CN101578264A - 含有非天然氨基酸和多肽的组合物、涉及非天然氨基酸和多肽的方法以及非天然氨基酸和多肽的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明中揭示非天然氨基酸和包括至少一个非天然氨基酸的多肽，以及制备这些非天然氨基酸和多肽的方法。非天然氨基酸(自身或作为多肽的一部分)可包括多种官能团，但通常具有至少一个吲哚、羰基和/或肼基。本发明中也揭示进一步经翻译后修饰的非天然氨基酸多肽，实现这些修饰的方法，和纯化这些多肽的方法。通常，经修饰的非天然氨基酸多肽包括至少一个吲哚、羰基和/或肼基。另外揭示使用这些非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法，其包括治疗、诊断和其它生物技术用途。

Description

含有非天然氨基酸和多肽的组合物、涉及非天然氨基酸和多肽的方法以及非天然氨基酸和多肽的用途
相关申请案
本申请案主张2006年12月18日申请的美国非临时专利申请案第60/870,594号的权利。
技术领域
本发明涉及非天然氨基酸，含有至少一个非天然氨基酸的多肽，制造这些非天然氨基酸和多肽的方法，以及这些非天然氨基酸和多肽关于诊断、环境、工业和治疗用途的用途。
背景技术
在蛋白质中并入非遗传性编码氨基酸(即，“非天然氨基酸”)的能力允许引入可提供天然存在的官能团的有价值替代物的化学官能团，诸如赖氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的巯基-SH、组氨酸的亚氨基等。据文献记载，某些化学官能团对20种常见的遗传性编码氨基酸中存在的官能团呈惰性，但与可结合于非天然氨基酸上的官能团完全并有效地反应以形成稳定键联。
如今可用某些方法来选择性地引入蛋白质中不存在的化学官能团，其对20种常见的遗传性编码氨基酸中所存在的所有官能团都呈化学惰性并且可用于与包含某些官能团的试剂有效并且选择性地反应以形成稳定共价键。
发明内容
本发明中描述用于制造、纯化、表征和使用非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略。一方面是衍生非天然氨基酸和/或非天然氨基酸多肽的方法、组合物、技术和策略。在一个实施例中，这些方法、组合物、技术和策略涉及化学衍生，在其它实施例中涉及生物衍生，在其它实施例中涉及物理衍生，在其它实施例中涉及衍生的组合。在其它或另外的实施例中，这些衍生具有区域选择性。在其它或另外的实施例中，这些衍生具有区域专一性。在其它或另外的实施例中，这些衍生在含有非天然氨基酸的试剂与衍生试剂中都为化学计量或接近化学计量的。在其它或另外的实施例中，这些衍生在周围温度下快速发生。在其它或另外的实施例中，这些衍生在水溶液中发生。在其它或另外的实施例中，这些衍生在介于约4与约10之间的pH值下发生。在其它或另外的实施例中，这些衍生在含有非天然氨基酸的试剂与衍生试剂中都为化学计量、接近化学计量或类化学计量的。在其它或另外的实施例中提供允许所需基团以化学计量、接近化学计量或类化学计量结合于非天然氨基酸多肽上的方法。在其它或另外的实施例中提供允许所需基团以化学计量、接近化学计量或类化学计量结合于非天然氨基酸多肽上的策略、反应混合物、合成条件。
一方面是基于羰基或经掩蔽羰基(包括含有至少一个酮基和/或至少一个醛基的基团)的反应性而用于肽和蛋白质的化学衍生的非天然氨基酸。其它或另外的方面是基于肼基或经掩蔽肼基的反应性而用于肽和蛋白质的化学衍生的非天然氨基酸。在其它或另外的实施例中，将至少一个前述非天然氨基酸并入多肽中，即，这些实施例是非天然氨基酸多肽。在其它或另外的实施例中，使非天然氨基酸在其侧链上经官能化以使得其与衍生分子的反应产生含吲哚的键联。在其它或另外的实施例中是可与衍生分子反应产生含吲哚键联的非天然氨基酸多肽的非天然氨基酸多肽。在其它或另外的实施例中，非天然氨基酸是选自具有羰基和/或肼侧链的氨基酸。在其它或另外的实施例中，非天然氨基酸包含经掩蔽侧链，包括经掩蔽肼基和/或经掩蔽羰基。
在其它或另外的实施例中，非天然氨基酸包含羰基侧链，其中羰基是选自酮或醛。在另一个实施例中是含有在用适当官能化试剂处理后能够形成吲哚的官能团的非天然氨基酸。在一些实施例中是含有吲哚部分的非天然氨基酸。在另一个实施例中是用于治疗病症、病状或疾病的含有吲哚部分的非天然氨基酸。在另一个或另外的实施例中，非天然氨基酸在结构上类似于天然氨基酸，但含有前述官能团中的一种。在另一个或其它的实施例中，非天然氨基酸类似于苯丙氨酸或酪氨酸(芳香族氨基酸)；而在另一个实施例中，非天然氨基酸类似于丙氨酸和亮氨酸(疏水性氨基酸)。在一个实施例中，非天然氨基酸具有与天然氨基酸的那些性质不同的性质。在一个实施例中，这些不同性质是侧链的化学反应性；在另一个实施例中，此不同的化学反应性允许非天然氨基酸的侧链作为多肽的单元经历反应，即使同一多肽中的天然存在氨基酸单元的侧链并不经历前述反应。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在氨基酸的化学性质正交的化学性质。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链包含含亲电子试剂的部分；在另一个实施例中，非天然氨基酸侧链上的含亲电子试剂的部分可经历亲核攻击以产生杂环衍生的蛋白质，包括含氮杂环衍生的蛋白质(例如，含有吲哚部分)。在这个段落中的任一前述实施例中，非天然氨基酸为独立分子或并入任何长度的多肽中；如果是后者，那么在一些实施例中，所述多肽进一步合并其它的天然存在氨基酸或非天然氨基酸。
另一方面是基于含吲哚的杂环键联制备衍生的非天然氨基酸多肽的经肼取代的分子。在另一个实施例中是通过形成含吲哚的杂环键联而用于衍生含羰基的非天然氨基酸多肽的经肼取代的分子。在其它实施例中，前述含羰基的非天然氨基酸多肽是含酮的非天然氨基酸多肽。在其它或另外的实施例中，含羰基的非天然氨基酸包含侧链，其中所述羰基是选自酮或醛。在其它或另外的实施例中，经肼取代的分子包含所需官能团。在其它或另外的实施例中，经肼取代的分子是经肼取代的聚乙二醇(PEG)分子。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在氨基酸的化学性质正交的化学性质，此允许非天然氨基酸与经肼取代的分子选择性地反应。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链包含含亲电子试剂的部分，其与含肼的分子选择性地反应；在另一个实施例中，非天然氨基酸侧链上的含亲电子试剂的部分可经历亲核攻击以产生杂环衍生的蛋白质，包括含氮杂环衍生的蛋白质。与这个段落中所述的实施例有关的另一个方面是由衍生分子与非天然氨基酸多肽的反应产生的经修饰的非天然氨基酸多肽。其它实施例包括已经修饰的非天然氨基酸多肽的任何进一步修饰。
另一方面是基于包括含氮杂环(例如，吲哚或含有吲哚部分的多环结构)的杂环键联制备衍生的非天然氨基酸多肽的经羰基取代的分子。在另一个实施例中是通过形成含吲哚的杂环键联而用于衍生含肼的非天然氨基酸多肽的经羰基取代的分子。在另一个实施例中是可在介于约1与约6之间的pH值范围内与含肼的非天然氨基酸多肽形成此杂环的经羰基取代的分子。在另一个实施例中是通过在衍生分子与含肼的非天然氨基酸多肽之间形成含吲哚的杂环键联而用于衍生含肼的非天然氨基酸多肽的经羰基取代的分子。在另一个实施例中，经羰基取代的分子是经酮取代的分子，在其它方面是经醛取代的分子。在其它实施例中，经羰基取代的分子包含所需官能团。在其它或另外的实施例中，经醛取代的分子是经醛取代的聚乙二醇(PEG)分子。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在氨基酸的化学性质正交的化学性质，此允许非天然氨基酸与经羰基取代的分子选择性地反应。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链包含与含羰基的分子选择性地反应的部分(例如，肼基)；在另一个实施例中，非天然氨基酸侧链上的亲核部分可经历亲电子攻击以产生杂环衍生的蛋白质，包括含氮杂环衍生的蛋白质。与这个段落中所述的实施例有关的另一个方面是由衍生分子与非天然氨基酸多肽的反应产生的经修饰的非天然氨基酸多肽。其它实施例包括已经修饰的非天然氨基酸多肽的任何进一步修饰。
另一方面是基于含吲哚的杂环键联而产生衍生的非天然氨基酸多肽的单官能、双官能和多官能连接子。在一个实施例中是可用于连接含羰基的非天然氨基酸多肽与其它分子的分子连接子(双官能和多官能)。在另一个实施例中是可用于连接含肼的非天然氨基酸多肽与其它分子的分子连接子(双官能和多官能)。在另一个实施例中，含羰基的非天然氨基酸多肽包含酮或醛。在利用含肼的非天然氨基酸多肽的一个实施例中，分子连接子在其一个末端处含有羰基；在其它实施例中，羰基是选自醛基或酮基。在其它或另外的实施例中，经肼取代的连接分子是经肼取代的聚乙二醇(PEG)连接分子。在其它或另外的实施例中，经羰基取代的连接分子是经羰基取代的聚乙二醇(PEG)连接分子。在其它实施例中，短语“其它分子”包括(仅举例来说)蛋白质、其它聚合物和小分子。在其它或另外的实施例中，含肼的分子连接子在所有末端处都包含相同或等效的基团，以使得在与含羰基的非天然氨基酸多肽反应后，所得产物是含羰基的非天然氨基酸多肽的均多聚物(homo-multimerization)。在其它实施例中，均多聚物是均二聚物。在其它或另外的实施例中，含羰基的分子连接子在所有末端处都包含相同或等效的基团，以使得在与含肼的非天然氨基酸多肽反应后，所得产物是含肼的非天然氨基酸多肽的均多聚物。在其它实施例中，均多聚物是均二聚物。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在氨基酸的化学性质正交的化学性质，此允许非天然氨基酸与经肼取代的连接分子选择性地反应。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链具有与天然存在氨基酸的化学性质正交的化学性质，此允许非天然氨基酸与经羰基取代的连接分子选择性地反应。在另一个实施例中，非天然氨基酸的侧链包含与含肼的连接分子选择性地反应的含亲电子试剂的部分；在另一个实施例中，非天然氨基酸侧链上的含亲电子试剂的部分可经历由含肼的连接分子进行的亲核攻击以产生杂环衍生的蛋白质，包括含氮杂环衍生的蛋白质。与这个段落中所述的实施例有关的另一个方面是由连接分子与非天然氨基酸多肽的反应产生的经键联(经修饰)的非天然氨基酸多肽。其它实施例包括已经键联(经修饰)的非天然氨基酸多肽的任何进一步修饰。
一方面是通过羰基与肼反应物的反应衍生蛋白质以产生杂环衍生的蛋白质(包括含氮杂环衍生的蛋白质)的方法。这一方面包括基于含羰基的反应物与含肼的反应物的缩合来衍生蛋白质以产生杂环衍生的蛋白质加合物(包括含氮杂环衍生的蛋白质加合物)的方法。在另外或其它的实施例中是用肼官能化聚乙二醇(PEG)分子衍生含酮蛋白质或含醛蛋白质的方法。在另外或其它方面，经肼取代的分子可包括蛋白质、其它聚合物和小分子。
另一方面是化学合成用于衍生经羰基取代的蛋白质的经肼取代的分子的方法。在一个实施例中，经肼取代的分子可包含肽、其它聚合物(非支化和支化)和小分子。在一个实施例中是制备适于衍生含羰基的非天然氨基酸多肽(仅举例来说，包括含酮或含醛的非天然氨基酸多肽)的经肼取代的分子的方法。在另一个或另外的实施例中，非天然氨基酸是在蛋白质的活体内翻译期间位点特异性地并入。在另一个或另外的实施例中，经肼取代的分子允许通过各羰基的亲核攻击以位点特异性方式进行含羰基的非天然氨基酸的位点特异性衍生以形成杂环衍生的多肽(包括含氮杂环衍生的多肽)。在另一个或另外的实施例中，制备经肼取代的分子的方法提供获得多种位点特异性衍生多肽的可能。在另一个或另外的实施例中是合成肼官能化聚乙二醇(PEG)分子的方法。
另一方面是化学合成用于衍生经肼取代的非天然氨基酸多肽的经羰基取代的分子的方法。在一个实施例中，经羰基取代的分子是经酮和/或经醛取代的分子。在另一个实施例中，经羰基取代的分子包括蛋白质、聚合物(非支化和支化)和小分子。在另一个或另外的实施例中，这些方法补充使得能够在蛋白质的活体内翻译期间位点特异性并入非天然氨基酸的技术。在另一个或另外的实施例中是制备适于与含肼的非天然氨基酸多肽反应以提供位点特异性衍生的非天然氨基酸多肽的经羰基取代的分子的一般方法。在另一个或另外的实施例中是合成经羰基取代的聚乙二醇(PEG)分子的方法。
另一方面是使用含肼的双官能连接子化学衍生经羰基取代的非天然氨基酸多肽的方法。在一个实施例中是通过缩合反应产生杂环(包括含氮杂环)键联，从而连接经肼取代的连接子与经羰基取代的蛋白质的方法。在其它或另外的实施例中，经羰基取代的非天然氨基酸是经酮和/或经醛取代的非天然氨基酸。在其它或另外的实施例中，非天然氨基酸多肽是使用含肼的双官能连接子位点特异性地和/或在三维结构的精确控制下衍生。在一个实施例中，使用这些方法来连接分子连接子(单官能、双官能和多官能)与含羰基(例如包括含酮和/或含醛)的非天然氨基酸多肽，其中连接子的至少一个末端含有肼基，其可通过杂环(包括含氮杂环)键联与含羰基的非天然氨基酸多肽键联。在另一个或另外的实施例中，使用这些连接子来连接含羰基的非天然氨基酸多肽与其它分子(例如包括蛋白质、其它聚合物(支化和非支化)和小分子)。
在一些实施例中，非天然氨基酸多肽是与水溶性聚合物键联。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些实施例中，聚乙二醇分子是双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物是与第二多肽键联。在一些实施例中，第二多肽与第一多肽相同，在其它实施例中，第二多肽是不同的多肽。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包含至少两个与包含聚乙二醇部分的水溶性聚合物键联的氨基酸。
在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包含增加非天然氨基酸多肽对受体的亲和力的取代、添加或缺失。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包含增加非天然氨基酸多肽的稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包含增加非天然氨基酸多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽包含增加宿主细胞中所产生的非天然氨基酸多肽的溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，相对于不具有取代、添加或缺失的氨基酸多肽，非天然氨基酸多肽包含调节蛋白酶抗性、血清半衰期、免疫原性和/或表达的取代、添加或缺失。
在一些实施例中，非天然氨基酸多肽是激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂。在一些实施例中，激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。在一些实施例中，包含与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸的多肽防止相应受体的二聚化。在一些实施例中，包含与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸的多肽调节多肽与结合搭配物、配体或受体的结合。在一些实施例中，包含与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸的多肽调节多肽的一种或一种以上的性质或活性。
在一些实施例中，选择密码子是选自由琥珀密码子(amber codon)、赭石密码子(ochre codon)、蛋白石密码子(opal codon)、独特密码子(unique codon)、稀有密码子(rare codon)、非天然密码子(unnatural codon)、五碱基密码子(five-basecodon)和四碱基密码子(four-base codon)组成的群组。
本发明中也描述制备与水溶性聚合物键联的非天然氨基酸多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含使包含非天然氨基酸的经分离多肽与包含与非天然氨基酸反应的部分的水溶性聚合物接触。在一些实施例中，所并入的非天然氨基酸对与20种常见氨基酸中的任一种都不具有反应性的水溶性聚合物具有反应性。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。聚合物的分子量视情况在所需聚合物的分子量范围内。
本发明中也描述包含包括至少一个本发明中所述的非天然氨基酸的多肽和医药学上可接受的载剂的组合物。在一些实施例中，非天然氨基酸是与水溶性聚合物键联。本发明中也描述包含医药学上可接受的载剂和多肽的医药组合物，其中至少一个氨基酸经非天然氨基酸取代。在一些实施例中，非天然氨基酸包含糖部分。在一些实施例中，水溶性聚合物是通过糖部分与多肽键联。本发明中也描述非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的前药；本发明中进一步描述包含这些前药和医药学上可接受的载剂的组合物。本发明中也描述非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的代谢物；在一些实施例中，这些代谢物具有补充或协同加强非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的活性的所需活性。本发明中也描述本发明中所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽向生物体(包括需要所需代谢物的患者)提供所需代谢物的用途。
本发明中也描述包含编码包含选择密码子的多肽的多核苷酸的细胞。在一些实施例中，细胞包含用于将非天然氨基酸代入多肽中的正交RNA合成酶和/或正交tRNA。在一些实施例中，细胞是在细胞培养物中，而在其它实施例中是多细胞生物(包括两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物)的部分的细胞。在任一个细胞实施例中，其它实施例包括产生非天然氨基酸多肽的多核苷酸的表达。在其它实施例中是可利用本发明中所述的非天然氨基酸产生非天然氨基酸多肽(包括经修饰的非天然氨基酸多肽)的生物体。在其它实施例中是含有本发明中所述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和/或经修饰的非天然氨基酸多肽的生物体。这些生物体包括单细胞生物和多细胞生物，其包括两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽是在活体外产生。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽是在细胞溶解产物中产生。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽是通过核糖体翻译产生。
本发明中也描述制备包含非天然氨基酸的多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含在允许多肽表达的条件下培养包含一种或一种以上编码多肽、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的多核苷酸的细胞；以及从细胞和/或培养基中纯化多肽。
本发明中也描述本发明中所述的非天然氨基酸的库或本发明中所述的非天然氨基酸多肽的库，或本发明中所述的经修饰的非天然氨基酸多肽的库，或其组合库。本发明中也描述含有至少一个非天然氨基酸、至少一个非天然氨基酸多肽和/或至少一个经修饰的非天然氨基酸的阵列。本发明中也描述含有至少一个编码包含选择密码子的多肽的多核苷酸的阵列。例如，使用本发明中所述的阵列来筛检生物体中非天然氨基酸多肽的产生(通过检测编码多肽的多核苷酸的转录或通过检测多肽的翻译)。
本发明中也描述筛检本发明中所述的库的所需活性的方法，或使用本发明中所述的阵列来筛检本发明中所述的库或其它化合物和/或多肽和/或多核苷酸的库的所需活性的方法。本发明中也描述来自库筛检的此活性数据用于开发和发现新的治疗剂的用途，以及治疗剂本身。
本发明中也描述增加多肽的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。在一些实施例中，所述方法包含用至少一个非天然氨基酸取代天然存在多肽中的任一个或一个以上氨基酸和/或使多肽与水溶性聚合物偶合。
本发明中也描述用有效量的医药组合物治疗需要此治疗的患者的方法，所述医药组合物包含包括非天然氨基酸的多肽和医药学上可接受的载剂。在一些实施例中，非天然氨基酸与水溶性聚合物偶合。
在其它或替代实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的包含至少一个非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸是选自由含吲哚的非天然氨基酸、含羰基的非天然氨基酸和含肼的非天然氨基酸组成的群组。在其它实施例中，这些非天然氨基酸已通过合成并入如本发明中所述的多肽中。在其它或替代实施例中，这种非天然氨基酸多肽包含至少一个选自式I-XV的氨基酸的非天然氨基酸。在另一个实施例中，这种非天然氨基酸多肽包含至少一个选自化合物1-4的氨基酸的天然氨基酸。
在其它或替代实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一个具有以下化合物结构的非天然氨基酸：
Figure A20078004697300291
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、经取代亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为一端与含吲哚的部分键联的连接子，所述连接子选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
n为0、1、2或3，并且m为0、1、2或3，条件是n或m中的至少一个不为0；
其中，具有相缔合Ra基团的结构1、2、3和4中的各环可含有0、1或2个Ra基团，并且Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中各R″独立地为H、烷基或经取代烷基；或当存在一个以上Ra基团时，两个Ra视情况形成芳基、环烷基或杂环烷基；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或R3与R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5各自独立地为H、卤素、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、OH、NH2、CN、NO2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基，或当存在一个以上R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；
或R5为L-X，其中，X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；光化辐射可激发的部分；配体；可光致异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸；放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合激活剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管抑素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体(shuttle vector)、大分子、拟抗原决定基(mimotope)、受体、反胶束(reverse micelle)和其任何组合；并且L是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
当存在一个以上R5基团时，两个邻位R5基团可视情况形成杂环烷基或芳香族杂环烷基；
或含-B-吲哚的部分合起来形成包含至少一个吲哚部分的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或其活性代谢物、盐或医药学上可接受的前药或溶剂化物。
在一个实施例中，X是选自水溶性聚合物；聚氧化烯；聚乙二醇；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；至少一个氨基酸；至少一个糖基；至少一个核苷酸；至少一个核苷；配体；生物素；生物素类似物；可检测标记；和其任何组合。
在一个实施例中，A与B都是键，各R3为H并且R4为H。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少一个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少两个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少三个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少四个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少五个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少六个氨基酸。
在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的非天然氨基酸多肽与医药学上可接受的载剂。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其中X是水溶性聚合物。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其中X是聚乙二醇的衍生物。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其中X是细胞毒性化合物。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其中X是药物。
在一些实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其中X是第二多肽。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其中第二多肽是含有非天然氨基酸多肽的肽。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其中第二多肽具有与具有结构1-4的化合物的非天然氨基酸多肽相同的氨基酸结构。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其中X是可检测标记。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其中在多肽内的特定位点处并入化合物1-4的至少一个非天然氨基酸。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其中使用翻译系统并入化合物1-4的非天然氨基酸。
在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其包含投与治疗有效量的包含至少一个非天然氨基酸的多肽，所述非天然氨基酸选自由以下各物组成的群组：
Figure A20078004697300331
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、经取代亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为一端与含吲哚的部分键联的连接子，所述连接子选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
n为0、1、2或3，并且m为0、1、2或3，条件是n或m中的至少一个不为0；
其中，具有相缔合Ra基团的结构1、2、3和4中的各环可含有0、1或2个Ra基团，并且Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中各R″独立地为H、烷基或经取代烷基；或当存在一个以上Ra基团时，两个Ra视情况形成芳基、环烷基或杂环烷基；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或R3与R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5各自独立地为H、卤素、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、OH、NH2、CN、NO2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基，或当存在一个以上R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；
或R5为L-X，其中，X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；光化辐射可激发的部分；配体；可光致异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸；放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合激活剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管抑素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束和其任何组合；并且L是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
当存在一个以上R5基团时，两个邻位R5基团可视情况形成杂环烷基或芳香族杂环烷基；
或含-B-吲哚的部分合起来形成包含至少一个吲哚部分的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或其活性代谢物、盐或医药学上可接受的前药或溶剂化物。
在一个实施例中，X是选自水溶性聚合物；聚氧化烯；聚乙二醇；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；至少一个氨基酸；至少一个糖基；至少一个核苷酸；至少一个核苷；配体；生物素；生物素类似物；可检测标记；和其任何组合。
在一个实施例中，A与B都是键，各R3为H并且R4为H。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少一个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少两个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少三个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少四个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少五个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少六个氨基酸。
在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其进一步包含投与医药学上可接受的载剂与治疗有效量的具有结构5-8的化合物的多肽。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其中R1与R2都是多肽。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其中X是水溶性聚合物。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其中X是聚乙二醇的衍生物。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其中X是细胞毒性化合物。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其中X是药物。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其中X是第二多肽。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，其中第二多肽是含有非天然氨基酸多肽的肽。
在其它或替代实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的包含至少一个具有化合物1-4的结构的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，其中所述多肽是与选自由以下各物组成的群组的治疗蛋白同源的蛋白质：α-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗体、抗体片段、载脂蛋白(apolipoprotein)、脱辅基蛋白(apoprotein)、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血钙素(calcitonin)、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配体、c-kit配体、胶原蛋白、菌落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞激活肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞激活肽、红细胞生成素(EPO)、剥脱性毒素(exfoliating toxin)、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维粘连蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白(hedgehog protein)、血红蛋白、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经素(neurturin)、中性粒细胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效营养因子(pleiotropin)、蛋白质A、蛋白质G、pth、致热外毒素A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素(somatotropin)、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原激活剂、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、尾加压素(urotensin)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体和皮质酮受体。
在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与具有结构5-8的化合物，其中在多肽内的特定位点处并入至少一个非天然氨基酸。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与具有结构5-8的化合物，其中使用翻译系统并入非天然氨基酸。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与具有结构5-8的化合物，其中使用翻译系统和翻译后修饰系统将非天然氨基酸并入多肽中。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与具有结构5-8的化合物，其中包含至少一个非天然氨基酸的多肽可稳定至少一个月。在另一个实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与具有结构5-8的化合物，其中包含至少一个非天然氨基酸的多肽可稳定至少两个月。
在其它或替代实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的包含至少一个含吲哚的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，并且所得含吲哚的非天然氨基酸多肽相对于同源天然存在氨基酸多肽来说增加多肽的生物可用性。
在其它或替代实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的包含至少一个含吲哚的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，并且所得含吲哚的非天然氨基酸多肽相对于同源天然存在氨基酸多肽来说增加多肽的安全性概况。
