個、多於15個、16個或更多個、17個或更多個、18個或更多個、19個或更多個、20個或更多個、21個或更多個、22個或更多個、23個或更多個、24個或更多個、25個或更多個、26個或更 多個或27個或更多個胺基酸經其他胺基酸取代者，但不限於此。
在上述位置之胺基酸殘基可經丙胺酸、麩 胺酸、天門冬胺醯胺酸、異白胺酸、纈胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、離胺酸、組胺酸、半胱胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及或天門冬胺酸取代。
本發明中，"促胰島素肽"意指保有分泌胰島 素功能的肽。促胰島素肽可刺激胰臟β細胞之胰島素合成或表現。具體地，促胰島素肽為GLP(類昇糖素胜肽)-1、促胰島素分泌素-3或促胰島素分泌素-4，但不限於此。促胰島素肽包含天然促胰島素肽、其前驅物、其致效劑、其衍生物、其片段及其變異體。再者，可包含如前述之其組合。
GLP-1係由小腸分泌的激素，一般會促進胰 島素之生合成及分泌、抑制昇糖素分泌及促進細胞攝取葡萄糖。在小腸中，昇糖素前驅物分解成3個肽，即，昇糖素、GLP-1及GLP-2。此處，GLP-1意指GLP-1(1-37)，其原先為不具促胰島素功能之形式，但之後進行並轉化成活化之GLP-1(7-37)形式。
促胰島素分泌素-4指具有39個胺基酸之 肽，其顯示與GLP-1有53%胺基酸序列同源性。促胰島素分泌素-4可具有下列序列，但不限於此：
促胰島素分泌素-4： His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser(SEQ ID NO：3)
同時，促胰島素分泌素-3為在位置2及3具有與促胰島素分泌素-4不同胺基酸之多肽。促胰島素分泌素-3為其中促胰島素分泌素-4位置2及3之胺基酸分別經絲胺酸及天門冬胺酸取代者，可表示為Ser2Asp3-促胰島素分泌素-4(1-39)。具體地，促胰島素分泌素-3可具有下列序列，但不限於此：
促胰島素分泌素-3：His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser(SEQ ID NO：4)
上述促胰島素肽衍生物可為促胰島素肽之N端經修飾者。更具體地，促胰島素肽衍生物可經由改變N端之電荷而造成受體之快速解離，及其可為N端之正電荷經改變成中性或淨負電荷之衍生物。
本發明促胰島素肽衍生物可包含其中促胰島素肽之N端胺基(或胺)經刪除之脫胺基-組胺醯基衍生物、其中胺基酸經羥基取代之β-羥基咪唑并丙酶基-衍生物、其中胺基酸經2個甲基修飾之二甲基-組胺醯基衍生物、其中N端胺基經羧基取代之β-羧基咪唑并丙醯基-衍生物，或其中N端組胺酸殘基之α碳經刪除而只保有咪唑 并乙醯基及因此胺基之正電荷經移除之咪唑并乙醯基衍生物，及其他N端胺基酸經修飾之衍生物亦包含於本發明之範疇內。
藉由實施例，促胰島素肽衍生物可為其中 促胰島素分泌素-4之N端胺基(或胺)或胺基酸殘基經化學上修飾之衍生物。具體地，其為經由取代或移除存在於促胰島素分泌素-4之N端組胺酸殘基(第1個胺基酸)之α碳的α胺基而製備的促胰島素分泌素-4衍生物。更具體地，其可包含移除N端胺基之脫胺基-組胺醯基-促胰島素分泌素-4(DA-促胰島素分泌素-4)、經由用羥基取代N端胺基而製備之β-羥基咪唑并丙基-促胰島素分泌素-4(HY-促胰島素分泌素-4)、經由用羧基取代N端胺基而製備之β-羧基咪唑并丙基-促胰島素分泌素-4(CX-促胰島素分泌素-4)、經由用2個甲基殘基修飾N端胺基而製備之二甲基-組胺醯基-促胰島素分泌素-4(DM-促胰島素分泌素-4)或移除N端組胺酸殘基之α碳之咪唑并乙醯基-促胰島素分泌素-4(CA-促胰島素分泌素-4)等。
顯然地Korean Patent Application Publication No.10-2012-0135123(或international publication WO 2012/165915)或international publication WO 2014/107035揭露之促胰島素肽亦包含於本發明之範疇。這些出版物之所有內容係以引用方式併入本文中。
本發明中，"GLP-1/昇糖素雙重致效劑"包含具有GLP-1/昇糖素雙重活性之肽或其片段、前驅物、變異 體或衍生物，像調酸素，一種天然GLP-1/昇糖素雙重致效劑。本發明中，GLP-1/昇糖素雙重致效劑可為採用長效技術而克服短半衰期之GLP-1/昇糖素雙重致效劑，較佳為可每星期給藥1次之長效GLP-1/昇糖素雙重致效劑，但不限於此。
GLP-1/昇糖素雙重致效劑包含調酸素。
"調酸素"意指從前-昇糖素，昇糖素之前驅物，製造的肽。本發明中，如前述，調酸素包含天然調酸素、其前驅物、其衍生物、其片段、其變異體等。
調酸素具體地可具有胺基酸序列HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA(SEQ ID NO：5)，但不限於此。
調酸素衍生物包含經由添加、刪除或取代調酸素序列之任何胺基酸而製備之肽、肽衍生物或肽模擬物，可活化GLP-1受體及昇糖素受體，及特別地，與天然調酸素之活化比較可活化較高濃度的各個受體。
