KR102478588B1 - 신규 중간체 제조를 통한 지속형 약물 결합체의 제조 방법 - Google Patents

신규 중간체 제조를 통한 지속형 약물 결합체의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지속형 약물 결합체의 신규 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 지속형 약물 결합체에 관한 것이다.

Description

신규 중간체 제조를 통한 지속형 약물 결합체의 제조 방법{Novel method for preparing a long-acting drug conjugate using a intermediate}
본 발명은 지속형 약물 결합체 제조를 위한 신규 중간체, 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 지속형 약물 결합체 제조 방법에 관한 것이다.
생리활성 폴리펩타이드는 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거되기 때문에, 약리성분으로 생리활성 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나, 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 생리활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 엄청난 고통을 야기하게 되며 높은 치료비용의 원인이 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 단백질 약물의 지속형 제제는 단백질 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.
단백질을 안정화시키고 단백질 가수분해효소와의 접촉 및 신장 소실을 억제하기 위한 방법으로, 종래에는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol: 이하 "PEG"라 약칭함)과 같이 용해도가 높은 고분자를 단백질 약물 표면에 화학적으로 부가시키는 방법이 사용되어 왔다. 그러나, PEG를 이용하는 방법은 PEG 분자량을 증가시켜 펩타이드 약물의 생체 내 지속시간을 연장할 수 있는 반면, 분자량이 증가할수록 펩타이드 약물의 역가가 현저히 낮아지고, 또한 펩타이드와의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다.
이에, 혈중반감기 증대를 위한 방법으로서, 면역글로불린 단편과 생리활성 폴리펩타이드의 결합체가 이용되어 왔고, 그 제조방법의 개선을 위해 다각도의 연구가 계속되어 왔다(한국공개특허 제10-2014-0109342호).
특히, 제조 공정 단축을 통한 효율적인 지속형 약물 결합체 제조 공정의 개발의 필요성은 꾸준히 대두되어 왔다.
본 발명의 하나의 목적은 지속형 약물 결합체 제조를 위한 신규 중간체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 중간체를 포함하는 지속형 약물 결합체 제조용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 중간체를 이용하는 지속형 약물 결합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 제조방법으로 제조된 지속형 약물 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 양태는 신규한 중간체이다.
하나의 구체예에서, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다:
[화학식 1]
X-L1-O(CH2CH2O)n-L2-R
상기 화학식 1에서,
X는 면역글로불린 Fc영역이고;
L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고;
L2는 -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, -COO-b2-, 또는 -b1-COO-b2-이며, a1, a2, b1 및 b2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고;
n은 10 내지 2400이고;
R은 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데히드, 말레이미드, C6-C20 아릴디설파이드, C5-C20 헤테로아릴디설파이드, 비닐술폰, 티올, 할로겐화 아세트아미드, 석시니미드, p-니트로페닐 카보네이트, 티오에스테르 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나임.
앞선 구체예에 따른 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 상기 화학식 1에서, L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고, L2는 -a1-NHCO- 또는 -a1-NHCO-a2- 이고, a1 및 a2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고, n은 200 내지 250이고, R은 말레이미드인 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 상기 X는 N-말단에 힌지 서열을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역인, 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 상기 X는 하기의 아미노산 서열에서 아미노산 서열이 일부 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 갖도록 변이된 힌지 서열을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역인 것인, 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다:
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 7).
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 상기 힌지 서열은 서열번호 8(Ser-Cys-Pro) 또는 서열번호 9(Pro-Ser-Cys-Pro)의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 상기 L1은 X의 말단에 위치한 아민 또는 티올 반응기에 결합하는 것인, 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 상기 화합물은 하기 화학식 2의 구조를 갖는 것인, 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다:
[화학식 2]
Figure 112021135816999-pat00001
상기 화학식 2에서, n은 200 내지 250임.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 상기 X는 IgG, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM 유래 면역글로불린 Fc 영역인 것인, 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 상기 X는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 유래 면역글로불린 Fc 영역인 것인, 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 상기 X는 이량체의 면역글로불린 Fc 영역인, 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 상기 X는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역인 것인, 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로서, 상기 화합물은 40 내지 250 kDa의 크기를 갖는 것인, 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지속형 약물 결합체 제조용 조성물이다.
하나의 구체예로서, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고, 상기 약물은 생리활성 폴리펩티드인 조성물에 관한 것이다:
[화학식 1]
X-L1-O(CH2CH2O)n-L2-R
*상기 화학식 1에서,
X는 면역글로불린 Fc 영역이고;
L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고;
L2는 -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, -COO-b2-, 또는 -b1-COO-b2-이며, a1, a2, b1 및 b2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고;
n은 10 내지 2400이고;
R은 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데히드, 말레이미드, C6-C20 아릴디설파이드, C5-C20 헤테로아릴디설파이드, 비닐술폰, 티올, 할로겐화 아세트아미드, 석시니미드, p-니트로페닐 카보네이트, 티오에스테르 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나임.
앞선 구체예에 따른 조성물로서, 상기 화학식 1에서,
L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고;
L2는 -a1-NHCO- 또는 -a1-NHCO-a2- 이고;
a1 및 a2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고;
n은 200 내지 250이고;
R은 말레이미드인, 조성물에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 생리활성 폴리펩티드는 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 호중구 증가 인자(G-CSF), 인간 성장 호르몬(hGH), 에리스로포이에틴(EPO), 글루카곤, 인슐린, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 인터페론 수용체, 지프로테인 관련수용체(G protein-coupled receptor), 인터루킨, 인터루킨 수용체, 효소, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, VIII, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 인크레틴, GIP(Gastric inhibitory polypeptide), GLP-1/GIP 이중활성체, GLP-1/GIP/글루카곤 삼중활성체, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물에 관한 것이다.
앞선 구체예에 따른 조성물로서, 상기 조성물의 화합물의 R은 약물의 시스테인과 결합하는 것인, 조성물에 관한 것이다.
앞선 구체예에 따른 조성물로서, 상기 X는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 유래 면역글로불Ÿ Fc 영역인 것인, 조성물에 관한 것이다.
앞선 구체예에 따른 조성물로서, 상기 X는 하기의 아미노산 서열에서 아미노산 서열이 일부 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 갖도록 변이된 힌지 서열을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역인 것인, 조성물에 관한 것이다:
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 7).
본 발명을 구현하는 또 다른 하나의 양태는 지속형 생리활성 폴리펩티드 결합체의 제조방법에 관한 것이다.
하나의 구체예로서, 힌지 서열을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 하기 화학식 3의 링커를 연결하여 제조된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 생리활성 폴리펩티드와 연결하여 결합체를 제조하는 단계를 포함하는, 지속형 생리활성 폴리펩티드 결합체의 제조방법에 관한 것이다:
[화학식 3]
CHO-L1-(OCH2CH2)nO-L2-R
상기 화학식 3에서,
L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고;
L2는 -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, -COO-b2-, 또는 -b1-COO-b2-이며, a1, a2, b1 및 b2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고;
n은 10 내지 2400이고;
R은 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데히드, 말레이미드, C6-C20 아릴디설파이드, C5-C20 헤테로아릴디설파이드, 비닐술폰, 티올, 할로겐화 아세트아미드, 석시니미드, p-니트로페닐 카보네이트, 티오에스테르 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나임.