在其它或替代实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的包含至少一个含吲哚的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，并且所得含吲哚的非天然氨基酸多肽相对于同源天然存在氨基酸多肽来说增加多肽的水溶性。
在其它或替代实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的包含至少一个含吲哚的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，并且所得含吲哚的非天然氨基酸多肽相对于同源天然存在氨基酸多肽来说增加多肽的治疗半衰期。
在其它或替代实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的包含至少一个含吲哚的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，并且所得含吲哚的非天然氨基酸多肽相对于同源天然存在氨基酸多肽来说增加多肽的血清半衰期。
在其它或替代实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的包含至少一个含吲哚的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，并且所得含吲哚的非天然氨基酸多肽相对于同源天然存在氨基酸多肽来说延长多肽的循环时间。
在其它或替代实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的包含至少一个含吲哚的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，并且所得含吲哚的非天然氨基酸多肽相对于同源天然存在氨基酸多肽来说调节多肽的生物活性。
在其它或替代实施例中是治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的包含至少一个含吲哚的非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽，并且所得含吲哚的非天然氨基酸多肽相对于同源天然存在氨基酸多肽来说调节多肽的免疫原性。
应了解，本发明中所述的方法和组合物并不限于本发明中所述的特定方法、方案、细胞系、构筑体和试剂，并且同样视情况改变。也应了解，本发明中使用的术语只是为了达成描述特定实施例的目的，并且不打算限制本发明中所述的方法和组合物的范围，所述范围应仅由随附权利要求加以限制。
除非上下文另外明确指出，否则如本发明中和随附权利要求中所使用，单数形式“一”和“所述”包括多个指示物。
除非另外定义，否则本发明中使用的所有科技术语都具有与本发明中所述的发明所属领域的技术人员通常所了解的含义相同的含义。虽然可将与本发明中所述的方法、装置和材料类似或等效的任何方法、装置和材料用于本发明的实践或测试中，但现仅对优选方法、装置和材料加以描述。
本发明中所讨论的公开案仅提供本申请案的申请日期之前的揭示内容。本发明决不应解释为承认本发明所述的发明者无权由于先前发明或任何其它原因而使所述揭示案的日期提前。
如本发明中所使用的术语“亲和性标记”是指可逆或不可逆地与另一分子结合以对其进行修饰、将其破坏或与其形成化合物的标记。举例来说，亲和性标记包括酶和其底物，或抗体和其抗原。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)是指分别通过氧原子、氨基或硫原子键联到分子上的烷基。
除非另外指出，否则术语“烷基”(自身或作为另一分子的部分)表示直链或支链或环状烃基，或其组合，其视情况为完全饱和、单不饱和或多不饱和的并且可包括具有指定碳原子数目(即C1-C10表示1到10个碳)的二价基团和多价基团。饱和烃基的实施例包括(但不限于)以下基团，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基；(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基等基团的同系物和异构体。不饱和烷基是具有一个或一个以上双键或三键的烷基。不饱和烷基的实施例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。除非另外指出，否则术语“烷基”还打算包括本发明中更详细定义的烷基的衍生物，诸如“杂烷基”、“卤烷基”和“同系烷基(homoalkyl)”。
术语“亚烷基”(自身或作为另一分子的部分)表示由烷烃衍生的二价基团，如由(-CH2-)n例示，其中n为1到约24。仅举例来说，这些基团包括(但不限于)具有10个或更少碳原子的基团，诸如结构-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-。“低碳烷基”或“低碳亚烷基”是通常具有8个或更少碳原子的较短链烷基或亚烷基。除非另外指出，否则术语“亚烷基”也打算包括本发明中描述为“亚杂烷基”的那些基团。
术语“氨基酸”是指天然存在氨基酸和非天然氨基酸，以及以类似于天然存在氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸(pyrolysine)和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构(仅举例来说，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳)的化合物。这些类似物视情况具有经修饰的R基团(举例来说，正亮氨酸)或视情况经修饰的肽主链，而仍保留与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸类似物的非限制性实施例包括高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。
氨基酸在本发明中可由其名称、其三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来指代。另外，核苷酸可由其公认的单字母代码来指代。
“抗体片段”表示除全长形式之外的抗体的任何形式。在本发明中，抗体片段包括为存在于全长抗体内的较小组分的抗体，以及经工程化的抗体。抗体片段包括(但不限于)Fv、Fc、Fab以及(Fab′)2、单链Fv(scFv)、双链抗体、三链抗体、四链抗体、双功能杂交抗体、CDR1、CDR2、CDR3、CDR的组合、可变区、构架区、恒定区、重链、轻链和可变区，以及替代性骨架非抗体分子、双特异性抗体等(Maynard和Georgiou，2000，Annu.Rev.Biomed.Eng.2：339-76；Hudson，1998，Curr.Opin.Biotechnol.9：395-402)。另一功能性子结构为单链Fv(scFv)，其包含由肽连接子共价连接的免疫球蛋白重链和轻链的可变区(S-z Hu等人，1996，Cancer Research，56，3055-3061)。这些小(Mr 25,000)蛋白质通常保持对单一多肽中的抗原的特异性和亲和性并且可为较大的抗原特异性分子提供适宜构建单元。除非另外特定指出，否则使用术语“抗体”的陈述和权利要求明确包括“抗体片段”。
如本发明中所使用，术语“芳香族”或“芳基”是指具有至少一个具有共轭π电子系统的环的闭环结构，并包括碳环芳基与杂环芳基(或“杂芳基”或“杂芳香族基团”)。碳环或杂环芳香族基团视情况含有5到20个环原子。所述术语包括共价键联的单环或稠环多环(即，共用相邻碳原子对的环)基团。芳香族基团可能未经取代或经取代。“芳香族基团”或“芳基”的非限制性实施例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、蒽基和菲基。上述芳基和杂芳基环系统中的每一个的取代基是选自本发明中描述的可接受的取代基的群组。
为了简便起见，当与其它术语组合使用(包括(但不限于)芳氧基、芳基硫氧基、芳烷基)时，术语“芳香族”或“芳基”包括如上文所定义的芳基环与杂芳基环两者。因此，术语“芳烷基”或“烷芳基”打算包括其中芳基连接至烷基上的那些基团(包括(但不限于)苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，其中所述烷基包括碳原子(包括(但不限于)亚甲基)已经杂原子(仅举例来说，氧原子)置换的那些烷基。这些芳基的实施例包括(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等。
如本发明中所使用，术语“亚芳基”是指二价芳基。“亚芳基”的非限制性实施例包括亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基和亚噻吩基。亚芳基的取代基是选自本发明中描述的可接受的取代基的群组。
术语“至少一个氨基酸”是指单一氨基酸、多重氨基酸、寡肽、氨基酸二聚物、氨基酸三聚物、氨基酸四聚物、多肽、蛋白质、抗体或氨基酸的任何其它连接链。
“双官能聚合物”(也称作“双官能连接子”)是指包含两个能够与其它部分特异性反应以形成共价键或非共价键的官能团的聚合物。这些部分包括(但不限于)天然氨基酸或非天然氨基酸或含有这些天然氨基酸或非天然氨基酸的肽上的侧基。仅举例来说，双官能连接子具有与第一肽上的基团具有反应性的官能团，以及与第二肽上的基团具有反应性的另一官能团，借此形成包括第一肽、双官能连接子和第二肽的接合物。用于将多种化合物与肽连接的程序和连接分子包括(例如)欧洲专利申请案第188,256号；美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号；第4,680,338号；和第4,569,789号。“多官能聚合物”也被称作“多官能连接子”，其是指包含两个或两个以上能够与其它部分反应的官能团的聚合物。这些部分包括(但不限于)天然氨基酸或非天然氨基酸或含有这些天然氨基酸或非天然氨基酸的肽上的侧基(包括(但不限于)氨基酸侧基)以形成共价键或非共价键。双官能聚合物或多官能聚合物视情况具有任何所需长度或分子量，并且视情况经选择以在与特定化合物键联的一个或一个以上分子与其所结合的分子或所述化合物之间提供特定所需间隔或构象。
如本发明中所使用，术语“生物可用性”是指物质或其活性部分从医药剂型传递并且在作用部位处或在一般循环中变得可用的速率以及程度。生物可用性的增加是指增加物质或其活性部分从医药剂型传递并且在作用部位处或在一般循环中变得可用的速率以及程度。举例来说，生物可用性的增加是指示为与其它物质或活性部分相比时血液中物质或其活性部分的浓度的增加。这种方法视情况用于评估任何多肽的生物可用性。
当在本发明中使用时，术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”表示可影响生物系统、途径、分子的任何物理或生物化学性质或与生物体相关的相互作用的任何物质，所述生物体包括(但不限于)病毒、细菌、噬菌体、转位子、朊病毒、昆虫、真菌、植物、动物和人类。具体来说，如本发明中所使用，生物活性分子包括(但不限于)打算用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其它动物的疾病，或以其它方式增强人类或动物的身体或精神健康状况的任何物质。生物活性分子的实施例包括(但不限于)肽、蛋白质、酶、小分子药物、硬性毒品、软性毒品、碳水化合物、无机原子或分子、染料、脂质、核苷、放射性核素、寡核苷酸、毒素、细胞、病毒、脂质体、微粒和胶束。适于与本发明中所述的方法和组合物一起使用的生物活性剂的种类包括(但不限于)药物、前药、放射性核素、显象剂、聚合物、抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子、类固醇剂、微生物来源的毒素等。
“调节生物活性”表示增加或降低多肽的反应性，改变多肽的选择性，增强或降低多肽的底物选择性。可通过比较非天然多肽的生物活性与天然多肽的生物活性来进行生物活性改变的分析。
如本发明中所使用，术语“生物材料”是指生物来源的材料，其包括(但不限于)从生物反应器和/或由重组方法和技术获得的材料。
如本发明中所使用，术语“生物物理探针”是指可检测或监测分子的结构变化的探针。这些分子包括(但不限于)蛋白质，并且“生物物理探针”视情况用于检测或监测蛋白质与其它大分子的相互作用。生物物理探针的实施例包括(但不限于)自旋标记、荧光团和可光活化基团。
如本发明中所使用，术语“生物合成”是指利用翻译系统(细胞或非细胞)的任何方法，其包括使用以下组分中的至少一个：多核苷酸、密码子、tRNA和核糖体。举例来说，使用部分VIII“包含非天然氨基酸的多肽的活体内产生”中所述的方法和技术将非天然氨基酸“通过生物合成并入”非天然氨基酸多肽中。
如本发明中所使用，术语“生物素类似物”(或也称作“生物素模拟物”)是除生物素之外以高亲和力与抗生物素蛋白和/或抗生物素蛋白链菌素结合的任何分子。
如本发明中所使用，术语“羰基”是指在选自由-C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-和-C(S)-组成的群组的部分处所含的基团，其包括(但不限于)含有至少一个酮基和/或至少一个醛基和/或至少一个酯基和/或至少一个羧酸基团和/或至少一个硫酯基的基团。这些羰基包括酮、醛、羧酸、酯和硫酯。另外，这些基团视情况为线性、分枝或环状分子的部分。
如本发明中所使用，术语“可化学裂解的基团”(也称作“化学上不稳定”)是指在暴露于酸、碱、氧化剂、还原剂、化学引发剂或自由基引发剂后分解或裂解的基团。
如本发明中所使用，术语“化学发光基团”是指在不加热的情况下由于化学反应而发光的基团。仅举例来说，在碱和金属催化剂的存在下，鲁米诺(luminol)(5-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮)与氧化剂(如过氧化氢(H2O2))反应产生激发态产物(3-氨基邻苯二甲酸盐，3-APA)。
如本发明中所使用，术语“发色团”是指吸收可见光波长、紫外线波长或红外线波长的光的分子。
如本发明中所使用，术语“辅因子”是指大分子的作用所必需的原子或分子。辅因子包括(但不限于)无机离子、辅酶、蛋白质或酶的活性所必需的一些其它因子。实施例包括血红蛋白中的血红素、叶绿素中的镁，以及用于蛋白质的金属离子。
如本发明中所使用，“比较窗口”是指在将特定序列与具有相同数目的邻接位置的参考序列最佳比对后用于对这两个序列进行比较的任一邻接位置的区段。这些邻接位置包括(但不限于)由约20个到约600个连续单元组成的群组，其包括约50个到约200个连续单元，以及约100个到约150个连续单元。仅举例来说，这些序列包括多肽和含有非天然氨基酸的多肽，其中连续单元包括(但不限于)天然氨基酸和非天然氨基酸。另外，仅举例来说，这些序列包括多核苷酸，其中核苷酸为相应连续单元。用于比较的序列比对方法包括(但不限于)Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性搜索方法；这些算法的计算机实施(WisconsinGenetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或手工比对和目测检查(例如参见Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))。
举例来说，用于测定序列一致性百分比和序列相似性的算法为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人，(1997)Nuc.Acids Res.25：3389-3402，和Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物科技信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。BLAST算法参数W、T和X将决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长为3以及期望值(E)为10以及BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。在进行BLAST算法时通常关闭“低复杂度”过滤。
BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(例如参见Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小和概率(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然会发生匹配的概率的指示。举例来说，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小和概率小于约0.2，或小于约0.01，或小于约0.001，那么就认为核酸与参考序列相似。
术语“保守性修饰变异体”适用于天然和非天然氨基酸序列与天然和非天然核酸序列，和其组合。对于特定核酸序列来说，“保守性修饰变异体”是指编码一致或基本上一致的天然和非天然氨基酸序列的天然和非天然核酸，或当天然和非天然核酸不编码天然和非天然氨基酸序列时是指基本上一致的序列。举例来说，由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定蛋白质。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每一位置处，密码子可改变为任一个所述的相应密码子而不改变所编码的多肽。这些核酸变异为“沉默变异(silent variation)”，其为保守性修饰变异中的一种。因此，例如编码天然或非天然多肽的本发明中的每一天然或非天然核酸序列也描述天然或非天然核酸的每一种可能的沉默变异。天然或非天然核酸中的每一密码子(除AUG和TGG之外，其中AUG通常仅为蛋氨酸的密码子，TGG通常仅为色氨酸的密码子)可经修饰以产生功能相同的分子。因此，编码天然和非天然多肽的天然和非天然核酸的每一沉默变异隐含在每一所述序列中。
关于氨基酸序列，对改变、添加或缺失编码序列中的单一天然和非天然氨基酸或少量天然和非天然氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加为“保守性修饰变异体”，其中所述改变将导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加，或天然和非天然氨基酸经化学上类似的氨基酸取代。科学文献中可获得的保守性取代表提供功能类似的天然氨基酸。这些保守性修饰变异体除为多态变异体之外(并且不排除这些变异体)，还为种间同系物以及本发明中所述方法和组合物的等位基因。
以下八组各自含有彼此为保守性取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)
(例如参见Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W HFreeman & Co.；第2版(1993年12月))。
除非另外指出，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”(自身或与其它术语组合)分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和、部分不饱和和完全不饱和的环键联。另外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环与分子的其余部分相连接的位置。杂原子包括(但不限于)氧、氮或硫。环烷基的实施例包括(但不限于)环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实施例包括(但不限于)1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。另外，所述术语还涵盖多环结构，其包括(但不限于)双环结构和三环结构。类似地，术语“亚杂环烷基”(自身或作为另一分子的部分)表示衍生自杂环烷基的二价基团，并且术语“亚环烷基”(自身或作为另一分子的部分)表示衍生自环烷基的二价基团。
如本发明中所使用，术语“环糊精”是指在成环时由至少6到8个葡萄糖分子组成的环状碳水化合物。环的外部含有水溶性基团；在环的中心是能够容纳小分子的相对非极性空穴。
如本发明中所使用，术语“细胞毒性”是指伤害细胞的化合物。
如本发明中所使用，术语“所需官能团”是指以下群组中的任一个：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；光化辐射可激发的部分；配体；可光致异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂(在这种情况下，生物活性剂可包括具有治疗活性的药剂，并且非天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸可与附属治疗剂一起充当共治疗剂或充当向生物体内的所需位点传递治疗剂的工具)；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸；放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合激活剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管抑素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束和其任何组合。
如本发明中所使用，术语“肼”是指包含至少一个肼官能团的基团/分子。
如本发明中所使用，术语“可检测标记”是指可视情况使用分析技术观测到的标记，这些分析技术包括(但不限于)荧光、化学发光、电子自旋共振、紫外/可见吸收光谱、质谱、核磁共振、磁共振和电化学方法。
如本发明中所使用，术语“羰基”是指含有至少一个醛或一个酮的基团/分子。
如本发明中所使用，术语“药物”是指在疾病或病状的预防、诊断、缓解、治疗或治愈中使用的任何物质。
如本发明中所使用，术语“染料”是指含有发色团的可溶性染色物质。
如本发明中所使用，术语“有效量”是指会在一定程度上减轻所治疗疾病或病状的一种或一种以上症状的所投与的药剂或化合物的足够量。结果可为疾病的症候、症状或病因的减少和/或缓解，或生物系统的任何其它所需改变。举例来说，所投与的药剂或化合物包括(但不限于)天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽，或经修饰的非天然氨基酸多肽。可投与含有这些天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物来进行预防性、增强性和/或治疗性治疗。视情况使用诸如剂量递增研究等技术来确定在任何个别情况下的适当“有效”量。
如本发明中所使用，术语“电子致密基团”是指当用电子束照射时散射电子的基团。这些基团包括(但不限于)钼酸铵、碱式硝酸铋、碘化镉(99％)、碳酰肼、六水合氯化铁、六亚甲基四胺(98.5％)、无水三氯化铟、硝酸镧、三水合乙酸铅、三水合柠檬酸铅、硝酸铅、高碘酸、磷钼酸、磷钨酸、铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌红、硝酸银、蛋白银(Ag检定：8.0-8.5％)“强”、四苯基卟吩银(S-TPPS)、氯金酸钠、钨酸钠、硝酸铊、氨基硫脲(TSC)、乙酸铀酰、硝酸铀酰和硫酸氧钒。
如本发明中所使用，术语“能量转移剂”是指可贡献或接受来自另一分子的能量的分子。仅举例来说，荧光共振能量转移(FRET)是偶极-偶极耦合过程，荧光供体分子的激发态能量通过这个过程非辐射性地转移到未激发受体分子上，所述未激发受体分子随后以较长波长荧光发射获赠的能量。
术语“增强”表示增加或延长所需作用的效力或持续时间。举例来说，“增强”治疗剂的作用是指在治疗疾病、病症或病状期间在效力或持续时间方面增加或延长治疗剂作用的能力。如本发明中所使用，“增强有效量”是指在治疗疾病、病症或病状期间足以增强治疗剂作用的量。当用于患者中时，有效用于此用途的量应取决于疾病、病症或病状的严重性和过程、先前治疗、患者的健康状态和对药物的反应，以及主治医师的判断。
如本发明中所使用，术语“真核生物”是指属于系统发育域(phylogeneticdomain)真核域(Eucarya)的生物体，包括(但不限于)动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括(但不限于)单子叶植物、双子叶植物和藻类)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫和原生生物。
如本发明中所使用，术语“脂肪酸”是指具有约C6或更长烃侧链的羧酸。
如本发明中所使用，术语“荧光团”是指经激发后发射光子并且进而发荧光的分子。
如本发明中所使用，术语“官能团”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基团”、“反应性位点”、“化学反应性基团”以及“化学反应性部分”是指发生化学反应的分子的部分或单元。这些术语在化学领域中在一定程度上同义，并且在本发明中用于指示执行某些功能或活性并与其它分子具有反应性的分子的部分。
术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。
如本发明中所使用，术语“卤酰基”是指含有卤素部分的酰基，其包括(但不限于)-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等。
如本发明中所使用，术语“卤烷基”是指含有卤素部分的烷基，其包括(但不限于)-CF3和-CH2CF3等。
如本发明中所使用，术语“杂烷基”是指直链或支链或环状烃基，或其组合，其由烷基和至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子组成，并且其中氮原子和硫原子视情况经氧化，并且氮杂原子视情况经季铵化。杂原子O、N和S以及Si视情况位于杂烷基的任何内部位置处或位于烷基与分子的其余部分相连接的位置处。实施例包括(但不限于)-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。另外，至多两个杂原子视情况为连续的，诸如，仅举例来说，-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。
术语“基于杂环的键联”或“杂环键联”是指由羰基与肼基的反应形成的部分。所得反应产物是杂环，包括杂芳基或杂环烷基。所得杂环基团充当非天然氨基酸或非天然氨基酸多肽与另一官能团之间的化学键联。在一个实施例中，杂环键联包括含氮杂环键联，包括(仅举例来说)吡咯键联、吲哚键联、苯并二氮呼键联和吡唑酮(pyrazalone)键联。
类似地，术语“亚杂烷基”是指由杂烷基衍生的二价基团，如由-CH2-CH2-S-CH2CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-所例示(但并非限制)。对于亚杂烷基来说，相同或不同的杂原子也可占据链的一端或两端(包括(但不限于)亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨基氧基亚烷基等)。更进一步地，对于亚烷基和亚杂烷基键联基团来说，键联基团的化学式所书写的方向并不表示键联基团的定向。举例来说，式-C(O)2R′-表示-C(O)2R′-与-R′C(O)2-两者。
如本发明中所使用，术语“杂芳基”或“杂芳香族”是指含有至少一个选自N、O和S的杂原子的芳基；其中氮原子和硫原子视情况经氧化，并且氮原子视情况经季铵化。杂芳基视情况经取代或未经取代。杂芳基视情况通过杂原子连接到分子的其余部分上。杂芳基的非限制性实施例包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。
如本发明中所使用，术语“同系烷基”是指作为烃基的烷基。
如本发明中所使用，术语“一致”是指相同的两个或两个以上序列或子序列。另外，如本发明中所使用，术语“实质上一致”是指当经由比较窗口或如使用比较算法或通过手工比对和目测检查所测量的指定区域比较和比对最大对应性时，具有一定百分比的相同连续单元的两个或两个以上序列。仅举例来说，如果在指定区域上连续单元为约60％一致、约65％一致、约70％一致、约75％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致或约95％一致，那么两个或两个以上序列为“实质上一致的”。这些百分比描述两个或两个以上序列的“一致性百分比”。序列的一致性可存在于长度为至少约75-100个连续单元的区域上、长度为约50个连续单元的区域上，或(如果未指定)整个序列上。这个定义也涉及测试序列的互补序列。仅举例来说，当氨基酸残基相同时，两个或两个以上的多肽序列为一致的，而如果氨基酸残基在指定区域上为约60％一致、约65％一致、约70％一致、约75％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致或约95％一致，那么两个或两个以上的多肽序列为“实质上一致的”。一致性可存在于长度为至少约75-100个氨基酸的区域上、长度为约50个氨基酸的区域上，或(如果未指定)多肽序列的整个序列上。另外，仅举例来说，当核酸残基相同时，两个或两个以上的多核苷酸序列为一致的，而如果核酸残基在指定区域上为约60％一致、约65％一致、约70％一致、约75％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致或约95％一致，那么两个或两个以上的多核苷酸序列为“实质上一致的”。一致性可存在于长度为至少约75-100个核酸的区域上、长度为约50个核酸的区域上，或(如果未指定)多核苷酸序列的整个序列上。
关于序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标，(必要时)并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定替代参数。随后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。
如本发明中所使用，术语“免疫原性”是指对投与治疗药物作出反应的抗体。可使用用于检测生物流体中的抗非天然氨基酸多肽抗体的定量和定性检定来获得针对治疗性非天然氨基酸多肽的免疫原性。这些检定包括(但不限于)放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附检定(ELISA)、发光免疫检定(LIA)和荧光免疫检定(FIA)。针对治疗性非天然氨基酸多肽的免疫原性的分析包括比较投与治疗性非天然氨基酸多肽后的抗体反应和投与治疗性天然氨基酸多肽后的抗体反应。
如本发明中所使用，术语“插入剂”(也称作“插入基团”)是指可插入分子的分子内空间或分子之间的分子间空间中的化学品。仅举例来说，插入剂或插入基团是插入DNA双螺旋的堆积碱基中的分子。
如本发明中所使用，术语“分离”是指从非关注组分中分离并移出所关注的组分。经分离的物质可为干燥或半干燥状态，或为溶液形式，其包括(但不限于)水溶液。经分离的组分可为均质状态，或经分离的组分可为包含其它医药学上可接受的载剂和/或赋形剂的医药组合物的部分。使用分析化学技术来测定纯度和均质性，所述技术包括(但不限于)聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。另外，当所关注的组分经分离并且是制剂中存在的主要物质时，本发明中将所述组分描述为实质上经纯化。如本发明中所使用，术语“纯化”是指所关注的组分为至少85％纯、至少90％纯、至少95％纯、至少99％或更纯。仅举例来说，当核酸或蛋白质不含至少一些在天然状态下与其缔合的细胞组分，或所述核酸或蛋白质已经浓缩到比其在活体内或活体外产生的浓度高的水平时，这些核酸或蛋白质为“经分离的”。同样，举例来说，当基因从侧接所述基因并且编码除所关注的基因以外的蛋白质的开放阅读框分离时，所述基因为经分离的。
如本发明中所使用，术语“标记”是指并入化合物中并且易于检测的物质，借此视情况检测和/或监测其物理分布。
如本发明中所使用，术语“键联”是指由连接子的官能团与另一分子之间的化学反应形成的键或化学部分。这些键包括(但不限于)共价键和非共价键，而这些化学部分包括(但不限于)酯、碳酸酯、亚胺、磷酸酯、腙、缩醛、原酸酯、肽键和寡核苷酸键。水解稳定的键联表示所述键联在水中实质上稳定并且在适用的pH值下(包括(但不限于)在生理条件下)长期(或许甚至无限期地)不与水反应。水解不稳定或可降解的键联表示所述键联可在水或水溶液(例如包括血液)中降解。酶促不稳定或可降解的键联表示所述键联可由一种或一种以上酶降解。仅举例来说，PEG和相关聚合物包括在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或一个以上末端官能团之间的连接子基团中的可降解键联。这些可降解的键联包括(但不限于)由PEG羧酸或活化PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应形成的酯键，其中这些酯基通常在生理条件下水解以释放生物活性剂。其它水解可降解的键联包括(但不限于)碳酸酯键；由胺与醛反应形成的亚胺键；由醇与磷酸酯基反应形成的磷酸酯键；作为酰肼与醛的反应产物的腙键；作为醛与醇的反应产物的缩醛键；作为甲酸盐与醇的反应产物的原酸酯键；由胺基(包括(但不限于)在诸如PEG的聚合物的末端上)与肽的羧基形成的肽键；以及由亚磷酰胺基(包括(但不限于)在聚合物的末端上)与寡核苷酸的5′羟基形成的寡核苷酸键。
如本发明中所使用，术语“培养基”是指用于生长和收集细胞和/或由这些细胞表达和/或分泌的产物的任何培养基。这些“培养基”包括(但不限于)溶液、固体、半固体或支撑或含有任何宿主细胞的刚性支撑物，所述宿主细胞包括(例如)细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核宿主细胞、大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌(Pseudomonas)宿主细胞，以及细胞内含物。这些“培养基”包括(但不限于)已生长宿主细胞的培养基、已分泌多肽的培养基，包括在增殖步骤之前或之后的培养基。这些“培养基”也包括(但不限于)含有宿主细胞溶解产物的缓冲剂或试剂，所述溶解产物例如在细胞内产生的多肽，并且宿主细胞已溶解或受到破坏以释放所述多肽。
如本发明中所使用，术语“代谢物”是指化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多肽)的衍生物，其是在化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多肽)代谢时形成的。术语“医药活性代谢物”或“活性代谢物”是指化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多肽)的生物活性衍生物，其是在此化合物(例如天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多肽)代谢时形成的。
如本发明中所使用，术语“代谢”是指由生物体改变特定物质的过程的和。这些过程包括(但不限于)水解反应和由酶催化的反应。关于代谢的其它信息是获自The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版，McGraw-Hill(1996)。仅举例来说，天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多肽的代谢物是通过将天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多肽投与宿主并分析来自宿主的组织样本来鉴别，或通过将天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、经修饰的天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸多肽与肝细胞一起活体外培育并且分析所得化合物来鉴别。
如本发明中所使用，术语“金属螯合剂”是指与金属离子形成金属络合物的分子。举例来说，这些分子与中心金属离子形成两个或两个以上的配位键并且形成环结构。
如本发明中所使用，术语“含金属的部分”是指含有金属离子、原子或粒子的基团。这些部分包括(但不限于)顺铂(cisplatin)、螯合金属离子(诸如镍、铁和铂)，以及金属纳米粒子(诸如镍、铁和铂)。
如本发明中所使用，术语“结合有重原子的部分”是指结合有通常比碳重的原子的离子的基团。这些离子或原子包括(但不限于)硅、钨、金、铅和铀。
如本发明中所使用，术语“经修饰”是指存在对天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的改变。这些改变或修饰是视情况通过天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的合成后修饰，或通过天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的共翻译修饰或翻译后修饰而获得。形式“经修饰或未经修饰”表示所讨论的天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽视情况经修饰，即所讨论的天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽可能经修饰或未经修饰。
