CN112839681A - 寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物及其医学用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于蛋白质缀合物领域。更具体地，本发明涉及用于治疗代谢紊乱或状况的共价连接有Fc单体多肽的寡聚体延伸的胰岛素，并且涉及产生这类寡聚体延伸的胰岛素‑Fc缀合物的方法。本发明还涉及新型Fc片段、中间产物，并且涉及这类中间产物在合成本发明的寡聚体延伸的胰岛素‑Fc缀合物的方法中的用途。最后，本发明提供了包含本发明的寡聚体延伸的胰岛素‑Fc缀合物的药物组合物，并且涉及这类组合物在治疗或预防与代谢紊乱或状况相关的医学状况中的用途。

Description

寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物及其医学用途
技术领域
本发明属于蛋白质缀合物领域。更具体地，本发明涉及用于治疗代谢紊乱或状况的共价连接有Fc单体多肽的寡聚体延伸的胰岛素，并且涉及产生这类寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物的方法。
本发明还涉及中间产物，并且涉及这类中间产物在合成本发明的寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物的方法中的用途。
最后，本发明提供了包含本发明的寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物的药物组合物，并且涉及这类组合物在治疗或预防与代谢紊乱或状况相关的医学状况中的用途。
背景
寡聚体延伸的胰岛素是通过用寡聚体(由氨基酸残基组成)延伸胰岛素的A链和/或B链而产生的胰岛素。
Fc融合蛋白(有时被称为肽体)是通常通过融合(即，连接原本编码单独蛋白质的两个或更多个基因)生物活性多肽与免疫球蛋白G的片段可结晶区(Fc结构域)而生成的嵌合蛋白，并且融合蛋白通常组合其组成部分的性质，例如，凭借与新生Fc受体FcRn结合而具有长血清半衰期的IgG样性质。
另一方面，蛋白质缀合物是具有“大的”、通常为重组的效应分子(例如IgG-Fc或白蛋白)的化合物，该效应分子经由合成连接体(例如PEG连接体)与治疗性多肽共价结合。蛋白质缀合物可用于多种情况，并且复杂性增加的生物治疗性化合物的鉴定和开发已提高了对用于制备这类化合物的有吸引力的方法的关注。由于蛋白质不像传统化学部分那样稳定，因此连接两个或更多个蛋白质出现了困难，并且传统反应化学可能无法在不损害蛋白质的情况下应用。此外，选择性问题使连接两个或更多个蛋白质变得复杂。
蛋白质和肽的半衰期可以通过与Fc融合而延长。然而，由于胰岛素是双链多肽，其被表达为单链类似物，随后通过酶处理而获得双链多肽，这对于蛋白质融合而言并非理想的。此外，融合仅限于N末端和/或C末端。因此，例如为了通过Fc的作用而延长胰岛素的半衰期，就需要化学缀合。
当缀合两个蛋白质时，连接体的性质至关重要。短连接体可能会影响各自蛋白质的活性。使两个蛋白质过于接近可能会影响分子的生物物理稳定性。可以影响这一点的连接体性质可以是，例如，第二分子上的缀合位置、连接体的长度、连接体的柔性、连接体的极性。在一些情况下，优选柔性连接体，而在其他情况下，需要刚性的连接体。将分子/蛋白质与第二分子缀合可能对缀合物的生物物理性质具有负面影响，这可以通过连接体性质来解决。
WO 2011/122921描述了具有改善的体内持续时间的胰岛素缀合物，该缀合物通过经由亲水性非肽基(例如PEG)连接体共价连接胰岛素与免疫球蛋白Fc区来制备，该连接体在两端具有反应性基团(例如，作为丙醛的醛官能团)，即所谓的同双官能连接体。所用的PEG连接体是多分散性的，其大小为3.4KDa至10KDa，并且多分散性连接体的使用对最终产物的合成和分析造成挑战。
WO 2016/178905描述了融合蛋白，其包含通过使用肽连接体与人IgG Fc区融合的胰岛素受体激动剂。
WO 2016/193380描述了新型胰岛素或胰岛素类似物，其延伸出主要为极性的氨基酸残基的序列，以便改善药物物质的半衰期和稳定性。
获得蛋白质与肽、小分子或延长体(protractor)聚合物之间的位点特异性缀合物的最常见方式为利用Cys的巯基和N末端氨基酸的伯氨基的独特亲核性质，以及Lys侧链的ε-NH2作为反应性处理点。赖氨酸通常富含于蛋白质中(Fc含有超过30个赖氨酸残基)，这限制了赖氨酸作为化学处理点的应用。然而，在胰岛素的情况下，仅存在一个赖氨酸(即在位置B29处)。另一方面，半胱氨酸在蛋白质中不常见，并且通常参与形成二硫键。半胱氨酸可以通过遗传工程而引入。然而，就胰岛素而言，这种修饰已被证明是困难的，特别是由于低表达产率和各种折叠问题。
将两个蛋白质通过它们各自的Cys、N末端氨基或Lys残基而位点特异性地缀合在一起同样具有挑战性。异双官能连接体的使用可以用于该目的。另外，更具挑战性的是缀合如下两个蛋白质的任务，其中一个蛋白质通过源自还原的二硫键的两个硫原子而被连接。
发明内容
与相似的非缀合的和非延伸的类似物相比，本发明的寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物显示出胰岛素受体亲和力降低。胰岛素受体亲和力的这种降低有助于胰岛素-Fc缀合物在循环中的作用延长，因为胰岛素在受体活化后内化并降解。因此，本发明的胰岛素-Fc缀合物的清除率降低。胰岛素受体亲和力的这种降低可能不会导致效力的丧失，例如，如在标准高胰岛素血症血糖钳夹试验中所测量的，并且高FcRn结合和低胰岛素受体亲和力的组合被认为对于获得本发明胰岛素-Fc缀合物的长时间持续作用是有益的。
因此，在其第一方面，本发明提供了由式I表示的新型寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物：
Figure BDA0003014129560000031
其中Ins代表人胰岛素的类似物，该胰岛素类似物为包含A链和B链的双链胰岛素分子，并且该胰岛素类似物包含氨基酸置换A14E、A21G、B25H、B29R和缺失desB30；
其中(GEQP)11-GQE-(aa1)是与所述胰岛素A链的C末端融合的重组延伸体；并且
其中(aa1)不存在或为脯氨酸(P)。
在第二方面，本发明提供了中间体化合物Ins-(GQEP)11-GQE-(aa1)-KP，
其中Ins代表人胰岛素的类似物，该胰岛素类似物为包含A链和B链的双链胰岛素分子，并且该胰岛素类似物包含氨基酸置换A14E、A21G、B25H、B29R和缺失desB30；
其中(GEQP)11-GQE-(aa1)是与所述胰岛素A链的C末端融合的重组延伸体；并且
其中(aa1)不存在或为脯氨酸(P)。
在第三方面，本发明提供了式II的中间体化合物：
Figure BDA0003014129560000041
其中
LG1代表对伯氨基具有反应性的离去基团；且
LG2代表巯基反应性基团的离去基团。
在第四方面，本发明提供了式III的中间体化合物：
Figure BDA0003014129560000051
其中Ins代表人胰岛素的类似物，该胰岛素类似物为包含A链和B链的双链胰岛素分子，并且该胰岛素类似物包含氨基酸置换A14E、A21G、B25H、B29R和缺失desB30；
其中(GEQP)11-GQE-(aa1)是与所述胰岛素A链的C末端融合的重组延伸体；
其中(aa1)不存在或为脯氨酸(P)；且
其中每个LG2代表巯基反应性基团的离去基团。
在第五方面，本发明提供了为226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447 hIgG4-Fc(226-447)的中间体化合物。
在第六方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的胰岛素-Fc缀合物和一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂。
在第七方面，本发明提供了用作药物的本发明的胰岛素-Fc缀合物。
在第八方面，本发明提供了本发明的胰岛素-Fc缀合物，其用于治疗或减轻包括人在内的活动物体的疾病或病症或病况，该疾病、病症或病况可以选自与糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、糖耐量减低、高血糖症、血脂异常、肥胖症、代谢综合征(代谢综合征X、胰岛素抵抗综合征)、高血压、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗死、中风、心血管疾病、冠心病、炎性肠综合征、消化不良或胃溃疡有关的疾病、病症或病况。
本发明的胰岛素-Fc缀合物显示出改善的药代动力学和/或药效学谱。
在本发明的一方面，本发明的化合物显示出增加的药效学效力。
在本发明的另一方面，与目前销售的长效胰岛素相比，本发明的化合物显示出至少两倍增加的药效学效力。
在本发明的另一方面，本发明的化合物具有延长的体内半衰期。
附图说明
图1显示了实施例5.1、5.2和5.3的血糖降低效果。将这些化合物以30nmol/kg的剂量皮下施用于饲养的Sprague-Dawley大鼠。
图2显示了实施例5.1、5.2和5.3的基线校正的血糖降低效果。将这些化合物以30nmol/kg的剂量皮下施用于饲养的Sprague-Dawley大鼠。
图3显示了实施例5.1、5.2和5.3的药代动力学谱。将这些化合物以30nmol/kg的剂量皮下施用于饲养的Sprague-Dawley大鼠。
图4显示了实施例5.1、5.2和5.3的血糖降低效果。将这些化合物以30nmol/kg的剂量皮下施用于饲养的、链脲佐菌素处理的Sprague-Dawley大鼠。
图5显示了实施例5.1、5.2和5.3的基线校正的血糖降低效果。将这些化合物以30nmol/kg的剂量皮下施用于饲养的、链脲佐菌素处理的Sprague-Dawley大鼠。
图6显示了实施例5.1、5.2和5.3的药代动力学谱。将这些化合物以30nmol/kg的剂量皮下施用于饲养的、链脲佐菌素处理的Sprague-Dawley大鼠。
描述
我们在此提供了由式I表示的新型寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物：
Figure BDA0003014129560000071
其中Ins代表人胰岛素的类似物，该胰岛素类似物为包含A链和B链的双链胰岛素分子，并且该胰岛素类似物包含氨基酸置换A14E、A21G、B25H、B29R和缺失desB30；
其中(GEQP)11-GQE-(aa1)是与所述胰岛素A链的C末端融合的重组延伸体；并且
其中(aa1)不存在或为脯氨酸(P)。
胰岛素类似物
人胰岛素由通过两个半胱氨酸二硫键相互连接的两条多肽链组成，即分别为A链(21个氨基酸的肽，SEQ ID NO:1)和B链(30个氨基酸的肽，SEQ ID NO:2)。在A链中存在第三链内二硫键。
本文中，术语胰岛素涵盖天然存在的胰岛素，例如人胰岛素，及其类似物。胰岛素类似物、胰岛素以及A链和B链中的氨基酸位置的编号是相对于人胰岛素进行的。
本文中，术语胰岛素类似物涵盖经修饰的人胰岛素多肽，其通过删除和/或置换(替换)天然胰岛素中存在的一个或多个氨基酸残基，和/或通过添加一个或多个氨基酸残基，而具有在形式上可衍生自天然存在的胰岛素(例如人胰岛素)的结构的分子结构。