根據本發明的GLP-1/昇糖素雙重致效劑的一些具體實例包含Korean Patent Application Publication Nos.10-20125-01372771(或International Publication WO 2012-169798)及10-2012-01639579(或International Publication WO 2012-173422)中揭露之GLP-1/昇糖素雙重致效劑及其衍生物或其長效型，其全部內容以引用方式併入本文中。
本發明中，與生理活性蛋白質或肽結合之載體可為可增加生理活性蛋白質或肽之體內半衰期的物 質。
生理活性蛋白質或肽的實例包含能夠減少 生理活性蛋白質或肽之腎臟清除率之各種物質，例如，聚乙二醇、脂肪酸、膽固醇、白蛋白或其片段、白蛋白結合物質、具有特殊胺基酸序列重複單元之聚合物、抗體、抗體片段、FcRn結合物質、體內結締組織或其衍生物、核苷酸、纖網蛋白、運鐵蛋白、類彈性蛋白多肽(ELP)、XTEN多肽、羧基端肽(CTP)、結構誘導探針(SIP)、醣類、高分子聚合物、特殊胺基酸序列、具有特殊胺基酸序列重複單元之聚合物等。此外，生理活性蛋白質或肽與載體間之連接包含基因重組及體外連接，但不限於此。
載體可與生理活性蛋白質或肽共價或非共 價連接。上述FcRn結合物質可為免疫球蛋白Fc區，例如，IgG Fc。
使用聚乙二醇作為載體時，可使用Ambrx Inc.之Recode技術而使能夠與聚乙二醇位點特異性結合。亦可使用Neose公司之糖聚乙二醇化技術而使能夠與糖基化部分特異性結合。再者，可使用使聚乙二醇在體內緩慢消除之可釋放PEG技術，但不限於此。而且，本發明可使用之技術包含使用PEG而增加生物可利用性之技術。此外，使用上述技術亦可使非肽基聚合物諸如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂質聚合物、幾丁質或玻尿酸與生理活性蛋白質或肽 結合。
使用白蛋白為載體時，本發明可使用之技 術包含其中白蛋白或白蛋白片段可直接與生理活性蛋白質或肽共價連接而增加體內穩定性之技術。即使白蛋白未直接連接，可使用其中白蛋白結合物質，例如，白蛋白-特異性結合抗體或抗體片段與生理活性蛋白質或肽結合而由此結合白蛋白之技術，及可使用其中具有白蛋白結合親和力的某些肽/蛋白質與生理活性蛋白質或肽結合之技術。此外，可使用其中具有白蛋白結合親和力的脂肪酸與生理活性蛋白質或肽結合之技術，但不限於此。此處可包含可增加使用白蛋白之體內穩定性之任合技術或結合方法。
本發明亦可包含為了增加體內半衰期而使 用抗體或抗體片段作為載體之結合生理活性蛋白質或肽的技術。可使用具有FcRn結合位點之抗體或抗體片段，及可使用任何不含FcRn結合位點之抗體片段諸如Fab。在此亦可包含使用催化性抗體之CovX公司的CovX-body技術，及本發明可包含使用免疫球蛋白Fc區而增加體內半衰期之技術。
使用免疫球蛋白Fc區時，結合Fc區及生理 活性蛋白質或肽之連接物及其結合方法可包含肽鍵或聚乙二醇等，但不限於此，任何化學結合方法均可用。此外，Fc區與胰島素類似物的結合率可為1：1或1：2，但不限於此。
包含Fc區之免疫球蛋白恆定區為可在體內 代謝之生物可降解多肽，所以可安全地使用作為藥物載 體。此外，由於其相對較低分子量，免疫球蛋白Fc區就製造、純化及複合物之產量而論比整個免疫球蛋白分子更為有利。再者，因為沒有Fab，而Fab由於從一個抗體到另一個抗體之胺基酸序列的差異而展現高非均質性，所以免疫球蛋白Fc單獨提供顯著加強均質性之複合物，及減少誘導血液抗原性之可能性。
而且，上述PEG係非特異性地結合目標肽 之特異位點或各種位點及因而增加肽之分子量。因此，PEG對抑制腎臟清除率及防止水解有效而且不造成特別的副作用。此外，PEG與外源肽結合時，可抑制存在於外源肽之抗原位點遭免疫細胞辨識。具體地，PEG可抑制抗原呈現細胞吞噬肽及蛋白水解。因此，能降低肽充當抗原之可能性。特別是外源蛋白質刺激CD4+T細胞之活化而作為抗原，約14-24短肽以結合第二類MHC之形式必須存在於抗原呈現細胞上。可在取決於PEG結合位置而降解成適當大小的過程中經抑制。
本發明具體例中，載體與生理活性蛋白質 或肽經由連接物而連結，特別地，非肽基連接物。
本發明中，非肽基連接物意指包含2種或更 多種重複單元之生物相容性聚合物，該重複單元經由肽連結以外之任何共價鍵彼此結合。非肽基連接物可與非肽基聚合物相互替代使用。
適用於本發明之非肽基連接物可選自生物 可降解聚合物、脂肪聚合物、幾丁質、玻尿酸及其組合構 成之群組。本文中使用之生物可降解聚合物可為聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙醚、聚乳酸(PLA)或聚乳酸-乙醇酸(PLGA)。在本發明之具體實施例中，非肽基聚合物為聚乙二醇。此外，所屬領域熟知之其衍生物及容易經由所屬領域已知之方法製備之衍生物均可包含於本發明之範圍。
使用於由傳統框內(inframe)融合方法而得 到之融合蛋白質的肽連接物具有容易在體內被蛋白質水解酵素裂解的缺點，因此無法如預期得到經由載體而增加活性藥物血清半衰期之充分效應。然而，因為本發明非肽基聚合物為不具肽連結之物質，基本上具有蛋白質水解酵素抗性，因此增加肽之血清半衰期。本發明可使用之非肽基聚合物的分子量具體地為1至100kDa，更具體地為1至20kDa。本發明非肽基聚合物，連接免疫球蛋白Fc區，可為一種類型之聚合物或為不同類型聚合物之組合。