앞선 구체예에 따른 제조방법으로서, 상기 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역은 환원제의 존재 하에 pH 4.0 내지 8.0에서 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 상기 화학식 3의 링커를 연결하여 제조된 것인, 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 결합체는 pH 5.5 내지 8.0에서 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커와 생리활성 폴리펩티드를 연결하여 제조된 것인, 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 결합체를 제조하는 단계는 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역 및 생리활성 폴리펩티드를 1:1 내지 1:3의 몰비로 반응시키는 것인, 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 제조방법은 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 상기 화학식 3의 링커를 연결하여 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 제조하는 단계; 및 상기 단계에서 제조된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커와 생리활성 폴리펩티드와 연결하여 결합체를 제조하는 단계를 포함하는 것인 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커는 생리활성 폴리펩티드의 시스테인과 연결되는 것인, 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 제조방법은 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 화학식 3의 링커를 연결하여 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 제조하는 단계; 상기 단계에서 제조된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 pH 6.0 내지 8.5의 완충 용액 속에서 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계; 및 상기 단계에서 정제된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커와 생리활성 폴리펩티드를 연결하여 결합체를 제조하는 단계를 포함하는 것인 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 제조하는 단계 후 한외/투석여과를 수행하지 않는 것을 특징으로 하는 것인, 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 결합체를 소수성 상호작용 크로마토그래피로 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 화학식 3에서의 L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고; L2는 -a1-NHCO- 또는 -a1-NHCO-a2- 이며; a1 및 a2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고; n은 200 내지 250이며; R은 말레이미드인 것인, 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 링커는 하기 화학식 4의 구조를 갖는 것인, 제조방법에 관한 것이다:
[화학식 4]
Figure 112021135816999-pat00002
상기 화학식 4에서, n은 200 내지 250임.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 링커는 1 내지 100 kDa의 크기를 갖는 것인, 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 생리활성 폴리펩티드는 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 호중구 증가 인자(G-CSF), 인간 성장 호르몬(hGH), 에리스로포이에틴(EPO), 글루카곤, 인슐린, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 인터페론 수용체, 지프로테인 관련수용체(G protein-coupled receptor), 인터루킨, 인터루킨 수용체, 효소, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, VIII, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 인크레틴, GIP(Gastric inhibitory polypeptide), GLP-1/GIP 이중활성체, GLP-1/GIP/글루카곤 삼중활성체, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 생리활성 폴리펩티드는 GLP-1/GIP/글루카곤 삼중활성체, 글루카곤, 또는 이의 유사체인 것인, 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 생리활성 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 힌지 서열은 하기의 아미노산 서열을 갖는 힌지 서열 중 일부가 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 갖도록 변이된 것인, 제조방법에 관한 것이다:
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 7).
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 힌지 서열은 서열번호 8(Ser-Cys-Pro) 또는 서열번호 9(Pro-Ser-Cys-Pro)의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 유래인, 제조방법에 관한 것이다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 조성물 또는 제조방법으로 제조된 지속형 약물 결합체이다.
본 발명에 따른 신규 중간체를 이용한 지속형 약물 결합체의 제조방법은 기존 정제 공정의 일부 생략에도 불구하고, 높은 수율로 지속형 약물 결합체를 제조할 수 있으므로, 지속형 약물 결합체 생산성을 높일 수 있다.
도 1은 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 구조를 MALDI-TOF 분석한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(α-아미노이소부티르산), Sar(N-메틸글리신), 알파-메틸글루탐산(α-methyl-glutamic acid) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.
알라닌 Ala, A 아르기닌 Arg, R
아스파라긴 Asn, N 아스파르트산 Asp, D
시스테인 Cys, C 글루탐산 Glu, E
글루타민 Gln, Q 글리신 Gly, G
*히스티딘 His, H 이소류신 Ile, I
류신 Leu, L 리신 Lys, K
메티오닌 Met, M 페닐알라닌 Phe, F
프롤린 Pro, P 세린 Ser, S
트레오닌 Thr, T 트립토판 Trp, W
티로신 Tyr, Y 발린 Val, V
본 발명의 하나의 양태는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
X-L1-O(CH2CH2O)n-L2-R
상기 화학식 1에서,
X는 면역글로불린 Fc영역이고;
L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고;
L2는 -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, -COO-b2-, 또는 -b1-COO-b2-이며, a1, a2, b1 및 b2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고;
n은 10 내지 2400이고;
R은 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데히드, 말레이미드, C6-C20 아릴디설파이드, C5-C20 헤테로아릴디설파이드, 비닐술폰, 티올, 할로겐화 아세트아미드, 석시니미드, p-니트로페닐 카보네이트, 티오에스테르 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나임.
본 발명에서, 상기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 지속형 결합체 제조를 위해 제조되는 신규 물질로서, 본원에서는 “중간체(intermediate)” 또는 “중간체 물질(intermediate material)”로 통용될 수 있다.
본 발명의 중간체를 이용한 지속형 약물 결합체 제조방법에서는, 한외/투석여과 및 소수성 상호작용 크로마토그래피로 정제하는 단계를 생략할 수 있으며, 상기 정제 단계의 생략에도 불구하고, 높은 수율로 지속형 약물 결합체를 제조할 수 있는 효과를 갖는다.
구체적으로, 상기 중간체는 면역글로불린 Fc 영역 및 링커가 연결된 형태로서, 상기 화학식 1의 중간체에서, X는 면역글로불린 Fc 영역이고, L1-(OCH2CH2)nO-L2-R은 링커에 해당할 수 있다. 구체적으로, 상기 화학식 1에서, L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고; L2는 -a1-NHCO- 또는 -a1-NHCO-a2- 이고; a1 및 a2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고; n은 200 내지 250이고; R은 말레이미드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 L1은 면역글로불린 Fc 영역과 결합하는 부위로서, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 L1은 X의 말단 혹은 라이신 잔기에 위치한 아민 또는 티올 반응기에 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 R은 중간체와 생리활성 폴리펩티드와 연결되는 부위로, 구체적으로 생리활성 폴리펩티드의 시스테인 또는 N-말단, 라이신 잔기와 같은 아민그룹에 연결될 수 있는 반응기(예를 들어, 티올, 말레이미드, 알데히드 및 숙시니미딜)를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 중간체는 하기 화학식 2의 구조를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
[화학식 2]
Figure 112021135816999-pat00003
상기 화학식 2에서, n은 1 내지 3000, 10 내지 2000, 50 내지 1000, 100 내지 700, 150 내지 300, 또는 200 내지 250임.
구체적으로, 상기 중간체는 40 내지 250 kDa, 80 내지 200kDa, 100 내지 150 kDa의 크기를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 X는 N-말단에 힌지 서열을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역일 수 있고, 구체적으로, 상기 힌지 서열은 하기의 아미노산에서 아미노산 서열이 일부 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 갖도록 변이된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 7).
본 발명의 용어, “면역글로불린 Fc 영역"은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및/또는 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 포함하는 부위를 의미할 수 있고, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 지속형 약물 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있다.
구체적으로, 상기 X는 IgG, IgA, IgD, IgE, 또는 IgM 유래 면역글로불린 Fc 영역일 수 있고, 보다 구체적으로, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 유래 면역글로불린 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 면역글로불린 Fc 영역은 N-말단에 특정 힌지 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, “힌지 서열”은 중쇄에 위치하여 이황화결합(inter disulfide bond)를 통하여 면역글로불린 Fc 영역의 이량체를 형성하는 부위를 의미한다.
본 발명의 용어, “N-말단”은 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노 말단을 의미하는 것으로, 아미노 말단의 최말단, 또는 최말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 이상의 아미노산까지 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 서열을 N-말단에 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상, 상기 힌지 서열은 상기 서열번호 7의 힌지 서열 중 8번째 또는 11번째 시스테인 잔기가 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 힌지 서열은 하나의 시스테인 잔기만을 포함하는, 3 내지 12개의 아미노산으로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 힌지 서열은 다음과 같은 서열을 가질 수 있다: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro, Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys, Glu-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys, Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Pro-Ser-Cys-Pro, Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro, Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys, Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Pro-Ser-Cys. 더욱 구체적으로는 상기 힌지 서열은 서열번호 8(Ser-Cys-Pro) 또는 서열번호 9(Pro-Ser-Cys-Pro)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 X는 힌지 서열의 존재로 면역글로불린 Fc 사슬 두 분자가 이량체를 형성한 형태일 수 있고, 또한, 본 발명의 중간체는 링커의 일 말단이 이량체의 면역글로불린 Fc 영역의 한 사슬에 연결된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 X는 이량체의 면역글로불린 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 X는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
예컨대, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6) 중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다.
예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동등한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 것일 수 있다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포 독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역 반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 더 구체적인 실시 형태에서는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 더 구체적인 실시 형태에서는 인간기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며, 보다 더 구체적인 실시 형태에서는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다. 더욱 더 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역이며, 가장 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 불변영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 구체적으로는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 구체적으로는 보체 의존적 독성(CDC, Complement dependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.
본 발명의 용어, “링커”는 지속형 약물 결합체에서 약물(예를 들어, 생리활성 폴리펩티드) 및 면역글로불린 Fc 영역을 연결하는 일 모이어티로서, 상기 링커는 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커일 수 있다. 구체적으로, 상기 링커는 하기 화학식 3으로 표현되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
[화학식 3]
CHO-L1-(OCH2CH2)nO-L2-R
상기 화학식 3에서,
L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고;
L2는 -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, -COO-b2-, 또는 -b1-COO-b2-이며, a1, a2, b1 및 b2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고;
n은 1 내지 3000, 10 내지 2000, 50 내지 1000, 100 내지 700, 150 내지 300, 또는 200 내지 250이고;
R은 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데히드, 말레이미드, C6-C20 아릴디설파이드, C5-C20 헤테로아릴디설파이드, 비닐술폰, 티올, 할로겐화 아세트아미드, 석시니미드, p-니트로페닐 카보네이트, 티오에스테르 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나임.