在一个实施方案中，胰岛素类似物包含相对于人胰岛素的少于10个氨基酸修饰(置换、缺失、添加(包括插入)及其任何组合)，或者相对于人胰岛素的少于9、8、7或6个修饰。除这些修饰外，本发明的Fc-胰岛素缀合物还包含与胰岛素A链C末端融合的重组延伸体。在本文中，重组延伸体不被定义为胰岛素类似物的一部分。
在本文中，如A1、A2、A3等术语分别表示当从N末端计数时在胰岛素A链中的位置1、2和3。类似地，如B1、B2、B3等术语分别表示当从N末端计数时在胰岛素B链中的位置1、2和3。使用针对氨基酸确立的单字母代码，如A21A、A21G和A21Q等术语分别表示在位置A21处的氨基酸是A、G和Q。使用针对氨基酸确立的三字母代码，其相应的表示分别是AlaA21、GlyA21和GlnA21。
在本文中，如desB30的术语表示缺乏B30氨基酸残基的胰岛素类似物。
术语A22表示处于A21的C端侧的氨基酸的位置。以这种方式，术语A23表示处于A22的C端侧的第一个氨基酸的位置。因此，A24表示处于A23的C端侧的氨基酸的位置，以此类推。以这种方式，A22G,A23G表示A链的C末端已经在位置A21的C端侧延伸了甘氨酸(G)残基，随后是位于位置A22的甘氨酸(G)残基(A22G)的C端侧的甘氨酸(G)残基。
根据本发明的胰岛素类似物是人胰岛素的类似物，该胰岛素类似物包含氨基酸置换A14E、A21G、B25H、B29R和缺失desB30。
在一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物是人胰岛素的类似物，该胰岛素类似物包含氨基酸置换A14E、A21G、B25H、B29R和缺失desB30，并且还进一步包含氨基酸置换B16H或氨基酸置换B16E。
在进一步的实施方案中，根据本发明使用的胰岛素类似物选自以下实例：
[A14E,A21G,B25H,B29R,desB30]人胰岛素(SEQ ID NO:3的A链，SEQ ID NO:4的B链)；
[A14E,A21G,B16H,B25H,B29R,desB30]人胰岛素(SEQ ID NO:3的A链，SEQ ID NO:5的B链)；和
[A14E,A21G,B16E,B25H,B29R,desB30]人胰岛素(SEQ ID NO:3的A链，SEQ ID NO:6的B链)。
寡聚体延伸的胰岛素类似物
本发明的胰岛素-Fc缀合物包含重组延伸体，该延伸体由氨基酸序列GQEP的重复及随后选自GQEKP和GQEPKP的氨基酸序列组成。
根据本发明的重组延伸体是与胰岛素A链C末端融合的延伸体，该延伸体具有氨基酸序列(GQEP)11-GQE-(aa1)-KP，其中(aa1)不存在或为脯氨酸(P)。
在一个实施方案中，该延伸体选自(GQEP)12-KP和(GQEP)11-GQEKP。
在一个实施方案中，该延伸体是(GQEP)12-KP。
在一个实施方案中，该延伸体是(GQEP)11-GQEKP。
应当指出，根据本发明引入的延伸体并非用于、也没有显著贡献于对于本发明胰岛素-Fc缀合物所观察到的延长的半衰期，但在本发明的背景下，延伸体碰巧提供了合适的间隔基团/连接体，从而避免了胰岛素类似物的屏蔽，并且延伸体也有助于更好的(改善的)溶解度和/或改善的糖动力学效力。
寡聚体延伸的融合胰岛素类似物的命名
在本发明的背景下，寡聚体延伸的胰岛素类似物通过说明氨基酸缺失、置换、插入和延伸相对于人胰岛素来命名。
以这种方式，实施例1.1的化合物表示人胰岛素的类似物(A14E,A21G,B25H,B29R,desB30)，其中位于A链的位置A14和A21的天然存在的氨基酸残基已经分别被谷氨酸(E)和谷氨酰胺(Q)所置换，并且其中位于位置B25和B29的天然存在的氨基酸残基已经分别被组氨酸(H)和精氨酸(R)所置换，并且位置B30已经被删除，并且该类似物从氨基酸位置A22开始从A链C末端延伸出由四种氨基酸残基按指定顺序(GQEP)的12个重复组成的延伸体，以构成由总共48个氨基酸残基组成的延伸体(命名为(GQEP)12)，随后为KP。完整的延伸体可以被表示为(GQEP)12-KP(因此赖氨酸被称为A70K)。
这种类似物也可以被表示为A14E,A21G,A22(GQEP)12,A70K,A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素(SEQ ID NO:10的A链和SEQ ID NO:4的B链)，并且该化合物在以下化学式1中示出。A22(GQEP)12因此表示连接至A21的(GQEP)12延伸体，其中该延伸体的第一个氨基酸(即连接至A21的氨基酸，在该实例中为G)对应于位置A22，即在该实例中为A22G。
Figure BDA0003014129560000101
连接体
在本发明的背景下，连接体是用来共价连接所讨论的蛋白质的化学部分或残基。当连接体与蛋白质反应时，形成连接体基团。因此，术语“-连接体-”旨在表示胰岛素-Fc缀合物的化学单元，其与蛋白质缀合物的每个多肽的氨基酸残基共价连接。
根据本发明，连接体用于将胰岛素类似物连接至Fc结构域。Fc结构域由通常通过共价键和/或非共价键(包括多肽间二硫键)保持在一起的两个多肽组成。使用常规二价连接体的共价连接将蛋白质仅连接至一个Fc多肽。然而，使用根据本发明的三价连接体(也称为三触角连接体)，获得两个Fc多肽链均与胰岛素类似物连接的蛋白质缀合物。
本发明的连接体由以下化学式2示出。
Figure BDA0003014129560000102
Figure BDA0003014129560000111
其中#表示与胰岛素的重组延伸体中赖氨酸(K)残基的ε氨基的连接点；而*表示与Fc组分即226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447 hIgG4-Fc(226-447)的位置229处的半胱氨酸(C)残基的硫原子的连接点。
抗体Fc组分
Fc区是IgG重链的C末端区域，其负责与行使包括再循环在内的各种功能的Fc受体结合，这导致半衰期延长。Fc部分通常衍生自IgG，并且缀合物部分通常包括含有新生Fc受体(FcRn)结合位点的免疫球蛋白序列的部分。补救受体FcRn负责免疫球蛋白的再循环及将其返回血液循环。通常引入免疫球蛋白Fc区的突变以改变某些性质，例如，获得增加的FcRn亲和力，获得延长的半衰期，或者减少或增加与其他受体的结合，获得降低的或增加的免疫效应物功能。
基于抗体同种型IgG的氨基酸重链序列的其他小差异，将它们进一步分组为亚类(例如，人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。
在本发明的背景下，术语“Fc区”、“Fc片段”或“Fc结构域”是指抗体的可结晶片段。Fc区是抗体的尾部。对于IgG抗体，Fc区包含两个相同的多肽(即为同型二聚体)，两者均包含重链的第二和第三恒定域(CH2和CH3)。Fc结构域也可以被称为二聚体，因为这两个Fc多肽非共价相互作用并且也可能共价相互作用，因为铰链半胱氨酸可以形成二硫键。在本发明的背景下，Fc结构域的一个Fc(单体)多肽被称为“Fc单体”或“Fc多肽”。同样在本发明的背景下，Fc结构域的蛋白质序列被称为“Fc多肽”，并且至少包含CH2和CH3结构域。
铰链区是抗体恒定区的CH1与CH2之间的蛋白质区段。根据Kabat EU编号，铰链区在IgG1的情况下对应于位置216至238，在IgG4-Fc的情况下对应于位置219至238。铰链区可以进一步分为在IgG1和IgG4的情况下分别对应于位置216至225和位置219至225的上铰链区。在IgG1和IgG4的情况下，核心铰链区均被称为位置226至231，而下铰链区被称为位置232至238。
人抗体的Fc区被糖基化，并且糖基化被认为与C1q相互作用有关，因此通过去除糖基化可以降低C1q结合。此外，非糖基化的Fc与Fcγ受体I、IIa、IIb和IIIa的结合分别减小或弱化，这又导致低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
糖基化可以酶促去除。在大肠杆菌中产生Fc导致非糖基化的Fc。用于制备免疫球蛋白Fc区的这类序列衍生物的技术在本领域中是公知的，并且例如在WO 97/34631和WO96/32478中公开。
本发明的IgG衍生的Fc片段是非糖基化的hIgG4 Fc片段，其天然地与Fcγ受体III弱结合。
根据本发明的Fc组分是226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(226-447)(SEQ ID NO:7)。
Fc组分被修饰，使得Fc多肽的铰链区仅包含一个(天然的)半胱氨酸(C)残基。这是通过在核心铰链位置226处开始本发明的Fc多肽序列并在位置226处置换天然半胱氨酸(C)残基而实现的。第一Fc单体的半胱氨酸能够与位于原始(同型二聚体)Fc多肽的第二单体上的相似半胱氨酸残基形成二硫键，例如，如以下化学式3所示。因此，Fc结构域的Fc多肽可通过二硫键共价连接或非共价连接。
Figure BDA0003014129560000121
如上所述，与本发明Fc多肽的连接经由衍生自Fc多肽中半胱氨酸残基的硫原子(-S-)来发生。
天然人IgG4的铰链核心序列(位置226-231)是CPSCPA(SEQ ID NO:8)。
本发明的铰链核心序列已被修饰，以通过有效去除起始Met而无需额外切割随后的残基，从而使Fc区表达为均质产物。根据本发明的铰链核心序列是AGPCPA(SEQ ID NO:9)。因此，根据本发明使用的IgG4衍生的Fc结构域包含氨基酸修饰226A、227G和228P。
对恒定区进行修饰，以稳定该分子，并改变其一种或多种功能性质，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合、蛋白质稳定性和/或抗原依赖性细胞毒性或上述性质的缺乏。此外，Fc结构域可经化学修饰(例如，一个或多个化学部分可连接至Fc部分)以改变其糖基化，从而改变该抗体的一种或多种功能性质。
根据本发明使用的IgG4衍生的Fc结构域包含氨基酸置换F234A和L235K，这导致对某些Fcγ受体的亲和力降低。
为了改善Fc结构域的化学稳定性，易发生脱酰胺的天冬酰胺可以被谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸置换。本发明的Fc组分包含N297E、N315Q和N384Q置换。
为了改善Fc结构域的物理稳定性，本发明的Fc组分包含L235K置换。
此外，IgG的C末端赖氨酸在人血液中被体内切割，并且从人血液中分离出的内源IgG含有极低水平的C末端赖氨酸。因此，位置447处的C末端赖氨酸缺失，例如，本发明的Fc组分包括des447。
Kabat的EU索引
(Kabat)EU编号方案是基于序列比对开发的、以一致的方式对抗体中的残基进行编号的广泛采用的标准。在本申请的上下文中，根据Kabat的EU索引对Fc链中的残基进行编号(如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)所述)。
根据本发明，始于位置226并且止于位置447的人IgG4-Fc的天然序列被表示为hIgG4-Fc(226-447)。由于Fc由两个相同的多肽组成，因此仅给出一个多肽的序列。如果位置228处的丝氨酸(S)被突变为脯氨酸(P)，则该类似物被表示为228P hIgG4-Fc(226-447)。同样，如果位置226处的半胱氨酸(C)被突变为丙氨酸(A)，位置227处的脯氨酸(P)被突变为甘氨酸(G)，并且位置228处的丝氨酸(S)被突变为脯氨酸(P)，则该产物被表示为226A,227G,228P hIgG4-Fc(226-447)。