本發明中，載體之特徵為其結合生理活性 蛋白質或肽之非端點內部殘基。在此情況，如上述，載體可經由連接物結合生理活性蛋白質或肽之非端點內部殘基。
當載體與生理活性蛋白質或肽結合時，生 理活性蛋白質或肽之非端點內部殘基可包含任何可降低其免疫原性之殘基，而無限制，而降低之免疫原性係與未結合載體之蛋白質或肽或與於蛋白質或肽之末端位點結合載 體之蛋白質或肽之免疫原性比較。
生理活性蛋白質或肽之非端點、內部胺基 酸可為離胺酸、半胱胺酸等。
更具體地，當生理活性蛋白質或肽為促胰 島素肽，特別是促胰島素分泌素-4或促胰島素分泌素-4之衍生物時，其內部殘基可為位置12或27的離胺酸殘基，但不限於此。
此外，使用醛連接物作為非肽基聚合物 時，N端與離胺酸殘基之胺基反應，可使用修飾形式之促胰島素肽改善反應產量。例如，可使用阻斷N端之方法、取代離胺酸殘基之方法、引進胺基之方法而將反應活性胺基維持於所需位置，且進一步可改善聚乙二醇化及偶合產量。
本發明之較佳具體例中，載體與本發明促 胰島素肽之非端點內部殘基結合之促胰島素肽共軛物，意指免疫球蛋白Fc區與促胰島素肽N端以外之胺基特異性結合之促胰島素肽共軛物。
具體實施例中，本發明者等進行一系列實 驗；即，選擇性結合PEG與促胰島素肽之離胺酸殘基的方法中，結合PEG與天然促胰島素分泌素-4時，在pH 9.0下進行反應，由此誘導離胺酸殘基之聚乙二醇化；而另一個方法中，結合PEG與N端-移除或保護形式之促胰島素分泌素-4衍生物時，在pH 7.5下進行反應，由此誘導離胺酸殘基之聚乙二醇化。結果證實，與N端結合正相反，當 結合離胺酸殘基時，顯著抑制離體T細胞活性(表2至4)。
再者，本文所使用術語"免疫球蛋白Fc區" 意指免疫球蛋白之重鏈恆定區2(CH2)及重鏈恆定區3(CH3)，免疫球蛋白之重鏈及輕鏈可變區、重鏈恆定區1(CH1)及輕鏈恆定區1(CL1)除外。可進一步在重鏈恆定區包含鉸鏈區。
而且，只要實質上具有與天然蛋白質相似 或較佳之生理效應，本發明免疫球蛋白Fc區可含有一部分或全部Fc區包含重鏈恆定區1(CH1)及/或輕鏈恆定區1(CL1)，而免疫球蛋白之重鏈及輕鏈可變區除外。此外，免疫球蛋白Fc區可為在CH2及/或CH3胺基酸序列之相對長部分具有刪除之片段。即，本發明免疫球蛋白Fc區可包括1)CH1結構域、CH2結構域、CH3結構域及CH4結構域、2)CH1結構域及CH2結構域、3)CH1結構域及CH3結構域、4)CH2結構域及CH3結構域、5)一種或多種結構域與免疫球蛋白鉸鏈區(或鉸鏈區之部分)之組合及6)重鏈恆定區及輕鏈恆定區各結構域之二聚物。
而且，本發明免疫球蛋白Fc區包含天然胺 基酸序列以及其序列衍生物(突變體)。胺基酸序列衍生物由於天然胺基酸序列之一個或多個胺基酸殘基之刪除、插入、非保守性或保守性取代或其組合而具有不同序列。例如，IgG Fc中，位置214至238、297至299、318至322或327至331之胺基酸殘基，已知在結合上具重要性，可使用作為修飾之標靶。而且，可能有各種不同衍生物，包 含可形成雙硫鍵之區域被刪除者，或天然Fc形式N端之某些胺基酸殘基經移除或於此添加甲硫胺酸殘基者，而且，移除效應功能，可能在補體結合位點發生刪除，諸如C1q-結合位點及抗體依賴的細胞介導細胞毒殺作用(ADCC)位點。International Publications,WO 97/34631,WO 96/32478等揭露製備此種免疫球蛋白Fc區序列衍生物之技術。
所屬領域習知蛋白質及肽之胺基酸交換， 不會全然改變分子活性(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常發生的交換為胺基酸殘基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu及Asp/Gly間的交換。
此外，如需要，可經由磷酸化、硫酸化、 丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙醯化、醯胺化等而修飾Fc區。
上述Fc衍生物可為展現與本發明Fc區相同 生物活性或改善Fc區之抗熱、pH等之結構穩定性的衍生物。
再者，可從分離自人及其他動物包含牛、 山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠或天竺鼠之天然形式得到這些Fc區，或可為得自轉殖動物細胞或微生物之其重組體或衍生物。本文中，從天然免疫球蛋白而取得之方法包含從人或動物有機體分離整個免疫球蛋白，然後用蛋白質水解酵素處理。木瓜酵素處理結果為分解天然免疫球蛋白 成Fab及Fc，及胃蛋白酶處理結果為產生pFc'及F(ab)2片段。可使這些片段進行粒徑排阻層析法等而分離Fc或pFc'片段。
具體地，人源Fc區為得自微生物之重組免 疫球蛋白Fc區。
此外，免疫球蛋白Fc區可為具有天然糖 鏈、比天然形式增加糖鏈或比天然形式減少糖鏈之形式，或可為去糖基化形式。可經由所屬領域之普通方法達成增加、減少或移除免疫球蛋白Fc糖鏈，諸如化學方法、酵素方法及使用微生物之遺傳工程方法。移除免疫球蛋白Fc區之糖鏈造成與補體成分C1q部分結合親和力之大幅降低及抗體依賴的細胞介導細胞毒殺作用或補體依賴的細胞毒殺作用之降低或移除，因而不誘導不必要的體內免疫反應。在這方面，去糖基化或非糖基化形式之免疫球蛋白Fc區可更適合於本發明作為藥物載體之目的。