상기 링커는 폴리에틸렌글리콜을 포함하고, 폴리에틸렌글리콜의 양 말단에 특정 화학 구조를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 화학식 3에서의 L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고; L2는 -a1-NHCO- 또는 -a1-NHCO-a2- 이며; a1 및 a2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고; n은 200 내지 250이며; R은 말레이미드일 수 있고, 상기 링커는 1 내지 200 kDa, 1 내지 150kDa, 1 내지 100kDa, 1 내지 50kDa, 또는 1 내지 10kDa의 크기를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 링커는 하기 화학식 4의 구조를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
[화학식 4]
Figure 112021135816999-pat00004
상기 화학식 4에서, n은 1 내지 3000, 10 내지 2000, 50 내지 1000, 100 내지 700, 150 내지 300, 또는 200 내지 250일 수 있다.
상기 링커의 일 말단은 면역글로불린 Fc 영역, 구체적으로는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단, 보다 구체적으로는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 위치하는 힌지 서열, 구체적으로 힌지 서열의 프롤린 잔기와 연결되어 중간체를 형성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 용어, "약학적으로 허용되는"은 의약학적 판단의 범위 내에서，과도한 독성，자극, 또는 알레르기 반응 등을 유발하지 않고 원하는 용도에 효과적으로 사용 가능한 물질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용되는 염" 이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산，말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산，숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산，시트르산, 메탄설폰산，포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산，벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속，마그네슘 등의 알칼리 토금속，및 암모늄 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 화학물 또는 잉의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물을 포함한다.
또한, 상기 화합물은 그 치환기에 비대칭 탄소중심(부재탄소)를 가질 경우, 거울상 이성질체(R 또는 S 이성질체), 라세미체, 또는 부분입체이성질체, 또는 이들의 임의의 혼합물의 형태로 존재할 수도 있다. 또한, 상기 화학물은 브릿지된 고리(bridged ring)을 포함할 경우, 엑소 또는 엔도 이성질체로서 존재할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하고, 상기 약물은 생리활성 폴리펩티드인 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
X-L1-O(CH2CH2O)n-L2-R
상기 화학식 1에서,
X는 면역글로불린 Fc영역이고;
L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고;
L2는 -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, -COO-b2-, 또는 -b1-COO-b2-이며, a1, a2, b1 및 b2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고;
n은 1 내지 3000, 10 내지 2000, 50 내지 1000, 100 내지 700, 150 내지 300, 또는 200 내지 250이고;
R은 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데히드, 말레이미드, C6-C20 아릴디설파이드, C5-C20 헤테로아릴디설파이드, 비닐술폰, 티올, 할로겐화 아세트아미드, 석시니미드, p-니트로페닐 카보네이트, 티오에스테르 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나임.
구체적으로, 상기 화학식 1에서, L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고; L2는 -a1-NHCO- 또는 -a1-NHCO-a2- 이고; a1 및 a2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고; n은 200 내지 250이고; R은 말레이미드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 중간체를 포함하는 조성물로서, 지속형 약물 결합체를 제조하는 용도를 갖는다.
구체적으로, 본 발명의 조성물은 링커 및 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 중간체를 포함하므로, 본 발명의 조성물과 생리활성 폴리펩티드를 반응시켜, 상기 중간체의 링커와 생리활성 폴리펩티드가 연결되어 지속형 약물 결합체가 제조될 수 있고, 보다 구체적으로, 링커의 일 말단에 해당하는 상기 화학식 1의 R이 생리활성 폴리펩티드의 시스테인 또는 N-말단, 라이신 잔기와 같은 아민그룹에 결합되어 지속형 약물 결합체가 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 조성물로 제조될 수 있는 지속형 약물 결합체의 생리활성 폴리펩티드는 질환에 대한 약리학적 효과를 나타낼 수 있는 한, 종류, 크기, 유래 등에 관계 없이 본 발명의 범주에 포함될 수 있다. 상기 생리활성 폴리펩티드의 예로는, 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 호중구 증가 인자(G-CSF), 인간 성장 호르몬(hGH), 에리스로포이에틴(EPO), 글루카곤, 인슐린, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 인터페론 수용체, 지프로테인 관련수용체(G protein-coupled receptor), 인터루킨, 인터루킨 수용체, 효소, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, VIII, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 인크레틴, GIP(Gastric inhibitory polypeptide), GLP-1/GIP 이중활성체, GLP-1/GIP/글루카곤 삼중활성체, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 또는 항체 단편일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 생리활성 폴리펩티드는 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 글루카곤, 인슐린, 효소, 인크레틴, GIP(Gastric inhibitory polypeptide), GLP-1/GIP 이중활성체, 또는 GLP-1/GIP/글루카곤 삼중활성체 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 중간체, 또는 이를 포함하는 조성물을 이용하여 지속형 약물 결합체를 제조하는 방법은 링커 및 면역글로불린 Fc 영역이 먼저 연결된 중간체를 생리활성 폴리펩티드와 연결하는 것이므로, 생리활성 폴리펩티드의 구체적인 종류에 구애 받지 않고 중간체와 연결될 수 있는 아미노산 잔기 또는 반응기를 갖는 생리활성 폴리펩티드라면 본 발명의 중간체, 또는 이를 포함하는 조성물을 이용하여 지속형 약물 결합체를 제한 없이 제조할 수 있다.
본 발명에서, 상기 X는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 유래 면역글로불린 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 X는 하기의 아미노산에서 아미노산 서열이 일부 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 갖도록 변이된 힌지 서열을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 7).
본 발명의 조성물을 이용하여 지속형 약물 결합체를 제조할 경우, 한외/투석여과를 수행하지 않고 지속형 약물 결합체를 제조할 수 있고, 선택적으로, 1회의 소수성 상호작용 크로마토그래피 공정을 생략할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 중간체 또는 이를 포함하는 조성물과 약물을 반응시켜 지속형 약물 결합체를 제조할 때, 제조되는 지속형 약물 결합체의 순도는 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 순도의 측정은 당업계에 알려진 방법으로 수행될 수 있고, 구체적으로는 SE-HPLC, RP-HPLC, 및 IE-HPLC에 의한 측정일 수 있으나, 당업계에서 이용되는 임의의 방법으로 측정된 것일 수 있다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 조성물로 제조되는 지속형 약물 결합체의 순도는 SE-HPLC 측정으로는 90% 이상, RP-HPLC 측정으로는 80% 이상, IE-HPLC 측정으로는 85% 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 조성물은 중간체를 안정화하고 지속형 약물 결합체를 제조하는데 필요한 완충액, 안정화제, 보존제, 염 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 조성물을 포함하는 지속형 약물 결합체 제조용 키트를 제공한다. 상기 키트는 지속형 약물 결합체를 제조하기 위한 시약, 설명서 등을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 지속형 약물 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법은 링커를 통해 약물 및 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 지속형 약물 결합체를 제조하는 방법으로서, 구체적으로는 상기 중간체를 약물과 연결하여 지속형 약물 결합체를 제조하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, i) 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 포함하는 링커 및 면역글로불린 Fc 영역을 연결한 후, ii) 상기 면역글로불린 Fc 영역과 연결된 링커를 약물(예를 들어, 생리활성 폴리펩티드 또는 단백질)과 연결하는 순으로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 즉, PEG를 포함하는 링커 및 면역글로불린 Fc 영역을 연결하여 중간체를 제조하는 1단계 이후, 중간체에 약물을 연결하는 2단계로 수행되는, 특정 순서의 지속형 약물 결합체를 제조하는 것을 특징으로 한다. 또는 본 발명의 제조방법은 1단계를 생략하고, 상기 중간체 또는 이를 포함하는 지속형 약물 결합체 제조용 조성물을 약물과 반응시켜 지속형 약물 결합체를 제조하는 2단계만 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 제조방법은 본 출원에서, “역순제법”으로 통용될 수 있다.
본 발명에서는, 중간체를 먼저 제조하고 이를 약물과 결합하는 지속형 약물 결합체 제조방법의 경우, 한외/투석여과 및 소수성 상호작용 크로마토그래피로 정제하는 단계를 생략할 수 있으며, 상기 정제 단계의 생략에도 불구하고, 높은 수율로 지속형 약물 결합체를 제조할 수 있음을 확인하였다.