如上所述，本发明的胰岛素-Fc缀合物可以被描述为经由上述连接体与胰岛素共价接合的两个单体Fc多肽。
本发明的胰岛素-Fc缀合物
在本发明的背景下，胰岛素-Fc缀合物代表包括经由连接体共价连接的胰岛素类似物和两个Fc单体的化合物。
本发明提供了由式I表示的新型胰岛素-Fc缀合物：
Figure BDA0003014129560000141
其中Ins代表人胰岛素的类似物，该胰岛素类似物为包含A链和B链的双链胰岛素分子，并且该胰岛素类似物包含氨基酸置换A14E、A21G、B25H、B29R和缺失desB30；
其中(GEQP)11-GQE-(aa1)是与所述胰岛素A链的C末端融合的重组延伸体；并且
其中(aa1)不存在或为脯氨酸(P)。
在进一步的实施方案中，根据本发明的胰岛素-Fc缀合物选自以下实例：
(A14E,A21G,A22(GQEP)12,A70K^,A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/(226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(226-447))3,5-双[(2-乙酰基)氨基]苯甲酰基缀合物(实施例5.1的化合物)；
(A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K^,A70P,B16H,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/(226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447 hIgG4-Fc(226-447))3,5-双[(2-乙酰基)氨基]苯甲酰基缀合物(实施例5.2的化合物)；和A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K^,A70P,B16E,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/(226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(226-447))3,5-双[(2-乙酰基)氨基]苯甲酰基缀合物(实施例5.3的化合物)。
本发明的胰岛素-Fc缀合物的命名
在本发明的背景下，为了便于参考，根据构成本发明缀合物的肽组成部分(即胰岛素组分和免疫球蛋白Fc组分)以及连接基团的说明来表示本发明的胰岛素-Fc缀合物。
以这种方式，实施例5.1的胰岛素-Fc缀合物(以下表示为化学式4)(其表示通过A链C末端延伸体连接的缀合物)可被表示为(A14E,A21G,A22(GQEP)12,A70K^,A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/(226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(226-447))3,5-双[(2-乙酰基)氨基]苯甲酰基缀合物，表明该化合物由经由三价连接基团3,5-双[(2-乙酰基)氨基]苯甲酰基缀合的胰岛素组分(即A14E,A21G,A22(GQEP)12,A70K,A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素)和Fc组分(即226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447 hIgG4-Fc(226-447))组成，并且该连接体将胰岛素组分的赖氨酸A98K的ε氨基桥接至-C(O)-，并且将Fc组分多肽的Cys229的每一个巯基桥接至-C(O)-CH2-。
应当指出，A70K^表示连接体与胰岛素的连接点。因此，^表示连接体所连接至的延伸的胰岛素类似中的位置。
Figure BDA0003014129560000161
在化学式4中，显示了两个Fc多肽序列的前三个氨基酸(即A-G-P)，并且放大显示了第四个氨基酸(即Cys)。该Fc多肽的剩余部分(即位置230至447)中的置换和缺失在方括号中示出[例如234A,235K,297E,315Q,384Q,des447]。
中间产物
在进一步的方面，本发明提供了用于制备本发明的胰岛素-Fc缀合物的中间体化合物。
寡聚体延伸的胰岛素类似物
寡聚体延伸的胰岛素类似物可以通过本领域已知的方法获得，例如，如WO 2016/193380中所述。
根据本发明，寡聚体延伸的胰岛素构建体的完整序列仅含有一个赖氨酸(K)残基。
在一个实施方案中，根据本发明使用的中间体化合物是包含与胰岛素A链C末端融合的极性重组延伸体的胰岛素类似物，该延伸体具有氨基酸序列(GQEP)11-GQE-(aa1)-KP，其中aa1不存在或为脯氨酸(P)；并且所述胰岛素是人胰岛素的类似物，该胰岛素类似物包含氨基酸置换A14E、A21G、B25H、B29R和缺失desB30。
在进一步的实施方案中，所述胰岛素类似物进一步包含氨基酸置换B16H或B16E。
在进一步的实施方案中，根据本发明使用的中间体化合物选自以下实例：
A14E,A21G,A22(GQEP)12,A70K,A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素(实施例1.1的化合物)；
A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K,A70P,B16H,B25H,B29R,desB30人胰岛素(实施例1.2的化合物)；和
A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K,A70P,B16E,B25H,B29R,desB30人胰岛素(实施例1.3的化合物)。
Fc片段
本发明的胰岛素-Fc缀合物涉及使用经由连接体与胰岛素共价接合的两个单体Fc多肽。
在进一步的方面，本发明提供了在制备本发明的胰岛素-Fc缀合物中用作中间体化合物的Fc多肽。
根据本发明使用的Fc多肽是226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447 hIgG4-Fc(226-447)。
连接基团
在另一方面，本发明提供了用于制备本发明的胰岛素-Fc缀合物的中间体化合物。
提供了三触角连接体，其中第一个末端能够与式I胰岛素组分的赖氨酸残基的ε氨基形成稳定的共价键，并且该末端不受硫醇或不受蛋白质内其他任何残基的影响。
连接体的第二和第三末端是相同的，并且能够与式I的Fc组分的巯基部分(即-SH)形成稳定的共价键(称为“Cys反应性末端/-i”)。在第一次缀合事件发生(即第一末端与赖氨酸缀合)后，该Cys反应性末端/i可直接反应(使用例如溴乙酰胺或碘乙酰胺、Michael受体等)，或者可适合于化学转化，这样将使它们对第二蛋白质的巯基具有反应性(例如将氯乙酰胺变为碘乙酰胺)，从而以顺序的两步方式提供所需的式I胰岛素-Fc缀合物。
本发明连接体的具体设计(含有两个反应性末端，每个反应性末端包含Sp2杂化碳C原子、CH2基团和卤素(Hlg)原子(表示为(C＝O)-CH2-Hlg)特别适合缀合Fc片段的链间二硫键，因为这些可以容易地且选择性地还原为游离巯基而不干扰其他链内二硫键。
本发明的中间产物代表三触角连接体，该连接体允许借助于异官能连接体的有效的蛋白质-蛋白质缀合。通过使用不同的离去基团，可以控制反应物的连接，并且该中间体在合成方法中特别有用，以便以有序的方式将两个或更多个蛋白质共价连接，从而确保不同的蛋白质可以在连接体的每一端连接。
根据本发明使用的中间体化合物可以用通式II来表征：
Figure BDA0003014129560000181
其中
LG1(其也可称为Lys反应性末端)代表对伯氨基具有反应性的离去基团；并且
LG2(其也可称为Cys反应性末端)代表巯基反应性基团的离去基团。
在本发明的背景下，LG1代表对伯氨基具有反应性的离去基团，例如常用的活性酯的离去基团。这类离去基团包括在肽合成中常规使用的活性酯，包括但不限于：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、磺基-NHS酯、五氟苯酚(PFP)酯、对硝基苯酚(PNP)酯、羟基苯并三唑(HOBt)酯和(羟基亚氨基)氰基乙酸乙酯(Oxyma)。
在一个实施方案中，“Lys反应性末端”(LG1)由琥珀酰亚胺酯(OSu酯)活化的羧酸部分代表，而“Cys反应性末端”LG2各自由碘化物、溴化物或氯化物代表。在位于胰岛素延伸体的末端部分(即第一蛋白质)中的Lys的ε氨基与OSu酯反应并适当纯化后，所得的缀合物与Fc片段(即第二和第三蛋白质)的巯基(在链间二硫键还原后直接形成，或者在氯乙酰胺的情况下，在暴露于高浓度的碘离子后形成)反应，引起所谓的“Finkelstein反应”，该反应导致氯交换为碘，从而生成双碘乙酰胺部分。最终结果是在两个感兴趣的蛋白质之间形成共价的位点特异性缀合物，即式I的胰岛素-Fc缀合物。
在进一步的实施方案中，所述中间产物是化学式5所示的(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-3,5-双[(2-溴乙酰基)氨基]苯甲酸酯：
Figure BDA0003014129560000191
包含连接基团的寡聚体延伸的胰岛素类似物
在一个实施方案中，根据本发明的中间体化合物是由通式III表征的化合物：
Figure BDA0003014129560000201
其中，
其中Ins代表人胰岛素的类似物，该胰岛素类似物为包含A链和B链的双链胰岛素分子，并且该胰岛素类似物包含氨基酸置换A14E、A21G、B25H、B29R和缺失desB30；
其中(GEQP)11-GQE-(aa1)是与所述胰岛素A链的C末端融合的重组延伸体；
其中(aa1)不存在或为脯氨酸(P)；并且
其中每个LG2代表巯基反应性基团的离去基团。
在进一步的实施方案中，每个LG2代表Br。
中间产物的制备方法
根据本发明使用的连接体可以通过标准技术产生，例如，如以下工作实施例所述。
可以分别制备并纯化待缀合的蛋白质和连接体。
在一方面，连接体的一个末端为伯氨基反应性基团，而另一个末端具有两个巯基反应性基团。
在第三个实施方案中，胰岛素的伯氨基与连接体反应，随后与具有两个游离半胱氨酸的Fc反应。
在进一步的实施方案中，Fc通过均来源于还原二硫键的两个硫原子连接。
胰岛素-Fc缀合物的制备方法
在进一步的方面，本发明提供了制备本发明的胰岛素-Fc缀合物的方法。
本发明的方法包括如下(连续的)步骤：
A)制备式II的中间体化合物；
B)将寡聚体延伸的胰岛素类似物构建体偶联至式II的中间体，以获得式III的中间体化合物；
C)还原Fc的链间二硫键以获得两个Fc单体，它们各自保持游离的半胱氨酸；以及
D)将所述两个Fc单体偶联至式III的中间体，以获得式I的胰岛素-Fc缀合物。
通常，分别产生各个组分，即寡聚体延伸的胰岛素类似物组分、Fc组分和连接体，并在合适的反应条件下将它们偶联在一起。
用于并入根据本发明的胰岛素-Fc缀合物中的胰岛素组分可以通过制备胰岛素、胰岛素类似物和胰岛素衍生物的常规方法获得，例如，如WO 2008/034881或WO 2016/193380中所概述的。
可以从分离自人类或动物的全长抗体获得Fc结构域，或者可以重组产生以及从经转化的哺乳动物细胞或微生物中获得Fc结构域。本领域中已知多种获得Fc结构域的技术。