本文中所使用，術語"去糖基化"意指酶促移 除Fc區之糖部分，及術語"非糖基化"意指由原核生物，具體地，E.co1i，製造未糖基化形式之Fc區。
同時，免疫球蛋白Fc區可衍生自人或其他 動物包含牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠或天竺鼠，較佳為人源。
而且，免疫球蛋白Fc區可為衍生自IgG、 IgA、IgD、IgE及IgM之Fc區，或由其組合或其雜合體而製成者。具體地，其係衍生自IgG或IgM，係在人血中最 充足之蛋白質中，及更具體地來自IgG，已知IgG加強配體結合蛋白質之半衰期，但不限於此。
另一方面，本文中所使用術語"組合"，意指 編碼相同來源之單鏈免疫球蛋白Fc區的多肽結合不同來源之單鏈多肽而形成二聚物或多聚物。即，二聚物或多聚物可由選自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc及IgE Fc片段所構成群組之2個或更多個片段而形成。
本發明中，術語"雜合體"意指單鏈免疫球 蛋白Fc區中存在相應於至少2個不同來源Fc片段之序列。本發明中，可有各種類型之雜合體。即，可有由1至4個選自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc及IgD Fc之CH1、CH2、CH3及CH4所構成群組之結構域所組成之雜合體，及可包含鉸鏈。另一方面，IgG亦可分為IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亞型，本發明中，可能為其組合或雜合體。具體地為IgG2及IgG4亞型，及最具體地很少具有效應功能，諸如補體依賴的細胞毒殺作用(CDC)之IgG4的Fc區。
即，本發明藥物之載體的免疫球蛋白Fc區可為，例如，人IgG4-衍生非糖基化Fc區，但不限於此。相較於可造成非所需免疫反應，例如，可在體內充作抗原而產生新抗體之非人源Fc區，人源Fc區為較佳。
本發明具體實施例中使用之非肽基聚合物具有能夠結合免疫球蛋白Fc區與生理活性蛋白質或肽之反應活性基團。進一步之具體實施例中，此反應活性基團位於兩末端。非肽基聚合物兩端點之反應活性基團較佳係 選自反應活性醛基、丙醛基、丁醛基、順丁烯二醯亞胺基及琥珀醯亞胺衍生物所構成之群組。琥珀醯亞胺衍生物可為琥珀醯亞胺丙酸酯、羥基琥珀醯亞胺基、琥珀醯亞胺基羧甲基或琥珀醯亞胺碳酸酯。特別地，當非肽基聚合物於其兩末端具有反應活性醛基之反應活性基團時，其係有效地於兩末端連接生理活性多肽與免疫球蛋白而有最小的非特異性反應。經由醛連結還原烷化製造的最終產物比經由醯胺連結所結合者更加穩定。醛反應活性基團擇性地於低pH時在N端反應，於高pH，諸如pH 9.0時，與離胺酸殘基形成共價鍵。
非肽基聚合物之兩端點反應活性基團可彼 此相同或不同。
例如，非肽基聚合物可在一個末端具有順 丁烯二醯亞胺基，在另一個末端具有醛基、丙醛基或丁醛基。使用兩末端具有反應活性羥基之聚乙二醇作為非肽基聚合物時，可經由已知化學反應活化羥基成各種反應活性基團，或可使用具有購自市售修飾反應活性基團之聚乙二醇以製備生理活性蛋白質或肽共軛物，具體地根據本發明之促胰島素肽共軛物。
本發明促胰島素肽共軛物不但可維持傳統 促胰島素肽之體內活性，諸如促進胰島素合成及分泌、抑制食慾、減輕體重、增加β細胞之血糖敏感度、促進β細胞增生或胃排空延遲，而且可顯著地增加促胰島素肽之血清半衰期及因此維持肽在體內之效應。據此，此促胰島素 肽共軛物適用於治療糖尿病、肥胖、急性冠狀動脈症候群或多囊性卵巢症候群。
另一個具體例中，本發明提供組成物，包 括其中載體經由非肽基連接物結合生理活性蛋白質或肽之非端點、內部殘基的生理活性蛋白質或肽之共軛物，其中該共軛物展現與未結合載體之生理活性蛋白質或肽比較降低之免疫原性。
具體地，上述共軛物之特徵為降低免疫原 性，而免疫原性為長效製劑之副作用。
而且，非肽基連接物可為聚乙二醇。
生理活性蛋白質或肽、連接物及共軛物如上述。
另一方面，本發明提供製備生理活性蛋白質或肽之共軛物的方法。
詳細地，本發明提供生理活性蛋白質或肽之共軛物的製備方法，包括下列步驟：(1)共價結合於兩末端具有醛、順丁烯二醯亞胺或琥珀醯亞胺反應活性基團之非肽基聚合物與生理活性蛋白質或肽之胺基或硫醇基；(2)從步驟(1)之反應混合物中分離經由生理活性蛋白質或肽之N末端以外之位點與非肽基聚合物共價結合之生理活性蛋白質或肽；及(3)共價結合免疫球蛋白Fc區與共價結合生理活性蛋白質或肽之非肽基聚合物的另一個末端而製造生理活性蛋 白質或肽之共軛物，其中非肽基聚合物之兩末端分別與免疫球蛋白Fc區及生理活性蛋白質或肽結合。
在更佳方面，本發明提供蛋白質共軛物的製備方法，包括下列步驟：(1)共價結合於兩末端具有醛反應活性基團之非肽基聚合物與生理活性蛋白質或肽之離胺酸殘基；(2)從步驟(1)之反應混合物中分離經由生理活性蛋白質或肽之離胺酸殘基與非肽基聚合物共價結合之生理活性蛋白質或肽；及(3)共價結合免疫球蛋白Fc區與共價結合生理活性蛋白質或肽之非肽基聚合物的另一個末端而製造共軛物，其中非肽基聚合物之兩末端分別與免疫球蛋白Fc區及生理活性蛋白質或肽結合。
更具體地，步驟(1)之非肽基聚合物與為生理活性蛋白質或肽之促胰島素肽之離胺酸殘基，在pH 7.5或更高之下結合。