如本发明中所使用，术语“经调节的血清半衰期”是指经修饰的生物活性分子的循环半衰期相对于其未经修饰形式的正变化或负变化。举例来说，经修饰的生物活性分子包括(但不限于)天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽。举例来说，血清半衰期是通过在投与生物活性分子或经修饰的生物活性分子后的多个时间点取血液样本且测定每一样本中所述分子的浓度而加以测量。血清浓度与时间的相关性使得可以计算血清半衰期。举例来说，经调节的血清半衰期为增加的血清半衰期，其使得给药方案能够得到改良或避免毒性作用。此血清增加为至少约两倍、至少约三倍、至少约五倍，或至少约十倍。这种方法视情况用于评估任何多肽的血清半衰期。
如本发明中所使用，术语“经调节的治疗半衰期”是指治疗有效量的经修饰的生物活性分子的半衰期相对于其未经修饰形式的正变化或负变化。举例来说，经修饰的生物活性分子包括(但不限于)天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽。举例来说，治疗半衰期是通过在投药后的多个时间点测量分子的药物动力学和/或药效学性质而加以测量。增加的治疗半衰期视情况使得能够得到特定有益给药方案、特定有益总剂量，或避免不良作用。举例来说，增加的治疗半衰期是由增加的效力、经修饰分子与其标靶的结合增加或减少、未经修饰分子的另一参数或作用机制的增大或减小，或由酶(仅举例来说，蛋白酶)实现的分子分解的增加或减少而产生的。这种方法用于评估任何多肽的治疗半衰期。
如本发明中所使用，术语“纳米粒子”是指具有约500nm到约1nm之间的粒度的粒子。
如本发明中所使用，术语“接近化学计量”是指参与化学反应的化合物的摩尔比为约0.75到约1.5。
如本发明中所使用，术语“非真核生物”是指非真核生物体。举例来说，非真核生物体属于真细菌(Eubacteria)(其包括(但不限于)大肠杆菌(Escherichiacoli)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))系统发育域，或古生菌(Archaea)(其包括(但不限于)詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)、热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、超嗜热古菌(Archaeoglobus fulgidus)、强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)、极端嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrum pernix)，或诸如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)和嗜盐菌种NRC-1等嗜盐菌(Halobacterium))系统发育域。
“非天然氨基酸”是指不为20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸中的一种的氨基酸。其它同义术语为“非天然编码氨基酸”、“非天然存在氨基酸”，以及其各种带有连字符和不带连字符的形式。术语“非天然氨基酸”包括(但不限于)通过修饰天然编码氨基酸(包括(但不限于)20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)而天然存在、但本身无法通过翻译复合物而并入正在生长的多肽链中的氨基酸。非天然编码的天然存在氨基酸的实施例包括(但不限于)N-乙酰葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰葡糖胺基-L-苏氨酸以及O-磷酸酪氨酸。另外，术语“非天然氨基酸”包括(但不限于)并非天然存在并且是通过合成而获得或通过修饰非天然氨基酸而获得的氨基酸。
如本发明中所使用，术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸以及其单链或双链形式的聚合物。仅举例来说，这些核酸和核酸聚合物包括(但不限于)(i)天然核苷酸的类似物，其具有与参考核酸类似的结合性质且以类似于天然存在核苷酸的方式代谢；(ii)寡核苷酸类似物，其包括(但不限于)PNA(肽基核酸)、反义技术中所使用的DNA的类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酯等)；(iii)其保守性修饰变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)以及互补序列和明确指出的序列。举例来说，简并密码子取代是通过产生其中一个或一个以上所选(或全部)密码子的第三位置经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes8：91-98(1994))。
如本发明中所使用，术语“氧化剂”是指从被氧化的化合物移除电子的化合物或物质。举例来说，氧化剂包括(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型二硫苏糖醇、氧化型赤藓糖醇(oxidized erythreitol)，以及氧。多种氧化剂适用于本发明中描述的方法和组合物中。
如本发明中所使用，术语“医药学上可接受”是指包括(但不限于)盐、载剂或稀释剂的物质，其不会消除化合物的生物活性或性质，并且相对无毒，即，所述物质经投与到个体而不会造成不良生物作用或以有害方式与含有所述物质的组合物的任一组分相互作用。
如本发明中所使用，术语“光亲和性标记”是指具有特定基团的标记，所述基团在曝露于光之后与对标记具有亲和性的分子形成键联。仅举例来说，此键联可为共价或非共价键联。
如本发明中所使用，术语“光笼化部分”是指在特定波长下照射后与其它离子或分子共价或非共价地结合的基团。
如本发明中所使用，术语“可光裂解的基团”是指在曝露于光之后断裂的基团。
如本发明中所使用，术语“光交联剂”是指包含两个或两个以上在曝露于光之后可与两个或两个以上单体分子或聚合物分子反应并形成共价或非共价键联的官能团的化合物。
如本发明中所使用，术语“可光致异构化部分”是指经光照射后从一种异构形式变为另一种异构形式的基团。
如本发明中所使用，术语“聚烷二醇”是指线性或分枝聚合聚醚多元醇。这些聚烷二醇包括(但不限于)聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。其它例示性实施例是列于(例如)商业供应商目录中，诸如Shearwater Corporation的目录“聚乙二醇和用于生物医学应用的衍生物”(“Polyethylene Glycol andDerivatives for Biomedical Applications”)(2001)。仅举例来说，这些聚合聚醚多元醇具有在所需聚合物分子量范围内的平均分子量。
如本发明中所使用，术语“在所需聚合物分子量范围内”表示介于约0.1kDa与约100kDa之间。举例来说，介于约100Da与约100,000Da或100,000Da以上之间。聚合物的分子量介于(例如)约100Da与约100,000Da之间，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da、1,000Da、900Da、800Da、700Da、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da和100Da。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约100Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物的分子量介于约10,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，聚合物分子是支化聚合物。支链聚合物的分子量介于(例如)约1,000Da与约100,000Da之间，其包括(但不限于)100,000Da、95,000Da、90,000Da、85,000Da、80,000Da、75,000Da、70,000Da、65,000Da、60,000Da、55,000Da、50,000Da、45,000Da、40,000Da、35,000Da、30,000Da、25,000Da、20,000Da、15,000Da、10,000Da、9,000Da、8,000Da、7,000Da、6,000Da、5,000Da、4,000Da、3,000Da、2,000Da和1,000Da。在一些实施例中，支链聚合物的分子量介于约1,000Da与约50,000Da之间。在一些实施例中，支链聚合物的分子量介于约1,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链聚合物的分子量介于约5,000Da与约40,000Da之间。在一些实施例中，支链聚合物的分子量介于约5,000Da与约20,000Da之间。
如本发明中所使用，术语“聚合物”是指由重复子单元构成的分子。这些分子包括(但不限于)多肽、多核苷酸或多糖或聚烷二醇。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本发明中可互换使用来指代氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于对肽的描述以及对蛋白质的描述，且反之亦然。这些术语适用于天然存在氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上的氨基酸残基为非天然氨基酸的氨基酸聚合物。另外，这些“多肽”、“肽”和“蛋白质”包括任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白质，其中氨基酸残基是通过共价肽键键联。
术语“翻译后修饰”是指在天然或非天然氨基酸已通过翻译并入多肽链中之后发生的所述氨基酸的任何修饰。这些修饰包括(但不限于)共翻译活体内修饰、共翻译活体外修饰(诸如在无细胞翻译系统中)、翻译后活体内修饰和翻译后活体外修饰。
如本发明中所使用，术语“前药”或“医药学上可接受的前药”是指在活体内或活体外转化为母体药物的药剂，其中所述物质不会消除药物的生物活性或性质，并且相对无毒，即，所述物质经投与到个体而不会造成不良生物作用或以有害方式与含有所述物质的组合物的任一组分相互作用。前药通常为药物前驱物，在投与个体且随后吸收后，其通过某些过程(诸如通过代谢途径转化)转化为具有活性或具有更高活性的物质。一些前药上所存在的化学基团使得前药的活性较小和/或赋予药物溶解性或一些其它性质。一旦化学基团已经裂解和/或经修饰，就由前药产生活性药物。前药通过酶促反应或非酶促反应在体内转化为活性药物。举例来说，前药提供改良的生理化学性质，诸如更好的溶解性、增强的传递特性(诸如特异性靶向特定细胞、组织、器官或配体)以及改良的药物治疗价值。这些前药的益处包括(但不限于)：(i)与母体药物相比，易于投药；(ii)前药可通过口服生物利用，而母体药物不可以；以及(iii)与母体药物相比，前药在医药组合物中具有改良的溶解性。前药包括活性药物的药理学非活性或活性降低的衍生物。前药经设计以用于(例如)调节药物或生物活性分子的量，其通过操纵药物的性质(诸如生理化学性质、生物医药性质或药物动力学性质)而到达所需作用部位。前药的实施例(不加限制地)可为以酯(“前药”)形式投与以利于穿过水溶性对迁移有害的细胞膜传送的非天然氨基酸多肽，但一旦其处于水溶性有益的细胞内部，前药就随后代谢水解为羧酸(活性实体)。前药也经设计为(例如)可逆药物衍生物，以用作改性剂以增强向位点特异性组织的药物传送。
如本发明中所使用，术语“预防有效量”是指预防性地应用于患者中的含有至少一种非天然氨基酸多肽或至少一种经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物的量，其会在一定程度上减轻所治疗的疾病、病状或病症的一种或一种以上症状。在这些预防性应用中，所述量取决于(例如)患者的健康状况、体重等因素。
如本发明中所使用，术语“经保护”是指存在防止化学反应性官能团在某些反应条件下发生反应的“保护基”或部分。保护基将根据所保护的化学反应性基团的类型而改变。仅举例来说，(i)如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基是选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)；(ii)如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基为邻吡啶基二硫化物；并且(iii)如果化学反应性基团为羧酸(诸如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基为苄基或诸如甲基、乙基或叔丁基等烷基。
仅举例来说，封端/保护基是选自：
Figure A20078004697300601
    
Figure A20078004697300602
    烯丙基     Bn           Cbz         alloc         Me
Figure A20078004697300603
     
Figure A20078004697300604
    
Figure A20078004697300605
  Et      叔丁基         TBDMS           Teoc
Figure A20078004697300606
(C8H5)3C-      
Figure A20078004697300607
  
Figure A20078004697300608
        Boc     pMBn      三苯甲基    乙酰基      Fmoc。
另外，保护基包括(但不限于)以下基团，包括诸如Nvoc和MeNvoc等对光不稳定的基团以及诸如Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons，New York，NY，1999中所述的其它保护基。
如本发明中所使用，术语“放射性部分”是指核自发发出核辐射(诸如α粒子、β粒子或γ粒子)的基团；其中，α粒子为氦核，β粒子为电子，且γ粒子为高能光子。
如本发明中所使用，术语“反应性化合物”是指在适当条件下对另一原子、分子或化合物具有反应性的化合物。
术语“重组宿主细胞”(也称作“宿主细胞”)是指包括外源多核苷酸的细胞，其中用于将外源多核苷酸插入细胞中的方法包括(但不限于)直接摄取、转导或f-配对以产生重组宿主细胞。仅举例来说，所述外源多核苷酸为非整合载体(包括(但不限于)质粒)，或可整合到宿主基因组中。
如本发明中所使用，术语“氧化还原活性剂”是指氧化或还原另一分子的分子，借此氧化还原活性剂被还原或氧化。氧化还原活性剂的实施例包括(但不限于)二茂铁、醌、Ru2+/3+络合物、Co2+/3+络合物和Os2+/3+络合物。
如本发明中所使用，术语“还原剂”是指能够向所还原的化合物追加电子的化合物或物质。举例来说，还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)和还原型谷胱甘肽。仅举例来说，使用这些还原剂来使巯基保持还原状态且减少分子内或分子间二硫键。
如本发明中所使用，术语“树脂”是指高分子量的不溶性聚合物珠粒。仅举例来说，这些珠粒是用作用于固相肽合成的支撑物，或在纯化之前用于附着分子的位点。
如本发明中所使用，术语“糖类”是指一系列碳水化合物，其包括(但不限于)糖、单糖、寡糖和多糖。
如本发明中所使用，术语“安全性”或“安全性概况”是指相对于已投与药物的次数来说与药物投与相关的副作用。举例来说，将已投与多次且只产生温和副作用或无副作用的药物称为具有优良的安全性概况。这种方法用于(例如)评估任何多肽的安全性概况。
如本发明中所使用，术语“自旋标记”是指可通过电子自旋共振光谱加以检测并且可连接到另一分子上的含有展现未成对电子自旋的原子或一组原子(即，稳定顺磁基团)的分子。这些自旋标记分子包括(但不限于)硝酰基和硝基氧，并且为单一自旋标记或双重自旋标记。
如本发明中所使用，术语“化学计量”是指参与化学反应的化合物的摩尔比为约0.9到约1.1。
如本发明中所使用，术语“类化学计量”是指在反应条件改变后或在添加剂存在下变为化学计量或接近化学计量的化学反应。这些反应条件的改变包括(但不限于)温度升高或pH值改变。这些添加剂包括(但不限于)加速剂。
如本发明中所使用，术语“个体”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。仅举例来说，个体为(但不限于)哺乳动物，其包括(但不限于)人类。
如本发明中所使用，术语“实质上经纯化”是指所关注的组分实质上或基本上不含在纯化之前通常伴随所关注的组分或与所关注的组分相互作用的其它组分。仅举例来说，当所关注的组分的制剂含有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以干重计)的污染组分时，所关注的组分为“实质上经纯化”的。因此，“实质上经纯化”的所关注的组分具有约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的纯度水平。仅举例来说，在重组产生的天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的情况下，天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽是从天然细胞或宿主细胞中纯化的。举例来说，当天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的制剂含有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以干重计)的污染物质时，所述制剂为“实质上经纯化”的。举例来说，当天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽是由宿主细胞重组产生时，天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽以细胞干重的约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或1％以下存在。举例来说，当天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽是由宿主细胞重组产生时，天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽以细胞干重的约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或1mg/L以下存在于培养基中。举例来说，“实质上经纯化”的天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽具有如根据适当方法(包括(但不限于)SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳)所测定的约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或更高的纯度水平。
术语“取代基”(也称作“非干扰取代基”)是指用于置换分子上的另一基团的基团。这些基团包括(但不限于)卤基、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C1-C10烷氧基、C5-C12芳烷基、C3-C12环烷基、C4-C12环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯基、二甲苯基、联苯基、C2-C12烷氧基烷基、C5-C12烷氧基芳基、C5-C12芳氧基烷基、C7-C12氧基芳基、C1-C6烷基亚磺酰基、C1-C10烷基磺酰基、-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中m为1到8)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基烷基、-NO2、-CN、-NRC(O)-(C1-C10烷基)、-C(O)-(C1-C10烷基)、C2-C10烷硫基烷基、-C(O)O-(C1-C10烷基)、-OH、-SO2、＝S、-COOH、-NR2、羰基、-C(O)-(C1-C10烷基)-CF3、-C(O)-CF3、-C(O)NR2、-(C1-C10芳基)-S-(C6-C10芳基)、-C(O)-(C6-C10芳基)、-(CH2)m-O-(CH2)m-O-(C1-C10烷基)(其中m各自为1到8)、-C(O)NR2、-C(S)NR2、-SO2NR2、-NRC(O)NR2、-NRC(S)NR2、其盐等。前述列表中的各R基团包括(但不限于)H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基，或烷芳基。当取代基是由其从左向右书写的常规化学式指定时，其同样涵盖由于从右向左书写结构而产生的化学上相同的取代基；举例来说，-CH2O-等于-OCH2-。
仅举例来说，烷基和杂烷基(包括称作亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基包括(但不限于)：-OR、＝O、＝NR、＝N-OR、-NR2、-SR、-卤素、-SiR3、-OC(O)R、-C(O)R、-CO2R、-CONR2、-OC(O)NR2、-NRC(O)R、-NRC(O)NR2、-NR(O)2R、-NR-C(NR2)＝NR、-S(O)R、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-NRSO2R、-CN和-NO2。前述列表中的各R基团包括(但不限于)氢、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的芳基(包括(但不限于)经1或2个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳烷基。当两个R基团与同一个氮原子连接时，其可与所述氮原子组合以形成5元环、6元环或7元环。举例来说，-NR2打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。
举例来说，芳基和杂芳基的取代基包括(但不限于)-OR、＝O、＝NR、＝N-OR、-NR2、-SR、-卤素、-SiR3、-OC(O)R、-C(O)R、-CO2R、-CONR2、-OC(O)NR2、-NRC(O)R、-NRC(O)NR2、-NR(O)2R、-NR-C(NR2)＝NR、-S(O)R、-S(O)2R、-S(O)2NR2、-NRSO2R、-CN、-NO2、-R、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，其数目在零到芳香环系统上的开放价态的总数的范围内；并且其中前述列表中的各R基团包括(但不限于)氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。
如本发明中所使用，术语“治疗蛋白”是指以下多肽/蛋白质中的任一种或全部：α-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗体、抗体片段、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配体、c-kit配体、胶原蛋白、菌落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞激活肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞激活肽、红细胞生成素(EPO)、剥脱性毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维粘连蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血红蛋白、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN家族的任何类干扰素分子或成员、白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经素、中性粒细胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效营养因子、蛋白质A、蛋白质G、pth、致热外毒素A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原激活剂、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体和皮质酮。
如本发明中所使用，术语“治疗有效量”是指投与到已罹患疾病、病状或病症的患者、足以治愈或至少部分阻止或在一定程度上减轻所治疗的疾病、病症或病状的一种或一种以上症状的含有至少一种非天然氨基酸多肽和/或至少一种经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物的量。这些组合物的功效视以下条件而定，所述条件包括(但不限于)疾病、病症或病状的严重性和过程、先前治疗、患者的健康状态和对药物的反应，以及主治医师的判断。仅举例来说，治疗有效量是通过包括(但不限于)剂量递增临床试验的方法来确定。
如本发明中所使用，术语“硫代烷氧基”是指通过氧原子与分子键联的含硫烷基。
术语“热熔点”或Tm是在平衡状态下50％的与标靶互补的探针与标靶序列杂交的温度(在确定离子浓度、pH值和核酸浓度下)。
如本发明中所使用，术语“毒性部分”是指可造成伤害或死亡的化合物。
如本发明中所使用，术语“治疗”包括缓解、缓和或改善疾病或病状症状，预防其它症状，改善或预防症状的潜在代谢病因，抑制疾病或病状，例如，阻止疾病或病状的发展，减轻疾病或病状，使得疾病或病状衰退，减轻由疾病或病状造成的病状，或终止疾病或病状的症状。术语“治疗”包括(但不限于)预防性和/或治疗性治疗。
如本发明中所使用，术语“水溶性聚合物”是指可溶于水性溶剂中的任何聚合物。这些水溶性聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述于揭示这些水溶性聚合物的美国专利第5,252,714号中，所述专利是以引用的方式并入本发明中)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯基醚马来酸酐、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖、纤维素以及纤维素衍生物(包括(但不限于)甲基纤维素和羧甲基纤维素)、血清白蛋白、淀粉以及淀粉衍生物、多肽、聚烷二醇和其衍生物、聚烷二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚和α-β-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺]等，或其混合物。仅举例来说，这些水溶性聚合物与天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的偶合可产生改变，所述改变包括(但不限于)水溶性增加、血清半衰期增加或受到调节、治疗半衰期增加或受到调节(相对于未经修饰的形式)、生物可用性增加、生物活性受到调节、循环时间延长、免疫原性受到调节、物理缔合特性受到调节(包括(但不限于)聚集和多聚物形成、受体结合改变、与一种或一种以上结合搭配物的结合改变，以及受体二聚化或多聚化作用改变)。另外，这些水溶性聚合物视情况具有其自身的生物活性。
除非另外指示，否则使用质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术以及药理学的常规方法。
本发明中呈示的化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、经修饰的非天然氨基酸多肽，和用于制备前述化合物的试剂)包括经同位素标记的化合物，其与以本发明中呈示的各式和结构所叙述的那些化合物相同，但一个或一个以上原子经原子质量或质量数与自然界中通常发现的原子质量或质量数不同的原子置换。可并入本发明化合物中的同位素的实施例包括氢、碳、氮、氧、氟以及氯的同位素，分别为诸如2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、18F、36Cl。本发明中描述的某些经同位素标记的化合物(例如，其中并入诸如3H和14C等放射性同位素的化合物)适用于药物和/或底物组织分布检定。此外，用诸如氘(即2H)等同位素进行取代可提供某些由较高代谢稳定性产生的治疗优点，例如活体内半衰期增加或剂量需求减少。
本发明中的一些化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于制备前述化合物的试剂)具有不对称碳原子，并且因此可以对映异构体或非对映异构体形式存在。可通过文献所记载的方法(例如，通过色谱和/或分级结晶)，基于物理化学差异将非对映异构混合物分离为其个别非对映异构体。通过使对映异构混合物与适当光学活性化合物(例如，醇)反应而将其转化为非对映异构混合物，分离非对映异构体并且使个别非对映异构体转化(例如，水解)为相应纯对映异构体，从而可分离对映异构体。包括非对映异构体、对映异构体和其混合物的所有这些异构体都被视为本发明中所描述的组合物的部分。
在另外或其它的实施例中，本发明中描述的化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于制备前述化合物的试剂)是以前药的形式使用。在另外或其它的实施例中，本发明中描述的化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于制备前述化合物的试剂)在投与到需要产生代谢物的生物体中之后代谢，所述代谢物随后用于产生所需作用，其包括所需治疗作用。在其它或另外的实施例中是非天然氨基酸和“经修饰或未经修饰的”非天然氨基酸多肽的活性代谢物。
本发明中描述的方法和调配物包括使用非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的N-氧化物、结晶形式(也称作多晶型物)或医药学上可接受的盐。另外，本发明中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽可以非溶剂化形式以及与医药学上可接受的溶剂(诸如水、乙醇等)形成的溶剂化形式存在。本发明中呈示的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的溶剂化形式也被视为揭示于本发明中。
本发明中的一些化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于制备前述化合物的试剂)可以若干互变异构形式存在。所有这些互变异构形式都被视为本发明中所描述的组合物的部分。同样，例如本发明中的任何化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于制备前述化合物的试剂)的所有烯醇-酮形式都被视为本发明中所描述的组合物的部分。
本发明中的一些化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于制备前述任一化合物的试剂)呈酸性且与医药学上可接受的阳离子形成盐。本发明中的一些化合物(包括(但不限于)非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽，以及用于制备前述化合物的试剂)呈碱性且因此与医药学上可接受的阴离子形成盐。包括二盐的所有这些盐都在本发明中所描述的组合物的范围内，并且是通过文献所记载的方法来制备。举例来说，视情况通过在水性、非水性或部分水性介质中使酸性实体与碱性实体接触来制备盐。通过使用以下技术中的至少一种来回收盐：过滤；以非溶剂沉淀，接着过滤；蒸发溶剂；或(在水溶液的情况下)冻干。
当母体非天然氨基酸多肽中存在的酸性质子经金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)置换或与有机碱配位时，视情况形成本发明中所揭示的非天然氨基酸多肽的医药学上可接受的盐。另外，视情况使用起始物质或中间物的盐来制备所揭示的非天然氨基酸多肽的盐形式。视情况通过使本发明中所描述的非天然氨基酸多肽的游离碱形式与医药学上可接受的无机酸或有机酸反应来制备呈医药学上可接受的酸加成盐(其为医药学上可接受的盐的类型)形式的本发明中所描述的非天然氨基酸多肽。或者，通过使本发明中所描述的非天然氨基酸多肽的游离酸形式与医药学上可接受的无机碱或有机碱反应来制备呈医药学上可接受的碱加成盐(其为医药学上可接受的盐的类型)形式的本发明中所描述的非天然氨基酸多肽。
医药学上可接受的盐的类型包括(但不限于)：(1)与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸为诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或与有机酸形成的酸加成盐，所述有机酸为诸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、丁二酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基双环-[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖酸、4，4′-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等；(2)当母体化合物中存在的酸性质子经金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)置换或与有机碱配位时所形成的盐。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、缓血酸胺、N-甲基葡糖胺等。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠等。
使用多种方法来分析和鉴别非天然氨基酸多肽医药学上可接受的盐的相应抗衡离子，所述方法包括(但不限于)离子交换色谱、离子色谱、毛细管电泳、感应耦合等离子体、原子吸收光谱、质谱或其任何组合。另外，使用实施例9-17中所描述的技术和方法来测试这些非天然氨基酸多肽医药学上可接受的盐的治疗活性。
应了解，对盐的提及包括其溶剂加成形式或晶体形式，尤其溶剂化物或多晶型物。溶剂化物含有化学计量或非化学计量的量的溶剂，并且通常在结晶过程中由医药学上可接受的溶剂(诸如水、乙醇等)形成。当溶剂为水时形成水合物，或当溶剂为醇时形成醇化物。多晶型物包括相同元素组成的化合物的不同晶体堆积排列。多晶型物通常具有不同的X射线衍射图、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶体形状、光学性质和电学性质、稳定性和溶解性。预期诸如再结晶溶剂、结晶速率和存储温度等各种因素使得单一晶体形式占优势。
使用多种技术来实现非天然氨基酸多肽医药学上可接受的盐的多晶型物和/或溶剂化物的筛检和表征，所述技术包括(但不限于)热分析、X射线衍射、光谱学、蒸气吸附和显微术。热分析方法专注于热化学降解或热物理过程(包括(但不限于)多晶型转变)，并且这些方法用于分析多晶型形式之间的关系，测定重量损失以测得玻璃化转变温度或用于赋形剂相容性研究。这些方法包括(但不限于)差示扫描量热法(DSC)、调制式差示扫描量热法(MDSC)、热重分析(TGA)，以及热重和红外分析(TG/IR)。X射线衍射方法包括(但不限于)单晶和粉末衍射计以及同步加速辐射源。所使用的各种光谱技术包括(但不限于)拉曼光谱、FTIR、UVIS和NMR(液态和固态)。各种显微术技术包括(但不限于)偏振光显微术、伴随能量分散型X射线分析(EDX)的扫描电子显微术(SEM)、伴随EDX的环境扫描电子显微术(在气体或水蒸气气氛中)、IR显微术，以及拉曼显微术。
附图说明
通过参考阐明说明性实施例的具体实施方式可获得对本发明方法和组合物的特征和优点的更好理解，所述实施例中利用本发明方法、组合物、装置和设备的原理，并且附随图式为：
图1为本发明中描述的方法、组合物、策略和技术的某些方面的关系的非限制性图示。
图2为费歇尔(Fischer)吲哚合成的非限制性图示。
图3为用于制备本发明中描述的非天然氨基酸的合成方法的说明性非限制性实施例。
图4为用于制备本发明中描述的非天然氨基酸的合成方法的说明性非限制性实施例。
图5为用于制备本发明中描述的非天然氨基酸的合成方法的说明性非限制性实施例。
图6为用于制备本发明中描述的非天然氨基酸的合成方法的说明性非限制性实施例。
图7为用于制备本发明中描述的非天然氨基酸的合成方法的说明性非限制性实施例。
图8为用于制备本发明中描述的非天然氨基酸的合成方法的说明性非限制性实施例。
图9为用于制备本发明中描述的非天然氨基酸的合成方法的说明性非限制性实施例。
图10为用于制备本发明中描述的非天然氨基酸的合成方法的说明性非限制性实施例。
图11为用于制备本发明中描述的非天然氨基酸的合成方法的说明性非限制性实施例。