可以通过用蛋白水解酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，由全长抗体产生Fc结构域。可使用亲和色谱法和DEAE阴离子交换色谱法将所得的Fab和F(ab’)2与Fc结构域分离。基于SEC-HPLC分析，可以确定Fc片段的纯度。
当使用重组方法时，可以表达所需的多肽并随后纯化Fc结构域。在一个实施方案中，Fc结构域为人来源的Fc结构域，如从经转化的微生物或哺乳动物细胞中获得的人IgGFc结构域。
另外，本发明的Fc片段可以是具有天然糖链、与天然形式相比增加的糖链或与天然形式相比减少的糖链的形式，或者可以是无糖基化形式。Fc片段的糖链的增加、减少或去除可通过本领域已知的方法如化学法或酶法来实现。另外，在天然糖基化位点位置297处的天冬酰胺可以通过分子工程化突变为例如丙氨酸。在重组DNA技术方法是使用微生物大肠杆菌的情况下，所产生的Fc将是无糖基化的。
当至少一个待缀合的蛋白质包含游离半胱氨酸时，本文所述的方法适合于制备蛋白质缀合物。游离半胱氨酸是可用于经由巯基反应性连接而缀合的半胱氨酸残基。游离Cys通常是不参与蛋白质内二硫键的半胱氨酸残基。游离半胱氨酸常常需要在缀合反应之前释放，因为具有游离Cys的蛋白质可与其他含硫分子形成混合二硫化物，所述其他含硫分子通常是在蛋白质产生和纯化时存在于细胞提取物中的有机小分子。
还可以通过使用还原剂还原现有的二硫键来产生游离半胱氨酸，这将获得两个可用的游离半胱氨酸，所使用的还原剂包括三烷基膦，如TCEP、BSPP等，或硫醇，如DTT、巯基乙醇等。
在一个实施方案中，可以通过还原包含二硫键(邻接Fc结构域的两个单体多肽)的Fc结构域来生成两个等同的半胱氨酸。
在进一步的实施方案中，Fc结构域在Fc结构域的铰链区中(例如在IgG1-Fc多肽或IgG4-Fc多肽片段的位置229)包含单个链间二硫键。可使用本文所述方法将这样的片段与三价连接体的两个臂连接。所得到的蛋白质缀合物(或缀合物中间体)将具有与Fc结构域(Fc多肽)的双官能对称连接，以及与胰岛素组分[Ins-(GQEP)11-GQE(aa1)KP]缀合的第三臂。
如本文所述，连接体经由赖氨酸的ε氨基与胰岛素类似物共价结合。赖氨酸通常富含于蛋白质中，因此不适合选择性缀合。然而，根据本发明使用的胰岛素类似物仅具有一个赖氨酸残基。
在一个实施方案中，使用位于A链延伸体的C末端序列Lys-Pro(KP)末端的赖氨酸残基作为缀合位点。
药物组合物
本发明涉及可用作药物并且特别用于治疗、预防或缓解代谢疾病或病症或病况的胰岛素-Fc缀合物。
包含本发明胰岛素-Fc缀合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯和药学上可接受的辅料的药物组合物可以根据本领域已知的方法来制备。
因此，在另一方面，本发明提供了新型药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的胰岛素-Fc缀合物，以及可选的一种或多种佐剂、辅料、载体和/或稀释剂。
术语“辅料”宽泛地指除活性治疗成分以外的任何组分。辅料可以是惰性物质、无活性物质和/或非药学活性物质。
可注射组合物可以通过使用常规技术来制备，该常规技术通常包括视情况溶解并混合所述成分以得到所需的最终产物，根据需要添加等渗剂、防腐剂和/或缓冲液，并且例如根据需要使用酸如盐酸或碱如氢氧化钠水溶液来调节该溶液的pH值。最后，可以用水调节该溶液的体积以得到所需浓度的成分。
组合物可以是稳定化的制剂。术语“稳定化的制剂”是指具有提高的物理和/或化学稳定性(优选兼具)的制剂。通常，制剂在使用和储存(按照推荐的使用和储存条件)期间必须是稳定的，直到达到失效日期。
可以通过将本发明的胰岛素-Fc缀合物溶解在水性介质中来制备溶液或悬浮液。
治疗方法
本发明涉及用于治疗用途的药物。更具体地，本发明涉及本发明的胰岛素-Fc缀合物在治疗或预防包括人在内的活动物体的代谢疾病或病症或病况中的用途，该方法包括向有需要的这类活动物体施用治疗有效量的根据本发明的胰岛素-Fc缀合物的步骤。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗或减轻与糖尿病有关的医学状况的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或减轻包括人在内的活动物体的疾病或病症或病况的方法，该疾病、病症或病况可以选自与糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、糖耐量减低、高血糖症、血脂异常、肥胖症、代谢综合征(代谢综合征X、胰岛素抵抗综合征)、高血压、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗死、中风、心血管疾病、冠心病、炎性肠综合征、消化不良或胃溃疡有关的疾病、病症或病况，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的胰岛素-Fc缀合物。
在第三个实施方案中，本发明提供了用于治疗或减轻包括人在内的活动物体的疾病或病症或病况的方法，该疾病、病症或病况可以选自与糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、糖耐量减低、高血糖症、血脂异常、肥胖症或代谢综合征(代谢综合征X、胰岛素抵抗综合征)有关的疾病、病症或病况。
在第四个实施方案中，本发明提供了用于治疗或减轻包括人在内的活动物体的疾病或病症或病况的方法，该疾病、病症或病况可以选自与糖尿病，特别是与1型糖尿病或2型糖尿病有关的疾病、病症或病况。
具体实施方案
通过以下本发明的非限制性实施方案进一步描述本发明：
1.由式I表示的胰岛素-Fc缀合物：
Figure BDA0003014129560000241
其中Ins代表人胰岛素的类似物，该胰岛素类似物为包含A链和B链的双链胰岛素分子，并且该胰岛素类似物包含氨基酸置换A14E、A21G、B25H、B29R和缺失desB30；
其中(GEQP)11-GQE-(aa1)是与所述胰岛素A链的C末端融合的重组延伸体；并且
其中(aa1)不存在或为脯氨酸(P)。
2.根据实施方案1的胰岛素-Fc缀合物，其中(aa1)不存在。
3.根据实施方案1的胰岛素-Fc缀合物，其中(aa1)为脯氨酸(P)。
4.根据实施方案1-3中任一项的胰岛素-Fc缀合物，其中Ins是胰岛素类似物[A14E,A21G,B25H,B29R,desB30]人胰岛素。
5.根据实施方案1-3中任一项的胰岛素-Fc缀合物，其中Ins代表进一步包含氨基酸置换B16H或氨基酸置换B16E的胰岛素类似物。
6.实施方案5的胰岛素-Fc缀合物，其中Ins代表选自[A14E,A21G,B25H,B29R,desB30]人胰岛素、[A14E,A21G,B16H,B25H,B29R,desB30]人胰岛素和[A14E,A21G,B16E,B25H,B29R,desB30]人胰岛素的胰岛素类似物。
7.实施方案6的胰岛素-Fc缀合物，其中Ins代表进一步包含B16H置换的胰岛素类似物。
8.实施方案7的胰岛素-Fc缀合物，其中Ins是胰岛素类似物[[A14E,A21G,B16H,B25H,B29R,desB30]人胰岛素。
9.实施方案6的胰岛素-Fc缀合物，其中Ins代表进一步包含B16E置换的胰岛素类似物。
10.实施方案9的胰岛素-Fc缀合物，其中Ins是胰岛素类似物[[A14E,A21G,B16E,B25H,B29R,desB30]人胰岛素。
11.实施方案1的胰岛素-Fc缀合物，其中所述寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物选自
(A14E,A21G,A22(GQEP)12,A70K^,A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/(226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(226-447))3,5-双[(2-乙酰基)氨基]苯甲酰基缀合物；
(A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K^,A70P,B16H,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/(226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447 hIgG4-Fc(226-447))3,5-双[(2-乙酰基)氨基]苯甲酰基缀合物；和
A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K^,A70P,B16E,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/(226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447 hIgG4-Fc(226-447))3,5-双[(2-乙酰基)氨基]苯甲酰基缀合物。
12.实施方案1的胰岛素-Fc缀合物，其中所述寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物是(A14E,A21G,A22(GQEP)12,A70K^,A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/(226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447 hIgG4-Fc(226-447))3,5-双[(2-乙酰基)氨基]苯甲酰基缀合物。
Figure BDA0003014129560000261
13.实施方案1的胰岛素-Fc缀合物，其中所述寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物是(A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K^,A70P,B16H,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/(226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447 hIgG4-Fc(226-447))3,5-双[(2-乙酰基)氨基]苯甲酰基缀合物
Figure BDA0003014129560000271
14.实施方案1的胰岛素-Fc缀合物，其中所述寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物是(A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K^,A70P,B16E,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/(226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447 hIgG4-Fc(226-447))3,5-双[(2-乙酰基)氨基]苯甲酰基缀合物
Figure BDA0003014129560000272
15.中间体化合物Ins-(GQEP)11-GQE-(aa1)-KP，