중간체의 형성 없이 링커와 생리활성 폴리펩티드를 먼저 연결하고, 이후에 면역글로불린 Fc 영역을 연결하는 기존 제법에서는, 생리활성 폴리펩티드가 연결된 링커(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)와 면역글로불린 Fc 영역을 연결할 때, 생리활성 폴리펩티드와 연결된 링커의 정제에 이용되는 평형완충액 및 용출완충액의 낮은 pH 조건(pH 3.0 내외)으로 인해 발생 가능한 응집(aggregation) 위험성 감소 및 반응을 위한 적절한 버퍼를 이용한 pH 조건을 맞춰 주어야 했기 때문에, 링커와 생리활성 폴리펩티드를 연결한 후, 면역글로불린 Fc 영역과 연결하는 공정 전에 한외/투석 여과가 별도의 공정으로 요구되었다. 반면, 링커와 면역글로불린 Fc 영역을 먼저 연결하여 중간체를 제조하는 본 발명의 제조방법에서는, 면역글로불린 Fc 영역과 링커가 연결된 형태를 정제 시 사용되는 버퍼의 pH가 상대적으로 높아 한외/투석여과 공정을 생략하고 생리활성 폴리펩티드와 연결시키는 공정을 수행할 수 있는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 제조방법은 상기 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 제조하는 단계 후 한외/투석여과를 수행하지 않는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 지속형 약물 결합체의 제조 방법에서는 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 정제액의 pH가 후속 반응액의 pH와 큰 차이가 없게 되므로, 한외/투석여과를 수행하지 않고, 약물의 연결을 수행할 수 있다. 한외/투석여과 공정의 생략으로, 농축 단계에서 발생할 수 있는 응집체 불순물 생성 위험을 감소 시키고, 제조 공정을 간소화하여 기술의 상업화 시 비용의 감소 효과 또한 기대할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법은 상기 결합체를 소수성 상호작용 크로마토그래피로 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피는 1회만 수행되는 것일 수 있고, 또는 지속형 약물 결합체의 약물의 성질 및 링커의 종류, 크기에 따라 1회 이상 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법은 고가의 약물의 사용량을 감소시킬 뿐만 아니라, 반응하지 않은 면역글로불린 Fc 영역의 양도 감소시킴에 따라 소수성 상호작용 크로마토그래피의 정제 공정을 전부 또는 일부 생략할 수 있게 하므로, 기존의 방법에 비하여 지속형 약물 결합체 제조에 필요한 원료 및 비용을 절감할 수 있는 효과를 갖는다.
한편, 본 발명에 따른 제조방법은 기존의 지속형 약물 결합체 제조 과정 중에 수행되는 한외/투석여과 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 공정이 생략되고, 최종 정제 공정만 수행(예를 들어, 1차례의 소수성 상호작용 크로마토그래피)됨에도 불구하고, 기존 공정과 대비하여 최종 결합체의 순도가 유지되는 장점을 갖는다. 즉, 본 발명에 따른 제조방법은 일부 정제 공정의 생략에도 불구하고, 최종 순도를 유지할 수 있고, 이로 인해 지속형 약물 결합체 제조의 생산성을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서 지속형 약물 결합체의 순도는 당업계의 공지된 방법으로 측정될 수 있으며, 그 방법의 예시로는 SE-HPLC, RP-HPLC, 또는 IE-HPLC 측정이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제조방법에 의할 경우, 지속형 약물 결합체의 최종 순도는 90% 이상, 구체적으로 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 제조방법은 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 먼저 제조한 후, 생리활성 폴리펩티드와 연결하는 순서를 거쳐 제조함에 따라, 생리활성 폴리펩티드는 물론 면역글로불린 Fc 영역 기준으로도 기존의 방법에 대비하여 높은 수율로 지속형 약물 결합체를 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 기존의 방법으로 지속형 약물 결합체를 제조하는 경우에 비해, 본 발명의 제조 방법으로 지속형 약물 결합체를 제조할 때의 수율이 2배 이상 향상된 것을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명의 제조방법은 힌지 서열을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 하기 화학식 3의 링커를 연결하여 제조된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 약물(생리활성 폴리펩티드)와 연결하여 결합체를 제조하는 단계를 포함하는, 지속형 약물 결합체의 제조방법에 관한 것이다:
[화학식 3]
CHO-L1-(OCH2CH2)nO-L2-R
상기 화학식 3에서,
L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고;
L2는 -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, -COO-b2-, 또는 -b1-COO-b2-이며, a1, a2, b1 및 b2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고;
n은 10 내지 2400이고;
R은 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데히드, 말레이미드, C6-C20 아릴디설파이드, C5-C20 헤테로아릴디설파이드, 비닐술폰, 티올, 할로겐화 아세트아미드, 석시니미드, p-니트로페닐 카보네이트, 티오에스테르 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로,
상기 제조방법은 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 상기 화학식 3의 링커를 연결하여 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 제조하는 단계; 및 상기 단계에서 제조된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커와 생리활성 폴리펩티드를 연결하여 결합체를 제조하는 단계를 포함하는 것일 수 있으며, 또는
상기 제조방법은 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 화학식 3의 링커를 연결하여 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 제조하는 단계; 상기 단계에서 제조된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 pH 6.0 내지 8.5, pH 6.0 내지 8.0, pH 6.0 내지 7.5, pH 6.0 내지 7.0, pH 6.1 내지 6.9, pH 6.2 내지 6.8, 또는 pH 6.3 내지 6.7의 의 완충 용액 속에서 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계; 및 상기 단계에서 정제된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커와 GLP-1 및 생리활성 폴리펩티드를 연결하여 결합체를 제조하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 제조방법에서,
(i) 상기 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역은 환원제의 존재 하에 pH 4.0 내지 8.0, pH 4.5 내지 7.5, pH 5.5 내지 7.5, pH 5.6 내지 7.4, pH 5.7 내지 7.3 또는 pH 5.8 내지 7.2에서 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 상기 화학식 3의 링커를 연결하여 제조된 것; 및/또는
(ii) 상기 결합체는 pH 5.5 내지 8.0, pH 6.0 내지 7.5, 또는 pH 6.5 내지 7.5에서 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커와 생리활성 폴리펩티드를 연결하여 제조된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 제조방법의 상기 결합체를 제조하는 단계는, 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역에 비해 동량이상의 생리활성 폴리펩티드를 반응시키는 것일 수 있고, 구체적으로, 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역: 생리활성 폴리펩티드를 1:1 내지 1:10, 1:1 내지 1:7, 1:1 내지 1:5, 또는 1:1 내지 1:3의 몰비로 반응시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, “단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역”은 하나의 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 하나의 링커가 면역글로불린 Fc 영역과 연결된, 본 발명에 따른 지속형 약물 결합체의 제조 과정 중간에 발생하는 중간체 물질을 의미한다. 즉, 본 발명에서, “단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역”은 “중간체” 또는 “중간체 물질”과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 유래 면역글로불린 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 하기의 아미노산 서열에서 아미노산 서열이 일부 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 갖도록 변이된 힌지 서열을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역일 수 있고, 구체적으로 상기 힌지 서열은 서열번호 8(Ser-Cys-Pro) 또는 서열번호 9(Pro-Ser-Cys-Pro)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 7).
본 발명의 “지속형 약물 결합체”는 체내에서 약리 활성을 나타내는 약물(생리활성 폴리펩티드)이 면역글로불린 Fc 영역과 링커를 통해 연결된 구조를 갖는, 반감기가 증대된 약물 결합체를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 지속형 약물 결합체는 중간체 또는 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역과 약물이 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 약물은 특정 질환에 대한 예방, 치료, 또는 개선의 효과를 나타낼 수 있는 한 특정 물질에 제한되지 않고, 천연형 또는 비천연형 단백질, 효소, 항체, 화합물 등이 될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 약물은 생리활성 폴리펩티드 또는 단백질일 수 있고, 더욱 구체적으로는 상기 생리활성 폴리펩티드는 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 호중구 증가 인자(G-CSF), 인간 성장 호르몬(hGH), 에리스로포이에틴(EPO), 글루카곤, 인슐린, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 인터페론 수용체, 지프로테인 관련수용체(G protein-coupled receptor), 인터루킨, 인터루킨 수용체, 효소, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, VIII, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 인크레틴, GIP(Gastric inhibitory polypeptide), GLP-1/GIP 이중활성체, GLP-1/GIP/글루카곤 삼중활성체, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 또는 항체 단편일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 생리활성 폴리펩티드는 GLP-1/GIP/글루카곤 삼중활성체, 글루카곤, 또는 이의 유사체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더욱 구체적으로, 상기 생리활성 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 생리활성 폴리펩티드의 변이체, 유도체, 및 단편 역시 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명에서 용어, "변이체"는 천연형 생리활성 폴리펩티드와 아미노산 서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, 천연형 생리활성 폴리펩티드와 동일한 기능을 보유한 펩타이드를 의미하며, 천연형 서열에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중에 어느 하나의 방법 또는 이들의 방법의 조합을 통해 제조될 수 있다.