图12为金属离子对费歇尔吲哚合成的影响的说明性非限制性实施例。
图13为镍金属离子对用于制备本发明中描述的非天然氨基酸的合成方法的加速作用的说明性非限制性实施例。
图14为溶剂对用于制备本发明中描述的非天然氨基酸的合成方法的作用的说明性非限制性实施例。
图15为在本发明中描述的含吲哚的非氨基酸的合成中所用的含肼的非天然氨基酸试剂的说明性非限制性实施例。
图16为在本发明中描述的含吲哚的非天然氨基酸的合成中所用的含羰基的非天然氨基酸试剂与含经掩蔽羰基的非天然氨基酸试剂的说明性非限制性实施例。
图17为在本发明中描述的含吲哚的非天然氨基酸的合成中所用的含羰基的非天然氨基酸试剂与含经掩蔽羰基的非天然氨基酸试剂的说明性非限制性实施例。
图18为在本发明中描述的含吲哚的非天然氨基酸的合成中所用的含羰基的非天然氨基酸试剂的说明性非限制性实施例。
图19为用含肼的试剂对含羰基的非天然氨基酸多肽进行翻译后修饰以形成经修饰的含吲哚的非天然氨基酸多肽的说明性非限制性实施例。
图20为用含羰基的试剂对含肼的非天然氨基酸多肽进行翻译后修饰以形成经修饰的含吲哚的非天然氨基酸多肽的说明性非限制性实施例。
图21为用含肼的试剂对含羰基的蛋白质与含经掩蔽羰基的蛋白质进行标记或修饰以形成含吲哚的非天然氨基酸蛋白质的说明性非限制性实施例。
图22为用含羰基的试剂对含肼的蛋白质进行标记或修饰以形成含吲哚的非天然氨基酸蛋白质的说明性非限制性实施例。
图23为(A)通过化学转化为含羰基的非天然氨基酸多肽对非天然氨基酸多肽进行修饰和(B)通过化学转化为含肼的非天然氨基酸多肽对非天然氨基酸多肽进行修饰的说明性非限制性实施例。这些非天然氨基酸多肽是用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本发明中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的任何方法、组合物、技术和策略中。
图24A为对含有肼和羰基非天然氨基酸的多肽或蛋白质进行修饰以引入所需官能团的说明性非限制性实施例。这些非天然氨基酸多肽是用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本发明中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的任何方法、组合物、技术和策略中。
图24B为含有官能团的多肽或蛋白质与PEG衍生物的反应的说明性非限制性实施例。这些非天然氨基酸多肽是用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本发明中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的任何方法、组合物、技术和策略中。
图25为使用双官能连接子基团通过形成吲哚来键联含非天然氨基酸的蛋白质或多肽与PEG衍生物的说明性非限制性代表图。
图26为合成两端都含有肼的双官能连接子基团的说明性非限制性实施例。
图27为使用双官能连接子来形成两个非天然氨基酸多肽的同型二聚物的说明性非限制性实施例。
图28为含支化PEG的试剂与含羰基非天然氨基酸的多肽反应形成经吲哚修饰的多肽的说明性非限制性实施例。这些非天然氨基酸多肽是用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本发明中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的任何方法、组合物、技术和策略中。
图29为含支化PEG的试剂与含肼非天然氨基酸的多肽反应形成经吲哚修饰的多肽的说明性非限制性实施例。这些非天然氨基酸多肽是用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本发明中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的任何方法、组合物、技术和策略中。
图30为含有肼和羰基的PEG衍生物的说明性非限制性实施例。
具体实施方式
I.引言
近年来，已报导蛋白质科学中的全新技术，其克服众多与蛋白质的位点特异性修饰相关的限制。具体来说，已将新的组分添加到原核生物大肠杆菌(Escherichia coli；E.coli)(例如，L.Wang等人，(2001)，Science 292：498-500)以及真核生物酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae；S.cerevisiae)(例如，J.Chin等人，Science 301：964-7(2003))的蛋白质生物合成机制中，其使得能够在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中。使用此方法，已回应琥珀密码子TAG而将具有新颖化学、物理或生物性质的许多新颖氨基酸(包括光亲和性标记和可光致异构化氨基酸、酮氨基酸和糖基化氨基酸)有效且高保真地并入大肠杆菌以及酵母中的蛋白质中。例如，参见J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society 124：9026-9027(以全文引用的方式并入)；J.W.Chin和P.G.Schultz，(2002)，ChemBioChem 3(11)：1135-1137(以全文引用的方式并入)；J.W.Chin等人，(2002)，PNAS United States of America 99(71)：11020-11024(以全文引用的方式并入)；以及L.Wang和P.G.Schultz，(2002)，Chem.Comm.，1-11(以全文引用的方式并入)。这些研究已证实有可能选择性地引入蛋白质中不存在的化学官能团，所述官能团对20种常见的遗传性编码氨基酸中存在的所有官能团都呈化学惰性且可用于有效且选择性地反应以形成稳定共价键。
II.概述
图1是本发明中描述的组合物、方法、技术和策略的非限制性实施例。某种程度上，本发明中描述制造和使用包含至少一个非天然氨基酸或具有羰基、肼基或杂环(包括含氮杂环)基团的经修饰非天然氨基酸的多肽的工具(方法、组合物、技术)。羰基包括(但不限于)酮或醛。这些非天然氨基酸视情况含有其它官能团，包括(但不限于)所需官能团。应注意，各种前述官能团并不打算暗示一种官能团的成员不可归类为另一种官能团的成员。当然，其会根据特定情况而重叠。仅举例来说，水溶性聚合物与聚乙二醇的衍生物在范围上重叠，但重叠并不完全并且因此，两种官能团都在上文中被引用。
如图1中所示，一方面是使用本发明中描述的方法、组合物和技术来选择和设计欲修饰的多肽的方法。视情况重新设计新颖多肽，其包括(仅举例来说)作为高通量筛检方法(在这种情况下，设计、合成、表征和/或测试多种多肽)的部分或根据研究人员的兴趣来设计。或者，视情况根据已知或部分表征的多肽的结构来设计新颖多肽。仅举例来说，生长激素基因超家族(Growth Hormone GeneSuperfamily)(见下文)已成为科学团体广泛研究的对象；在一个实施例中，根据这个基因超家族的一个或一个以上成员的结构来设计新颖多肽。选择哪个或哪些氨基酸来进行取代和/或修饰的原则单独描述于本发明中。使用哪种修饰的选择也描述于本发明中，并用于满足实验人员或最终用户的需求。这些需求包括(但不限于)操纵多肽的治疗功效；改良多肽的安全性概况；调节多肽的药物动力学、药理学和/或药效学，仅举例来说，增加水溶性、生物可用性，增加血清半衰期，增加治疗半衰期，调节免疫原性，调节生物活性或延长循环时间。另外，这些修饰包括(仅举例来说)向多肽提供其它官能团；向多肽中并入标签、标记或可检测信号；易化多肽的分离性质；以及前述修饰的任何组合。
本发明中也描述已经修饰或视情况经修饰以含有肼基、羰基或杂环(包括含氮杂环)基团的非天然氨基酸。羰基包括(但不限于)酮和醛。这个方面包括用于制备、纯化、表征和使用这些非天然氨基酸的方法。本发明中描述的另一方面是将至少一个所述非天然氨基酸并入多肽中的方法、策略和技术。这个方面也包括用于制备、纯化、表征和使用含有至少一个所述非天然氨基酸的这些多肽的方法。这个方面同样包括用于制备、纯化、表征和使用可用于制备(至少部分地)含有至少一个非天然氨基酸的多肽的寡核苷酸(包括DNA和RNA)的组合物和方法。这个方面同样包括用于制备、纯化、表征和使用可表达可用于制造(至少部分地)含有至少一个非天然氨基酸的多肽的这些寡核苷酸的细胞的组合物和方法。
因此，本发明中提供和描述包含至少一个非天然氨基酸或具有肼基、羰基或杂环(包括含氮杂环)基团的经修饰的非天然氨基酸的多肽。经羰基修饰的非天然氨基酸包括(但不限于)酮和醛。在某些实施例中，具有至少一个非天然氨基酸或具有肼基、羰基或杂环(包括含氮杂环)基团的经修饰的非天然氨基酸的多肽在所述多肽上的一些位置处包括至少一次共翻译或翻译后修饰。在这些实施例中，经羰基修饰的非天然氨基酸进一步包括(但不限于)酮和醛。在一些实施例中，共翻译或翻译后修饰通过细胞机制(例如，糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰等)发生，在许多情况下，这些基于细胞机制的共翻译或翻译后修饰发生在多肽上的天然存在氨基酸位点处，然而，在某些实施例中，基于细胞机制的共翻译或翻译后修饰发生在多肽上的非天然氨基酸位点上。
在其它实施例中，翻译后修饰并不利用细胞机制，而是通过利用本发明中描述的化学方法或适用于特定反应性基团的其它方法将包含第二反应性基团的分子(包括(但不限于)所需官能团)连接到至少一个包含第一反应性基团的非天然氨基酸(包括(但不限于)含有酮、醛、肼或杂环(包括含氮杂环)官能团的非天然氨基酸)上来提供官能团。在某些实施例中，共翻译或翻译后修饰是在真核细胞或非真核细胞中活体内进行。在某些实施例中，翻译后修饰是不利用细胞机制在活体外进行。这个方面同样包括用于制备、纯化、表征和使用含有至少一个所述经翻译后修饰的非天然氨基酸的这些多肽的方法。
本发明中描述的方法、组合物、策略和技术的范围内也包括能够与作为多肽的部分的非天然氨基酸(含有羰基、酮、酮醛、肼或其经保护形式)反应以产生前述任一翻译后修饰的试剂。一般来说，所得经翻译后修饰的非天然氨基酸应产生至少一种吲哚衍生物。在一些实施例中，所得经修饰的基于吲哚的非天然氨基酸经历后续修饰反应。这个方面也包括用于制备、纯化、表征和使用能够进行所述非天然氨基酸的任何所述翻译后修饰的所述试剂的方法。
在某些实施例中，多肽包括至少一种由一种宿主细胞在活体内进行的共翻译或翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常无法通过另一种宿主细胞类型进行。在某些实施例中，多肽包括至少一种由真核细胞在活体内进行的共翻译或翻译后修饰，其中所述共翻译或翻译后修饰通常无法通过非真核细胞进行。这些共翻译或翻译后修饰的实施例包括(但不限于)糖基化、乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰等。在一个实施例中，共翻译或翻译后修饰包含通过GlcNAc-天冬酰胺键联将寡糖与天冬酰胺连接(包括(但不限于)，其中寡糖包含(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等)。在另一个实施例中，共翻译或翻译后修饰包含通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键联将寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接。分泌信号序列的实施例包括(但不限于)原核分泌信号序列、真核分泌信号序列、关于细菌表达进行5′优化的真核分泌信号序列、新颖分泌信号序列、果胶酸裂解酶分泌信号序列、Omp A分泌信号序列和噬菌体分泌信号序列。分泌信号序列的实施例包括(但不限于)STII(原核)、Fd GIII和M13(噬菌体)、Bgl2(酵母)和源自转位子的信号序列bla。在某些实施例中，蛋白质或多肽可包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合物等。这个方面同样包括用于制备、纯化、表征和使用含有至少一种所述共翻译或翻译后修饰的这些多肽的方法。在其它实施例中，糖基化非天然氨基酸多肽是以非糖基化形式制备。糖基化非天然氨基酸的此类非糖基化形式是视情况由以下方法或任何所述方法的组合产生，所述方法包括以化学或酶促方式从经分离或实质上经纯化或未经纯化的糖基化非天然氨基酸多肽中移除寡糖基团；在不使此类非天然氨基酸多肽糖基化的宿主(所述宿主包括经工程化或突变以不使此类多肽糖基化的原核细胞或真核细胞)中产生非天然氨基酸；向细胞培养基(其中，由通常会使此类多肽糖基化的真核细胞产生此类非天然氨基酸多肽)中引入糖基化抑制剂。本发明中也描述通常经糖基化的非天然氨基酸多肽(通常经糖基化表示当在使天然存在多肽糖基化的条件下制备时会糖基化的多肽)的这些非糖基化形式。当然，通常经糖基化的非天然氨基酸多肽的这些非糖基化形式视情况呈未经纯化形式、实质上经纯化形式或经分离形式。
在替代实施例中，非天然氨基酸多肽含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或十个或十个以上含有羰基、酮基、醛基、肼基、杂环(包括含氮杂环)基团或其经保护形式的非天然氨基酸。非天然氨基酸可相同或不同，例如，蛋白质中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或20个以上不同位点，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或20个以上不同的非天然氨基酸。在某些实施例中，以蛋白质的天然存在形式存在的特定氨基酸中的至少一个(但少于全部)经非天然氨基酸取代。
本发明中提供和描述的方法和组合物包括包含至少一个含有羰基、酮基、醛基、肼基、杂环(包括含氮杂环)基团或其经保护或经掩蔽形式的非天然氨基酸的多肽。将至少一个非天然氨基酸引入多肽中可允许应用包括特定化学反应(包括(但不限于)与一个或一个以上非天然氨基酸反应，而不与通常存在的20种氨基酸反应)的接合化学。一旦并入非天然存在氨基酸侧链，就可通过利用本发明中描述的化学方法或适用于天然编码氨基酸中存在的特定官能团或取代基的化学方法来修饰这些侧链。
本发明中描述的非天然氨基酸方法和组合物提供具有多种官能团、取代基或部分的物质与其它物质(包括(但不限于)所需官能团)的接合物。
在某些实施例中，本发明中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽、连接子和试剂(包括式I-XV化合物和化合物1-4)在水溶液中在适度酸性条件(包括(但不限于)约1到约6的pH值)下稳定。在其它实施例中，这些化合物在适度酸性条件下稳定至少一个月。在其它实施例中，这些化合物在适度酸性条件下稳定至少2周。在其它实施例中，这些化合物在适度酸性条件下稳定至少5天。
本发明中描述的组合物、方法、技术和策略的另一方面是研究或使用前述任一种经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的方法。这个方面中包括(仅举例来说)将会由于包含经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的多肽或蛋白质而获益的治疗、诊断、基于检定、工业、化妆品、植物生物学、环境、能量产生、消费品和/或军事用途。
III.多肽中非天然氨基酸的定位
本发明中描述的方法和组合物包括将一个或一个以上非天然氨基酸并入多肽中。在某些实施例中，在不破坏多肽活性的一个或一个以上特定位置处并入一个或一个以上非天然氨基酸。视情况通过进行“保守性”取代(包括(但不限于)以非天然或天然疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸，以非天然或天然庞大氨基酸取代庞大氨基酸，以非天然或天然亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸)和/或将非天然氨基酸插入不需活性的位置中来实现此并入。尽管对于本发明中描述的非天然氨基酸来说，所述取代尚未可知，但在天然存在氨基酸的基团内进行保守性取代的实践已有文献记载。类似方法视情况用于本发明中描述的非天然氨基酸。
可使用多种生物化学和结构方法来选择多肽内用非天然氨基酸进行取代的所需位点。多肽链的任何位置都适于选择以并入非天然氨基酸，并且对于任何目的来说或在无特定所需目的的情况下，视情况根据合理设计或通过随机选择进行选择。视情况，基于产生具有任何所需性质或活性((包括(但不限于)激动剂、超激动剂、部分激动剂、反向激动剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂、与结合搭配物结合的调节剂、结合搭配物活性调节剂、结合搭配物构象调节剂、二聚物或多聚物形成)、与天然分子相比无活性或性质改变的非天然氨基酸多肽(其视情况经进一步修饰或保持未经修饰)，或操纵多肽的任何物理或化学性质(诸如溶解性、聚集或稳定性)来进行所需位点的选择。举例来说，可使用包括(但不限于)点突变分析、丙氨酸扫描或同系物扫描法的方法来鉴别多肽中需要多肽的生物活性的位置。视多肽所寻求的所需活性而定，除通过包括(但不限于)丙氨酸或同系物扫描诱变的方法鉴别为对生物活性来说较为关键的那些残基之外的残基是用非天然氨基酸取代的良好候选者。或者，再次视多肽所寻求的所需活性而定，经鉴别为对生物活性来说较为关键的位点也是用非天然氨基酸取代的良好候选者。另一代替方法将为用非天然氨基酸简单进行多肽链上每一位置中的连续取代且观察对多肽活性的影响。在任何多肽中选择用非天然氨基酸取代的位置的任何手段、技术或方法都适用于本发明中描述的方法、技术和组合物中。
也可研究含有缺失的多肽的天然存在突变体的结构和活性以确定可能允许用非天然氨基酸取代的蛋白质区域。一旦除去可能无法允许用非天然氨基酸取代的残基，就可使用包括(但不限于)相关多肽和任何缔合配体或结合蛋白的三维结构的方法来研究提出的取代在每一剩余位置上的影响。在蛋白质数据库(ProteinData Bank)(PDB，www.rcsb.org)(含有蛋白质以及核酸的大分子的三维结构数据的集中数据库)中可获得多种多肽的X射线结晶和NMR结构，其可用于鉴别可用非天然氨基酸取代的氨基酸位置。另外，如果无法获得三维结构数据，那么视情况作出模型来研究多肽的二级结构和三级结构。因此，易于获得可用于用非天然氨基酸取代的氨基酸位置的身份。
并入非天然氨基酸的例示性位点包括(但不限于)从潜在受体结合区域中排除的那些位点，或与结合蛋白或配体结合的区域，其完全或部分地对溶剂暴露，与邻近残基具有最小氢键结相互作用或无氢键结相互作用，最低程度地暴露于邻近反应性残基，和/或处于如由特定多肽与其相缔合受体、配体或结合蛋白的三维晶体结构所预测具有高度弹性的区域中。
多种非天然氨基酸视情况取代或并入多肽中的给定位置中。举例来说，根据对多肽与其相缔合配体、受体和/或结合蛋白的三维晶体结构的研究来选择用于并入的特定非天然氨基酸，优选保守性取代。
在一个实施例中，本发明中描述的方法包括向多肽中并入非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸包含第一反应性基团；并且使所述多肽与包含第二反应性基团的分子(包括(但不限于)所需官能团)接触。在某些实施例中，第一反应性基团是羰基部分并且第二反应性基团是肼部分，由此形成吲哚键联。在某些实施例中，第一反应性基团是肼部分并且第二反应性基团是羰基部分，由此形成吲哚键联。
在一些情况下，使非天然氨基酸取代或并入与多肽内的其它添加、取代或缺失组合以影响其它化学、物理、药理和/或生物特性。在一些情况下，其它添加、取代或缺失增加多肽的稳定性(包括(但不限于)对蛋白水解降解的抗性)或增加多肽对其适当受体、配体和/或结合蛋白的亲和性。在一些情况下，其它添加、取代或缺失增加多肽的溶解度(包括(但不限于)，当在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达时)。在一些实施例中，选择用天然编码或非天然氨基酸取代的位点，此外，选择另一位点来并入非天然氨基酸，以增加在大肠杆菌或其它重组宿主细胞中表达后的多肽溶解性。在一些实施例中，多肽包含调节对缔合配体、结合蛋白和/或受体的亲和性、调节(包括(但不限于)增加或减少)受体二聚化、稳定受体二聚物、调节循环半衰期、调节释放或生物可用性、利于纯化，或改良或改变特定投药途径的另一添加、取代或缺失。类似地，非天然氨基酸多肽可包含改良多肽的检测(包括(但不限于)GFP)、通过组织或细胞膜的转运、前药释放或活化、尺寸减小、纯化或其它特性的化学或酶促裂解序列、蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括(但不限于)FLAG或poly-His)或其它基于亲和性的序列(包括(但不限于)FLAG、poly-His、GST等)或键联分子(包括(但不限于)生物素)。
IV.作为范例的生长激素超基因家族
本发明中描述的方法、组合物、策略和技术不限于多肽或蛋白质的特定类型、种类或家族。实际上，几乎任何多肽都可视情况经设计或修饰以包括至少一个本发明中描述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸。仅举例来说，多肽与治疗蛋白同源。
因此，关于生长激素(GH)超基因家族的以下描述是为实现说明性目的并且仅作为实施例来提供，并且不会对本发明中描述的方法、组合物、策略和技术的范围造成限制。此外，本申请案中对GH多肽的提及打算使用其专业术语作为GH超基因家族中的任何成员的实施例。因此，应了解，本发明中关于GH多肽或蛋白质所描述的修饰和化学同样可适用于GH超基因家族中的任何成员，包括本发明中特定列出的那些成员。
以下蛋白质包括由生长激素(GH)超基因家族的基因编码的蛋白质(Bazan，F.，Immunology Today 11：350-354(1990)；Bazan，J.F.Science 257：410-411(1992)；Mott，H.R.和Campbell，I.D.，Current Opinion in Structural Biology 5：114-121(1995)；Silvennoinen，O.和Ihle，J.N.，SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINERECEPTORS(1996))：生长激素、泌乳刺激素、胎盘催乳激素、红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白细胞介素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35次单位)、IL-13、IL-15、抑瘤素M、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、α干扰素、β干扰素、ε干扰素、γ干扰素、ω干扰素、τ干扰素、粒细胞-菌落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞菌落刺激因子(M-CSF)和心肌营养素-1(CT-1)(“GH超基因家族”)。预计这个基因家族的其它成员将来会通过基因克隆和测序加以鉴别。GH超基因家族的成员具有类似的二级结构和三级结构，但其通常具有有限的氨基酸或DNA序列一致性。共同的结构特征使得所述基因家族的新成员易于鉴别且同样适用本发明中描述的非天然氨基酸方法和组合物。
包括G-CSF(Zink等人，FEBS Lett.314：435(1992)；Zink等人，Biochemistry33：8453(1994)；Hill等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5167(1993))、GM-CSF(Diederichs，K.等人，Science 154：1779-1782(1991)；Walter等人，J.Mol.Biol.224：1075-1085(1992))、IL-2(Bazan，J.F.和McKay，D.B.，Science 257：410-413(1992))、IL-4(Redfield等人，Biochemistry 30：11029-11035(1991)；Powers等人，Science 256：1673-1677(1992))和IL-5(Milburn等人，Nature 363：172-176(1993))的众多细胞因子的结构已通过X射线衍射和NMR研究加以确定，并且其展示与GH结构的惊人保守性，但其缺乏显著的一级序列同源性。根据建模和其它研究认为IFN是这个家族的成员(Lee等人，J.Interferon Cytokine Res.15：341(1995)；Murgolo等人，Proteins 17：62(1993)；Radhakrishnan等人，Structure 4：1453(1996)；Klaus等人，J.Mol.Biol.274：661(1997))。包括睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、血小板生成素(TPO)、抑瘤素M、巨噬细胞菌落刺激因子(M-CSF)、IL-3、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IL-13、IL-15和粒细胞-菌落刺激因子(G-CSF)以及诸如α、β、ω、τ、ε和γ干扰素等IFN的大量其它细胞因子和生长因子都属于这个家族(在Mott和Campbell，Current Opinion in Structural Biology 5：114-121(1995)；Silvennoinen和Ihle(1996)SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETICCYTOKINE RECEPTORS中评述)。如今认为所有上述细胞因子和生长因子构成一个大的基因家族。
除了共有类似的二级结构和三级结构之外，这个家族的成员还共有以下性质，即其必须使细胞表面受体寡聚以激活细胞内信号转导途径。一些GH家族成员(包括(但不限于)GH和EPO)与单一类型的受体结合并且使其形成同型二聚物。包括(但不限于)IL-2、IL4和IL-6的其它家族成员与一种以上类型的受体结合并且使这些受体形成异质二聚物或更高级聚集体(Davis等人，(1993)Science 260：1805-1808；Paonessa等人，(1995)EMBO J.14：1942-1951；Mott和Campbell，Current Opinion in Structural Biology 5：114-121(1995))。诱变研究已展示，如同GH一样，这些其它细胞因子和生长因子含有多个受体结合位点(通常两个)，并且依次与其同源受体结合(Mott和Campbell，Current Opinion in Structural Biology5：114-121(1995)；Matthews等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9471-9476)。如同GH一样，这些其它家族成员的主要受体结合位点主要存在于四个α螺旋和A-B环中。参与受体结合的螺旋束中的特定氨基酸在家族成员中有所不同。与GH超基因家族的成员相互作用的大多数细胞表面受体在结构上相关并且构成第二大的多基因家族。例如参见美国专利第6,608,183号，其是以引用的方式并入本发明中以描述GH超基因家族。
由GH超基因家族的多个成员的突变研究得到的一般结论是连接α螺旋的环通常趋向于不参与受体结合。具体来说，对于大多数(若非全部)家族成员中的受体结合来说，短B-C环似乎并非必要。为此，在GH超基因家族的成员中，B-C环视情况经如本发明中所述的非天然氨基酸取代。A-B环、C-D环(以及干扰素/GH超家族的类IL-10成员的D-E环)也视情况经非天然氨基酸取代。最接近螺旋A并且远离最后螺旋的氨基酸也趋向于不参与受体结合，并且也可为用于引入非天然氨基酸的位点。在一些实施例中，非天然氨基酸在包括(但不限于)A-B、B-C、C-D或D-E环的前1、2、3、4、5、6、7或7个以上氨基酸的环结构内的任何位置处进行取代。在一些实施例中，非天然氨基酸在A-B、B-C、C-D或D-E环的后1、2、3、4、5、6、7或7个以上氨基酸内进行取代。
GH家族的某些成员(包括(但不限于)EPO、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IFN、GM-CSF、TPO、IL-10、IL-12p35、IL-13、IL-15和β干扰素)含有N-键联和/或O-键联的糖。蛋白质中的糖基化位点几乎全部存在于环区域中并且不存在于α螺旋束中。因为环区域通常不参与受体结合并且因为其为用于共价连接糖基团的位点，所以其可为将非天然氨基酸取代引入蛋白质中的适用位点。蛋白质中包含N-键联糖基化位点以及O-键联糖基化位点的氨基酸为非天然氨基酸取代的位点，因为这些氨基酸为表面暴露的。因此，天然蛋白质在这些位点处允许连接到蛋白质上的庞大糖基团，并且糖基化位点趋向于位于远离受体结合位点处。
有可能在将来发现GH基因家族的其它成员。可通过预测蛋白质序列的计算机辅助的二级结构和三级结构分析并且通过设计用来鉴别与特定标靶结合的分子的选择技术来鉴别GH超基因家族的新成员。GH超基因家族的成员通常具有四个或五个由非螺旋状氨基酸(环区域)连接的两性分子螺旋。在一些实施例中，蛋白质在其N末端含有疏水信号序列以促进从细胞中分泌。这些后来发现的GH超基因家族成员也包括在本发明中描述的方法和组合物中。
V.非天然氨基酸
本发明中描述的方法和组合物中所使用的非天然氨基酸具有以下四种性质中的至少一种：(1)非天然氨基酸侧链上的至少一个官能团具有至少一种与20种常见的遗传性编码氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)的化学反应性正交，或至少与包括非天然氨基酸的多肽中存在的天然存在氨基酸的化学反应性正交的特征和/或活性和/或反应性；(2)所引入的非天然氨基酸对20种常见的遗传性编码氨基酸实质上呈化学惰性；(3)非天然氨基酸可稳定地并入多肽中，优选地具有与天然存在氨基酸相当的稳定性或在典型生理条件下具有稳定性，且进一步优选地，所述并入可通过活体内系统发生；以及(4)非天然氨基酸包括羰基、酮基、醛基、肼基、杂环(包括含氮杂环)基团(包括吲哚基)或可通过与试剂反应而转变为羰基、酮基、醛基、肼基、杂环(包括含氮杂环)基团(包括吲哚基)的官能团，所述反应优选地在不破坏包括非天然氨基酸的多肽的生物性质的条件下发生(当然，除非此生物性质的破坏为修饰/转变的目的)，或优选其中转变可在水性条件下在介于约1与约6之间的pH值下发生，或优选其中非天然氨基酸上的反应性位点为亲电子位点。可用于本发明中描述的组合物和方法的满足关于非天然氨基酸的所述四种性质的氨基酸的说明性非限制性实施例呈示于图15-18中。可将任何数目的非天然氨基酸引入多肽中。
应注意，虽然图15、图16和图18呈示具有经取代的碳环芳基侧链的氨基酸，但应了解，这些图也揭示经取代的杂芳基侧链。举例来说，图15的每一化合物都具有经取代的苯基侧链；然而，在一些实施例中，苯基是经吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噻吩基或呋喃基置换。因此，碳环芳基侧链只是本发明中包括的多种芳香族基团的说明性实施例。
非天然氨基酸视情况也包括羰基或可转变为羰基的经保护或经掩蔽基团、在经保护基团脱保护或经掩蔽基团去掩蔽后的羰基、肼基或可转变为肼基的经保护或经掩蔽基团。
视情况用于本发明中描述的方法和组合物中的非天然氨基酸包括(但不限于)包含可光活化交联剂的氨基酸、经自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、金属结合氨基酸、含金属的氨基酸、放射性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼化和/或可光致异构化氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸(诸如经糖取代的丝氨酸)、其它经碳水化合物修饰的氨基酸、含酮基的氨基酸、包含聚乙二醇或其它聚醚的氨基酸、经重原子取代的氨基酸、可化学裂解和/或可光裂解的氨基酸、具有与天然氨基酸相比延长的侧链的氨基酸(包括(但不限于)聚醚或长链烃，其包括(但不限于)大于约5个碳或大于约10个碳)、含经碳键联的糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸，以及包含一个或一个以上毒性部分的氨基酸。
在一些实施例中，非天然氨基酸包含糖部分。这些氨基酸的实施例包括N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。这些氨基酸的实施例也包括氨基酸与糖之间的天然存在N-键或O-键由自然界中通常不存在的共价键(包括(但不限于)烯烃、肟、硫醚、酰胺、杂环(包括含氮杂环)、羰基等)代替的实施例。这些氨基酸的实施例也包括天然存在蛋白质中通常不存在的糖类，诸如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。
通过将非天然氨基酸并入多肽中而并入这些多肽中的化学部分提供多种优点和对多肽的操纵。举例来说，独特非天然氨基酸(包括(但不限于)具有二苯甲酮和芳基叠氮化物(包括但不限于苯基叠氮化物侧链)的氨基酸)例如允许蛋白质的有效活体内和活体外光交联。光反应性非天然氨基酸的实施例包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸和对苯甲酰基-苯丙氨酸。具有光反应性非天然氨基酸的多肽随后视情况通过光反应性基团的激发(提供瞬时控制)而任意交联。在非限制性实施例中，非天然氨基酸的甲基经同位素标记取代(包括(但不限于)经甲基取代)，作为局部结构和动力学的探针(包括(但不限于)借助于核磁共振和振动光谱)。
A.非天然氨基酸的结构和合成：肼基、类肼基、经掩蔽肼基以及经保护肼基
含有肼基的非天然氨基酸可与多种羰基和羰基等效基团反应以通过吲哚键联形成接合物。因此，在本发明中描述的某些实施例中是具有包含肼基、类肼基(其具有与肼基类似的反应性并且在结构上与肼基类似)、经掩蔽肼基(其可容易地转化为肼基)或经保护肼基(其在脱保护后具有与肼基类似的反应性)的侧链的非天然氨基酸。这些氨基酸包括具有式(I)的结构的氨基酸：
Figure A20078004697300841
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、经取代亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为
Figure A20078004697300851
R为H、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、经取代亚炔基、羰基或经取代羰基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或R3与R4合起来或两个R3基团合起来视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团合起来形成包含肼基、经保护肼基或经掩蔽肼基的双环或三环环烷基或杂环烷基；
应注意，如果结构J中出现
Figure A20078004697300852
那么这表示J可在任何位置处与B和R连接。作为非限制性实施例，如果J是肼苯基衍生物，那么B和J视情况位于环周围，如下所示：
Figure A20078004697300853
也应进一步注意，环视情况进一步视情况经取代。另外，应注意到，与肼基相邻的至少一个取代基是氢。这些非天然氨基酸视情况呈盐形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
在一个实施例中，A与B都是键，各R3为H并且R4为H。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少一个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少两个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少三个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少四个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少五个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少六个氨基酸。
在某些实施例中，式(I)化合物在水溶液中在适度酸性条件下稳定至少1个月。在某些实施例中，式(I)化合物在适度酸性条件下稳定至少2周。在某些实施例中，式(I)化合物在适度酸性条件下稳定至少5天。在某些实施例中，所述酸性条件是pH值为约2到约8。
另外，包括具有式(II)的结构的以下氨基酸：
Figure A20078004697300861
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、经取代亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、＝N-O-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
R3和R4是独立地选自由氢组成的群组或选自胺保护基，其包括(但不限于)：
Figure A20078004697300871