[實施例]
在下文中，將經由下列實施例更詳細說明本發明。然而，下列實施例旨在說明本發明而非限制本發明之範圍於此。
實施例1：促胰島素分泌素-4之聚乙二醇化及聚乙二醇化促胰島素分泌素-4位置異構物之分離
於天然促胰島素分泌素-4(American Peptides)之N端與 3.4K PropionALD(2)PEG(分子量3.4kDa有2個丙醛基之PEG，IDB Inc.,Korea)之聚乙二醇化，使肽與PEG於莫耳比為1：15，肽濃度為3mg/ml及4℃下反應90分鐘。此時，在100mM NaOAc緩衝液(pH 4.0)中進行反應，並於此添加還原劑，20mM SCB(NaCNBH3)。
而且，於促胰島素分泌素-4之離胺酸(Lys) 與3.4K PropionALD(2)PEG之聚乙二醇化，使肽與PEG於莫耳比為1：30，肽濃度為3mg/ml及4℃下反應3小時。此時，在100mM Na-磷酸緩衝液(pH 9.0)中進行反應，並於此添加還原劑，20mM SCB。經由SOURCE Q(XK 16ml,Amersham Biosciences)從反應溶液初步純化單聚乙二醇化肽，並經SOURCES(XK 16ml,Amersham Biosciences)分離異構物。可見到N端-聚乙二醇化之波峰較早出現，然後2個離胺酸(Lys)-聚乙二醇化波峰依序出現。藉由胜肽圖譜法從洗提峰確認聚乙二醇化位點。
首先洗提出Lys12-聚乙二醇化共軛物，然後 於最後部分洗提出Lys27-聚乙二醇化共軛物。N端位置異構物及Lys12位置異構物間之完美波峰分離是可能的。
管柱：SOURCE Q(XK 16ml,Amersham Biosciences)58-27
流速：2.0ml/min
梯度：A0→40% 80min B(A：20mM tris pH8.5,B：A+0.5M NaCl)
管柱：SOURCE S(XK 16ml,Amersham Biosciences)
流速：2.0ml/min
梯度：A0→100% 50min B(A：20mM檸檬酸pH 3.0,B：A+0.5M KCl)
實施例2：CA促胰島素分泌素-4離胺酸殘基之聚乙二醇化及位置異構物之分離
於CA促胰島素分泌素-4(American Peptides)離胺酸(Lys)殘基與3.4K PropionALD(2)PEG之聚乙二醇化，使CA促胰島素分泌素-4與PEG於莫耳比為1：30，CA促胰島素分泌素-4濃度為3mg/ml及4℃下反應3小時。CA促胰島素分泌素-4為N端-修飾之促胰島素分泌素-4其中天然促胰島素分泌素N端組胺酸殘基之α碳缺失及側鏈之β碳直接結合羧基碳。此時，在100mM Na-磷酸緩衝液(pH 9.0)中進行反應，並於此添加還原劑，20mM SCB。經由SOURCE Q(XK 16ml,Amersham Biosciences)從反應溶液初步純化單聚乙二醇化肽，並經SOURCES(XK 16ml,Amersham Biosciences)分離異構物。
可見到2個離胺酸(Lys)-聚乙二醇化波峰出現。藉由胜肽圖譜法從洗提峰確認聚乙二醇化位點。
首先洗提出Lys12-聚乙二醇化共軛物，然後於最後部分洗提出Lys27-聚乙二醇化共軛物。N端位置異構物及Lys12位置異構物間之完美波峰分離是可能的。
管柱：SOURCE Q(XK 16ml,Amersham Biosciences)
流速：2.0ml/min
梯度：A0→40% 80min B(A：20mM tris pH8.5,B：A+ 0.5M NaCl)
管柱：SOURCE S(XK 16ml,Amersham Biosciences)
流速：2.0ml/min
梯度：A0→100% 50min B(A：20mM檸檬酸pH 3.0,B：A+0.5M KCl)
實施例3：製備咪唑并-乙醯基促胰島素分泌素-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc共軛物
使用咪唑并-乙醯基促胰島素分泌素-4(CA促胰島素分泌素-4,AP,USA)如實施例2之相同方式使3.4K PropionALD(2)PEG與CA促胰島素分泌素-4之Lys反應。然後使用最後的異構物峰(Lys 27位置異構物)進行偶合反應，Lys 27位置異構物在兩個Lys異構物峰當中顯示大量反應性且容易與N端異構物區別。肽與免疫球蛋白Fc於莫耳比1：8，總蛋白質濃度60mg/mL及4℃下反應20小時。在100mM K-P(pH 6.0)之溶液中進行該反應並於此添加還原劑，20mM SCB。偶合反應之後，如同實施例2進行使用16ml SOURCE Q及16ml SOURCE ISO之兩步驟純化。逆相HPLC分析結果顯示95.8%純度。
實施例4：分離人周邊血液單核細胞(PBMC)用於離體試驗及選擇供體