본 발명에서 용어, “유도체”는 상기 천연형 생리활성 폴리펩티드의 일부 아미노산을 부가, 결실 또는 치환의 형태로 변형시켜서, 천연형 생리활성 폴리펩티드와 유사한 활성을 나타내는 펩타이드, 펩타이드 유도체 또는 펩타이드 모방체 등을 포함한다.
*본 발명에서 용어, “단편”은 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지않는 아미노산 (예; D형 아미노산)도 가능할 수 있다.
생리활성 폴리펩티드 변이체, 유도체, 및 단편에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고, N-말단 아미노산 잔기에 탈아미노화 (deamination)된 생리활성 폴리펩티드도 포함된다.
상기 생리활성 폴리펩티드 유도체는 바이오시밀러와 바이오베터 형태를 포함하는데, 바이오시밀러의 예를 들자면 공지 효소와 발현 숙주의 차이, 당화의 양상과 정도의 차이, 특정 위치의 잔기가 해당 효소의 기준 서열에 비추어 볼 때 100% 치환이 아닌 경우, 그 치환 정도의 차이도 본 발명의 지속형 약물 결합체에서 사용할 수 있는 바이오시밀러 효소에 해당한다. 상기 생리활성 폴리펩티드, 변이체, 유도체 및 단편은 유전자 재조합을 통해 동물세포, 대장균, 효모, 곤충세포, 식물세포, 살아있는 동물 등에서 생산할 수 있으며 생산 방법은 이에 한정되지 않으며, 상업적으로 이용 가능한 생리활성 폴리펩티드, 변이체, 유도체 및 단편일 수도 있다.
또한, 상기 생리활성 폴리펩티드, 변이체, 유도체 및 단편과 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 생리활성 폴리펩티드, 변이체, 유도체 및 단편은 재조합 기술에 의해 미생물로부터 수득하거나, 상업적으로 이용가능 한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "상동성(homology)"은, 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성은 두 서열을 육안으로 비교하여 결정할 수도 있으나, 비교대상이 되는 서열을 나란히 배열하여 상동성 정도를 분석해 주는 생물정보 알고리즘(bioinformatic algorithm)을 사용하여 결정할 수 있다. 상기 두 개의 아미노산 서열 사이의 상동성은 백분율로 표시할 수 있다. 유용한 자동화된 알고리즘은 Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, W, USA)의 GAP, BESTFIT, FASTA와 TFASTA 컴퓨터 소프트웨어 모듈에서 이용가능하다. 상기 모듈에서 자동화된 배열 알고리즘은 Needleman & Wunsch와 Pearson & Lipman과 Smith & Waterman 서열 배열 알고리즘을 포함한다. 다른 유용한 배열에 대한 알고리즘과 상동성 결정은 FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST와 CLUSTAL W를 포함하는 소프트웨어에서 자동화되어 있다.
상기 생리활성 폴리펩티드, 변이체, 유도체 및 단편의 서열 및 이를 코딩하는 염기서열의 정보는 NCBI 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다.
상기 치환되거나 추가되는 아미노산은 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep과 Genzyme pharmaceuticals가 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 생리활성 폴리펩티드, 변이체, 유도체 및 단편은 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위하여 이의 N-말단 및/또는 C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 유기단으로 보호되거나, 또는 펩타이드 말단 등에 아미노산이 추가되어 변형된 형태일 수 있다.
특히, 화학적으로 합성한 펩타이드의 경우, N- 및 C-말단이 전하를 띠고 있기 때문에, 이러한 전하를 제거하기 위하여 N-말단을 아세틸화 (acetylation) 및/또는 C-말단을 아미드화 (amidation)할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 펩타이드 그 자체, 이의 염 (예컨대, 상기 펩타이드의 약학적으로 허용가능한 염), 또는 이의 용매화물의 형태를 모두 포함한다. 또한, 펩타이드는 약학적으로 허용되는 임의의 형태일 수 있다.
상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어 "용매화물"은 본 발명에 따른 펩타이드 또는 이의 염이 용매 분자와 복합체를 형성한 것을 말한다.
또한, 본 발명에서 '특정 서열번호로 구성되는 펩타이드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
본 발명의 지속형 약물 결합체 제조방법은 생리활성 폴리펩티드와 면역글로불린 Fc 영역이 링커를 통해 연결된 결합체를 제조하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 링커와 면역글로불린 Fc 영역의 연결은 링커의 일 말단과 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단이 공유 또는 비공유 결합에 의한 것일 수 있으나, 결합 위치나 방식은 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단 프롤린과 링커의 -CHO기의 연결에 의해 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 링커는 하기 화학식 4의 구조를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
[화학식 4]
Figure 112021135816999-pat00005
상기 화학식 4에서, n은 200 내지 250임.
*또한, 상기 링커는 1 내지 200 kDa, 1 내지 150kDa, 1 내지 100kDa, 1 내지 50kDa, 또는 1 내지 10kDa의 크기를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역은 하기 화학식 2의 구조를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[화학식 2]
Figure 112021135816999-pat00006
본 발명의 제조방법은 상기 화학식 2의 구조를 갖는 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 일 말단에 생리활성 폴리펩티드를 연결하는 단계를 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 링커의 면역글로불린 Fc 영역과 연결되지 않은 다른 일 말단은 생리활성 폴리펩티드와 연결되는 것일 수 있고, 구체적으로는 생리활성 폴리펩티드의 -SH기 또는 -SH기를 포함하는 아미노산, 또는 시스테인과 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 지속형 약물 결합체는 다음과 같은 화학식 5의 구조를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[화학식 5]
Figure 112021135816999-pat00007
상기 화학식 5은 좌측부터 생리활성 폴리펩티드, 링커, 및 면역글로불린 Fc 영역이 순차적으로 연결된 구조를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 실시예에서는 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 먼저 제조한 후 생리활성 폴리펩티드와 연결하는 본 발명의 제조방법으로 지속형 약물 결합체를 제조할 경우, 한외/투석여과 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 공정이 생략되고, 최종 정제 공정만 수행(예를 들어, 1차례의 소수성 상호작용 크로마토그래피)됨에도 불구하고, 기존 공정과 대비하여 최종 결합체의 순도가 유지되면서도 수율이 향상되는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 방법으로 제조된, 지속형 약물 결합체를 제공한다.
본 발명의 제조방법으로 제조된 지속형 약물 결합체는 링커 또는 면역글로불린 Fc 영역이 연결되지 않은, 생리활성 폴리펩티드에 비해 증가된 반감기를 나타내므로, 약제의 제조에 유리한 효과를 갖는다.
본 발명의 제조방법으로 제조된 지속형 약물 결합체는 질환의 예방, 치료, 및 개선 용도를 갖는 약제 또는 조성물의 제조에 이용에 이용될 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
비교예: 페길화된 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 영역의 연결에 의한 결합체 제조
페길화된 생리활성 폴리펩타이드를 면역글로불린 Fc 영역과 연결하여 지속형 결합체를 제조하였다.
비교예 1: 페길화된 GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1과 면역글로불린 Fc영역의 연결에 의한 결합체 제조
생리활성 폴리펩타이드(GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1(서열번호 1)의 시스테인(-SH기)에 페길화(PEGylation)시키기위하여, GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1:PEG (말레이미드-10kDa-PEG-알데하이드)를 포함하는 링커(화학식 4)의 몰비를 1:1.0~1.3으로, GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1의 농도를 3 g/L로 하여 약 1시간 반응시켰다. 구체적으로 반응은 이소프로판올을 포함한 50mM Tris(pH 7.5 @6±4℃) 버퍼에서 이루어졌다. 단일 페길화된 GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1을 얻기 위해 상기 반응액을 구연산나트륨과 에탄올이 포함된 평형완충액으로 총 20배 부피가 되게 희석하고 정제하였다. 이 때, SP High Performance(GE Healthcare, 양이온 교환 크로마토그래피)컬럼을 이용하여 구연산나트륨과 에탄올이 포함된 용액과 염화칼륨 농도구배로 단일 페길화된 GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1을 정제하였다. 페길화된 GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1 정제액을 물로 희석한 후, 분리막 한외/투석여과(UF/DF)방법을 통하여 0.1 M 인산칼륨용액으로 완충액교환 및 농축하여 최종 회수농도가 3 g/L이상이 되게 하였다.