其中Ins代表人胰岛素的类似物，该胰岛素类似物为包含A链和B链的双链胰岛素分子，并且该胰岛素类似物包含氨基酸置换A14E、A21G、B25H、B29R和缺失desB30；
其中(GEQP)11-GQE-(aa1)是与所述胰岛素A链的C末端融合的重组延伸体；并且
其中(aa1)不存在或为脯氨酸(P)。
16.实施方案15的中间体化合物，其中(aa1)不存在。
17.实施方案15的中间体化合物，其中(aa1)为脯氨酸(P)。
18.实施方案15-17中任一项的中间体化合物，其中所述胰岛素类似物进一步包含氨基酸置换B16H或B16E。
19.实施方案15-18中任一项的中间体化合物，其中所述中间体化合物选自
A14E,A21G,A22(GQEP)12,A70K,A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素(实施例1.1的化合物)；
A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K,A70P,B16H,B25H,B29R,desB30人胰岛素(实施例1.2的化合物)；和
A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K,A70P,B16E,B25H,B29R,desB30人胰岛素(实施例1.3的化合物)。
20.式II的中间体化合物：
Figure BDA0003014129560000281
其中
LG1代表对伯氨基具有反应性的离去基团；且
LG2代表巯基反应性基团的离去基团。
21.实施方案20的中间体化合物，其中所述中间体化合物为(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-3,5-双[(2-溴乙酰基)氨基]苯甲酸酯
Figure BDA0003014129560000282
22.式III的中间体化合物：
Figure BDA0003014129560000291
其中Ins代表人胰岛素的类似物，该胰岛素类似物为包含A链和B链的双链胰岛素分子，并且该胰岛素类似物包含氨基酸置换A14E、A21G、B25H、B29R和缺失desB30；
其中(GEQP)11-GQE-(aa1)是与所述胰岛素A链的C末端融合的重组延伸体；
其中(aa1)不存在或为脯氨酸(P)；并且
其中每个LG2代表巯基反应性基团的离去基团。
23.实施方案22的中间体化合物，其中所述胰岛素类似物进一步包含氨基酸置换B16H或B16E。
24.实施方案22-23中任一项的中间体化合物，其中每个LG2代表Br。
25.实施方案22的中间体化合物，其中所述中间体化合物选自
A14E,A21G,A22(GQEP)12,A70K(N(eps)-3,5-双[(2-溴乙酰基)氨基]苯甲酰基),A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素
Figure BDA0003014129560000301
A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K(N(eps)-3,5-双[(2-溴乙酰基)氨基]苯甲酰基),A70P,B16H,B25H,B29R,desB30人胰岛素
Figure BDA0003014129560000302
和
A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K(N(eps)-3,5-双[(2-溴乙酰基)氨基]苯甲酰基),A70P,B16E,B25H,B29R,desB30人胰岛素
Figure BDA0003014129560000303
26.中间体化合物，其为226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(226-447)。
27.药物组合物，其包含根据实施方案1-14中任一项的胰岛素-Fc缀合物和一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂。
28.根据实施方案1-14中任一项的胰岛素-Fc缀合物，其用作药物。
29.根据实施方案1-14中任一项的胰岛素-Fc缀合物，其用于治疗或减轻包括人在内的活动物体的疾病或病症或病况，该疾病、病症或病况可以选自与糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、糖耐量减低、高血糖症、血脂异常、肥胖症、代谢综合征(代谢综合征X、胰岛素抵抗综合征)、高血压、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗死、中风、心血管疾病、冠心病、炎性肠综合征、消化不良或胃溃疡有关的疾病、病症或病况。
30.治疗、预防或减轻包括人在内的活动物体的代谢疾病或病症或病况的方法，所述方法包括向这类有需要的活动物体施用治疗有效量的根据实施方案1-14中任一项的胰岛素-Fc缀合物的步骤。
实施例
参照以下实施例进一步说明本发明，这些实施例并非意在以任何方式限制所请求保护的本发明的范围。
以下实施例和通用程序涉及在本说明书和合成方案中鉴别的中间体化合物和最终产物。使用以下实施例对本发明化合物的制备进行详细描述，但所描述的化学反应是就其对制备本发明化合物的一般适用性而公开的。
偶尔，所述反应可能并不像所描述的那样适用于包含在本发明公开范围内的每种化合物。本领域技术人员将容易认识到发生这种情况的化合物。在这些情况下，所述反应可以通过本领域技术人员已知的常规改动，即通过干扰基团的适当保护、通过更换成其他常规试剂或通过反应条件的常规修改而成功进行。或者，本文公开的或常规的其他反应将可适用于本发明相应化合物的制备。在所有制备方法中，所有起始材料都是已知的，或者可以从已知的起始材料容易地制备。
所有温度均以摄氏度表示，并且除非另有说明，当提及产量时，所有份数和百分比都以重量计，而当提及溶剂和洗脱液时，所有份数都以体积计。
材料与方法
缩写列表
AOC：曲线上面积
AUC：曲线下面积
BG：血糖
BHK：幼仓鼠肾
BSPP：双(对磺酸基苯基)苯基膦二水合物二钾盐
CV：柱体积
DMF：二甲基甲酰胺
DTT：二硫苏糖醇
ECD：胞外域
EDC：N-乙基-N'-二甲基氨基丙基碳二亚胺
EDTA：乙二胺四乙酸
DIC：二异丙基碳二亚胺
EA：乙醇胺
EtOH：乙醇
HEPES：2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸
HI：人胰岛素
HMWP：高分子量产物
HSA：人血清白蛋白
IGF-1R：胰岛素生长因子1受体
IR：胰岛素受体
IR-A：胰岛素受体同种型A
IR-B：胰岛素受体同种型B
LCMS：液相色谱质谱法
LLOQ：定量下限
MeCN：乙腈
MQ：MiliQ水
NMP：N-甲基吡咯烷酮
OSu：N-羟基琥珀酰亚胺基
PBS：磷酸盐缓冲盐水
PD：药效学
PK：药代动力学
Rt：保留时间
RT：室温
RP：反相
S.c.：皮下
SP：磺基-丙基
SPA：闪烁迫近测定
STZ：链脲佐菌素
TCEP：三(2-羧基乙基)膦
TIV：总离子计数
TFA：三氟乙酸
Tris：三(羟甲基)氨基甲烷或2-氨基-2-羟甲基丙烷-1,3-二醇
WGA：麦胚凝集素
UPLC：超高效液相色谱法
检测和表征的通用方法
LCMS方法1
系统：Agilent 1290infinity系列
UPLC柱：Phenomenex Aeris widepore 3,6μC4 50x2,1mm
检测器：Agilent Technologies LC/MSD TOF 6230(G6230A)
检测器设置：电离方法：Agilent Jet Stream源扫描范围：m/z最小值100，m/z最大值3200线性反射器模式正模式
条件：阶梯梯度：5％至90％B梯度运行时间：10分钟：0-1min 5-20％B，1-7min 20-90％B，7-8min 90％B 8-8.5min 90-5％B 8.5-10min 5％B
流速：0.40ml/min固定柱温：40℃
洗脱液：溶剂A：99.90％H2O，0.02％TFA溶剂B：99.90％CH3CN，0.02％TFA溶剂C：NA
LCMS方法2
系统：Waters Acquity UPLC H-Class SQD2 2000
柱：Acquity UPLC BEH 1.7μC18
Figure BDA0003014129560000341
2,1x50mm。部件编号：186002350
检测器：UV：PDA，SQD 2000
检测器设置：电离方法：ES+扫描范围：500-2000锥孔电压：60V扫描时间：0.5
条件：线性梯度：10％至80％B梯度运行时间：2.50min总运行时间：4min流速：0.3ml/min(0-2,51min)和0.8ml/min(2.51-4.00min)
柱温：40℃ PDA：210-400nm
洗脱液：溶剂A：99.90％H2O，0.1％TFA溶剂B：99.90％CH3CN，0.1％TFA溶剂C：NA
LCMS方法3
LC-系统：Waters Acquity UPLC H级
柱：Waters Acquity BEH,C-18,1.7μm,2.1mm x 50mm
检测器：Waters Xevo G2-XS QTof
检测器设置：电离方法：ES扫描范围：50–4000amu
运行模式：MS分辨率模式正/负：正模式电压：毛细管
3.00kV；样品锥80V，源60V温度：源150℃，脱溶剂化500℃，扫描时间0.500s中间扫描延迟：0.014s
条件：线性梯度：5％至95％B梯度运行时间：4.0分钟总运行时间：7.0分钟流速：0.4ml/min柱温：40℃
洗脱液：溶剂A：99.90％Mq-水，0.1％甲酸溶剂B：99.90％乙腈，0.1％甲酸溶剂C：99.99％MQ水，0.01％TFA
梯度：A 90-0％；B 5-95％，C 5％
结果说明和验证：化合物的实测质量为M/z，其为该化合物的实测分子离子((M+z)/z)。计算质量是所需化合物的分子量。计算M/z是所需化合物的分子量(M+z)/z。纯度：分析物峰的总离子电流(TIC)AUC，总excl溶剂峰AUC的百分比，通过系统软件报告身份：每种分析物质量峰的质量从最高到最低以m/z表示。扫描范围是在所用方法中扫描的范围。检测方法是，例如，线性反射器。
实施例1：本发明的寡聚体延伸的胰岛素化合物的制备
根据本发明使用的寡聚体延伸的融合胰岛素化合物可以通过本领域已知的各种技术来产生，例如，如WO 2016/193380 A1中所述。
实施例1.1：A14E,A21G,A22(GQEP)12,A70K,A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素的制 备
标题化合物是具有(GQEP)12-KP的C末端A链延伸体的胰岛素类似物A14E,A21G,B25H,B29R,desB30人胰岛素(SEQ ID NO:10的A链，SEQ ID NO:4的B链)。
将编码胰岛素的DNA与编码重组延伸体的DNA融合。将DNA克隆到酵母中，表达并收获胰岛素。延伸的胰岛素被表达为单链前体，使用胰蛋白酶将该单链前体切割成双链延伸的胰岛素。
在SP Sepharose上捕获前体：