Figure A20078004697300872
并且
Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、CN、NO2、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k为1、2或3)组成的群组，并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸视情况呈盐形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
在一个实施例中，A与B都是键。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少一个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少两个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少三个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少四个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少五个氨基酸。在另一个实施例中，R1与R2各自为至少六个氨基酸。
另外，包括具有式(III)的结构的以下氨基酸：
Figure A20078004697300873
其中：
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-、-N(R′)-、-S-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；-S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
R3和R4是独立地选自由氢组成的群组或选自胺保护基，其包括(但不限于)：
Figure A20078004697300881
并且
Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k为1、2或3)组成的群组，并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；并且
n为0到8。
这些非天然氨基酸可呈盐形式，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
在另一个实施例中是具有以下结构的式(II)化合物：
Figure A20078004697300883
其中，n为0、1、2、3或4；m为0、1、2、3或4；条件是n+m为1、2、3、4或5；X1和X2独立地为键、O或NH；并且y为0或1。
另外，包括以下氨基酸：
Figure A20078004697300891
其中这些化合物视情况氨基经保护且羧基经保护，或为其盐，或可并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
另外，包括具有式(IV)的结构的以下氨基酸：
Figure A20078004697300892
其中：
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
R3和R4是独立地选自由氢组成的群组或选自胺保护基，其包括(但不限于)：
Figure A20078004697300893
Figure A20078004697300894
并且
Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、CN、NO2、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k为1、2或3)组成的群组，并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
这些非天然氨基酸视情况呈盐形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
另外，包括以下氨基酸：
其中这些化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护且羧基经保护，或为其盐，或视情况并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
B.非天然氨基酸的结构和合成：羰基、类羰基、经掩蔽羰基和经保护羰基
具有亲电子反应性基团的氨基酸可进行多种反应以通过各种化学反应(包括(但不限于)亲核加成反应)键联分子。这些亲电子反应性基团包括羰基(包括酮基或醛基)、类羰基(其具有类似于羰基的反应性并且在结构上与羰基类似)、经掩蔽羰基(其可容易地转化为羰基)，或经保护羰基(其在脱保护后具有与羰基类似的反应性)。这些氨基酸包括具有式(V)的结构的氨基酸：
Figure A20078004697300911
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为
Figure A20078004697300912
Figure A20078004697300913
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基，或当存在一个以上R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或R3与R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团合起来形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经掩蔽羰基(包括经掩蔽二羰基)的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或-J-R基团合起来形成包含至少一个羰基(包括二羰基)、经保护羰基(包括经保护二羰基)或经掩蔽羰基(包括经掩蔽二羰基)的单环或双环环烷基或杂环烷基；
条件是当A为亚苯基并且R3各自为H时，B存在；并且当A为-(CH2)4-并且R3各自为H时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-；并且当A与B都不存在并且R3各自为H时，R不为甲基。
这些非天然氨基酸视情况呈盐形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
在某些实施例中，式(V)化合物在水溶液中在适度酸性条件下稳定至少1个月。在某些实施例中，式(V)化合物在适度酸性条件下稳定至少2周。在某些实施例中，式(V)化合物在适度酸性条件下稳定至少5天。在某些实施例中，所述酸性条件是pH值为约2到约8。
在式(V)化合物的某些实施例中，B为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)(亚烷基或经取代亚烷基)-或-S(O)2(亚烷基或经取代亚烷基)-。在式(I)化合物的某些实施例中，B为-O(CH2)-、-CH＝N-、-CH＝N-NH-、-NHCH2-、-NHCO-、-C(O)-、-C(O)-(CH2)-、-CONH-(CH2)-、-SCH2-、-S(＝O)CH2-或-S(O)2CH2-。在式(V)化合物的某些实施例中，R为C1-6烷基或环烷基。在式(V)化合物的某些实施例中，R为-CH3、-CH(CH3)2或环丙基。在式(V)化合物的某些实施例中，R1为H、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙酰基(TFA)或苄氧羰基(Cbz)。在式(V)化合物的某些实施例中，R1为树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸。在式(V)化合物的某些实施例中，R2为OH、O-甲基、O-乙基或O-叔丁基。在式(V)化合物的某些实施例中，R2为树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸。在式(V)化合物的某些实施例中，R2为多核苷酸。在式(V)化合物的某些实施例中，R2为核糖核酸(RNA)。在式(V)化合物的某些实施例中，R2为tRNA。在式(V)化合物的某些实施例中，tRNA特异性识别选择密码子。在式(V)化合物的某些实施例中，选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子组成的群组。在式(V)化合物的某些实施例中，R2为抑制tRNA。
在式(V)化合物的某些实施例中，是选自由以下各基团组成的群组：
(i)A为经取代低碳亚烷基、C4亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的二价连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-N(R′)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(S)-、-S(O)N(R′)、-S(O)2N(R′)、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)N(R′)-、-N(R′)S(O)2N(R′)、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；
(ii)A是可选的，并且当存在时为经取代低碳亚烷基、C4亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B为选自由以下各基团组成的群组的二价连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-N(R′)、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(S)-、-S(O)N(R′)、-S(O)2N(R′)、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)N(R′)-、-N(R′)S(O)2N(R′)-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-和-C(R′)2-N(R-)-N(R′)-；
(iii)A为低碳亚烷基；
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的二价连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-，和
(iv)A为亚苯基；
B为选自由以下各基团组成的群组的二价连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-；
J为
Figure A20078004697300941
Figure A20078004697300942
R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基，或当存在一个以上R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；
R1是可选的，并且当存在时为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2是可选的，并且当存在时为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R3与R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基；
R′为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
或-A-B-J-R基团合起来形成包含至少一个羰基的双环或三环环烷基或杂环烷基。
另外，包括具有式(VI)的结构的氨基酸：
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(S)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)S(O)kN R′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(NNO2)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(NCOOR′)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
条件是当A为亚苯基时，B存在；并且当A为-(CH2)4-时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-；并且当A与B都不存在时，R不为甲基。这些非天然氨基酸视情况呈盐形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
另外，包括具有式(VII)的结构的氨基酸：
Figure A20078004697300961
其中：
B为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(S)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)S(O)kNR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(NNO2)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(NCOOR′)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、NO2、CN、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；或至少两个Ra合起来形成杂环、杂芳基或芳基。
这些非天然氨基酸视情况呈盐形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
另外，包括以下氨基酸：
Figure A20078004697300971
这些非天然氨基酸为视情况氨基经保护的基团、羧基经保护和/或呈盐形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
另外，包括具有式(VIII)的结构的以下氨基酸：
Figure A20078004697300981
其中：
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(S)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)S(O)kNR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(NNO2)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(NCOOR′)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、CN、NO2、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)k R′(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；并且n为0到8；
条件是当A为-(CH2)4-时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-。这些非天然氨基酸视情况呈盐形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
另外，包括以下氨基酸：
Figure A20078004697300991
其中这些化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护且羧基经保护，或为其盐，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
另外，包括具有式(IX)的结构的以下氨基酸：
Figure A20078004697300993
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(S)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)S(O)kNR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(NNO2)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(NCOOR′)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
Y和Z是独立地选自由-OH、经氧取代的烷基、-SH或经硫取代的烷基组成的群组，并且Y和Z合起来可形成环烷基环。
这些非天然氨基酸视情况呈盐形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
另外，包括具有式(X)的结构的以下氨基酸：
Figure A20078004697301001
其中：
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N R′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(S)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)S(O)kNR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(NNO2)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(NCOOR′)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、CN、NO2、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；或至少两个Ra合起来形成杂环、杂芳基或芳基；并且
Y和Z是独立地选自由-OH、经氧取代的烷基、-SH或经硫取代的烷基组成的群组，并且Y和Z合起来可形成环烷基环。
这些非天然氨基酸视情况呈盐形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
另外，包括以下氨基酸：
Figure A20078004697301011
Figure A20078004697301021
其中这些化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护且羧基经保护，或为其盐，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
另外，包括具有式(XI)的结构的以下氨基酸：
Figure A20078004697301022
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)、-N(R′)C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(S)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)S(O)kNR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(NNO2)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(NCOOR′)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、CN、NO2、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；或至少两个Ra合起来形成杂环、杂芳基或芳基；并且
Y独立地选自由OR″、NR″R″、NC(O)R″组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基。
这些非天然氨基酸视情况呈盐形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
另外，包括以下氨基酸：
Figure A20078004697301031
其中这些化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护且羧基经保护，或为其盐，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
另外，包括具有式(XII)的结构的以下氨基酸：
Figure A20078004697301041
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、CN、NO2、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；或至少两个Ra合起来形成杂环、杂芳基或芳基；
R3和R4独立地为H、卤素、CN、NO2、烷基、经取代烷基、N(R′)2、C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k为1、2或3)，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
X为C、N、O、S；条件是当X为O或S时，R4不可为H、卤素、CN、NO2、烷基、经取代烷基、N(R′)2、C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′；其中k为1、2或3，并且n为0、1或2。
另外，包括以下氨基酸：
Figure A20078004697301042
其中这些化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护且羧基经保护，或为其盐，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
另外，包括具有式(XIII)的结构的以下氨基酸：
Figure A20078004697301051
其中：
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(S)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)S(O)kNR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NCN)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(NNO2)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(NCOOR′)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)和-C(R′)2-NN(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；并且n为0到8，并且
Y和Z是独立地选自由-OH、经氧取代的烷基、-SH或经硫取代的烷基组成的群组，并且Y和Z合起来可形成环烷基环。
这些非天然氨基酸视情况呈盐形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
另外，包括以下氨基酸：
其中这些化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护且羧基经保护，或为其盐，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
另外，包括具有式(XIV)的结构的以下氨基酸：
其中：
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N R′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(S)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)S(O)kNR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-、-N(R′)C(NGN)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)′C(NNO2)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)C(NCOOR′)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；并且n为0到8；并且
Y独立地选自由OR″、NR″R″、NC(O)R″组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基。
这些非天然氨基酸视情况呈盐形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
另外，包括以下氨基酸：
Figure A20078004697301071
其中这些化合物视情况氨基经保护、视情况羧基经保护、视情况氨基经保护且羧基经保护，或为其盐，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
C.含有吲哚基官能团的非天然氨基酸
通过含有肼的非天然氨基酸与含有羰基的试剂之间的反应或含有羰基的非天然氨基酸与含有肼基的试剂之间的反应来制备含有吲哚基团的非天然氨基酸。此反应被称作费歇尔吲哚合成(Fisher indole synthesis)。此反应通常是在强酸和/或金属离子加速剂存在下在极苛刻条件下进行，或在有机溶剂中在回流下进行。图2描述此反应的机理，其包括在芳基肼与羰基化合物之间形成芳基腙中间物，接着进行[3，3]σ移位重排(sigmarropic rearrangement)以在消除氨后形成吲哚产物。
在一个实施例中，羰基与芳基肼之间的反应是在室温下在水性缓冲液中进行。在另一个实施例中，羰基与芳基肼之间的反应是在约1到约6以及约2到约4的pH值下进行。另外，例如通过进行腙中间物形成和重排步骤来加速反应以在不同pH值下形成吲哚。在一个实施例中，腙中间物的形成是在pH 5下实现。在另一个实施例中，重排步骤是在pH 1下进行。图3-6和图8-11描述pH值对费歇尔吲哚合成的影响。
在某些实施例中，使用金属离子来加速吲哚产物的形成速率。图12阐明对吲哚产物的形成速率具有加速作用的金属离子的非限制性实施例。在另一个实施例中，反应环境中有机溶剂的量对吲哚产物的形成速率具有影响。图14描述溶剂对吲哚产物的形成速率的影响。
此反应中所用的试剂视情况进一步与所需官能团键联。在一些实施例中，将非天然氨基酸并入多肽中，在与适当溶剂反应后，在多肽与所关注的分子之间形成接合物。
所述氨基酸包括具有式(XV)的结构的氨基酸：
Figure A20078004697301081
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、经取代亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为
Figure A20078004697301091
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或R3与R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5各自独立地为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、CN、NO2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、L-Y，或当存在一个以上R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；
当存在一个以上R5基团时，两个R5视情况形成杂环烷基或芳香族杂环烷基；
n为0、1、2或3，并且m为0、1、2或3，条件是n或m中的至少一个不为0；
其中，具有相缔合Ra基团的结构1、2、3和4中的各环可含有0、1或2个Ra基团，并且Ra各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基；或当存在一个以上Ra基团时，两个Ra视情况形成芳基、环烷基或杂环烷基；
Y是选自：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；光化辐射可激发的部分；配体；可光致异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂(在这种情况下，生物活性剂可包括具有治疗活性的药剂，并且非天然氨基酸多肽或经修饰的非天然氨基酸可与附属治疗剂一起充当共治疗剂或充当向生物体内的所需位点传递治疗剂的工具)；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸；放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合激活剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管抑素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束和其任何组合；
L是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2N(R′)-N(R′)-，其中k为1、2或3并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
或-A-B-J基团合起来形成包含吲哚部分的双环或三环环烷基或杂环烷基。
在一个实施例中，Y是选自水溶性聚合物；聚氧化烯；聚乙二醇；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；至少一个氨基酸；至少一个糖基；至少一个核苷酸；至少一个核苷；配体；生物素；生物素类似物；可检测标记；和其任何组合。
在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物：
Figure A20078004697301111
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、经取代亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为一端与含吲哚的部分键联的连接子，所述连接子选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-N R′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
n为0、1、2或3，并且m为0、1、2或3，条件是n或m中的至少一个不为0；
其中，具有相缔合Ra基团的结构1、2、3和4中的各环可含有0、1或2个Ra基团，并且Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-O R″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基；或当存在一个以上Ra基团时，两个Ra视情况形成芳基、环烷基或杂环烷基；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或R3与R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5各自独立地为H、卤素、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、OH、NH2、CN、NO2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基，或当存在一个以上R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；
或R5为L-X，其中，X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；光化辐射可激发的部分；配体；可光致异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸；放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合激活剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管抑素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束和其任何组合；并且L是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
当存在一个以上R5基团时，两个邻位R5基团可视情况形成杂环烷基或芳香族杂环烷基；
或含有-B-吲哚的部分合起来形成包含至少一个吲哚部分的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或其活性代谢物、盐或医药学上可接受的前药或溶剂化物。
在一个实施例中，X是选自水溶性聚合物；聚氧化烯；聚乙二醇；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；至少一个氨基酸；至少一个糖基；至少一个核苷酸；至少一个核苷；配体；生物素；生物素类似物；可检测标记；和其任何组合。
在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中A为键、经取代或未经取代的低碳亚烷基，或未经取代或经取代的选自由亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基或亚噻吩基组成的群组的亚芳基。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中A为键。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中A为经取代或未经取代的低碳亚杂烷基。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中A为亚苯基。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中A为经取代低碳亚杂烷基，其中取代基为单一＝O基团。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中A为经取代低碳亚烷基，其中取代基为单一＝O基团。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中B为键、低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R″)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R″)CO-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R″)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)(亚烷基或经取代亚烷基)-或-S(O)2(亚烷基或经取代亚烷基)-。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中B为键。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中B为-O(CH2)-、-NHCH2-、-NHCO-、-C(O)-、-C(O)-(CH2)-、-CONH-(CH2)-、-SCH2-、-S(＝O)CH2-或-S(O)2CH2-。在一些实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中R5为-OH、-NH2或NO2。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中R1为H、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙酰基(TFA)或苄氧羰基(Cbz)。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中R1为树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中R2为OH、O-甲基、O-乙基或O-叔丁基。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中R2为树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中R2为多核苷酸。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中R2为核糖核酸(RNA)。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中R2为tRNA。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中所述tRNA特异性识别选择密码子。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中所述选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子组成的群组。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中R2为抑制tRNA。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中X为选自由肽、蛋白质、酶、抗体、药物、染料、脂质、核苷、寡核苷酸、细胞、病毒、脂质体、微粒和胶束组成的群组的生物活性剂。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中X为选自由抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子和类固醇剂组成的群组的药物。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中X为选自由辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶组成的群组的酶。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中X为选自由荧光部分、磷光部分、化学发光部分、螯合部分、电子致密部分、磁性部分、插入部分、放射性部分、发色团部分和能量转移部分组成的群组的可检测标记。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中X为包含烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基的聚合物。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中所述聚合物包含聚氧化烯或经取代聚氧化烯。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中所述聚合物包含-[(亚烷基或经取代亚烷基)-O-(氢、烷基或经取代烷基)]x，其中x为20-10,000。在另一个实施例中是具有化合物1-4的结构的化合物，其中所述聚合物为具有介于约2KDa到约40KDa范围内的分子量的m-PEG。在某些实施例中，式(XV)化合物在水溶液中在适度酸性条件下稳定至少1个月。在某些实施例中，式(XV)化合物在适度酸性条件下稳定至少2周。在某些实施例中，式(XV)化合物在适度酸性条件下稳定至少5天。在某些实施例中，所述酸性条件是pH值为约2到约8。