상기에서 제조된 단일 페길화된 GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1을 면역글로불린 Fc 영역과 연결하여 지속형 결합체를 다음과 같이 제조하였다.
이 때, 단일 페길화된 GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1의 PEG의 알데하이드기와 면역글로불린 Fc 영역의 아미노말단이 결합하도록 단일 페길화된 GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1과 면역글로불린 Fc영역의 몰비를 1:2로, 총 단백질 농도(GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1 및 면역글로불린 Fc 영역)를 30 g/L로 하여 6±4℃에서 약 12시간 반응시켰다.
결합반응 이후 미 반응된 면역글로불린 Fc 영역을 분리, 제거하기 위해 Butyl 4 Fast Flow (GE Healthcare, 소수성 상호작용 크로마토그래피) 컬럼을 이용하여 정제하였다. 이 때, 반응액에 트리스와 염화나트륨을 투입하였고, 비스트리스가 포함된 용액과 염화나트륨 농도구배로 정제하였다.
이후, Source 15ISO (GE Healthcare) 컬럼을 사용하여, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하였다. 이를 통해, 공정 부산물을 제거하여, 면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1의 결합체를 수득하였다. 이 때, 구연산나트륨이 포함된 버퍼와 황산암모늄의 농도 구배를 이용하여 정제하였다.
비교예 2: 페길화된 글루카곤 아날로그 1와 면역글로불린 Fc영역의 연결에 의한 결합체 제조
생리활성 폴리펩타이드(글루카곤 아날로그 1; 서열번호 4)의 시스테인(-SH기)에 페길화(PEGylation)시키기위하여, 글루카곤 아날로그 1:PEG (말레이미드-10kDa-PEG-알데하이드)를 포함하는 링커(화학식 1)의 몰비를 1:1.3으로, 글루카곤 아날로그 1의 농도를 3 g/L로 하여 약 1시간 반응시켰다. 구체적으로 반응은 이소프로판올을 포함한 50 mM Tris(pH 7.3) 버퍼에서 이루어졌다. 단일 페길화된 글루카곤 아날로그 1을 얻기 위해 상기 반응액을 구연산나트륨과 에탄올이 포함된 평형완충액으로 총 20배 부피가 되게 희석하고 정제하였다. 이 때, SP High Performance(GE Healthcare, 양이온 교환 크로마토그래피) 컬럼을 이용하여 구연산나트륨과 에탄올이 포함된 용액과 염화칼륨 농도구배로 단일 페길화된 글루카곤 아날로그 1을 정제하였다. 페길화된 글루카곤 아날로그 1 정제액을 물로 희석한 후, 분리막 한외/투석여과(UF/DF)방법을 통하여 0.1 M 인산칼륨용액으로 완충액교환 및 농축하여 최종 회수농도가 3 g/L이상이 되게 하였다.
상기에서 제조된 단일 페길화된 글루카곤 아날로그 1을 면역글로불린 Fc 영역과 연결하여 지속형 결합체를 다음과 같이 제조하였다.
이 때, 단일 페길화된 글루카곤 아날로그 1의 PEG의 알데하이드기와 면역글로불린 Fc 영역의 아미노말단이 결합하도록 단일 페길화된 글루카곤 아날로그 1과 면역글로불린 Fc 영역의 몰비를 1:5로, 총 단백질 농도(글루카곤 아날로그 1 및 면역글로불린 Fc 영역)를 20 g/L로 하여 6±4℃에서 약 12시간 반응시켰다.
결합반응 이후 미 반응된 면역글로불린 Fc 영역을 분리, 제거하기 위해 Butyl 4 Fast Flow (GE Healthcare, 소수성 상호작용 크로마토그래피) 컬럼을 이용하여 정제하였다. 이 때, 반응액에 트리스와 염화나트륨을 투입하였고, 비스트리스가 포함된 용액과 염화나트륨 농도구배로 정제하였다.
이후, Source 15ISO (GE Healthcare) 컬럼을 사용하여, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하였다. 이를 통해, 공정 부산물을 제거하여, 면역글로불린 Fc 영역-PEG 링커-글루카곤 아날로그 1의 결합체를 수득하였다. 이 때, 구연산나트륨이 포함된 버퍼와 황산암모늄의 농도 구배를 이용하여 정제하였다.
본 발명자들은 상기 비교예 1 및 2에 따른 결합체 제조 과정에서, 막 투과 공정 및 정제 공정(소수성 상호작용 크로마토그래피, Butyl 4 Fast Flow)을 생략하여 효율적인 결합체 생산이 가능하면서도 제조되는 결합체의 높은 순도를 유지할 수 있는 공정을 다음과 같이 개발하였다.
실시예 1 : 단일 페길화된(mono-PEGylated) 면역글로불린 Fc 영역의 제조
실시예 1-1. 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 제조
N-말단에 Pro-Ser-Cys-Pro 서열의 힌지 영역을 갖는 면역글로불린 Fc 영역(49.8kDa)의 N 말단에 페길화(PEGylation)시키기 위하여, 면역글로불린 Fc 영역:PEG를 포함하는 링커(화학식 4의 구조, 10 kDa)의 몰비를 1:1로, 면역글로불린 Fc 영역의 농도를 50 g/L로 하여 6±4℃에서 약 4시간 반응시켰다.
[화학식 4]
Figure 112021135816999-pat00008
구체적으로, 반응은 5 mM Bis Tris (pH 6.5)와 인산칼륨이 포함된 조성 에서 이루어 졌으며, 10 mM NaCNBH3 (sodium cyanoborohydride) 환원제를 첨가하여 반응시켰다. 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 얻기 위해 상기 반응액을 BisTris 버퍼로 희석하고 정제하였다.
이 때, 양이온 교환 크로마토그래피로 단일 페길화된 옥시토모듈린을 정제했던 비교예의 제조 방법과 달리, Capto Q ImpRes (GE Healthcare, 음이온 교환 크로마토그래피) 컬럼을 이용하여 BisTris 가 포함된 버퍼와 염화나트륨 농도구배로 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 정제하였다.
실시예 1-2. 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 구조 분석
상기 실시예 1-1의 방법으로 제조된, 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 구조를 MALDI-TOF 및 Peptide mapping을 통해 분석하였다. MALDI-TOF 분석 결과 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역 예상 분자량과 일치하였고 (도 1), Peptide mapping 분석 결과 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단에 PEG가 90%이상 페길화된 것을 확인하였다.
한편, 상기 실시예 1-1의 방법으로 제조된 단일 페길화된(Mono-PEGylated) 면역글로불린 Fc 영역 (화학식 2)을 SE-HPLC, RP-HPLC와 IE-HPLC 분석법을 사용하여 분석한 결과, SE-HPLC 측정으로는 90%이상, RP-HPLC 측정으로는 90% 이상, 및 IE-HPLC 측정으로는 80%이상의 순도로 제조된 것을 확인하였다.
[화학식 2]
Figure 112021135816999-pat00009
실시예 2 : 페길화된 면역글로불린 Fc 영역과 생리활성 폴리펩타이드의 연결에 의한 결합체 제조
상기 실시예 1-1에서 제조된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 다양한 생리활성 펩타이드와 연결하여 지속형 결합체를 다음과 같이 제조하였다.
양이온 크로마토그래피로 페길화된 생리활성 폴리펩타이드를 정제한 후 분리막 한외/투석여과(UF/DF) 방법에 의해 페길화된 생리활성 폴리펩타이드를 완충액교환 및 농축했던 비교예의 제조 방법과 달리, 한외/투석여과 없이 peptide conjugation을 통해 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 생리활성 폴리펩타이드와 반응시켰다. 이렇게 제조된 지속형 결합체는 높은 순도로 제조되어 비교예의 제조 방법과 달리, 2차례의 소수성 상호작용 크로마토그래피 중 1차례를 생략할 수 있다.