SP柱(约200mL)用0.5M NaOH再生，并用0.1M柠檬酸pH 3.5平衡。捕获运行(阳离子交换)在20℃下进行。用水1:1稀释酵母上清液，并以10-20mL/min的流速上样。用0.1M柠檬酸pH 3.5洗涤，并用60％EtOH进行洗涤。用0.2M乙酸钠pH 5.5/40％EtOH洗脱该类似物。用水稀释SP合并物(约600ml)两次，并添加50mM甘氨酸。将pH调节至9.3，并添加3-5mg胰蛋白酶/g胰岛素。在UPLC上进行反应。3小时后，添加柠檬酸，将pH调节至3.5，并在50mm 15μGemini柱上纯化。
柱：10μm Gemini C18 50x250mm
Figure BDA0003014129560000361
477ml
缓冲液：A：10ml甲酸/5L 10％w/w乙腈
B：70％w/w乙腈
梯度：10-50％B-缓冲液。
梯度时间：120min。
流速：80ml/min。
通过LCMS(使用LCMS方法1)确定完整质量：
计算的平均质量为10795.0；实测平均质量为10796.0
实施例1.2：A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K,A70P,B16H,B25H, B29R,desB30人胰岛素的制备
标题化合物是具有(GQEP)11-GQEKP的C末端A链延伸体的胰岛素类似物A14E,A21G,B16H,B25H,B29R,desB30人胰岛素。
A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K,A70P,B16H,B25H,B29R,desB30人胰岛素(SEQ ID NO:11的A链，SEQ ID NO:5的B链)按照实施例1.1中描述的程序制备。
通过LCMS(使用LCMS方法1)确定完整质量：
计算的平均质量为10672.0；实测平均质量为10673.0
实施例1.3：A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K,A70P,B16E,B25H, B29R,desB30人胰岛素的制备
标题化合物是具有(GQEP)11-GQEKP的C末端A链延伸体的胰岛素类似物A14E,A21G,B16E,B25H,B29R,desB30人胰岛素。
A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K,A70P,B16E,B25H,B29R,desB30人胰岛素(SEQ ID NO:11的A链，SEQ ID NO:6的B链)按照实施例1.1中描述的程序制备。
通过LCMS(使用LCMS方法1)确定完整质量：
计算的平均质量为10664.4；实测平均质量为10665.0
实施例2：Fc组分的制备
226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(226-447)的制备
将编码MAGP-IgG4 Fc氨基酸序列(225M,226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447,IgG4-Fc(226-447))氨基酸序列的DNA序列插入到修饰的载体(基于pET-11)中，处于T7启动子的控制下，并转化到BL21(DE3)衍生的宿主株中
(AGPCPAPEAKGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFESTYRVVSVLTVLHQDWLQGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESQGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG)
然后从大肠杆菌中作为包涵体高水平地产生226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447 hIgG4-Fc(226-447)(SEQ ID NO:7)。使用蒸馏水将包涵体洗涤两次，并以10mg/ml溶解于6M尿素，10mM DTT，50mM Tris pH 9.0中。将溶解的包涵体快速稀释至重折叠溶液(20mM EA pH 10.0，3.3M尿素，0.125mM半胱氨酸，0.125mM胱氨酸，pH 8.5)中至1mg/mL终浓度过夜。使用AIEX Q Sepharose Fast Flow柱捕获重折叠的蛋白质
缓冲液：A：20mM Tris，pH 8.5，B：20mM Tris，500mM NaCl，pH 8.5
梯度：15-30％，15CV
第二柱阴离子交换Source 30Q
缓冲液：A：20mM His，pH 6.2，B：20mM His，100mM NaCl，pH 8.5
梯度：10-40％，20CV
最后将纯化的Fc分子溶解在10mM Tris pH7.5，30mM NaCl中。
通过LCMS(使用LCMS方法1)确定完整质量：
计算的平均质量为49583.3；实测平均质量为49585.0
实施例3：用于胰岛素类似物衍生化的连接体的制备
(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-3,5-双[(2-溴乙酰基)氨基]苯甲酸酯的合成
Figure BDA0003014129560000381
将3,5-二氨基苯甲酸(0.5g)溶解于5ml无水DMF中。将该反应在冰上冷却，同时在+5℃下在反应中逐滴加入溶解于DMF(1.8mL)中的溴乙酸酐(1.8g)。除去冰浴，并将反应在室温下搅拌4小时。向反应中加入50ml冰冷的水，形成灰色沉淀物。将该混合物在冰箱中储存过夜。滤出沉淀物并用水洗涤。将沉淀物溶解于2-甲基-四氢呋喃(20mL)中，经Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。向残余物中添加N-羟基琥珀酰亚胺(416mg)和DIC(1.0mL)。在室温下搅拌3小时后，将混合物在真空下浓缩。添加乙腈(20mL)并滤出尿素。将滤液在真空下浓缩至约5mL。从乙醚中沉淀。洗涤沉淀物并离心两次。分离的化合物在真空中在氮气流下干燥。
LCMS方法3：m/1：计算值为492.1；实测值为491.9。
实施例4：胰岛素衍生物的制备
实施例4.1中给出了包含寡聚体延伸的胰岛素类似物和连接基团的代表性胰岛素衍生物的制备。除非另有说明，否则实施例4.2-4.3的胰岛素衍生物按照实施例4.1中提供的方法制备。
实施例4.1：A14E,A21G,A22(GQEP)12,A70K(N(eps)-3,5-双[(2-溴乙酰基)氨基]苯 甲酰基),A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素的合成
Figure BDA0003014129560000391
将A14E,A21G,A22(GQEP)12,A70K,A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素(实施例1.1)(400mg)在0.1M Na2CO3(10ml)和乙腈(2ml)中的溶液用1N NaOH调节至pH 11.1。在剧烈搅拌下逐滴加入溶解于NMP(0.5ml)中的实施例3的(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-3,5-双[(2-溴乙酰基)氨基]苯甲酸酯(45mg)。将pH再次调节至11.1。20分钟后，加入另外的在NMP(0.5ml)中的(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-3,5-双[(2-溴乙酰基)氨基]苯甲酸酯(18mg)。40分钟后，用TFA将pH调节至2.0，并加水至40ml。通过RP色谱法进行纯化。
柱：Phenomenex,Gemini-NX,AXIA,5μ,C18,
Figure BDA0003014129560000401
30x250mm
缓冲液：A：0.1％TFA水溶液；B：0.1％TFA的乙腈溶液
梯度：在40分钟内20-50％B
将产物合并物冻干，得到标题化合物，产率为27％。
LCMS方法2：计算质量为11171.5；实测质量：11170.0，Rt 1.31min
实施例4.2：A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K(N(eps)-3,5-双[(2- 溴乙酰基)氨基]苯甲酰基),A70P,B16H,B25H,B29R,desB30人胰岛素的合成
Figure BDA0003014129560000402
按照实施例4.1描述的通用连接体-胰岛素缀合程序，由A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K,A70P,B16H,B25H,B29R,desB30人胰岛素(实施例1.2)和实施例3的(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-3,5-双[(2-溴乙酰基)氨基]苯甲酸酯制备标题化合物。
LCMS方法2：计算质量为11048.4；实测质量：11048.0，Rt 1.26min
实施例4.3：A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K(N(eps)-3,5-双[(2- 溴乙酰基)氨基]苯甲酰基),A70P,B16E,B25H,B29R,desB30人胰岛素的合成
Figure BDA0003014129560000411
按照实施例4.1描述的通用连接体-胰岛素缀合程序，由A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K,A70P,B16E,B25H,B29R,desB30人胰岛素(实施例1.3)和实施例3的(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-3,5-双[(2-溴乙酰基)氨基]苯甲酸酯制备标题化合物。
LCMS方法2：计算质量为11040.4；实测质量：11041.0，Rt 1.31min实施例5：胰岛 素-Fc缀合物的制备
实施例5.1中给出了代表性胰岛素-Fc缀合物的制备。除非另有说明，否则实施例5.2-5.3的胰岛素缀合物按照实施例5.1中提供的方法制备。
实施例5.1：(A14E,A21G,A22(GQEP)12,A70K^,A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/ (226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(226-447))3,5-双[(2-乙 酰基)氨基]苯甲酰基缀合物的制备
Figure BDA0003014129560000421
向在20mM Tris，30mM NaCl，pH 7.5(60ml)中的7.35mg/ml实施例2的226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(226-447)(441mg)中加入EDTA(125mg)。添加溶解于水(1ml)中的BSPP(38mg)，并在室温下温和搅拌18小时。使用412ml G-25fine sephadex脱盐柱将该混合物缓冲液更换为20mM Tris，10mM EDTA pH 7.5。在室温下，向pH 7.6的洗脱合并物(95ml)中逐滴添加溶解于水(5ml)和乙腈(1ml)中的实施例4.1的A14E,A21G,A22(GQEP)12,A70K(N(eps)-3,5-双[(2-溴乙酰基)氨基]苯甲酰基),A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素(100mg)。用1N NaOH将pH调节至7.6，并在室温下搅拌过夜。用水(100ml)稀释该反应，用1N NaOH将pH调节至8.9，电导率为3.05mS/cm，并通过阴离子交换进行纯化。