所述氨基酸的非限制性实施例包括具有以下结构的氨基酸：
Figure A20078004697301162
或其盐；或在所述化合物的任何位置处并入的多肽。这些非天然氨基酸视情况呈盐形式，或并入非天然氨基酸多肽、聚合物、多糖或多核苷酸中并视情况经翻译后修饰。
在一些实施例中是进一步具有结构5-8的化合物：
Figure A20078004697301171
n为0、1、2或3，并且m为0、1、2或3，条件是n或m中的至少一个不为0；
其中，具有相缔合Ra基团的结构5、6、7和8中的各环可含有0、1或2个Ra基团，并且Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基；或当存在一个以上Ra基团时，两个Ra视情况形成芳基、环烷基或杂环烷基。
在另一个实施例中是具有结构9-12的化合物：
Figure A20078004697301172
其中n为0、1、2、3或4；m为0、1、2、3或4；条件是n+m为1、2、3、4或5；X1和X2独立地为键、O或NH；并且y为0或1。
在另一个实施例中是选自由以下各物组成的群组的化合物：
Figure A20078004697301181
Figure A20078004697301182
或其盐；或在任何化合物的任何位置处并入的多肽。
C.非天然氨基酸的细胞摄取
真核细胞对非天然氨基酸的摄取是在设计和选择非天然氨基酸(包括(但不限于)用于并入蛋白质中)时通常考虑的一个问题。举例来说，α-氨基酸的高电荷密度暗示这些化合物不可能为细胞可渗透的。天然氨基酸是通过一系列基于蛋白质的转运系统而被吸收到真核细胞中。可进行快速筛检以分析哪些非天然氨基酸(如果存在)被细胞吸收。例如，参见标题为“Protein Arrays”的美国专利公开案第2004/198637号(此专利公开案是以全文引用的方式并入本发明中)中的毒性检定，以及Liu，D.R.和Schultz，P.G.(1999)Progress toward the evolution of anorganism with an expanded genetic code.PNAS United States 96：4780-4785。尽管易于用各种检定来分析摄取，但设计适用于细胞摄取途径的非天然氨基酸的替代方案为提供活体内产生氨基酸的生物合成途径。
通常，通过如本发明中所述的细胞摄取产生的非天然氨基酸是以足以进行有效蛋白质生物合成的浓度(包括(但不限于)天然细胞量)产生，但未达到诸如影响其它氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度。以此方式产生的典型浓度为约10mM到约0.05mM。
D.非天然氨基酸的生物合成
许多生物合成途径已存在于用于产生氨基酸和其它化合物的细胞中。虽然特定非天然氨基酸的生物合成方法可能在自然界(包括(但不限于)细胞)中不存在，但本发明中描述的方法和组合物提供这些方法。举例来说，通过加入新的酶或修饰现有宿主细胞途径而视情况在宿主细胞中产生非天然氨基酸的生物合成途径。其它新酶包括天然存在的酶或人工演化的酶。举例来说，对氨基苯丙氨酸的生物合成(如标题为“In vivo incorporation of unnatural amino acids”的WO2002/085923中的实施例中所呈示)依赖于来自其它生物体的已知酶的组合的加入。可通过以包含这些酶的基因的质粒转化真核细胞而将所述基因引入到真核细胞中。当在细胞中表达时，这些基因提供合成所需化合物的酶促途径。本发明中提供视情况加入的酶的类型的实施例。其它酶序列见于(例如)基因库(Genbank)中。人工演化的酶可以相同方式加入到细胞中。以此方式操纵细胞的细胞机制和资源以产生非天然氨基酸。
多种方法可用于制备用于生物合成途径或用于演化现有途径的新颖酶。举例来说，包括(但不限于)如由Maxygen，Inc.(可通过万维网(world wide web)以www.maxygen.com获得)所开发的递归重组可用于开发新颖酶和途径。例如，参见Stemmer(1994)，Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling，Nature370(4)：389-391；和Stemmer，(1994)，DNA shuffling by random fragmentation andreassembly：In vitro recombination for molecular evolution，Proc.Natl.Acad.Sci. USA.，91：10747-10751。类似地，由Genencor(可通过万维网以genencor.com获得)开发的DesignPathTM视情况用于代谢途径工程设计中，其包括(但不限于)用于工程设计在细胞中产生非天然氨基酸的途径。此技术使用新基因的组合(包括(但不限于)通过功能基因组学以及分子进化和设计所鉴别的那些基因)来改造宿主生物体中的现有途径。Diversa Corporation(可通过万维网以diversa.com获得)也提供快速筛检基因库和基因途径的技术，其包括(但不限于)产生通过生物合成产生非天然氨基酸的新途径。
通常，以如本发明中所述的经工程设计的生物合成途径产生的非天然氨基酸是以足以进行有效蛋白质生物合成的浓度(包括(但不限于)天然细胞量)产生，但未达到诸如影响其它氨基酸浓度或耗尽细胞资源的程度。以此方式在活体内产生的典型浓度为约10mM到约0.05mM。一旦以包含用于产生特定途径所需的酶的基因的质粒转化细胞并且产生非天然氨基酸，那么视情况使用活体内选择以针对核糖体蛋白质合成与细胞生长进一步优化非天然氨基酸的产生。
E.其它合成方法
视情况，使用文献记载的方法或使用本发明中描述的技术或由其组合来合成本发明中描述的非天然氨基酸。作为辅助，下表提供视情况经组合以产生所需官能团的各种起始亲电子试剂和亲核试剂。所提供的信息打算为说明性的并且不限制本发明中描述的合成技术。
表1：共价键联和其前驱物的实施例
  共价键联产物   亲电子试剂   亲核试剂
  羧酰胺   活化酯   胺/苯胺
  羧酰胺   酰基叠氮化物   胺/苯胺
  羧酰胺   酰基卤化物   胺/苯胺
  酯   酰基卤化物   醇/酚
  酯   酰基腈   醇/酚
  羧酰胺   酰基腈   胺/苯胺
  亚胺   醛   胺/苯胺
  腙   醛或酮   肼
  肟   醛或酮   羟胺
  烷基胺   烷基卤化物   胺/苯胺
  酯   烷基卤化物   羧酸
  硫醚   烷基卤化物   硫醇
  醚   烷基卤化物   醇/酚
  硫醚   磺酸烷酯   硫醇
  酯   磺酸烷酯   羧酸
  醚   磺酸烷酯   醇/酚
  酯   酐   醇/酚
  羧酰胺   酐   胺/苯胺
  苯硫酚   芳基卤化物   硫醇
  芳基胺   芳基卤化物   胺
  硫醚   氮丙啶(Azindine)   硫醇
  硼酸酯   硼酸盐   二醇
  羧酰胺   羧酸   胺/苯胺
  酯   羧酸   醇
  肼   酰肼   羧酸
  N-酰基脲或酐   碳化二亚胺   羧酸
  酯   重氮烷   羧酸
  硫醚   环氧化物   硫醇
  硫醚   卤基乙酰胺   硫醇
  氨基三嗪   卤基三嗪   胺/苯胺
  三嗪基醚   卤基三嗪   醇/酚
  脒   酰亚胺酯   胺/苯胺
  脲   异氰酸酯   胺/苯胺
  氨基甲酸酯   异氰酸酯   醇/酚
  硫脲   异硫氰酸酯   胺/苯胺
  硫醚   马来酰亚胺   硫醇
  亚磷酸酯   亚磷酰胺   醇
  硅烷基醚   硅烷基卤化物   醇
  烷基胺   磺酸酯   胺/苯胺
  硫醚   磺酸酯   硫醇
  酯   磺酸酯   羧酸
  醚   磺酸酯   醇
  磺酰胺   磺酰基卤化物   胺/苯胺
  磺酸酯   磺酰基卤化物   酚/醇
一般来说，碳亲电子试剂易于受到互补亲核试剂(包括碳亲核试剂)攻击，其中攻击性的亲核试剂向碳亲电子试剂提供电子对以在亲核试剂与碳亲电子试剂之间形成新键。
碳亲核试剂的非限制性实施例包括(但不限于)烷基格氏试剂(alkylGrignard)、烯基格氏试剂、芳基格氏试剂以及炔基格氏试剂、有机锂试剂、有机锌试剂、烷基锡试剂、烯基锡试剂、芳基锡试剂以及炔基锡试剂(有机锡烷)、烷基硼烷试剂、烯基硼烷试剂、芳基硼烷试剂以及炔基硼烷试剂(有机硼烷以及有机硼酸盐)；这些碳亲核试剂在水或极性有机溶剂中具有动力学稳定的优点。碳亲核试剂的其它非限制性实施例包括磷内鎓盐、烯醇和烯醇化物试剂；这些碳亲核试剂具有相对易于由前驱物产生的优点。当与碳亲电子试剂一起使用时，碳亲核试剂在碳亲核试剂与碳亲电子试剂之间形成新的碳-碳键。
适于与碳亲电子试剂偶合的非碳亲核试剂的非限制性实施例包括(但不限于)伯胺与仲胺、硫醇、硫醇盐，以及硫醚、醇、醇盐、叠氮化物、氨基脲等。当与碳亲电子试剂一起使用时，这些非碳亲核试剂通常产生杂原子键联(C-X-C)，其中X为杂原子，其包括(但不限于)氧、硫或氮。
在一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其包含使式(II)化合物与含羰基的化合物反应，其中所述式(II)化合物为：
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、经取代亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为一端与含吲哚的部分键联的连接子，所述连接子选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、＝N-O-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、CN、NO2、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k为1、2或3)组成的群组，并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R3和R4独立地为氢或胺保护基，其包括(但不限于)：
Figure A20078004697301231
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中A为经取代或未经取代的低碳亚烷基，或未经取代或经取代的选自由亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基或亚噻吩基组成的群组的亚芳基。在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中A为经取代或未经取代的低碳亚杂烷基。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中A为经取代低碳亚杂烷基，其中取代基为单一＝O基团。在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中A为经取代低碳亚烷基，其中取代基为单一＝O基团。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中B为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R″)-、-NR″-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R″)CO-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R″)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)(亚烷基或经取代亚烷基)-或-S(O)2(亚烷基或经取代亚烷基)-；其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中B为-O(CH2)-、-NHCH2-、-NHCO-、-C(O)-、-C(O)-(CH2)-、-CONH-(CH2)-、-SCH2-、-S(＝O)CH2-或-S(O)2CH2-。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中R1为H、叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、N-乙酰基、四氟乙酰基(TFA)或苄氧羰基(Cbz)。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中R3和R4为氢、
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中R1为树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸。在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中R2为OH、O-甲基、O-乙基或O-叔丁基。在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中R2为树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸。
在一些实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中式(II)化合物具有以下结构：
Figure A20078004697301241
其中，n为0、1、2、3或4；m为0、1、2、3或4；条件是n+m为1、2、3、4或5；X1和X2独立地为键、O或NH；并且y为0或1。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中R2为多核苷酸。在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中R2为核糖核酸(RNA)。在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中R2为tRNA。在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中所述tRNA特异性识别选择密码子。在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中所述选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子组成的群组。在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中R2为抑制tRNA。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，所述化合物选自由以下各物组成的群组：
Figure A20078004697301242
在一些实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，所述化合物对应于式(IV)：
其中，Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、CN、NO2、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，所述化合物选自由以下各物组成的群组：
Figure A20078004697301252
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其进一步包含使式(V)化合物与含肼的试剂反应；其中所述式(V)化合物为：
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为
Figure A20078004697301261
Figure A20078004697301262
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基，或当存在一个以上R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或R3与R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团合起来形成包含至少一个羰基(包括羰基)、经保护羰基(包括经保护羰基)或经掩蔽羰基(包括经掩蔽羰基)的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或-J-R基团合起来形成包含至少一个羰基(包括羰基)、经保护羰基(包括经保护羰基)或经掩蔽羰基(包括经掩蔽羰基)的单环或双环环烷基或杂环烷基；
条件是当A为亚苯基并且R3各自为H时，B存在；并且当A为-(CH2)4-并且R3各自为H时，B不为-NHC(O)(CH2CH2)-；并且当A与B都不存在并且R3各自为H时，R不为甲基。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，所述化合物对应于式(VI)：
Figure A20078004697301271
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中A为经取代或未经取代的低碳亚烷基，或选自由亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基或方法组成的群组的未经取代或经取代的亚芳基。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中B为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R″)-、-NR″-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R″)CO-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R″)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)(亚烷基或经取代亚烷基)-或-S(O)2(亚烷基或经取代亚烷基)-。在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中B为-O(CH2)-、-NHCH2-、-NHCO-、-C(O)-、-C(O)-(CH2)-、-CONH-(CH2)-、-SCH2-、-S(＝O)CH2-或-S(O)2CH2-。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，所述化合物选自由以下各物组成的群组：
Figure A20078004697301281
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，所述化合物对应于式(VII)：
Figure A20078004697301282
其中，Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，所述化合物选自由以下各物组成的群组：
Figure A20078004697301283
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，所述化合物对应于式(VIII)：
Figure A20078004697301292
其中，Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
Y和Z是独立地选自由-OH、经氧取代的烷基、-SH或经硫取代的烷基组成的群组，并且Y和Z合起来可形成环烷基环。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，所述化合物选自由以下各物组成的群组：
Figure A20078004697301293
Figure A20078004697301301
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，所述化合物对应于式(IX)：
Figure A20078004697301302
其中，Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
Y是独立地选自由OR″、NR″R″、NC(O)R″组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，所述化合物选自由以下各物组成的群组：
Figure A20078004697301303
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，所述化合物对应于式(X)：
Figure A20078004697301311
其中，Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基；或当存在一个以上Ra基团时，两个Ra视情况形成环烷基或杂环烷基；
R3和R4独立地为H、卤素、CN、NO2、烷基、经取代烷基、N(R′)2、C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k为1、2或3)，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
X为C、N或S，条件是当X为O或S时，R4不可为H、卤素、CN、NO2、烷基、经取代烷基、N(R′)2、C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′；其中k为1、2或3，并且n为0、1或2。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，所述化合物选自由以下各物组成的群组：
Figure A20078004697301312
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，所述化合物对应于式(XI)：
Figure A20078004697301321
其中，Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基组成的群组；
Y和Z是独立地选自由-OH、经氧取代的烷基、-SH或经硫取代的烷基组成的群组，并且Y和Z合起来可形成环烷基环。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，所述化合物选自由以下各物组成的群组：
Figure A20078004697301322
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，所述化合物对应于式(XII)：
其中，Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
其中B进一步包含-CH＝N-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-；
n为1、2或3；并且
Y是独立地选自由OR″、NR″R″、NC(O)R″组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，所述化合物选自由以下各物组成的群组：
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中所述化合物可在水溶液中在适度条件下与含羰基的试剂反应。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中所述化合物与含羰基或含经保护羰基的试剂的反应具有以下特征中的至少一个：(i)在约1到约6的pH值范围内发生；(ii)产生在生物条件下稳定的吲哚键联；(iii)具位点特异性；(iv)不会不可逆转地破坏多肽的三级结构；(v)在室温下发生；(vi)容易在水溶液中发生；或(vii)具区域选择性和/或区域专一性。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中适度条件是pH值为约1到约6。在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中适度条件是pH值为约3到约6。在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，反应是在水溶液中在适度条件下进行。
在另一个实施例中是制备结构1或2的化合物的方法，其中式(V)化合物与含肼的试剂的反应具有以下特征中的至少一个：(i)在约1到约6的pH值范围内发生；(ii)产生在生物条件下稳定的吲哚键联；(iii)具位点特异性；(iv)不会不可逆转地破坏多肽的三级结构；(v)容易在室温下发生；(vi)容易在水溶液中发生；或(vii)具区域选择性和/或区域专一性。
VI.具有非天然氨基酸的多肽
为方便起见，这个部分中所描述的化合物的形式、性质和其它特征已经一般性描述和/或用特定实施例加以描述。然而，这个部分中所描述的形式、性质和其它特征不应仅限于这个部分中所提供的一般性描述或特定实施例，而是这个部分中所描述的形式、性质和其它特征同样良好适用于处于式I-XV的范围内的所有化合物和具有结构1-4的化合物，包括处于本发明中的说明书、权利要求以及图式中所描述的式I-XV和具有结构1-4的化合物的范围内的任何子式或特定化合物。
本发明中描述的组合物和方法提供将至少一个非天然氨基酸并入多肽中。非天然氨基酸视情况存在于多肽上的任何位置处，包括多肽的任何末端位置或任何内部位置。相对于同源天然存在氨基酸多肽来说，非天然氨基酸优选不破坏多肽的活性和/或三级结构，除非活性和/或三级结构的所述破坏是将非天然氨基酸并入多肽中的一个目的。此外，相对于同源天然存在氨基酸多肽来说，将非天然氨基酸并入多肽中视情况在一定程度上改变多肽的活性(例如，操纵多肽的治疗功效；改良多肽的安全性概况；调节多肽的药物动力学、药理学和/或药效学(例如，增加水溶性、生物可用性；增加血清半衰期；增加治疗半衰期；调节免疫原性；调节生物活性；或延长循环时间)；向多肽提供其它官能团；向多肽中并入标签、标记或可检测信号；易化多肽的分离性质；以及前述修饰的任何组合)和/或三级结构，而完全不会造成活性和/或三级结构的破坏。尽管相对于同源天然存在氨基酸多肽来说，将非天然氨基酸并入多肽中视情况不会对多肽的活性和/或三级结构产生影响，但对活性和/或三级结构的这些修饰通常是实现这些并入的一个目标。因此，认为非天然氨基酸多肽、包含非天然氨基酸多肽的组合物、用于制造这些多肽和多肽组合物的方法、用于纯化、分离和表征这些多肽和多肽组合物的方法，以及使用这些多肽和多肽组合物的方法都在本发明的范围内。此外，本发明中所描述的非天然氨基酸多肽视情况连接到另一多肽(包括(例如)非天然氨基酸多肽或天然存在氨基酸多肽)上。
多肽是选自(例如)任何已知的治疗蛋白，所述治疗蛋白是已知对患有疾病、病症或病状的人具有治疗作用的蛋白质。仅举例来说，多肽是选自：α-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗体、抗体片段、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配体、c-kit配体、胶原蛋白、菌落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞激活肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞激活肽、红细胞生成素(EPO)、剥脱性毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维粘连蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血红蛋白、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经素、中性粒细胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效营养因子、蛋白质A、蛋白质G、pth、致热外毒素A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM 1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原激活剂、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、尾加压素、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体和皮质酮受体。
本发明中描述的非天然氨基酸多肽视情况通过生物合成或非生物合成来制备。生物合成表示利用翻译系统(细胞或非细胞)的任何方法，其包括使用以下组分中的至少一个：多核苷酸、密码子、tRNA和核糖体。非生物合成表示不利用翻译系统的任何方法：这种方法可进一步分为利用固态肽合成方法、固相肽合成方法的方法；利用至少一种酶的方法；以及不利用至少一种酶的方法；另外，这些子部分中的任何子部分都可与另一子部分重叠，并且许多方法视情况利用这些子部分的组合。
本发明中描述的方法、组合物、策略和技术不限于多肽或蛋白质的特定类型、种类或家族。实际上，本发明中描述的组合物的范围允许几乎任何多肽都包括至少一个本发明中描述的非天然氨基酸。仅举例来说，多肽与治疗蛋白同源。在相关或另一个实施例中，非天然氨基酸多肽与生长激素超基因家族的任何多肽成员同源。
非天然氨基酸多肽视情况如本发明中其它地方所述进一步经修饰，或非天然氨基酸多肽视情况不经进一步修饰而使用。出于多种目的将非天然氨基酸并入多肽中，所述目的包括(但不限于)定制蛋白质结构和/或功能的改变，改变蛋白酶标靶位点的大小、酸性、亲核性、氢键结、疏水性、可接近性，靶向部分(包括(但不限于)，对于多肽阵列)等。包括非天然氨基酸的多肽可具有增强的或甚至全新的催化或生物物理性质。仅举例来说，可通过将非天然氨基酸包括于多肽中来改变以下性质：毒性、生物分布、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化能力、半衰期(包括(但不限于)血清半衰期)、与其它分子反应(包括(但不限于)共价或非共价)的能力等。具有包括至少一个非天然氨基酸的多肽的组合物适用于(包括，但不限于)新颖治疗剂、诊断剂、催化酶、工业酶、结合蛋白(包括(但不限于)抗体)，以及研究(包括(但不限于)对蛋白质结构和功能的研究)。例如，参见Dougherty，(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of ProteinStructure and Function，Current Opinion in Chemical Biology，4：645-652。
此外，多肽的非天然氨基酸组分的侧链向多肽提供多种其它官能团；仅举例来说，且并非加以限制，多肽的非天然氨基酸部分的侧链包括任何所需官能团。
一方面，组合物包括至少一种具有至少一个(包括(但不限于)至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或十个以上)非天然氨基酸的多肽。这些非天然氨基酸视情况相同或不同。另外，多肽中视情况存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20个以上的不同位点，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20个以上的不同或相同非天然氨基酸。另一方面，组合物包括其中存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代的多肽。对于具有一个以上非天然氨基酸的给定多肽来说，这些非天然氨基酸可相同或不同(仅举例来说，多肽可包括两种或两种以上不同类型的非天然氨基酸，或可包括两个相同的非天然氨基酸)。对于具有两个以上非天然氨基酸的给定多肽来说，所述非天然氨基酸可相同、不同或为多个数目的相同种类的非天然氨基酸与至少一个不同的非天然氨基酸的组合。
尽管本发明中描述的非天然氨基酸多肽的实施例是视情况通过固相肽合成方法(仅举例来说，使用固体树脂)、通过溶液相肽合成方法和/或不借助于酶以化学方式合成，但本发明中描述的非天然氨基酸多肽的其它实施例允许通过细胞膜、细胞提取物或溶解产物系统或通过活体内系统(仅举例来说，使用原核细胞或真核细胞的细胞机制)合成。在其它或另外的实施例中，本发明中描述的非天然氨基酸多肽的一种关键特征在于其是利用核糖体来合成。在本发明中描述的非天然氨基酸多肽的其它或另外的实施例中，非天然氨基酸多肽是通过方法的组合(包括(但不限于)固体树脂、不借助于酶、借助于核糖体和/或通过活体内系统的组合)来合成。
通过核糖体和/或活体内系统合成非天然氨基酸多肽具有与用固体树脂或不借助于酶合成的非天然氨基酸多肽不同的优点和特征。这些优点或特征包括不同的杂质分布：利用核糖体的系统和/或活体内系统将具有源自所利用的生物系统的杂质，其包括宿主细胞蛋白质、膜部分和脂质，而来自利用固体树脂和/或不借助于酶的系统的杂质分布可包括有机溶剂、保护基、树脂材料、偶合试剂以及合成程序中使用的其它化学品。另外，通过使用核糖体和/或活体内系统合成的非天然氨基酸多肽的同位素模式可反映细胞所利用的原料的同位素模式；另一方面，用固体树脂和/或不借助于酶合成的非天然氨基酸多肽的同位素模式可反映合成中所利用的氨基酸的同位素模式。此外，通过使用核糖体和/或活体内系统合成的非天然氨基酸可实质上不含氨基酸的D-异构体，和/或可能能够容易地将内部半胱氨酸氨基酸并入多肽的结构中，和/或可能很少提供内部氨基酸缺失多肽。另一方面，通过固体树脂和/或不使用酶合成的非天然氨基酸多肽可具有较高含量的氨基酸的D-异构体和/或较低含量的内部半胱氨酸氨基酸和/或较高百分比的内部氨基酸缺失多肽。此外，应能够区分通过使用核糖体和/或活体内系统合成的非天然氨基酸多肽与通过固体树脂和/或不使用酶合成的非天然氨基酸多肽。
VII.包含核酸和寡核苷酸的组合物和方法
A.用于本发明中的通用重组核酸方法
在本发明中描述的方法和组合物的众多实施例中，将编码所关注的多肽(包括例如GH多肽)的核酸分离、克隆，并且通常使用重组方法使其变异。这些实施例是用于(包括，但不限于)蛋白质表达或产生来源于多肽的变异体、衍生物、表达盒或其它序列的过程中。在一些实施例中，编码多肽的序列是操作性连接于异源启动子上。