於24小時內從健康供體收集之血液分離人周邊血液單核細胞(PBMC)。捐血係由UK National Blood Transfusion Service(Addenbrooke Hospital,Cambridge,UK)供應。從使用LymphoprepTM(Axis-shield,Dundee,Scotland)經由密度梯度離心法得到之血沉棕黃層分離周邊血液單核細胞。當中，使用CD8+ RosetteSepTM(StemCell Technologies Inc,London,UK)移除CD8+T細胞。使用前將各供體之周邊血液單核細胞貯存於液態氮中。使用以HLA SSP-PCR為基礎之組織分型試劑盒(Biotest,Solihull,UK)分析供體細胞之HLA-DR單倍體基因型。使用KLH(Keyhole Limpet Haemocyanin,Pierce(Perbio),Northumberland,UK)測試T細胞之反應活性，KLH為衍生自A型流感及Epstein Barr病毒之抗原肽。
選擇代表世界人口HLA-DR型頻率之50供 體並由單一群組組成。構成群組之各供體的第二類MHC單倍體基因型及T細胞之反應活性示於下列表1。比較供體基因型頻率與世界人口頻率，結果示於第1圖。以下表1顯示各供體在抗原肽KLH上之HLA-DR基因型及T細胞之反應活性。
上文表1中，灰色部分顯示供體細胞融解前後與KLH之反應活性顯著不同的實例。
實施例5：EpiScreenTM離體T細胞增生試驗
為了根據代表性生理活性蛋白質或肽之促胰島素肽的聚乙二醇化位點來辨識免疫原性抑制機制，而比較未經結合天然促胰島素分泌素-4及未經結合CA促胰島素分泌素-4、於離胺酸殘基聚乙二醇化之CA促胰島素分泌素-4(CA促胰島素分泌素-4-PEG(內部))及於N端聚乙二醇化之天然促胰島素分泌素-4(促胰島素分泌素-4-PEG(N端))之T細胞增生能力。此時，因為CA促胰島素分泌素-4不具有可聚乙二醇化之N端殘基，所以不製備CA促胰島素分泌素-4之N端聚乙二醇化CA-促胰島素分泌素-4。
於T細胞增生試驗，融解供體之周邊血液 單核細胞(PBMC)並測量細胞數及活力。用AIM-V培養基將細胞稀釋至4-6x106細胞/ml。將各供體細胞分配至24孔培養盤後，加入試驗樣本至最終濃度50μg/ml(n=3)。放置抗原肽KLH處理組以辨識各供體細胞之再生性。所有試驗組及對照組均於37℃及5%CO2之培養箱條件下培養8天。在第5、第6、第7及第8天取出部分細胞並轉移至96孔培養盤而測量細胞增生率。於測量細胞增生率，在每孔添加0.75μl[3H]-胸苷(Perkin Elmer Buckinghamshire,UK)並培養18小時，然後使用TomTec Mach III細胞收集裝置，用96-孔過濾盤收集細胞。
使用1450 Microbeta Wallac Trilux液體閃爍 計數器(Perkin Elmer Buckinghamshire,UK)測量各孔之放射 性(每分鐘計數，cpm)。以2個或更多個SI(SI2,p<0.05)為正值之模擬指數(SI)之試驗閾值為基礎測定結果。在包含相應於SI1.9之邊界值的情況，分別用(P*)指明。結果，CA促胰島素分泌素-4及促胰島素分泌素-4分別於12%及10%供體中展現正值。然而，於肽內部殘基聚乙二醇化之CA促胰島素分泌素-4在所有供體中均展現負值。另一方面，於N端聚乙二醇化之促胰島素分泌素-4在6%供體中展現正值。據此，如果聚乙二醇化產生在肽之內部離胺酸殘基而不是N端，則顯著抑制肽之免疫原性(表2)。表2顯示T-細胞增生及介白素-2(IL-2)分泌。
表3顯示T-細胞增生反應之強度及頻率(包含SI1.9邊界值)。
上述結果顯示透過生理活性蛋白質或肽之內部殘基而非端點而結合非肽基聚合物，特別是PEG，抑制生理活性蛋白質或肽之免疫原性。
實施例6：EpiScreenTM離體介白素-2(IL-2)分泌試驗
為了根據代表性蛋白質或肽之促胰島素肽的聚乙二醇化位點來辨識免疫原性抑制機制，而使用與EpiScreenTM T細胞增生檢測中相同之供體細胞及樣本來比較及測量實施例5之未經結合促胰島素分泌素-4及聚乙二醇化促胰島素分泌素-4之IL-2分泌量。結合抗介白素-2抗體(R & D Systems,Abingdon,UK)與ELISpot分析盤(Millipore,Herts,UK)。用PBS(磷酸鹽緩衝生理食鹽水)3次洗滌分析盤，然後添加補充1%牛血清白蛋白之PBS並反應。用AIM-V培養基洗滌後，以100μl/孔分配AIM-V培養基稀釋之供體細胞(4-6x106細胞/ml)。添加試驗樣本各50μl(n=6)以使最終濃度為50μg/ml(n=6)。培養8天後，依序將生物素標記IL-2檢測抗體及鹼性磷酸酶標記鏈黴卵白素(streptavidin-AP)(R & D Systems,Abingdon,UK)與ELISpot分析盤結合然後於分析盤添加BCIP/NBT(R&D Systems,Abingdon,UK)而顯現斑點。經由蒸餾水洗滌而完成反應，然後乾燥分析盤。 使用Immunoscan Analyser掃描及分析每孔斑點數(spw)。以2個或更多個SI(SI2,p<0.05)為正值之模擬指數(SI)之試驗閾值為基礎測定離體T細胞活性測量試驗結果。在包含相應於SI1.9之邊界值的情況，分別用(P*)指明。結果，CA促胰島素分泌素-4及促胰島素分泌素-4分別於12%及16%供體中展現正值。然而，於肽內部殘基聚乙二醇化之CA促胰島素分泌素-4只在2%供體中展現正值。另一方 面，於N端聚乙二醇化之促胰島素分泌素-4在6%供體中展現正值。據此，如果聚乙二醇化產生在肽之內部離胺酸而不是N端，則顯著抑制肽之免疫原性(表2至4)。表4顯示T-細胞之介白素-2(IL-2)分泌反應強度及頻率(包含SI1.9邊界值)。