A缓冲液：20mM Tris，pH 9.0(1.5mS/cm)
B缓冲液：20mM Tris，500mM NaCl，pH 9.0(43mS/cm)
流速：35ml/min
梯度，阶梯：0-30％B经过1CV，30％B 1CV，30-70％B经过4CV，70-90％B经过3CV
将化合物合并物缓冲液更换为水，随后进行冻干。
柱：脱盐柱，400ml Sephadex G-25fine
将产物合并物冻干。产率43％。
LCMS方法1：计算质量：60595.0；实测质量：60596.3
实施例5.2：(A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K^,A70P,B16H,B25H, B29R,desB30人胰岛素)/(226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc (226-447))3,5-双[(2-乙酰基)氨基]苯甲酰基缀合物的制备
Figure BDA0003014129560000431
按照实施例5.1描述的通用胰岛素Fc缀合程序，由实施例4.2的A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K(N(eps)-3,5-双[(2-溴乙酰基)氨基]苯甲酰基),A70P,B16H,B25H,B29R,desB30人胰岛素和实施例2的226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(226-447)合成标题化合物。
LCMS方法1：计算质量：60471.9；实测质量：60473.1
实施例5.3：(A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K^,A70P,B16E,B25H, B29R,desB30人胰岛素)/(226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc (226-447))3,5-双[(2-乙酰基)氨基]苯甲酰基缀合物的制备
Figure BDA0003014129560000441
按照实施例5.1描述的通用胰岛素Fc缀合程序，由实施例4.3的A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K(N(eps)-3,5-双[(2-溴乙酰基)氨基]苯甲酰基),A70P,B16E,B25H,B29R,desB30人胰岛素和实施例2的226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(226-447)合成标题化合物。
LCMS方法1：计算质量：60463.8；实测质量：60465.9
实施例6：在增溶的受体上测量的胰岛素受体亲和力
本发明的胰岛素类似物对人胰岛素受体(IR)的相对结合亲和力通过在闪烁迫近测定(SPA)(根据Glendorf T等人(2008)Biochemistry 47,4743-4751)中的竞争结合来确定，参见表1中的结果。相对于人胰岛素对胰岛素受体A的亲和力(100％)报告亲和力。
简言之，在96孔Optiplates(Perkin-Elmer Life Sciences)中进行人胰岛素标准品和待测胰岛素类似物的稀释系列，随后添加在由100mM HEPES(pH 7.8)、100mM NaCl、10mM MgSO4和0.025％(v/v)吐温20组成的结合缓冲液中的[125I-A14Y]-人胰岛素、抗IR小鼠抗体83-7、增溶的人IR-A(通过麦胚凝集素色谱法从过表达IR-A holoreceptor的幼仓鼠肾(BHK)细胞中半纯化的)和SPA珠(抗小鼠聚乙烯基甲苯SPA珠，GE Healthcare)。将板在22℃下轻轻摇动孵育22-24小时，以2000rpm离心2分钟，并在TopCount NXT(Perkin-ElmerLife Sciences)上进行计数。
根据四参数逻辑模型(Volund A(1978)Biometrics 34 357-365)分析SPA的数据，并且相对于在同一板内测量的人胰岛素标准品的结合亲和力计算所述类似物的结合亲和力。
表1.体外数据
Figure BDA0003014129560000451
数据显示，所有测试的本发明化合物均相对于人胰岛素在0.4％至4.5％的范围内与胰岛素受体结合。这些亲和力被认为在体内给药后足以促进血糖降低。
实施例7：在膜缔合受体上测量的胰岛素和胰岛素样生长因子-1受体亲和力
从用含有人IR-A、IR-B或IGF-IR插入物的pZem219B载体稳定转染的BHK细胞中纯化与膜缔合的人IR和IGF-1R。收获BHK细胞，并在冰冷的缓冲液(25mM HEPES pH 7.4，25mMCaCl2和1mM MgCl2，250mg/L杆菌肽，0.1mM Pefablock)中均化。将匀浆铺在41％(w/v)蔗糖垫上，并在4℃下以95000g离心75分钟。收集质膜，用缓冲液(如上)以1:5稀释，并在4℃下以40000g再次离心45分钟。将沉淀物重悬于最小体积的缓冲液中，并通过针(规格23)抽三次，之后在-80℃下储存直至使用。通过SPA设置中的竞争结合来确定膜缔合的人IR-A、IR-B或IGF-1R中任一个的相对结合亲和力。IR测定在96孔OptiPlates(Perkin-Elmer LifeSciences)中一式两份进行。将膜蛋白与总体积为200pL的测定缓冲液(50mM HEPES，150mMNaCl，5mM MgSO4、0.01％Triton X-100、0.1％(w/v)HSA(Sigma A1887)，不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂)中的50pM[125IA14Y]-人胰岛素、50μg麦胚凝集素(WGA)包被的PVT微球(GEHealthcare)和浓度逐渐增加的配体在温和搅动下于25℃孵育150分钟。通过将板以2000rpm离心2分钟来终止测定，并通过在TopCount NXT(Perkin-Elmer Life Sciences)上进行计数来对结合的放射性进行定量。
除了使用膜缔合的IGF-1R和50pM[125I-Tyr31]-人IGF-1之外，IGF-1R测定基本上与IR结合测定一样进行。根据四参数逻辑模型(
Figure BDA0003014129560000462
A(1978)Biometrics 34 357-365)分析SPA的数据，并且相对于在同一板内测量的人胰岛素标准品的结合亲和力计算待测类似物的结合亲和力。
本发明化合物的IR(A同种型)、IR(B同种型)和IGF-1R结合数据在以下表2中给出。
数据显示，所有测试的本发明化合物均相对于人胰岛素在0.6％至3.1％的范围内与胰岛素受体A和B结合。这些亲和力被认为在体内给药后足以促进血糖降低。此外，数据表明，本发明的化合物与IGF1R结合的亲和力低于与IR-A和IR-B结合的亲和力(0.3％至0.9％)。
表2.胰岛素和胰岛素样生长因子-1受体亲和力
Figure BDA0003014129560000461
实施例8：在大鼠脂肪细胞中的脂肪生成
作为本发明胰岛素缀合物的体外效力的量度，可以使用脂肪生成。从附睾脂肪垫中分离出原代大鼠脂肪细胞，并与3H-葡萄糖在含有例如0.1％无脂肪HSA和本发明的标准品(人胰岛素，HI)或胰岛素缀合物的缓冲液中孵育。标记的葡萄糖以剂量依赖性方式转化为可提取的脂质，从而产生完整的剂量响应曲线。结果表示为本发明胰岛素与标准品(HI)相比的带有95％置信限的相对效力(％)。
数据在以下表3中给出。
数据显示，所有测试的本发明化合物均相对于人胰岛素在0.6％至2.9％的范围内对脂肪生成具有效力。这些亲和力被认为在体内给药后足以促进血糖降低。
表3.在大鼠脂肪细胞中的脂肪生成
以下实施例编号的化合物 脂肪生成相对效力(％)
5.1 2.86
5.2 1.14
5.3 0.64
实施例9：体内PK/PD研究
通过向正常的和链脲佐菌素(STZ)处理的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠皮下(s.c.)给药，在体内测试胰岛素-Fc缀合物。正常大鼠在给药时的体重大约为300g。STZ处理的大鼠在给药时的体重大约为400g，并在给予胰岛素-Fc缀合物前四天用40mg/kg STZ(Sigma-Aldrich，编号S0130)静脉内处理以诱发糖尿病。
大鼠在颈部区域皮下给予30nmol/kg的胰岛素-Fc缀合物的剂量。从舌静脉采集用于血糖和血浆胰岛素分析的血样，直至给药后10天。通过免疫测定(LLOQ＝1000pM)测量胰岛素-Fc浓度，皮下给药后得到的半衰期值在表4中示出。正常大鼠的PK谱在图3中示出，链脲佐菌素处理的大鼠的PK谱在图6中示出。使用Biosen S Line(EKF)测量血糖(BG)，正常大鼠的BG和基线校正的BG谱分别在图1和图2中示出，链脲佐菌素处理的大鼠的BG和基线校正的BG谱分别在图4和图5中示出。另外，表5中显示了10天基线校正的BG谱的曲线上面积(AOCBG)。
表4.向正常的和链脲佐菌素处理的大鼠皮下给予30nmol/kg胰岛素-Fc缀合物后的药代动力学数据(半衰期平均值)。
Figure BDA0003014129560000481
表5.向正常的和链脲佐菌素处理的大鼠皮下给予30nmol/kg胰岛素-Fc缀合物后，直至给药后10天的基线校正血糖谱的曲线上面积(AOCBG，平均值)，以与媒介物的差值给出。
Figure BDA0003014129560000482
数据显示，在正常大鼠中长时间(4-7天)以及在链脲佐菌素处理的大鼠中长达至少10天，本发明的测试化合物非常有效地能够降低血糖。
数据显示，本发明的胰岛素-Fc缀合物在施用于正常的和链脲佐菌素处理的大鼠时均显示出非常长的PK谱。
实施例10：稳定性研究
用于稳定性研究的样品的制备
用于稳定性研究的样品如下制备：称量8-10mg冷冻干燥的物质。将冷冻干燥的物质在预制溶液A(5mM磷酸盐(pH 7.4)，140mM NaCl和70ppm聚山梨醇酯20)中溶解至100μM。使用Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific Inc.)，使用280nm处的吸光度和理论消光系数确定蛋白质浓度。稀释到溶液A中以达到30μM的终浓度。
通过阴离子交换色谱法的纯化
阴离子交换色谱法在配备有荧光检测器(Waters Acquity FLR Detector)的超高效液相色谱系统(Waters Acquity H-Class)上进行。在梯度洗脱模式下使用来自Agilent的尺寸为50×4.6mm的Bio SAX柱，温度保持在30℃。流动相A为5/95(v/v)乙腈/水，含有25mM BIS-TRIS丙烷，pH 7.3，流动相B为5/95(v/v)乙腈/水，含有25mM BIS-TRIS丙烷和350mM NaCl，pH 7.3。进样量为3μL。流速保持在0.5mL/min，采用在3分钟内从10％到47％B的线性梯度，随后是30分钟内从47％到55％B的线性梯度。在331nm的发射波长和280nm的激发波长下检测到峰，并使用来自Waters的EMPOWER 3软件进行数据处理。以API相对于其他所有物质的百分比分析样品的纯度。
