CN108623659A - 一种氨基酸全部选用d型氨基酸的抗菌肽合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种氨基酸全部选用D型氨基酸的抗菌肽合成方法，将树脂用二氯甲烷、N，N‑二甲基甲酰胺进行活化，后遵循固相合成方法得到直链肽KWCFRVCYRGICYRRCR*；使用三氟乙酸、水、苯酚和三异丙基硅烷的混合溶液对树脂进行切割，旋蒸除去三氟乙酸，加入冰乙醚，有白色固体析出，使用冻干机对其冻干，得到固体粉末；构建其中的两对二硫键，3位，16位半胱氨酸选用的巯基保护基为三苯甲基，7位和12位的半胱氨酸选用的巯基保护基为乙酰胺甲基。本发明的有益效果是在保持原本抗菌活性的基础上，溶血活性有了显著降低。

Description

一种氨基酸全部选用D型氨基酸的抗菌肽合成方法
技术领域
本发明属于化学技术领域，涉及一种氨基酸全部选用D型氨基酸的抗菌肽合成方法。
背景技术
Tachyplesin I是一种具有广谱抗菌活性的抗菌肽，但由于其溶血性问题，它的研究和应用受限。已有研究表明，将D型氨基酸应用于多肽中，可提高其稳定性。因此，对原多肽进行这样的改造可能会增强其生物活性。
考虑到D性异亮氨酸价格昂贵，野生型多肽(KWCFRVCYRGICYRRCR*)序列中的异亮氨酸，被采用亮氨酸取代，因此新设计多肽序列为KWCFRVCYRGLCYRRCR*。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氨基酸全部选用D型氨基酸的抗菌肽合成方法，本发明的有益效果是在保持原本抗菌活性的基础上，溶血活性有了显著降低。
本发明一种氨基酸全部选用D型氨基酸的抗菌肽合成方法所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
步骤1：将树脂用二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺进行活化，后遵循固相合成方法得到直链肽KWCFRVCYRGLCYRRCR*；
步骤2：使用三氟乙酸、水、苯酚和三异丙基硅烷的混合溶液对树脂进行切割，旋蒸除去三氟乙酸，加入冰乙醚，有白色固体析出，离心后的固体加水溶解，使用冻干机对其冻干，得到固体粉末；
步骤3：构建其中的两对二硫键，3位，16位半胱氨酸选用的巯基保护基为三苯甲基，7位和12位的半胱氨酸选用的巯基保护基为乙酰胺甲基。
进一步，步骤1中用1：1的二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺对树脂进行活化。
进一步，步骤1中17个氨基酸全部采用D型氨基酸。
进一步，步骤2中三氟乙酸：水：苯酚：三异丙基硅烷＝88：5：5：2。
进一步，步骤3中对3位16位的二硫键进行构建：采用空气氧化法，取50mg的固体粉末，以0.2mg/mL的浓度溶解在150mL 0.2M碳酸氢铵水溶液中，于250mL茄形瓶，电磁搅拌，室温条件下反应48h，使用冻干机得到白色固体粉末。
进一步，步骤3中对7位12位的二硫键进行构建：称取10mg白色固体粉末溶于反应溶剂中，其中水：乙腈：TFA＝5：5：0.01，V/V，反应溶剂中加入3mL碘/乙腈溶液，使溶液保持发黄的状态；于50mL茄形瓶，室温搅拌反应30分钟后，加入抗坏血酸水溶液，混匀，使溶液呈无色澄清，冻干后得到最终产物白色固体粉末TPAD。
进一步，碘/乙腈溶液为5mg/mL，抗坏血酸水溶液5mg/mL。
附图说明
图1是本发明合成方法示意图；
图2是Tachyplesin I与TPAD的溶血活性示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。如图1所示，本发明合成方法如下：
1、D型Tachyplesin I(TPAD)的合成：选用Rink-Amide树脂，用1：1的二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺对树脂进行活化，后遵循固相合成方法得到直链肽KWCFRVCYRGICYRRCR*，其中的17个氨基酸全部采用D型氨基酸。