本发明中也描述可产生非天然氨基酸多肽的细胞，其中所述多肽上的至少一个非天然氨基酸包含具有羰基、肼、吲哚键联的侧链。所述细胞使用本发明中描述的方法或其变化形式产生所述非天然氨基酸多肽，但通过生物合成产生至少一个非天然氨基酸。可使用本发明中描述的技术、方法、组合物和策略或其变化形式来制备可生物合成至少一个非天然氨基酸的细胞。
可根据母体多肽的氨基酸序列来合成编码包含非天然氨基酸的多肽的核苷酸序列，且随后改变所述核苷酸序列以实现相关氨基酸残基的引入(即，并入或取代)或移除(即，缺失或取代)。可根据文献所记载的方法通过定点诱变来适当修饰核苷酸序列。或者，可通过化学合成来制备核苷酸序列，包括(但不限于)通过使用寡核苷酸合成仪并且优选地选择将产生重组多肽的宿主细胞中所偏爱的那些密码子来制备核苷酸序列，其中寡核苷酸是根据所需多肽的氨基酸序列进行设计。举例来说，可通过PCR、连接或连接链反应来合成并组装编码所需多肽的部分的若干小寡核苷酸。例如，参见Barany等人，Proc.Natl.Acad.Sci.88：189-193(1991)；U.S.6,521,427，其是以引用的方式并入本发明中以揭示前述内容。
本发明中描述的非天然氨基酸方法和组合物利用重组遗传学领域中的技术。揭示用于本发明中描述的非天然氨基酸方法和组合物的通用方法的基础著作包括Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版，2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；以及Current Protocolsin Molecular Biology(Ausubel等人编，1994)。
描述分子生物学技术的一般著作包括Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press，Inc.，SanDiego，CA(Berger)；Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第 2版)，第1卷或第2卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork，1989(″Sambrook″)以及Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.与John Wiley & Sons，Inc.的合资企业，(1999全年增补)(″Ausubel″)。这些著作描述诱变，载体、启动子的使用以及许多其它相关主题，所述相关主题涉及(包括，但不限于)包括用于制备包括非天然氨基酸、正交tRNA、正交合成酶和其对的蛋白质的选择密码子的基因或多核苷酸的产生。
出于多种目的在本发明中描述的非天然氨基酸方法和组合物中使用多种类型的诱变，所述目的包括(但不限于)产生新颖合成酶或tRNA，使tRNA分子突变，使编码合成酶、tRNA库的多核苷酸突变，产生合成酶库，产生选择密码子，插入编码所关注的蛋白质或多肽中的非天然氨基酸的选择密码子。所述诱变包括(但不限于)定点诱变、随机点诱变、同源重组、DNA改组或其它递归诱变方法、嵌合构建、使用含有尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向诱变、经硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用带缺口的双螺旋DNA的诱变等，或其任何组合。其它合适方法包括点错配修复、使用修复缺陷型宿主品系的诱变、限制性选择和限制性纯化、缺失诱变、通过总基因合成进行的诱变、双链断裂修复等。包括(但不限于)涉及嵌合构筑体的诱变也包括在本发明中描述的非天然氨基酸方法和组合物中。在一个实施例中，可由天然存在分子或已变异或突变的天然存在分子的文献所记载的信息(包括(但不限于)序列比较、物理性质、晶体结构等)来指导诱变。
本发明中可见的著作和实施例描述这些和其它相关程序。其它信息可见于以下公开案和其中引用的参考文献中：Ling等人，Approaches to DNA mutagenesis：anoverview，Anal Biochem.254(2)：157-178(1997)；Dale等人，Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method，Methods Mol.Biol.57：369-374(1996)；Smith，In vitro mutagenesis，Ann.Rev.Genet.19：423-462(1985)；Botstein和Shortle，Strategies and applications of in vitromutagenesis，Science 229：1193-1201(1985)；Carter，Site-directed mutagenesis，Biochem.J.237：1-7(1986)；Kunkel，The efficiency of oligonucleotide directedmutagenesis，在Nucleic Acids & Molecular Biology中(Eckstein，F.和Lilley，D.M.J.编，Springer Verlag，Berlin))(1987)；Kunkel，Rapid and efficient site-specificmutagenesis without phenotypic selection，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(1985)；Kunkel等人，Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypicselection，Methods in Enzymol.154，367-382(1987)；Bass等人，Mutant Trprepressors with new DNA-binding specificities，Science 242：240-245(1988)；Methods in Enzymol.100：468-500(1983)；Methods in Enzymol.154：329-350(1987)；Zoller和Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors：anefficient and general procedure for the production of point mutations in any DNAfragment，Nucleic Acids Res.10：6487-6500(1982)；Zoller  和Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors，Methods in Enzymol.100：468-500(1983)；Zoller和Smith，Oligonucleotide-directedmutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primers and asingle-stranded DNA template，Methods in Enzymol.154：329-350(1987)；Taylor等人，The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions toprepare nicked DNA，Nucl.Acids Res.13：8749-8764(1985)；Taylor等人，The rapidgeneration of oligonucleotide-directed mutations at high frequency usingphosphorothioate-modified DNA，Nucl.Acids Res.13：8765-8785(1985)；Nakamaye和Eckstein，Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioategroups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl.Acids Res.14：9679-9698(1986)；Sayers等人，5′-3′Exonucleases in phosphorothioate-basedoligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl.Acids Res.16：791-802(1988)；Sayers等人，Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction withrestriction endonucleases in the presence of ethidium bromide，(1988)Nucl.Acids Res.16：803-814；Kramer等人，The gapped duplex DNA approach tooligonucleotide-directed mutation construction，Nucl.Acids Res.12：9441-9456(1984)；Kramer和Fritz，Oligonucleotide-directed construction of mutations viagapped duplex DNA，Methods in Enzymol.154：350-367(1987)；Kramer等人，Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach tooligonucleotide-directed construction of mutations，Nucl.Acids Res.16：7207(1988)；Fritz等人，Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplex DNAprocedure without enzymatic reactions in vitro，Nucl.Acids Res.16：6987-6999(1988)；Kramer等人，Point Mismatch Repair，Cell 38：879-887(1984)；Carter等人，Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors，Nucl.Acids Res.13：4431-4443(1985)；Carter，Improved oligonucleotide-directed mutagenesisusing M13 vectors，Methods in Enzymol.154：382-403(1987)；Eghtedarzadeh和Henikoff，Use of oligonucleotides to generate large deletions，Nucl.Acids Res.14：5115(1986)；Wells等人，Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing thetransition state of subtilisin，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317：415-423(1986)；Nambiar等人，Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease Sprotein，Science 223：1299-1301(1984)；Sakmar和Khorana，Total synthesis andexpression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guaninenucleotide-binding protein(transducin)，Nucl.Acids Res.14：6361-6372(1988)；Wells等人，Cassette mutagenesis：an efficient method for generation of multiplemutations at defined sites，Gene 34：315-323(1985)；Grundstrom等人，Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ′shot-gun′gene synthesis，Nucl. Acids Res.13：3305-3316(1985)；Mandecki，Oligonucleotide-directed double-strandbreak repair in plasmids of Escherichia coli：a method for site-specific mutagenesis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：7177-7181(1986)；Arnold，Protein engineering forunusual environments，Current Opinion in Biotechnology 4：450-455(1993)；Sieber等人，Nature Biotechnology，19：456-460(2001).W.P.C.Stemmer，Nature 370，389-91(1994)；以及I.A.Lorimer，I.Pastan，Nucleic Acids Res.23，3067-8(1995)。关于这些方法中的一些方法的其它细节可见于Methods in Enzymology第154卷中，所述文献也描述各种诱变方法对故障查找问题的有效控制。
本发明中描述的方法和组合物也包括使用真核宿主细胞、非真核宿主细胞以及生物体通过正交tRNA/RS对在活体内并入非天然氨基酸。用对应于本发明中描述的多肽的多核苷酸或包括对应于本发明中描述的多肽的多核苷酸的构筑体(包括(但不限于)对应于本发明中描述的多肽的载体，其可为(例如)克隆载体或表达载体)使宿主细胞遗传工程化(包括(但不限于)转化、转导或转染)。举例来说，将正交tRNA、正交tRNA合成酶和欲衍生的蛋白质的编码区域操作性连接到在所需宿主细胞中起作用的基因表达控制元件上。载体可呈(例如)质粒、科斯质粒(cosmid)、噬菌体、细菌、病毒、裸露多核苷酸或接合多核苷酸的形式。通过特定方法将载体引入细胞和/或微生物中，所述方法包括电穿孔(Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，5824(1985))、通过病毒载体感染、由具有核酸的小粒子在小珠粒或粒子的基质内或在表面上高速弹道渗透(Klein等人，Nature 327，70-73(1987))等。
可在经改良适于诸如筛检步骤、活化启动子或选择转化株等活动的常规营养培养基中培养经工程化设计的宿主细胞。可视情况将这些细胞培养到转基因生物体中。包括(但不限于)关于细胞分离和培养(例如，关于后续核酸分离)的其它有用参考文献包括Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，第3版，Wiley-Liss，New York以及其中引用的参考文献；Payne等人，(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons，Inc.NewYork，NY；Gamborg和Phillips(编)(1995)Plant Cell，Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg NewYork)以及Atlas和Parks(编)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRCPress，Boca Raton，FL。
可使用将标靶核酸引入细胞中的数种方法，其中任一方法都可用于本发明中描述的方法和组合物中。这些方法包括：将受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、基因枪法(projectile bombardment)和经病毒载体(在本发明中进一步论述)感染等。细菌细胞可用于扩增含有对应于本发明中描述的多肽的DNA构筑体的质粒的数目。使细菌生长到对数生长期并且可通过多种方法分离细菌内的质粒(例如参见Sambrook)。另外，可购得众多试剂盒以用于从细菌中纯化质粒(例如参见EasyPrepTM、FlexiPrepTM，两者都来自Pharmacia Biotech；StrataCleanTM，来自Stratagene；以及QIAprepTM，来自Qiagen)。然后，进一步操纵经分离并纯化的质粒以产生其它质粒，将其用于转染细胞或并入用于感染生物体的相关载体中。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列，以及适用于调节特定标靶核酸的表达的启动子。载体视情况包含通用表达盒，其含有至少一个独立的终止子序列、允许所述表达盒在真核细胞或原核细胞或两者中复制的序列(包括(但不限于)穿梭载体)以及用于原核系统与真核系统两者的选择标记。载体适于在原核细胞、真核细胞或优选两者中复制和整合。参见Gillam和Smith，Gene 8：81(1979)；Roberts等人，Nature，328：731(1987)；Schneider，E.等人，Protein Expr.Purif.6(1)：10-14(1995)；Ausubel，Sambrook，Berger(都同上文)。适用于克隆的细菌和噬菌体的目录由(例如)ATCC提供，例如，ATCC出版的The ATCC Catalogue of bacteria and bacteriophage(1992)Gherna等人(编)。用于测序、克隆和分子生物学的其它方面的其它基本程序以及潜在理论考虑因素也见于Watson等人，(1992)Recombinant DNA，第2版，Scientific American Books，NY中。另外，基本上任何核酸(以及实质上任何经标记核酸，无论标准或非标准)都可从多种商业来源的任一个定制或标准定购，这些商业来源诸如the MidlandCertified Reagent Company(Midland，TX mcrc.com)、The Great American GeneCompany(Ramona，CA，通过万维网以genco.com获得)、ExpressGen Inc.(Chicago，IL，通过万维网以expressgen.com获得)、Operon Technologies Inc.(Alameda，CA)以及许多其它来源。
B.选择密码子
本发明中描述的方法和组合物中所涵盖的选择密码子扩充蛋白质生物合成机制的遗传密码子框架。举例来说，选择密码子包括(但不限于)独特三碱基密码子、无义密码子(诸如终止密码子，包括(但不限于)琥珀密码子(UAG)或蛋白石密码子(UGA))、非天然密码子、四个或四个以上碱基的密码子、稀有密码子等。可引入所需基因或多核苷酸中的选择密码子的数目范围广泛，包括(但不限于)在编码所关注的多肽的至少一部分的单一多核苷酸中存在一个或一个以上、两个或两个以上、三个或三个以上、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上选择密码子。
在一个实施例中，所述方法涉及使用作为终止密码子的选择密码子以在活体内并入一个或一个以上的非天然氨基酸。举例来说，产生识别终止密码子(包括(但不限于)UAG)的O-tRNA并且通过O-RS用所需非天然氨基酸使O-tRNA氨酰基化。天然存在宿主的氨酰基-tRNA合成酶无法识别此O-tRNA。可使用定点诱变在所关注的多肽中的所关注位点处引入终止密码子(包括(但不限于)UAG)。例如，参见Sayers，J.R.等人，(1988)，5′，3′Exonuclease in phosphorothioate-basedoligomicleotide-directed mutagenesis.Nucleic Acids Res.，16(3)：791-802。当在活体内组合O-RS、O-tRNA和编码所关注的多肽的核酸时，回应UAG密码子而并入非天然氨基酸以得到在指定位置处含有非天然氨基酸的多肽。
也可利用稀有密码子来编码非天然氨基酸。举例来说，当活体外蛋白质合成反应中的精氨酸浓度降低时，证明稀有精氨酸密码子AGG有效用于通过经丙氨酸酰化的合成tRNA插入Ala。例如参见Ma等人，Biochemistry.32：7939(1993)。在这种情况下，合成tRNA与作为大肠杆菌中的次要物质存在的天然存在tRNAArg竞争。一些生物体并不使用所有三联体密码子。已利用藤黄微球菌(Micrococcus luteus)中的未指定密码子AGA在活体外转录/翻译提取物中插入氨基酸。例如参见Kowal和Oliver，Nucl.Acid.Res.，25：4685(1997)。在一个实施例中，可产生本发明中描述的组合物和方法的组分以在活体内使用这些稀有密码子。
活体内并入非天然氨基酸可在不显著干扰真核宿主细胞的情况下进行。举例来说，因为UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包括(但不限于)琥珀抑制tRNA)与真核释放因子(包括(但不限于)eRF)(其结合终止密码子，并起始正在生长的肽从核糖体中的释放)之间的竞争，所以抑制效率可通过(包括，但不限于)增加O-tRNA和/或抑制tRNA的表达水平来进行调节。
选择密码子还包含延长密码子，包括(但不限于)四个或四个以上碱基的密码子，诸如四个、五个、六个或六个以上碱基的密码子。四碱基密码子的实施例包括(但不限于)AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五碱基密码子的实施例包括(但不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本发明中描述的方法和组合物的特征包括使用基于移码抑制(frameshiftsuppression)的延长密码子。四个或四个以上碱基的密码子可将(包括，但不限于)一个或一个以上非天然氨基酸插入同一个蛋白质中。举例来说，在存在具有反密码子环(例如，具有至少8-10nt的反密码子环)的突变O-tRNA(包括(但不限于)特定移码抑制tRNA)的情况下，将四个或四个以上碱基的密码子读作单一氨基酸。在其它实施例中，反密码子环可解码(包括，但不限于)至少一个四碱基密码子、至少一个五碱基密码子或至少一个六碱基密码子或更多碱基的密码子。因为存在256种可能的四碱基密码子，所以可使用四个或四个以上碱基的密码子在同一细胞中编码多个非天然氨基酸。参见Anderson等人，(2002)Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size，Chemistry and Biology，9：237-244；Magliery，(2001)Expanding the Genetic Code：Selection of EfficientSuppressors of Four-base Codons and Identification of″Shifty″Four-base Codonswith a Library Approach in Escherichia coli.J.Mol.Biol.307：755-769。
举例来说，已经使用活体外生物合成方法利用四碱基密码子将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参见Ma等人，(1993)Biochemistry，32：7939-7945；和Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，121：34-40。使用CGGG和AGGU，从而在活体外利用两个化学酰化的移码抑制tRNA同时将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物并入抗生物素蛋白链菌素中。例如参见Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，121：12194-12195。在活体内研究中，Moore等人检查具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可为U、A、G或C)的能力，并且发现四联体UAGA可通过具有UCUA反密码子的tRNALeu以13％到26％的效率解码，其中在0或-1框架中极少解码。参见Moore等人，(2000)J.Mol.Biol.，298：195-205。在一个实施例中，可在本发明中描述的方法和组合物中使用基于稀有密码子或无义密码子的延长密码子，其可减少其它不合需要的位点处的错义通读和移码抑制。
对于给定系统来说，选择密码子也可包括一个天然三碱基密码子，其中内源性系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。举例来说，这包括缺乏识别天然三碱基密码子的tRNA的系统，和/或三碱基密码子为稀有密码子的系统。
选择密码子视情况包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩充现有的遗传符号系统。一个额外的碱基对使三联体密码子的数目从64增加到125。第三碱基对的性质包括稳定并具选择性的碱基配对、通过聚合酶以高保真性有效地酶促并入DNA中以及在合成新的非天然碱基对之后有效的持续引物延伸。对可适于方法和组合物的非天然碱基对的描述包括(例如)Hirao等人，(2002)Anunnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein，NatureBiotechnology，20：177-182，并且还参见Wu，Y.等人(2002)J.Am.Chem.Soc.124：14626-14630。其它相关公开案列于本发明中。
对于活体内使用来说，非天然核苷是膜可渗透的并且经磷酸化以形成相应的三磷酸盐。另外，增加的遗传信息为稳定的并且不受细胞酶破坏。Benner和其它人先前的工作利用不同于典型Watson-Crick配对的氢键结模式，其中最值得注意的实施例是iso-C:iso-G配对。例如参见Switzer等人，(1989)J.Am.Chem.Soc，111：8322-8322；和Piccirilli等人，(1990)Nature，343：33-37；Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.，4：602-608。这些碱基通常在一定程度上与天然碱基错配并且不能酶促复制。Kool和同事证实碱基之间的疏水性堆积相互作用可代替氢键结来驱动碱基对的形成。参见Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.，4：602-608；以及Guckian和Kool，(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，36(24)：2825-2828。在开发满足所有上述要求的非天然碱基对的工作中，Schultz、Romesberg和同事已系统地合成并研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS:PICS自身配对比天然碱基对稳定，并且可通过大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段(Klenow fragment)(KF)有效地并入DNA中。例如参见McMinn等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，121：11585-11586；和Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，122：3274-3278。可通过KF以足以用于生物功能的效率和选择性合成3MN：3MN自身配对。例如参见Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，122：8803-8804。然而，这两种碱基都充当用于进一步复制的链终止子。突变DNA聚合酶近来已得到发展，其可用于复制PICS自身配对。另外，也可复制7AI自身配对。例如参见Tae等人，(2001)J.Am.Chem.Soc，123：7439-7440。也已开发出在结合Cu(II)后形成稳定配对的新颖金属碱基对Dipic:Py。参见Meggers等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，122：10714-10715。因为延长密码子和非天然密码子固有地与天然密码子正交，所以本发明中描述的非天然氨基酸方法可利用这一性质来产生正交tRNA以供其使用。
也可使用翻译旁路系统(translational bypassing system)将非天然氨基酸并入所需多肽中。在翻译旁路系统中，将大序列并入基因中，但并未将其翻译成蛋白质。所述序列含有充当诱导核糖体跳过所述序列并在插入下游重新开始翻译的提示的结构。
在某些实施例中，本发明中描述的方法和/或组合物中所关注的蛋白质或多肽(或其部分)是由核酸编码。通常，核酸包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上的选择密码子。
可在“Mutagenesis and Other Molecular Biology Techniques”指导下使用(例如)本发明中描述的方法对编码所关注的蛋白质或多肽的基因进行诱变，从而使其包括(例如)一个或一个以上的选择密码子以并入非天然氨基酸。举例来说，对所关注的蛋白质的核酸进行诱变以使其包括一个或一个以上的选择密码子，从而提供一个或一个以上的非天然氨基酸的并入。本发明中描述的方法和组合物包括例如包括至少一个非天然氨基酸的任何蛋白质的任何这种变异体(包括(但不限于)突变体)形式。类似地，本发明中描述的方法和组合物包括相应核酸，即，具有一个或一个以上编码一个或一个以上非天然氨基酸或允许所述非天然氨基酸的活体内并入的选择密码子的任何核酸。
可容易地使编码所关注的多肽(包括(仅举例来说)GH多肽)的核酸分子突变以在多肽的任何所需位置处引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将反应性分子、水溶性聚合物、蛋白质或多种其它分子引入所关注的蛋白质上。适于将半胱氨酸并入多肽的所需位置中的方法包括美国专利第6,608,183号(其是以引用的方式并入本发明中以揭示前述揭示内容)中所述的方法，以及诱变技术。这种引入并利用半胱氨酸的技术的使用可与本发明中描述的引入并利用非天然氨基酸的技术联合使用。
VIII.包含非天然氨基酸的多肽的活体内产生
为方便起见，这部分中描述的包含非天然氨基酸的多肽的活体内产生已经一般性描述和/或用特定实施例加以描述。然而，这部分中所描述的包含非天然氨基酸的多肽的活体内产生不应仅限于这部分中所提供的一般描述或特定实施例，而是这部分中所描述的包含非天然氨基酸的多肽的活体内产生同样良好适用于处于式I-XV的范围内的所有化合物，包括处于本发明中的说明书、权利要求以及图式中所描述的式I-XV的范围内的任何子式或特定化合物。
可使用经修饰以添加或取代在天然存在系统中未编码的氨基酸的tRNA和tRNA合成酶在活体内产生本发明中描述的多肽。
产生使用在天然存在系统中未编码的氨基酸的tRNA和tRNA合成酶的方法描述于(例如)标题为“In vivo incorporation of unnatural amino acids”的美国专利第7,045,337号和标题为“Methods and compositions for the production oforthogonal tRNA-aminoacyl tRNA synthetases pairs”的美国专利第7,083,970号中，所述专利都是以引用的方式并入本发明中。这些方法涉及产生独立于翻译系统的内源性(且因此有时称作“正交”)合成酶和tRNA起作用的翻译机制。在一个实施例中，翻译系统包含编码多肽的多核苷酸；所述多核苷酸可为从相应DNA转录的mRNA，或所述mRNA可从RNA病毒载体中产生；此外，所述多核苷酸包含对应于并入非天然氨基酸的预先指定位点的选择密码子。翻译系统进一步包含包括非天然氨基酸的tRNA，其中所述tRNA对前述选择密码子具有特异性；在其它实施例中，非天然氨基酸经氨酰基化。在其它或另外的实施例中，翻译系统包含对tRNA具有特异性的氨酰基合成酶，并且在其它或另外的实施例中，翻译系统包含正交tRNA和正交氨酰基tRNA合成酶。在其它或另外的实施例中，翻译系统包含以下各物中的至少一个：包含前述多核苷酸的质粒(通常呈DNA的形式)、包含前述多核苷酸的基因组DNA(通常呈DNA的形式)或前述多核苷酸已整合于其中的基因组DNA(在其它实施例中，所述整合为稳定整合)。在翻译系统的其它或另外的实施例中，选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子组成的群组。在翻译系统的其它或另外的实施例中，tRNA为抑制tRNA。在其它或另外的实施例中，非天然氨基酸多肽是由核糖体合成。
在其它或另外的实施例中，翻译系统包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)。通常，在翻译系统中O-RS优先用至少一个非天然氨基酸使O-tRNA氨酰基化并且O-tRNA识别至少一个由系统中的其它tRNA无法识别的选择密码子。为回应所编码的选择密码子，翻译系统因此将非天然氨基酸插入系统中所产生的多肽中，从而将非天然氨基酸“取代”到所编码的多肽中的位置中。
用于将特定合成氨基酸插入多肽中的多种正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶通常适用于本发明中描述的方法中以产生本发明中描述的非天然氨基酸多肽。举例来说，酮基特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶是描述于Wang，L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(1)：56-61(2003)和Zhang，Z.等人，Biochem.42(22)：6735-6746(2003)中。例示性O-RS或其部分是由多核苷酸序列编码并且包括美国专利第7,045,337号和第7,083,970号(其各自是以全文引用的方式并入本发明中)中所揭示的氨基酸序列。与O-RS一起使用的相应O-tRNA分子也描述于美国专利第7,045,337号和第7,083,970号中，所述专利是以全文引用的方式并入本发明中。另外，Mehl等人，J.Am.Chem.Soc.2003；125：935-939以及Santoro等人，Nature Biotechnology 2002年10月；20：1044-1048(其是以全文引用的方式并入本发明中)论述筛检方法以及用于将对氨基苯丙氨酸并入多肽中的氨酰基tRNA合成酶和tRNA分子。
适用于本发明中描述的方法中的例示性O-tRNA序列包括(但不限于)如美国专利第7,045,337号(其是以引用的方式并入本发明中)中所揭示的核苷酸序列SEQ ID NO：1或2。对特定非天然氨基酸具有特异性的O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对的其它实施例描述于美国专利第7,083,970号中，所述专利是以全文引用的方式并入本发明中。在酿酒酵母中结合含酮基氨基酸与含叠氮基氨基酸两者的O-RS和O-tRNA描述于Chin，J.W.等人，Science 301：964-967(2003)中。
O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的使用涉及选择编码非天然氨基酸的特异性密码子。尽管可使用任何密码子，但通常需要选择很少或从不在表达O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的细胞中使用的密码子。仅举例来说，例示性密码子包括诸如终止密码子(琥珀密码子、赭石密码子和蛋白石密码子)等无义密码子、四个或四个以上碱基的密码子以及很少使用或不使用的其它天然三碱基密码子。
可使用诱变方法(包括(但不限于)定点诱变、盒式诱变、限制选择诱变等)将特异性选择密码子引入多核苷酸编码序列中的适当位置中。
产生可用于并入非天然氨基酸的蛋白质生物合成机制的组分(诸如O-RS、O-tRNA和正交O-tRNA/O-RS对)的方法描述于Wang，L.等人，Science 292：498-500(2001)；Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)；Zhang，Z.等人，Biochemistry 42：6735-6746(2003)中。用于活体内并入非天然氨基酸的方法和组合物描述于美国专利第7,045,337号中，所述专利是以全文引用的方式并入本发明中。用于选择用于生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美国专利第7,045,337号和第7,083,970号中，所述专利都是以全文引用的方式并入本发明中。另外，标题为“Site Specific Incorporation of Keto AminoAcids into proteins”的PCT公开案第WO 04/035743号(其是以全文引用的方式并入)描述用于并入酮基氨基酸的正交RS和tRNA对。标题为“Expanding theEukaryotic Genetic Code”的PCT公开案第WO 04/094593号(其是以全文引用的方式并入本发明中)描述用于将非天然编码的氨基酸并入真核宿主细胞中的正交RS和tRNA对。