报告为Δ纯度％＝纯度％(5℃)-纯度％(30℃)。
通过非变性大小排阻色谱法测定高分子量产物
在配备有UV/Vis检测器(Waters 2489UV/Vis检测器)的高效液相色谱系统(Waters Alliance)上进行非变性大小排阻色谱法。使用Waters
Figure BDA0003014129560000491
BEH
Figure BDA0003014129560000492
3.5μm柱，尺寸为7.8x 300mm，保持在30℃。流动相为50mM磷酸钠(pH 7.0)，50mM NaCl，5％异丙醇(v/v)。进样量为5μL。流速保持在0.5mL/min。使用215nm处的吸光度检测到峰，并使用来自Waters的EMPOWER 3软件进行数据处理。通过将主峰之前洗脱的物质的总积分与主单体峰相关联，分析了样品的高分子量产物(HMWP)。在所有色谱图中，均观察到完全基线分离。
报告为ΔHMWP％＝HMWP％(5℃)-HMWP％(30℃)。
稳定性研究的结果
通过比较在5℃(对照)与30℃(热诱发的应激)下由阴离子交换色谱法得到的纯度和高分子量产物(HMWP)的形成，评价了Fc-胰岛素类似物的稳定性。结果可见表6。观察到应激样品中的纯度比对照中低3-7％。与对照相比，应激样品中HMWP的量减少了0.5-2％，即，在30℃孵育过程中，一些聚集的物质已经解离。
表6.通过阴离子交换色谱法测得的API的纯度和HMWP
Figure BDA0003014129560000501
*由于仪器错误而丢失
实施例11：hFcRn ECD的结合的SPR分析
使用PBS(pH 7.4)(Sigma-Aldrich，目录号D8537)将实施例5.1、5.2和5.3的胰岛素-Fc缀合物的粉末以5mg/ml溶解，然后使用Biacore4000仪器测量在pH 6.0和25℃下hFcRn胞外域对这三种胰岛素-Fc缀合物样品的结合亲和力。
首先，使用1x HBS-EP+(pH 7.4)(GE Healthcare，目录号BR-1006-69)作为运行缓冲液，通过胺偶合，将在10mM乙酸钠(pH 4.5)(GE Healthcare，目录号BR100350)中以10ug/ml稀释的这三种胰岛素-Fc样品和以30ug/ml稀释的野生型hIgG4 Fc(在HEK293细胞中生产，即糖基化的)固定在CMD50L传感器芯片(XanTec Bioanalytics GmbH)上，在每个使用的流动池中的点2或4处以70-90RU。野生型hIgG4 Fc用作对照样品。在每个使用的流动池中，点2、3和4在固定前被以等体积混合的100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和400mM N-乙基-N'-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)激活，并在固定后用1M盐酸乙醇胺-NaOH(pH 8.5)封闭。从Amine Coupling Kit，2型(GE Healthcare，目录号BR100633)获得NHS、EDC和乙醇胺。
接下来，将4000nM以2倍系列稀释度稀释的hFcRn胞外域通过每个使用的流动池注入60秒钟，以使hFcRn胞外域与固定在传感器芯片上的胰岛素-Fc缀合物和野生型hIgG4 Fc样品结合，随后解离180秒。1x PBS-EP+(pH 6.0)用作hFcRn胞外域的稀释缓冲液，并在每个结合循环中以30ul/min的流速用作运行缓冲液。在每个结合循环之后，通过以30ul/min的流速注入1x PBS-EP+(pH 7.4)60秒钟来再生传感器芯片。通过将3mM的0.5M EDTA(pH 8.0)(Invitrogen，目录号15575038)稀释到1x PBS-P+(GE Healthcare，目录号28995084)中来制备1x PBS-EP+(pH 7.4)缓冲液。通过使用约10M HCl将1x PBS-EP+缓冲液的pH从7.4调节到6.0，制备1x PBS-EP+(pH 6.0)缓冲液。使用Biacore4000Evaluation Software 1.0(GEHealthcare)中的1:1结合模型，通过结合曲线的稳态拟合来确定亲和力(平衡解离常数，KD)。
结果在表7中示出。结果表明，与本发明化合物的结合与野生型hIgG4-Fc相当。
表7.在pH 6.0下hFcRn ECD的结合的SPR分析
Figure BDA0003014129560000511
虽然本文已经阐述并描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附权利要求书涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和改变。
Figure IDA0003014129610000011
Figure IDA0003014129610000021
Figure IDA0003014129610000031
Figure IDA0003014129610000041
Figure IDA0003014129610000051
Figure IDA0003014129610000061
Figure IDA0003014129610000071
Figure IDA0003014129610000081

Claims (15)

1.由式I表示的胰岛素-Fc缀合物：
Figure FDA0003014129550000011
其中Ins代表人胰岛素的类似物，该胰岛素类似物为包含A链和B链的双链胰岛素分子，并且该胰岛素类似物包含氨基酸置换A14E、A21G、B25H、B29R和缺失desB30；
其中(GEQP)11-GQE-(aa1)是与所述胰岛素A链的C末端融合的重组延伸体；并且
其中(aa1)不存在或为脯氨酸(P)。
2.根据权利要求1所述的胰岛素-Fc缀合物，其中Ins代表进一步包含氨基酸置换B16H或氨基酸置换B16E的胰岛素类似物。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中Ins代表选自[A14E,A21G,B25H,B29R,desB30]人胰岛素、[A14E,A21G,B16H,B25H,B29R,desB30]人胰岛素和[A14E,A21G,B16E,B25H,B29R,desB30]人胰岛素的胰岛素类似物。
4.根据权利要求1所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物选自
(A14E,A21G,A22(GQEP)12,A70K^,A71P,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/(226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447hIgG4-Fc(226-447))3,5-双[(2-乙酰基)氨基]苯甲酰基缀合物
Figure FDA0003014129550000021
(A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K^,A70P,B16H,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/(226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447 hIgG4-Fc(226-447))3,5-双[(2-乙酰基)氨基]苯甲酰基缀合物
Figure FDA0003014129550000022
和
(A14E,A21G,A22(GQEP)11,A66G,A67Q,A68E,A69K^,A70P,B16E,B25H,B29R,desB30人胰岛素)/(226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447 hIgG4-Fc(226-447))3,5-双[(2-乙酰基)氨基]苯甲酰基缀合物
Figure FDA0003014129550000031
5.中间体化合物Ins-(GQEP)11-GQE-(aa1)-KP，
其中Ins代表人胰岛素的类似物，该胰岛素类似物为包含A链和B链的双链胰岛素分子，并且该胰岛素类似物包含氨基酸置换A14E、A21G、B25H、B29R和缺失desB30；
其中(GEQP)11-GQE-(aa1)是与所述胰岛素A链的C末端融合的重组延伸体；并且
其中(aa1)不存在或为脯氨酸(P)。
6.根据权利要求5所述的中间体化合物，其中所述胰岛素类似物进一步包含氨基酸置换B16H或B16E。
7.式II的中间体化合物：
Figure FDA0003014129550000032
其中
LG1代表对伯氨基具有反应性的离去基团；且
LG2代表巯基反应性基团的离去基团。
8.根据权利要求7所述的中间体化合物，其中所述中间体化合物为(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-3,5-双[(2-溴乙酰基)氨基]苯甲酸酯
Figure FDA0003014129550000041
9.式III的中间体化合物：
Figure FDA0003014129550000042
其中Ins代表人胰岛素的类似物，该胰岛素类似物为包含A链和B链的双链胰岛素分子，并且该胰岛素类似物包含氨基酸置换A14E、A21G、B25H、B29R和缺失desB30；
其中(GEQP)11-GQE-(aa1)是与所述胰岛素A链的C末端融合的重组延伸体；
其中(aa1)不存在或为脯氨酸(P)；并且
其中每个LG2代表巯基反应性基团的离去基团。
10.根据权利要求9所述的中间体化合物，其中所述胰岛素类似物进一步包含氨基酸置换B16H或B16E。
11.中间体化合物，其为226A,227G,228P,234A,235K,297E,315Q,384Q,des447 hIgG4-Fc(226-447)。
12.药物组合物，其包含根据权利要求1-4中任一项的胰岛素-Fc缀合物和一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂。
13.根据权利要求1-4中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其用作药物。
14.根据权利要求1-4中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其用于治疗或减轻包括人在内的活动物体的疾病或病症或病况，该疾病、病症或病况可以选自与糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、糖耐量减低、高血糖症、血脂异常、肥胖症、代谢综合征(代谢综合征X、胰岛素抵抗综合征)、高血压、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗死、中风、心血管疾病、冠心病、炎性肠综合征、消化不良或胃溃疡有关的疾病、病症或病况。
15.治疗、预防或减轻包括人在内的活动物体的代谢疾病或病症或病况的方法，所述方法包括向这类有需要的活动物体施用治疗有效量的根据权利要求1-4中任一项的胰岛素-Fc缀合物的步骤。
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