2、随后使用三氟乙酸(TFA)：水：苯酚：三异丙基硅烷＝88：5：5：2的20mL混合溶液对树脂进行切割，旋蒸除去三氟乙酸，加入冰乙醚，有白色固体析出，离心后的固体加水溶解，使用冻干机对其冻干，得到固体粉末。
3、然后开始构建其中的两对二硫键，3位，16位半胱氨酸选用的巯基保护基为三苯甲基(Trt)，而7位和12位的半胱氨酸选用的巯基保护基为乙酰胺甲基(Acm)。
(1)首先对3位16位的二硫键进行构建：Trt保护基在切割过程中被同时脱去，因此采用空气氧化法，取50mg的固体粉末，以0.2mg/mL的浓度溶入150mL0.2M碳酸氢铵水溶液，250mL茄形瓶，电磁搅拌，室温条件下反应48h，反应结束后进行HPLC分离分析，同时辅以ESI-MS检测，收集目标峰后，使用冻干机得到白色固体粉末。
(2)然后对7位12位的二硫键进行构建：称取10mg白色固体粉末溶10mL反应溶剂(水：乙腈：TFA＝5：5：0.01，V/V)中，加入3mL碘/乙腈溶液(5mg/mL)，使溶液保持发黄的状态；50mL茄形瓶，室温搅拌反应30分钟后，加入抗坏血酸水溶液(5mg/mL)，混匀，使溶液呈无色澄清，进行HPLC分离分析，同时辅以ESI-MS检测，收集目标峰，冻干后得到最终产物白色固体粉末TPAD 2mg。
本发明实施例积极效果：发现TPAD仍保持着与原Tachyplesin I相当的抗菌活性而其溶血活性相对于TachyplesinI有了明显下降。野生型Tachyplesin I的HC50(半数致溶血浓度)为159.2μg/ml时，而全D型氨基酸合成的Tachyplesin I的HC50(半数致溶血浓度)大于512μg/ml，因此该方法有助于降低该多肽的溶血性。图2是TachyplesinI与TPAD的溶血活性示意图。
表1(TPAD与Tachyplesin I的最小抑菌浓度)
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种氨基酸全部选用D型氨基酸的抗菌肽合成方法，其特征在于按照以下步骤进行：
步骤1：将树脂用二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺进行活化，后遵循固相合成方法得到直链肽KWCFRVCYRGICYRRCR*；
步骤2：使用三氟乙酸、水、苯酚和三异丙基硅烷的混合溶液对树脂进行切割，旋蒸除去三氟乙酸，加入冰乙醚，有白色固体析出，使用冻干机对其冻干，得到固体粉末；
步骤3：构建其中的两对二硫键，3位，16位半胱氨酸选用的巯基保护基为三苯甲基，7位和12位的半胱氨酸选用的巯基保护基为乙酰胺甲基。
2.按照权利要求1所述一种氨基酸全部选用D型氨基酸的抗菌肽合成方法，其特征在于：所述步骤1中用1：1的二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺对树脂进行活化。
3.按照权利要求1所述一种氨基酸全部选用D型氨基酸的抗菌肽合成方法，其特征在于：所述步骤1中17个氨基酸全部采用D型氨基酸。
4.按照权利要求1所述一种氨基酸全部选用D型氨基酸的抗菌肽合成方法，其特征在于：所述步骤2中三氟乙酸：水：苯酚：三异丙基硅烷＝88：5：5：2。
5.按照权利要求1所述一种氨基酸全部选用D型氨基酸的抗菌肽合成方法，其特征在于：所述步骤3中对3位16位的二硫键进行构建：采用空气氧化法，取50mg的固体粉末，以0.2mg/mL的浓度溶解于150mL 0.2M碳酸氢铵水溶液，250mL茄形瓶，电磁搅拌，室温条件下反应48h，使用冻干机得到白色固体粉末。
6.按照权利要求1所述一种氨基酸全部选用D型氨基酸的抗菌肽合成方法，其特征在于：所述步骤3中对7位12位的二硫键进行构建：称取10mg白色固体粉末溶10mL，反应溶剂水：乙腈：TFA＝5：5：0.01，V/V，反应溶剂中加入3mL碘/乙腈溶液，使溶液保持发黄的状态；50mL茄形瓶，室温搅拌反应30分钟后，加入抗坏血酸水溶液，混匀，使溶液呈无色澄清，冻干后得到最终产物白色固体粉末TPAD。
7.按照权利要求6所述一种氨基酸全部选用D型氨基酸的抗菌肽合成方法，其特征在于：所述碘/乙腈溶液为5mg/mL，抗坏血酸水溶液5mg/mL。
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