실시예 2-1. GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1 결합체 제조
실시예 1-1의 음이온 크로마토그래피 후 한외/투석여과 없이 GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1(서열번호 1)의 peptide conjugation 반응을 수행하여 지속형 결합체(면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1를 제조하였다.
[서열번호 1]
Figure 112021135816999-pat00010
이 때, 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 PEG 한 쪽 말단의 말레이미드 반응기와 GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1이 결합하도록 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역과 GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1의 몰비를 1:1로, GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1 단백질 농도를 0.2 g/L로 하여 6±4℃에서 약 2 시간 반응시켰다. 이 때 반응액은 이소프로판올을 포함한 Tris-Cl(6±4℃)버퍼에서 수행되었다. 상기 반응액은 SE-HPLC, RP-HPLC, IE-HPLC 분석법으로 분석하였으며, SE-HPLC 측정으로는 90%이상, RP-HPLC 측정으로는 80% 이상, 및 IE-HPLC 측정으로는 70%이상인 것으로 확인하였다.
이후, 상기 반응물의 결과물로 Source 15ISO (GE Healthcare) 컬럼을 사용하여, 한번의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하였다. 이를 통해, 반응 부산물을 제거하고 면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1의 결합체를 수득하였다. 이 때, 구연산나트륨이 포함된 버퍼와 황산암모늄의 농도 구배를 이용하여 정제하였다. 투입 GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1 대비 수율은 비교예 1의 수율에 비해 2배이상 향상된 것으로 확인하였다.
용출된 면역글로불린 Fc-PEG를 포함하는 링커- GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 1 결합체는 SE-HPLC, RP-HPLC, IE-HPLC, 및 SDS-PAGE 분석법을 사용하여 분석하였으며, SE-HPLC측정으로는 90%이상, RP-HPLC측정으로는 90%이상, 및 IE-HPLC측정으로는 90%이상의 고순도로 제조되었음을 확인하였다.
실시예 2-2. GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 2 결합체 제조
실시예 1-1의 음이온 크로마토그래피 후 한외/투석여과 없이 GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 2(서열번호 2)의 peptide conjugation 반응을 수행하여 지속형 결합체(면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 2))를 제조하였다.
[서열번호 2]
Figure 112021135816999-pat00011
이 때, 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 PEG 한 쪽 말단의 말레이미드 반응기와 GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 2의 시스테인이 결합하도록 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역과 GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 2의 몰비를 1:1로, 삼중활성체 아날로그 2 단백질 농도를 0.2 g/L로 하여 6±4℃에서 약 2시간 반응시켰다. 이 때 반응액은 이소프로판올을 포함하는 Tris-Cl(6±4℃)버퍼에서 수행되었다. 반응 후의 결과물을 SE-HPLC, RP-HPLC, 및 IE-HPLC 분석법으로 분석한 결과, GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 2를 포함하는 지속형 결합체의 순도는 SE-HPLC 측정으로는 90%이상, RP-HPLC 측정으로는 80% 이상, 및 IE-HPLC 측정으로는 70% 이상인 것으로 확인하였다.
이후, 상기 반응물의 결과물로 Source 15ISO (GE Healthcare) 컬럼을 사용하여, 한 번의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하였다. 이를 통해, 반응 부산물을 제거하고 면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커- 삼중활성체 아날로그 2을 수득하였다. 이 때, 구연산나트륨이 포함된 버퍼와 황산암모늄의 농도 구배를 이용하여 정제하였다. 투입 삼중활성체 아날로그 2 대비 수율은 비교예 1의 수율에 비해 상대적으로 약 2배 이상 향상된 것으로 확인하였다.
용출된 면역글로불린 Fc 영역- PEG를 포함하는 링커 - GLP-1/GIP/Glucagon삼중활성체 아날로그 2 결합체는 SE-HPLC, RP-HPLC, IE-HPLC, 및 SDS-PAGE 분석법을 사용하여 분석하였으며, SE-HPLC측정으로는 90%이상, RP-HPLC측정으로는 90%이상, 및 IE-HPLC측정으로는 80%이상의 고순도로 제조되었음을 확인하였다.
실시예 2-3. GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 3 결합체 제조
실시예 1-1의 음이온 크로마토그래피 후 한외/투석여과 없이 GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 3(서열번호 3)의 peptide conjugation 반응을 수행하여 지속형 결합체(면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 3)를 제조하였다.
[서열번호 3]
Figure 112021135816999-pat00012
이 때, 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 PEG의 한 쪽 말단의 말레이마이드반응기와 GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 3의 시스테인이 결합하도록 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역과 GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 3의 몰비를 1:1로, GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 3 단백질 농도를 0.2 g/L로 하여 6±4℃에서 약 2시간 반응시켰다. 이 때 반응액은 이소프로판올을 포함한 Tris-Cl(6±4℃)버퍼에서 수행 되었다. 반응 후의 결과물을 SE-HPLC, RP-HPLC, IE-HPLC 분석법으로 분석한 결과, SE-HPLC 측정으로는 90%이상, RP-HPLC 측정으로는 80% 이상, 및 IE-HPLC 측정으로는 70% 이상인 것으로 확인하였다.
이후, 상기 반응물의 결과물로 Source 15ISO (GE Healthcare) 컬럼을 사용하여, 한 번의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하였다. 이를 통해, 반응 부산물을 제거하고 면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 3의 결합체를 수득하였다. 이 때, 구연산나트륨이 포함된 버퍼와 황산암모늄의 농도 구배를 이용하여 정제하였다. 투입 삼중활성체 아날로그 3 대비 수율은 비교예 1의 수율에 비해 상대적으로 약 2배 이상 향상된 것으로 확인하였다.
용출된 면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커- GLP-1/GIP/Glucagon 삼중활성체 아날로그 3 결합체는 SE-HPLC, RP-HPLC, 및 IE-HPLC 분석법을 사용하여 분석하였으며, SE-HPLC측정으로는 90%이상, RP-HPLC측정으로는 90%이상, 및 IE-HPLC측정으로는 90%이상의 고순도로 제조되었음을 확인하였다.
실시예 2-4. 글루카곤 아날로그 1 결합체 제조
실시예 1-1의 음이온 크로마토그래피 후 한외/투석여과 없이 글루카곤 아날로그 1(서열번호 4)의 peptide conjugation 반응을 수행하여 지속형 결합체(면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-글루카곤 아날로그 1)를 제조하였다.
[서열번호 4]
Figure 112021135816999-pat00013
이 때, 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 PEG 한 쪽 말단의 말레이미드반응기와 글루카곤 아날로그 1이 결합하도록 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역과 글루카곤 아날로그 1의 몰비를 1:1로, 글루카곤 아날로그 1 단백질 농도를 0.2 g/L로 하여 6±4℃에서 약 2시간 반응시켰다. 이 때 반응액은 이소프로판올을 포함한 Tris-Cl(6±4℃)버퍼에서 수행되었다. 반응 후의 결과물을 SE-HPLC, RP-HPLC 및 IE-HPLC 분석법으로 분석한 결과, 면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-글루카곤 아날로그 1의 순도는 SE-HPLC 측정으로는 90%이상, RP-HPLC 측정으로는 70% 이상, 및 IE-HPLC 측정으로는 70%이상인 것으로 확인되었다.
이후, 상기 반응물의 결과물로 Source 15ISO (GE Healthcare) 컬럼을 사용하여, 한번의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하였다. 이를 통해, 반응 부산물을 제거하고 면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-글루카곤 아날로그 1의 결합체를 수득하였다. 이 때, 구연산나트륨이 포함된 버퍼와 황산암모늄의 농도 구배를 이용하여 정제하였다. 투입 글루카곤 아날로그 1 대비 수율은 비교예 2의 수율에 비해 1.5배 이상 향상된 것으로 확인하였다.
용출된 면역글로불린 Fc-PEG를 포함하는 링커- 글루카곤 아날로그 1 결합체는 SE-HPLC, RP-HPLC, 및 IE-HPLC 분석법을 사용하여 분석하였으며, SE-HPLC측정으로는 90%이상, RP-HPLC측정으로는 90%이상, 및 IE-HPLC측정으로는 90%이상 의 고순도로 제조되었음을 확인하였다.
실시예 2-5. 글루카곤 아날로그 2 결합체 제조
실시예 1-1의 음이온 크로마토그래피 후 한외/투석여과 없이 글루카곤 아날로그 2(서열번호 5)의 peptide conjugation 반응을 수행하여 지속형 결합체(면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-글루카곤 아날로그 2)를 제조하였다.