上述結果顯示透過生理活性蛋白質或肽之 內部殘基而非端點而結合非肽基聚合物，特別是PEG，抑制生理活性蛋白質或肽之免疫原性。
實施例7：正常大鼠抗長效促胰島素肽抗體之生成
將實施例3藉由PEG連接CA促胰島素分泌素-4與免疫球蛋白Fc片段而製備之共軛物皮下給藥予正常Sprague Dawley大鼠每星期1次共26星期(低、中或高劑量)，放置經4星期恢復期(n=40~60/組)。給藥之前及給藥期間於第 13、第19及第26星期，及恢復期結束時，收集血液從中分離血清。測定是否產生抗促胰島素肽之抗體。
結果，160隻給予藥物之受試大鼠中，只有 2隻在13星期的恢復期後偵測到抗體。然而，證實這些抗體不是藥物之中和抗體(表5)。表5顯示大鼠(SD大鼠)經26星期給藥之抗體生成。
實施例8：石蟹猴(Cynomolgus monkey)之抗持續胰島素分泌肽抗體之生成試驗
將實施例3藉由PEG連接CA促胰島素分泌素-4與免疫球蛋白Fc片段而製備之共軛物經皮下給藥予石蟹猴每星期1次共26星期，然後放置經4星期恢復期(n=8~12/組)。給藥之前及給藥期間於第12、第19及第26星期，及恢復期結束時，取出血液從中分離血清。測定是否產生抗促胰島素肽之抗體。
結果，所有受試石蟹猴均未測出抗體生成 (表6)。表6顯示石蟹猴經26星期給藥之抗體生成。
實施例9：檢測血中抗藥物抗體及中和能力評估
為了檢測實施例3之共軛物是否在大鼠或石蟹猴體內生成抗藥物抗體(ADA)，用橋連ELISA方法檢查共軛物。將實施例3之生物素標記共軛物結合鏈黴卵白素偶合於其底部之96-微孔盤，用水洗滌。一起加入實施例3之地谷新(Digoxigenin)(DIG)標記共軛物(下文稱為，HM11260C)及大鼠或猴之血清樣本而反應，然後用水洗滌。然後，添加山葵過氧化酶偶合抗DIG抗體(抗-DIG-POD抗體)並用TMB基質(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺基質)顯色。
大鼠血清的測量靈敏度為3.1ng/ml，猴血清的測量靈敏度為12.5ng/ml。於評估偵測之抗HM11260C抗體對HM11260C之中和能力，將血清樣本及HM11260C添加至人類GLP-1過表達細胞株(GLP-1R/CHO)，然後測量 cAMP-誘導之抑制率。160隻動物中只有2隻產生之抗體證實不具中和力。
上述結果顯示經由結合非肽連接物及Fc片 段於生理活性蛋白質或肽之內部殘基而非端點，降低生理活性蛋白質或肽之免疫原性，因此抑制所需肽充當抗原之機制。該結果亦證實，使用上述製造方法之情況，顯著抑制動物之T細胞活化及抗體生成反應。
由前述之說明，所屬領域熟練之技術人員 應瞭解本發明可用不改變本發明之技術精神或主要特徵之其他具體形式來實現。在這一點，上述具體例係用於說明之目的，且應瞭解不限於此。應理解涵蓋所附權利要求書之含意及範圍衍生之變化及修正形式及其等同物而不只是前述詳細的說明。
<110> 韓美藥品股份有限公司
<120> 降低蛋白質及肽之免疫原性之方法
<130> OPA15095
<150> KR 10-2014-0068660
<151> 2014-06-05
<160> 5
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰島素Alpha鏈
<400> 1
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胰島素Beta鏈
<400> 2
<210> 3
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 促胰島素分泌素-4(Exendin-4)
<400> 3
<210> 4
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 促胰島素分泌素-3(Exendin-3)
<400> 4
<210> 5
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 調酸素(oxyntomodulin)
<400> 5
由於本案的圖為試驗結果數據，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims (16)

  1. 一種與未結合載體之生理活性蛋白質或肽比較降低生理活性蛋白質或肽之免疫原性之方法，該方法包括結合載體與生理活性蛋白質或肽之非端點、內部殘基。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該載體係選自下列者所構成之群組：聚乙二醇、脂肪酸、膽固醇、白蛋白或其片段、白蛋白結合物質、具有特殊胺基酸序列重複單元之聚合物、抗體、抗體片段、FcRn結合物質、體內結締組織或其衍生物、核苷酸、纖網蛋白、運鐵蛋白、類彈性蛋白多肽(ELP)、XTEN多肽、羧基端肽(CTP)、結構誘導探針(SIP)、醣類及高分子量聚合物。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中FcRn結合物質包含免疫球蛋白Fc區。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中生理活性蛋白質或肽與載體藉由插入其間之連接物而結合。