[서열번호 5]
Figure 112021135816999-pat00014
이 때, 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 PEG 한 쪽 말단의 말레이미드 반응기와 글루카곤 아날로그 2가 결합하도록 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역과 글루카곤 아날로그 2의 몰비를 1:1로, 글루카곤 아날로그 2 단백질 농도를 0.2 g/L로 하여 6±4℃에서 약 2시간 반응시켰다. 이 때 반응액은 이소프로판올을 포함한 Tris-Cl(6±4℃)버퍼에서 수행되었다. 반응 후의 결과물을 SE-HPLC, RP-HPLC, 및 IE-HPLC 분석법으로 분석한 결과, 면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-글루카곤 아날로그 2 결합체의 순도는 SE-HPLC 측정으로는 90%이상, RP-HPLC 측정으로는 70% 이상, 및 IE-HPLC 측정으로는 70% 이상인 것으로 확인되었다
이후, 상기 반응물의 결과물로 Source 15ISO (GE Healthcare) 컬럼을 사용하여, 한 번의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하였다. 이를 통해, 반응 부산물을 제거하고 면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-글루카곤 아날로그 2의 결합체를 수득하였다. 이 때, 구연산나트륨이 포함된 버퍼와 황산암모늄의 농도 구배를 이용하여 정제하였다. 투입 글루카곤 아날로그 2 대비 수율은 비교예 2의 수율에 비해 상대적으로 약 1.5배 이상 향상된 것으로 확인하였다.
용출된 면역글로불린 Fc-PEG를 포함하는 링커-글루카곤 아날로그 2 결합체는 SE-HPLC, RP-HPLC 및 IE-HPLC 분석법을 사용하여 분석하였으며, SE-HPLC측정으로는 90%이상, RP-HPLC측정으로는 90%이상, 및 IE-HPLC측정으로는 90% 이상의 고순도로 제조되었음을 확인하였다.
실시예 2-6. 글루카곤 아날로그 3 결합체 제조
실시예 1-1의 음이온 크로마토그래피 후 한외/투석여과 없이 글루카곤 아날로그 3(서열번호 6)의 peptide conjugation 반응을 수행하여 지속형 결합체(면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-글루카곤 아날로그 3)를 제조하였다.
[서열번호 6]
Figure 112021135816999-pat00015
이 때, 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 PEG 한 쪽 말단의 말레이미드 반응기와 글루카곤 아날로그 3의 시스테인이 결합하도록 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역과 글루카곤 아날로그 3의 몰비를 1:1로, 글루카곤 아날로그 3 단백질 농도를 0.2 g/L로 하여 6±4℃에서 약 2시간 반응시켰다. 이 때 반응액은 이소프로판올을 포함한 Tris-Cl(6±4℃)버퍼에서 수행되었다. 반응 후의 결과물을 반응액은 SE-HPLC, RP-HPLC, 및 IE-HPLC 분석법으로 분석한 결과, 면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-글루카곤 아날로그 3 결합체의 순도는 SE-HPLC 측정으로는 90%이상, RP-HPLC 측정으로는 70% 이상, 및 IE-HPLC 측정으로는 70%이상인 것으로 확인되었다.
이후, 상기 반응물의 결과물로 Source 15ISO (GE Healthcare) 컬럼을 사용하여, 한 번의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하였다. 이를 통해, 반응 부산물을 제거하고 면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-글루카곤 아날로그 3의 결합체를 수득하였다. 이 때, 구연산나트륨이 포함된 버퍼와 황산암모늄의 농도 구배를 이용하여 정제하였다. 투입 글루카곤 아날로그 3 대비 수율은 기존 수율에 비해 상대적으로 약 1.5배 이상 향상된 것으로 확인하였다.
용출된 면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커- 글루카곤 아날로그 3 결합체는 SE-HPLC, RP-HPLC, 및 IE-HPLC 분석법을 사용하여 분석하였으며, SE-HPLC측정으로는 90% 이상, RP-HPLC측정으로는 90% 이상, 및 IE-HPLC측정으로는 90% 이상의 고순도로 제조되었음을 확인하였다.
하기 표 1 및 2는 본 발명의 비교예 및 실시예의 방법을 비교한 표이다.
Figure 112021135816999-pat00016
Figure 112021135816999-pat00017
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> HANMI PHARM. CO., LTD. <120> Novel method for preparing a long-acting drug conjugate using a intermediate <130> IKPA200948-KR-D1 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GIP/Glucagon Triple Agonist analog 1 <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <400> 1 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp His His Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Gln Pro Pro Pro Ser Cys 35 40 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GIP/Glucagon Triple Agonist analog 2 <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <400> 2 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp His His Cys Ser 20 25 30 Ser Gly Gln Pro Pro Pro Ser 35 <210> 3 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLP-1/GIP/Glucagon Triple Agonist analog 3 <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <400> 3 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp His His Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Gln Pro Pro Pro Ser Cys 35 40 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glucagon analog 1 <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <400> 4 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys 20 25 30 <210> 5 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glucagon analog 2 <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <400> 5 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Cys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glucagon analog 3 <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <400> 6 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys 20 25 30 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 7 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of hinge region <400> 8 Ser Cys Pro 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of hinge region <400> 9 Pro Ser Cys Pro 1 <210> 10 <211> 221 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 10 Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1]
    X-L1-O(CH2CH2O)n-L2-R
    상기 화학식 1에서,
    X는 N-말단에 서열번호 9(Pro-Ser-Cys-Pro)의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 서열을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역이고;
    L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고;
    L2는 -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, -COO-b2-, 또는 -b1-COO-b2-이며, a1, a2, b1 및 b2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고;
    n은 10 내지 2400이고;
    R은 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데히드, 말레이미드, C6-C20 아릴디설파이드, C5-C20 헤테로아릴디설파이드, 비닐술폰, 티올, 할로겐화 아세트아미드, 석시니미드, p-니트로페닐 카보네이트, 및 티오에스테르로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1에서,
    L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고;
    L2는 -a1-NHCO- 또는 -a1-NHCO-a2- 이고;
    a1 및 a2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고;
    n은 200 내지 250이고;
    R은 말레이미드인, 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  3. 제1항에 있어서, 상기 L1은 서열번호 9의 프롤린(Pro) 잔기와 연결되는 것인, 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  4. 제1항에 있어서, 상기 L1은 X의 말단에 위치한 아민 반응기에 결합하는 것인, 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  5. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 40 내지 250 kDa의 크기를 갖는 것인, 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  6. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물, 이의 입체 이성질체, 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 지속형 약물 결합체 제조용 조성물로서,
    상기 약물은 생리활성 폴리펩티드인 조성물:
    [화학식 1]
    X-L1-(OCH2CH2)nO-L2-R
    상기 화학식 1에서,
    X는 N-말단에 서열번호 9(Pro-Ser-Cys-Pro)의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 서열을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역이고;
    L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고;
    L2는 -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, -COO-b2-, 또는 -b1-COO-b2-이며, a1, a2, b1 및 b2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고;
    n은 10 내지 2400이고;
    R은 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데히드, 말레이미드, C6-C20 아릴디설파이드, C5-C20 헤테로아릴디설파이드, 비닐술폰, 티올, 할로겐화 아세트아미드, 석시니미드, p-니트로페닐 카보네이트, 및 티오에스테르로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나임.
  7. 제6항에 있어서, 상기 화학식 1에서,
    L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고;
    L2는 -a1-NHCO- 또는 -a1-NHCO-a2- 이고;
    a1 및 a2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고;
    n은 200 내지 250이고;
    R은 말레이미드인, 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩티드는 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 호중구 증가 인자(G-CSF), 인간 성장 호르몬(hGH), 에리스로포이에틴(EPO), 글루카곤, 인슐린, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 인터페론 수용체, 지프로테인 관련수용체(G protein-coupled receptor), 인터루킨, 인터루킨 수용체, 효소, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, VIII, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 인크레틴, GIP(Gastric inhibitory polypeptide), GLP-1/GIP 이중활성체, GLP-1/GIP/글루카곤 삼중활성체, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 조성물의 화합물의 R은 약물의 시스테인과 결합하는 것인, 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 지속형 약물 결합체의 제조에서 한외/투석여과를 수행하지 않고 지속형 약물 결합체를 제조할 수 있도록 하는 것인, 조성물.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항의 조성물을 생리활성 폴리펩티드와 반응시켜 제조된, 지속형 약물 결합체.
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