  5. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該連接物為非肽基連接物。
  6. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該非肽基連接物係選自下列者所構成之群組：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸及其組合。
  7. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中生理活性蛋白質或肽藉由非肽基聚合物結合免疫球蛋白Fc區而該非 肽基聚合物係選自下列者所構成之群組：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙醚、生物可降解聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸及其組合。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該生理活性蛋白質或肽係選自下列者所構成之群組：抗肥胖肽、促胰島素肽或其類似物、瘦素、胰島素、胰島素類似物、昇糖素、人類生長激素、生長激素釋放激素、生長激素釋放肽、干擾素、干擾素受體、群落刺激因子、類昇糖素胜肽諸如GLP-1、GLP-1/昇糖素雙重致效劑、抑胃多肽(GIP)、G蛋白偶聯受體、介白素、介白素受體、酵素、介白素結合蛋白、細胞介素結合蛋白、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、過敏抑制物、細胞壞死醣蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制因子、轉移生長因子、α 1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、脂蛋白-E、紅血球生成因子、高糖基化紅血球生成因子、血管生成素、血紅素、凝血酶、凝血酶受體活化肽、凝血酶調節素、凝血因子VII、VIIa、VIII、IX及XIII、胞漿素原活化物、血纖維蛋白結合肽、脲激酶、鏈球菌激酶、水蛭素、蛋白C、C反應蛋白、腎素抑制劑、膠原酶抑制物、超氧化物歧化酶、血小板衍生生長因子、上皮細胞生長因子、表皮細胞生長因子、血管抑制素、血管收縮素、骨生長因子、骨刺激蛋白、降血鈣素、心房肽、軟骨誘導 因子、依降鈣素(elcatonin)、結締組織活化因子、組織因子路徑抑制物、濾泡刺激素、黃體激素、黃體激素釋放激素、神經生長因子、副甲狀腺素、鬆弛素、胰泌素、體介素、類胰島素生長因子、腎上腺皮質素、昇糖素、膽囊收縮素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促腎上腺皮質素釋放因子、促甲狀腺激素、自毒素、乳鐵素、肌骨素、受體、受體拮抗劑、細胞表面抗原、病毒衍生疫苗抗原、單株抗體、多株抗體及抗體片段。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該生理活性蛋白質或肽係選自促胰島素分泌素-4、促胰島素分泌素-4衍生物、GLP-1致效劑、胰島素及GLP-1/昇糖素雙重致效劑所構成之群組。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中促胰島素分泌素-4衍生物為促胰島素分泌素-4之N端電荷經修飾之促胰島素分泌素-4衍生物，其係選自下列者所構成之群組：促胰島素分泌素-4之N端胺基經刪除之促胰島素分泌素-4衍生物；促胰島素分泌素-4之N端胺基經羥基取代之促胰島素分泌素-4衍生物；促胰島素分泌素-4之N端胺基經羧基取代之促胰島素分泌素-4衍生物；促胰島素分泌素-4之N端胺基經二甲基修飾之促胰島素分泌素-4衍生物；及促胰島素分泌素-4之N端組胺酸殘基之α碳經刪除之促胰島素分泌素-4衍生物。
  11. 如申請專利範圍第9項或第10項所述之方法，其中該內部殘基為促胰島素分泌素-4之N端電荷經修飾之促 胰島素分泌素-4衍生物之位置12或27上的離胺酸殘基。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該內部殘基為促胰島素分泌素-4之N端電荷經修飾之促胰島素分泌素-4衍生物之位置27上的離胺酸殘基。
  13. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中促胰島素分泌素-4之N端電荷經修飾之促胰島素分泌素-4衍生物為其中促胰島素分泌素-4之N端組胺酸殘基之α碳經刪除之促胰島素分泌素-4衍生物。
  14. 一種組成物，包括生理活性蛋白質或肽之共軛物其中載體藉由非肽基連接物結合生理活性蛋白質或肽之非端點、內部殘基，其中該共軛物與未結合載體之生理活性蛋白質或肽比較展現降低之免疫原性。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之組成物，其中該共軛物具有降低之免疫原性，而免疫原性為長效製劑之副作用。
  16. 如申請專利範圍第14項所述之組成物，其中該非肽基連接物為聚乙二醇。
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