用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法包含：(a)产生来源于来自第一生物体的至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况突变体)RS库，所述第一生物体包括(但不限于)原核生物体，仅举例来说，詹氏甲烷球菌、热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌、嗜热栖热菌等，或真核生物体；(b)选择(和/或筛检)RS(视情况突变体RS)库中在非天然氨基酸和天然氨基酸的存在下氨酰基化正交tRNA(O-tRNA)的成员，从而提供活性(视情况突变体)RS的池；和/或(c)选择(视情况通过阴性选择)所述池中在不存在非天然氨基酸的情况下优先氨酰基化O-tRNA的活性RS(包括(但不限于)突变体RS)，从而提供至少一种重组O-RS；其中至少一种重组O-RS优先用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰基化。
在一个实施例中，RS为非活性RS。可通过使活性RS突变来产生非活性RS。仅举例来说，可通过使至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个或至少约10个或10个以上的氨基酸突变为不同氨基酸(包括(但不限于)丙氨酸)来产生非活性RS。
可使用各种技术来产生突变体RS库，所述技术包括(但不限于)根据蛋白质三维RS结构的合理设计，或随机或合理设计技术中RS核苷酸的诱变。仅举例来说，可通过定点突变、随机突变、产生多样性的重组突变、嵌合构筑体、合理设计以及本发明中描述的其它方法来产生突变体RS。
在一个实施例中，选择(和/或筛检)RS(视情况突变体RS)库中的活性成员(包括(但不限于)在非天然氨基酸和天然氨基酸的存在下氨酰基化正交tRNA(O-tRNA)的成员)包括(但不限于)：将阳性选择或筛检标记(包括(但不限于)抗生素抗性基因等)和(视情况突变体)RS库引入多个细胞中，其中阳性选择和/或筛检标记包含至少一个选择密码子，其包括(但不限于)琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子以及四碱基密码子；在选择剂存在下使所述多个细胞生长；通过抑制阳性选择或筛检标记中的至少一个选择密码子来鉴别在选择和/或筛检剂的存在下存活(或展示特异性反应)的细胞，从而提供含有活性(视情况突变体)RS池的阳性选择细胞的子集。视情况，选择和/或筛检剂浓度可改变。
一方面，阳性选择标记为氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因，并且选择密码子为CAT基因中的琥珀终止密码子。其它选择标记包括(但不限于)新霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、潮霉素抗性基因或任何其它可用的抗性基因。视情况，阳性选择标记为β-内酰胺酶基因，并且选择密码子为β-内酰胺酶基因中的琥珀终止密码子。另一方面，阳性筛检标记包含荧光或发光筛检标记或基于亲和性的筛检标记(包括(但不限于)细胞表面标记)。
在一个实施例中，阴性选择或筛检池中的活性RS(视情况突变体)(包括(但不限于)在不存在非天然氨基酸的情况下优先氨酰基化O-tRNA的活性RS)包括(但不限于)：利用来自阳性选择或筛检的活性(视情况突变体)RS池将阴性选择或筛检标记引入第二生物体的多个细胞中，其中阴性选择或筛检标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)抗生素抗性基因，其包括(但不限于)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因)；并且，鉴别在补充有非天然氨基酸以及筛检或选择剂的第一培养基中存活或展示特异性筛检反应，但在未补充有非天然氨基酸以及选择或筛检剂的第二培养基中不能存活或不展示特异性反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛检细胞。仅举例来说，CAT鉴别方案视情况充当确定适当O-RS重组体的阳性选择和/或阴性筛检。例如，视情况在含有具有或不具有一个或一个以上非天然氨基酸的CAT(其包含至少一个选择密码子)的生长培养盘上复制克隆池。因此，认为仅在含有非天然氨基酸的培养盘上生长的菌落含有重组O-RS。一方面，选择(和/或筛检)剂的浓度有所改变。在一些方面，第一生物体与第二生物体不同。因此，第一生物体和/或第二生物体视情况包含：原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。在其它实施例中，筛检标记包含荧光或发光筛检标记或基于亲和性的筛检标记。
在另一个实施例中，筛检或选择(包括(但不限于)阴性选择)池中的活性(视情况突变体)RS包括(但不限于)：分离来自阳性选择步骤(b)的活性突变体RS的池；将阴性选择或筛检标记(其中阴性选择或筛检标记包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)毒性标记基因，其包括(但不限于)核糖核酸酶barnase基因，所述基因包含至少一个选择密码子))和活性(视情况突变体)RS的池引入第二生物体的多个细胞中；并且鉴别在未补充非天然氨基酸的第一培养基中存活或展示特异性筛检反应，但在补充有非天然氨基酸的第二培养基中不能存活或不展示特异性筛检反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛检细胞，其中至少一种重组O-RS对非天然氨基酸具有特异性。一方面，至少一个选择密码子包含约两个或两个以上的选择密码子。这些实施例视情况可包括其中至少一个选择密码子包含两个或两个以上的选择密码子，并且其中第一生物体与第二生物体不同(包括(但不限于)，每一生物体视情况为(包括，但不限于)原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等)。此外，一些方面包括其中阴性选择标记包含核糖核酸酶barnase基因(其包含至少一个选择密码子)。其它方面包括其中筛检标记视情况包含荧光或发光筛检标记或基于亲和性的筛检标记。在本发明中的实施例中，筛检和/或选择视情况包括筛检和/或选择严格度的变化。
在另一个实施例中，产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法可进一步包含：(d)分离至少一种重组O-RS；(e)产生来源于至少一种重组O-RS的第二组O-RS(视情况突变)；以及(f)重复步骤(b)和(c)，直到获得包含优先氨酰基化O-tRNA的能力的突变O-RS。视情况，重复步骤(d)-(f)(包括，但不限于)至少约两次。一方面，来源于至少一种重组O-RS的第二组突变O-RS可通过诱变(包括(但不限于)随机诱变、定点诱变、重组或其组合)产生。
在上述方法中，选择/筛检步骤(包括(但不限于)阳性选择/筛检步骤(b)、阴性选择/筛检步骤(c)或阳性和阴性选择/筛检步骤(b)和(c)两者)的严格度视情况包括改变选择/筛检严格度。在另一个实施例中，阳性选择/筛检步骤(b)、阴性选择/筛检步骤(c)或阳性和阴性选择/筛检步骤(b)和(c)两者包含使用报导基因，其中所述报导基因是由荧光活化细胞分选技术(FACS)进行检测或其中所述报导基因是通过发光进行检测。视情况，在细胞表面、噬菌体呈现等上呈现报导基因，并且根据涉及非天然氨基酸或类似物的亲和性或催化活性来选择报导基因。在一个实施例中，将突变合成酶呈现在细胞表面、噬菌体呈现等上。
产生重组正交tRNA(O-tRNA)的方法包括(但不限于)：(a)产生来源于至少一种tRNA(包括(但不限于)来自第一生物体的抑制tRNA)的突变体tRNA的库；(b)选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛检在来自第一生物体的RS不存在的情况下由来自第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(视情况突变体)tRNA的库，从而提供tRNA(视情况突变体)的池；以及(c)选择或筛检tRNA(视情况突变体)的池中由引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA；其中所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子并且无法由来自第二生物体的RS有效识别，并且由O-RS优先氨酰基化。在一些实施例中，至少一种tRNA为抑制tRNA和/或包含天然和/或非天然碱基的独特三碱基密码子，或为无义密码子、稀有密码子、非天然密码子、包含至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石终止密码子。在一个实施例中，重组O-tRNA具有正交性的改良。应了解，在一些实施例中，在无需修饰的情况下视情况将O-tRNA从第二生物体引入到第一生物体中。在多个实施例中，第一生物体与第二生物体相同或不同并且视情况选自(包括，但不限于)原核生物(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、热自养甲烷杆菌、大肠杆菌、嗜盐菌等)、真核生物、哺乳动物、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。另外，重组tRNA视情况经非天然氨基酸氨酰基化，其中非天然氨基酸是天然地或通过遗传操纵在活体内生物合成。视情况将非天然氨基酸加入到至少第一生物体或第二生物体的生长培养基中，其中所述非天然氨基酸能够达到适当细胞内浓度以允许并入非天然氨基酸多肽中。
一方面，选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛检库中由氨酰基-tRNA合成酶(步骤(b))氨酰基化的(视情况突变体)tRNA包括：将毒性标记基因(其中所述毒性标记基因包含至少一个选择密码子(或导致产生毒性剂或静态剂的基因或生物体必需的基因，其中这种标记基因包含至少一个选择密码子))和(视情况突变体)tRNA的库引入来自第二生物体的多个细胞中；以及，选择存活细胞，其中所述存活细胞含有包含至少一种正交tRNA或非功能性tRNA的(视情况突变体)tRNA的池。举例来说，可通过使用比较比率细胞密度检定来选择存活细胞。
另一方面，毒性标记基因可包括两个或两个以上的选择密码子。在本发明中描述的方法的另一个实施例中，毒性标记基因为核糖核酸酶barnase基因，其中所述核糖核酸酶barnase基因包含至少一个琥珀密码子。视情况，核糖核酸酶barnase基因可包括两个或两个以上的琥珀密码子。
在另一个实施例中，选择或筛检(视情况突变体)tRNA的池中由引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员可包括：将阳性选择或筛检标记基因(其中所述阳性标记基因包含药物抗性基因(包括(但不限于)β-内酰胺酶基因，其包含至少一个选择密码子，诸如至少一个琥珀终止密码子)或生物体必需的基因，或使得毒性剂解毒的基因)以及O-RS和(视情况突变体)tRNA的池引入来自第二生物体的多个细胞中；以及，鉴别在选择或筛检剂(包括(但不限于)抗生素)的存在下生长的存活细胞或筛检细胞，从而提供具有至少一种重组tRNA的细胞池，其中所述至少一种重组tRNA是由O-RS氨酰基化并且回应所述至少一个选择密码子而将氨基酸插入由阳性标记基因编码的翻译产物中。在另一个实施例中，选择和/或筛检剂的浓度存在改变。
提供产生特异性O-tRNA/O-RS对的方法。方法包括(但不限于)：(a)产生来源于来自第一生物体的至少一种tRNA的突变体tRNA的库；(b)阴性选择或筛检库中在来自第一生物体的RS不存在的情况下由来自第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(视情况突变体)tRNA，从而提供(视情况突变体)tRNA的池；(c)选择或筛检(视情况突变体)tRNA的池中由引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子并且无法由来自第二生物体的RS有效识别，并且由O-RS优先氨酰基化。所述方法也包括(d)产生来源于来自第三生物体的至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(视情况突变体)RS的库；(e)选择或筛检突变体RS的库中在非天然氨基酸和天然氨基酸的存在下优先氨酰基化所述至少一种重组O-tRNA的成员，从而提供活性(视情况突变体)RS的池；以及(f)阴性选择或筛检池中在不存在非天然氨基酸的情况下优先氨酰基化所述至少一种重组O-tRNA的活性(视情况突变体)RS，从而提供至少一种特异性O-tRNA/O-RS对，其中所述至少一种特异性O-tRNA/O-RS对包含至少一种对非天然氨基酸具有特异性的重组O-RS和至少一种重组O-tRNA。由本发明中描述的方法产生的特异性O-tRNA/O-RS对包括在本发明中描述的范围和方法中。举例来说，特异性O-tRNA/O-RS对可包括(包括，但不限于)mutRNATyr-mutTyrRS对(诸如mutRNATyr-SS12TyrRS对)、mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对等。另外，这些方法包括其中第一生物体与第三生物体相同(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌)。
用于选择用于第二生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也包括在本发明中描述的方法中。所述方法包括(但不限于)：将标记基因、tRNA以及从第一生物体分离或来源于第一生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)引入来自第二生物体的第一组细胞中；将标记基因和tRNA引入来自第二生物体的双重复细胞组中；以及，选择不能在双重复细胞组中存活的第一组中的存活细胞或筛检展示特异性筛检反应而在双重复细胞组中不能产生这种反应的细胞，其中第一组和双重复细胞组是在选择或筛检剂存在下生长，其中存活细胞或筛检细胞包含用于第二生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一个实施例中，比较以及选择或筛检包括活体内互补检定。选择或筛检剂的浓度可改变。
本发明中描述的生物体包含多种生物体以及多种组合。在一个实施例中，生物体视情况为原核生物体，其包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌、嗜热栖热菌等。或者，生物体为真核生物体，其包括(但不限于)植物(包括(但不限于)复杂植物，诸如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌(包括(但不限于)酵母等)、动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等。
A.在非真核细胞和真核细胞中的表达
这部分中所揭示的技术可应用于本发明中描述的非天然氨基酸多肽的非真核细胞和真核细胞中的表达。所述表达系统进一步描述于美国专利申请案第号中。
如本发明中所述的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供合成较大适用量的包含非天然氨基酸的多肽的能力。一方面，组合物视情况包括(但不限于)至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或1克以上的包含非天然氨基酸的多肽，或可通过活体内多肽产生方法(本发明中提供关于重组蛋白产生和纯化的细节)得到的量的所述多肽。另一方面，多肽视情况以在(包括，但不限于)细胞溶解产物、缓冲液、医药缓冲液或其它液体悬浮液(包括(但不限于)约1nl到约100L或100L以上的体积)中(包括，但不限于)每升至少10微克多肽、每升至少50微克多肽、每升至少75微克多肽、每升至少100微克多肽、每升至少200微克多肽、每升至少250微克多肽、每升至少500微克多肽、每升至少1毫克多肽或每升至少10毫克多肽或每升10毫克以上的多肽的浓度存在于组合物中。在包括至少一个非天然氨基酸的真核细胞中产生大量(包括(但不限于)大于通过其它方法(包括(但不限于)活体外翻译)得到的典型量)蛋白质是本发明中描述的方法、技术和组合物的特征。
如本发明中所述的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供生物合成较大适用量的包含非天然氨基酸的多肽的能力。举例来说，包含非天然氨基酸的多肽可以在细胞提取物、细胞溶解产物、培养基、缓冲液等中(包括，但不限于)至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20毫克/升、30毫克/升、40毫克/升、50毫克/升、60毫克/升、70毫克/升、80毫克/升、90毫克/升、100毫克/升、200毫克/升、300毫克/升、400毫克/升、500毫克/升、600毫克/升、700毫克/升、800毫克/升、900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或10克/升以上的蛋白质的浓度产生。
这个部分中所揭示的技术可应用于本发明中描述的非天然氨基酸多肽的表达系统、培养和分离。非天然氨基酸多肽可在任何数目的合适表达系统(包括(但不限于)酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌)中表达。
一旦已建立重组宿主细胞株(即，已将表达构筑体引入宿主细胞中并且分离具有适当表达构筑体的宿主细胞)，就在适于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞株。重组宿主细胞株的培养方法应取决于所利用的表达构筑体的性质和宿主细胞的身份。通常使用文献所记载的方法来培养重组宿主细胞株。通常在含有可吸收的碳、氮和无机盐来源并且视情况含有维生素、氨基酸、生长因子和其它蛋白质培养补充剂的液体培养基中培养重组宿主细胞。用于培养宿主细胞的液体培养基可视情况含有防止不需要的微生物生长的抗生素或抗真菌剂和/或包括(但不限于)用于选择含有表达载体的宿主细胞的抗生素的化合物。
重组宿主细胞可以分批或连续形式培养，其中细胞收集(在所需多肽在细胞内积聚的情况下)或培养物上清液的收集为分批或连续形式。对于原核宿主细胞中的产生来说，优选分批培养和细胞收集。如果通过细胞或细胞系表达系统来实现蛋白质表达，那么可以多种模式(包括(但不限于)在整个培养物主体内以悬浮形式生长的非锚定依赖性细胞，或作为需要与固体底物连接以进行增殖的锚定依赖性细胞(即，单层类型的细胞生长))使细胞在活体外增殖。来自连续建立的细胞系的非锚定依赖性或悬浮液培养物是用于大规模产生细胞和细胞产物的最广泛使用的手段。此外，可根据如上所述的多种产生考虑因素来选择细胞类型和增殖模式。
在一个实施例中，本发明中描述的非天然氨基酸多肽是在重组系统中表达之后进行纯化。可通过多种文献所记载的方法从宿主细胞或培养基中纯化多肽。通常，在细菌宿主细胞中产生的多种多肽可溶性较差或不可溶(呈包涵体的形式)。在一个实施例中，为增大重组产生的多肽的溶解性，利用本发明中所揭示的方法可容易地在所选择的多肽中进行氨基酸取代。在不溶性多肽的情况下，所述多肽可通过离心或过滤从宿主细胞溶解产物中收集并且可进一步接着进行细胞的均质化。在可溶性较差的多肽的情况下，可加入包括(但不限于)聚乙烯亚胺(PEI)的化合物以诱发部分可溶性多肽的沉淀。随后，可通过离心或过滤方便地收集沉淀的多肽。可使用文献所记载的方法将重组宿主细胞破碎或均质化以从细胞内释放包涵体。可使用文献广泛记载的方法进行宿主细胞破碎或均质化，所述方法包括(但不限于)酶促细胞破碎、超声波降解、杜恩斯均质化(dounce homogenization)或高压释放破碎。在本发明中描述并涵盖的方法的一个实施例中，使用高压释放技术来破碎大肠杆菌宿主细胞以释放多肽的包涵体。当处理多肽的包涵体时，由于诸如溶解、机械剪切或蛋白质水解等因素，将重复均质化时间最小化以便最大化包涵体的产率而不造成损失为有利的。
随后，可使用文献所记载的众多合适溶解剂中的任一个使不溶性或沉淀的多肽溶解。举例来说，用尿素或盐酸胍溶解多肽。溶解多肽的体积应最小化，以便可使用可方便处理的批量大小来进行大批量制备。在重组宿主可以体积为数千升的批量生长的大规模商业装置中，此因素可为重要的。另外，当在大规模商业装置中制造多肽时，尤其对于人类医药用途来说，如果可能的话，应避免可能损坏机器和容器或多肽产物本身的苛性化学品。在本发明中描述并涵盖的方法中已展示，可使用较温和变性剂尿素代替较苛性变性剂盐酸胍来溶解多肽包涵体。尿素的使用显著地降低对在多肽的制造和纯化过程中所用的不锈钢设备造成损坏的风险，同时有效溶解多肽包涵体。
在可溶性多肽的情况下，肽可分泌到周质空间或培养基中。另外，可溶性肽可存在于宿主细胞的细胞质中。可溶性肽可在进行纯化步骤之前加以浓缩。可使用文献所记载的方法(包括(但不限于)本发明中描述的方法)从(例如)细胞溶解产物或培养基中浓缩可溶性肽。另外，可使用文献所记载的方法(包括(但不限于)本发明中描述的方法)破碎宿主细胞并且从宿主细胞的细胞质或周质空间中释放可溶性肽。
当以融合蛋白形式制备多肽时，优选去除融合序列。可通过包括(但不限于)酶促裂解或化学裂解的方法来实现融合序列的去除，其中优选酶促裂解。可使用文献所记载的方法来实现融合序列的酶促去除。用于去除融合序列的酶的选择将根据融合体的身份来确定，并且反应条件将根据酶的选择来指定。可使用包括(但不限于)溴化氰、TEV蛋白酶和其它试剂的试剂来实现化学裂解。视情况，通过文献所记载的方法从裂解的融合序列中纯化裂解的多肽。这些方法将由融合序列和多肽的身份和性质来确定。纯化方法可包括(但不限于)尺寸排阻色谱、疏水性相互作用色谱、离子交换色谱或透析或其任何组合。
也视情况纯化多肽以从蛋白质溶液中去除DNA。可通过文献所记载的方法来去除DNA，所述方法包括(但不限于)沉淀或离子交换色谱。在一个实施例中，通过用核酸沉淀剂(诸如(但不限于)硫酸鱼精蛋白)沉淀来去除DNA。可使用文献所记载的方法(包括(但不限于)离心或过滤)将多肽与沉淀的DNA分离。在将使用多肽来治疗人类的情况下，宿主核酸分子的去除是一个重要因素，并且本发明中描述的方法将宿主细胞DNA降低到医药学上可接受的水平。
小规模或大规模发酵的方法也可用于蛋白质表达中，所述方法包括(但不限于)发酵罐、振荡烧瓶、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、转瓶培养系统以及搅拌槽生物反应器系统。这些方法中的每一个都可以分批、分批馈料或连续模式方法进行。
通常可使用文献所记载的方法来回收本发明中描述的人类形式的非天然氨基酸多肽。举例来说，可将培养基或细胞溶解产物离心或过滤以去除细胞碎片。可将上清液浓缩或稀释到所需体积或渗滤到合适缓冲液中以调节制剂以便用于进一步纯化。本发明中描述的非天然氨基酸多肽的进一步纯化包括(但不限于)使多肽变异体的脱酰胺和截短形式与相应完整形式分离。
根据文献所记载的方法，可将本发明中描述的方法和组合物中所涵盖的多肽(包括(但不限于)包含非天然氨基酸的多肽、包含非天然氨基酸的多肽的抗体、包含非天然氨基酸的多肽的结合搭配物)部分纯化或实质上纯化为均质。因此，可根据文献所记载的方法来回收和纯化本发明中描述的多肽，所述方法包括(但不限于)硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱提取、柱色谱、亲和柱色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水性相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、凝集素色谱、凝胶电泳以及其任何组合。在制备恰当折叠的成熟蛋白时，必要时可使用蛋白再折叠步骤。在需要高纯度的最终纯化步骤中可使用高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其它合适方法。在一个实施例中，使用针对非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的多肽)制备的抗体作为纯化试剂，从而(包括，但不限于)用于包含一个或一个以上非天然氨基酸的多肽的基于亲和性的纯化。必要时，在部分地纯化或纯化到均质后，视情况将多肽用于多种效用，包括(但不限于)用作检定组分、治疗剂、预防剂、诊断剂、研究试剂和/或用作抗体制备的免疫原。
在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中制备包含至少一个非天然氨基酸的多肽的一个优点在于，所述多肽通常会以其天然构象进行折叠。然而，在本发明中描述的方法和组合物的某些实施例中，在合成、表达和/或纯化之后，多肽可具有不同于相关多肽的所需构象的构象。在本发明中描述的方法和组合物的一方面中，视情况使所表达的蛋白质变性并且随后使其复性。此可选的变性和复性是利用文献所记载的方法来实现，所述方法包括(但不限于)将伴侣蛋白(chaperonin)添加到所关注的多肽中，以及将多肽溶解在离液剂(包括(但不限于)盐酸胍)中，并且利用蛋白二硫化物异构酶。
一般来说，有时需要使所表达的多肽变性和还原，并且随后使所述多肽再折叠成优选构象。举例来说，可通过将胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣蛋白加入到所关注的翻译产物中来实现所述再折叠。使蛋白质还原、变性和复性的方法包括上述参考文献，以及Debinski等人，(1993)J.Biol.Chem.，268：14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconjug.Chem..4：581-585；和Buchner，等人，(1992)Anal.Biochem.，205：263-270。举例来说，Debinski等人描述胍-DTE中包涵体蛋白的变性和还原。可在含有(包括，但不限于)氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中使蛋白质再折叠。再折叠试剂可流动或以其它方式移动以与一种或一种以上的多肽或其它表达产物接触，或一种或一种以上的多肽或其它表达产物也可流动或以其它方式移动以与再折叠试剂接触。
在原核制备非天然氨基酸多肽的情况下，如此制备的多肽可能会错误折叠并且因此缺乏生物活性或具有降低的生物活性。可通过“再折叠”来恢复蛋白质的生物活性。在一个实施例中，通过使用(例如)一种或一种以上的离液剂(包括(但不限于)尿素和/或胍)以及能够还原二硫键的还原剂(包括(但不限于)二硫苏糖醇、DTT或2-巯基乙醇、2-ME)溶解(其中多肽也为不溶性的)、展开并还原多肽链而使错误折叠的多肽再折叠。在中等浓度的离液剂下，随后加入氧化剂(包括(但不限于)氧、胱氨酸或胱胺)，其允许再形成二硫键。可使用文献所记载的方法使展开或错误折叠的多肽再折叠，所述方法诸如美国专利第4,511,502号、第4,511,503号和第4,512,922号中所述的方法，所述专利的每一个都是以引用的方式并入本发明中以揭示前述揭示内容。多肽也可与其它蛋白质共折叠以形成异二聚物或异多聚物。在再折叠或共折叠之后，视情况将多肽进一步纯化。
在纯化之后，可将非天然氨基酸多肽交换到不同缓冲液中和/或通过文献所记载的方法(包括(但不限于)渗滤和透析)使其浓缩。以单一纯化蛋白质形式提供的hGH可经历聚集和沉淀。在某些实施例中，经纯化的非天然氨基酸多肽可为至少90％纯(如由反相高效液相色谱(RP-HPLC)或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)所测量)。在某些其它实施例中，经纯化的非天然氨基酸多肽可为至少95％纯，或至少98％纯，或至少99％纯或具有更高纯度。无论非天然氨基酸多肽的纯度的确切数值如何，非天然氨基酸多肽都足够纯以便用作医药产品或用于进一步加工(包括(但不限于)与诸如PEG等水溶性聚合物接合)。
在某些实施例中，非天然氨基酸多肽分子在不存在其它活性成分或蛋白质(除了赋形剂、载剂以及稳定剂、血清白蛋白等)的情况下可用作治疗剂，并且在某些实施例中，非天然氨基酸多肽分子可与另一种多肽或聚合物复合。
可使用多种方法和程序来分析含有一个或一个以上非天然氨基酸的多肽的产率和纯度，所述方法和程序包括(但不限于)与蛋白质染色法联合的SDS-PAGE、免疫印迹法、质谱、基质辅助激光解吸/电离-质谱(MALDI-MS)、液相色谱/质谱、等电聚焦、分析型阴离子交换、色谱聚焦和圆二色谱。举例来说，这些用于表征蛋白质的方法和程序包括(但不限于)Bradford检定、SDS-PAGE和银染色SDS-PAGE、考马斯染色SDS-PAGE(coomassie stained SDS-PAGE)。其它方法包括(但不限于)去除内毒素的步骤。内毒素是位于革兰氏阴性宿主细胞(诸如，大肠杆菌)的外膜上的脂多糖(LPS)。降低内毒素含量的方法包括(但不限于)使用二氧化硅支撑物、玻璃粉末或羟基磷灰石的纯化技术，反相色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱、阴离子交换色谱、疏水性相互作用色谱，这些方法的组合等。可能需要修饰或其它方法以从所关注的多肽中去除诸如共迁移蛋白等污染物。测量内毒素含量的方法包括(但不限于)鲎变形细胞溶解产物(Limulus AmebocyteLysate，LAL)检定。
在某些实施例中，可通过生物合成将式I-XV的氨基酸(包括在式I-XV的范围内的任何子式或特定化合物)并入多肽中，从而产生非天然氨基酸多肽。在其它实施例中，在多肽内的特定位点处并入所述氨基酸。在其它实施例中，使用翻译系统将所述氨基酸并入多肽中。在其它实施例中，所述翻译系统包含：(i)编码多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含对应于并入上述氨基酸的预先指定位点的选择密码子，以及(ii)包含氨基酸的tRNA，其中所述tRNA对选择密码子具有特异性。在这些翻译系统的其它实施例中，多核苷酸为在翻译系统中产生的mRNA。在这些翻译系统的其它实施例中，翻译系统包含包括多核苷酸的质粒或噬菌体。在这些翻译系统的其它实施例中，翻译系统包含包括多核苷酸的基因组DNA。在这些翻译系统的其它实施例中，多核苷酸被稳定地整合到基因组DNA中。在这些翻译系统的其它实施例中，翻译系统包含对选择密码子具有特异性的tRNA，其中所述选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子、非天然密码子、五碱基密码子和四碱基密码子组成的群组。在这些翻译系统的其它实施例中，tRNA为抑制tRNA。在这些翻译系统的其它实施例中，翻译系统包含将在上述氨基酸上氨酰基化的tRNA。在这些翻译系统的其它实施例中，翻译系统包含对tRNA具有特异性的氨酰基合成酶。在这些翻译系统的其它实施例中，翻译系统包含正交tRNA和正交氨酰基tRNA合成酶。在这些翻译系统的其它实施例中，多肽是由核糖体合成，并且在其它实施例中，翻译系统为包含选自由细菌细胞、古细菌细胞和真核细胞组成的群组的细胞的活体内翻译系统。在其它实施例中，细胞为大肠杆菌细胞、酵母细胞、来自假单胞菌种的细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或昆虫细胞。在这些翻译系统的其它实施例中，翻译系统为包含来自细菌细胞、古细菌细胞或真核细胞的细胞提取物的活体外翻译系统。在其它实施例中，细胞提取物是来自大肠杆菌细胞、来自假单胞菌种的细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或昆虫细胞。在其它实施例中，多肽的至少一部分是通过固相或溶液相肽合成方法或其组合来合成，而在其它实施例中进一步包含将多肽连接到另一多肽上。在其它实施例中，可通过生物合成将式I-XV的氨基酸(包括在式I-XV的范围内的任何子式或特定化合物)并入多肽中，其中所述多肽是与治疗蛋白同源的蛋白质。
B.活体内翻译后修饰
由于在真核细胞中产生具有至少一个非天然氨基酸的所关注的多肽，这些多肽可能包括真核翻译后修饰。在某些实施例中，多肽包括至少一个非天然氨基酸以及至少一次由真核细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰并非由原核细胞进行。举例来说，翻译后修饰包括(包括，但不限于)乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键修饰、糖基化等。一方面，翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬酰胺键联将寡糖(包括(但不限于)(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc))连接到天冬酰胺上。参见表1，其列出真核蛋白质的N-键联寡糖的一些实施例(也可存在其它残基，其未展示)。另一方面，翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨酸键联，或GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键联将寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)连接到丝氨酸或苏氨酸上。
部分1.01表1：通过GlcNAc键连接的寡糖的实施例
Figure A20078004697301631
Figure A20078004697301641
另一方面，翻译后修饰包括前驱物(包括(但不限于)降血钙素前驱物、降血钙素基因相关的肽前驱物、前甲状旁腺激素原(preproparathyroid hormone)、前胰岛素原、胰岛素原、前阿黑皮素原(prepro-opiomelanocortin)、阿黑皮素原等)的蛋白水解加工、组装成多亚单位蛋白质或大分子组装物，翻译到细胞中的另一位点(包括(但不限于)细胞器，诸如内质网、高尔基体(golgi apparatus)、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等，或通过分泌途径)。在某些实施例中，蛋白质包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合物等。
非天然氨基酸的一个优点在于：其提供可用于添加其它分子的其它化学部分。这些修饰可在真核细胞或非真核细胞中活体内进行，或在活体外进行。因此，在某些实施例中，翻译后修饰是通过非天然氨基酸进行。举例来说，翻译后修饰可通过亲核-亲电子反应进行。目前用于蛋白质的选择性修饰的大多数反应涉及在亲核与亲电子反应搭配物之间形成共价键，所述反应包括(但不限于)α-卤基酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。在这些情况下的选择性是由蛋白质中亲核残基的数目和可接近性决定的。在本发明中描述或使用本发明中描述的方法制备的多肽中，可在活体外和活体内使用其它更具选择性的反应，包括(但不限于)非天然羰基氨基酸与肼的反应。说明性实施例可见于以下参考文献中。Cornish等人，(1996)J.Am.Chem.Soc.118：8150-8151；Mahal等人，(1997)Science，276：1125-1128；Wang等人，(2001)Science 292：498-500；Chin等人，(2002)J.Am. Chem.Soc.124：9026-9027；Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci..99：11020-11024；Wang等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.100：56-61；Zhang等人，(2003)Biochemistry.42：6735-6746；以及Chin等人，(2003)Science 300：964-967。这允许用包括荧光团、交联剂、糖衍生物和细胞毒性分子的许多试剂来选择性标记几乎任何蛋白质。也参见2003年1月16日申请的标题为“Glycoprotein synthesis”的美国专利申请案第10/686,944号，所述专利申请案是以引用的方式并入以揭示前述揭示内容。(包括，但不限于)通过叠氮基氨基酸进行的翻译后修饰也可通过施陶丁格连接反应(Staudinger ligation)(包括(但不限于)利用三芳基膦试剂)进行。例如参见Kiick等人，(2002)Incorporation of azides into recombinant proteinsfor chemoselective modification by the Staudinger ligtation，PNAS99(1)：19-24。
IX.用于制备非天然氨基酸多肽的替代系统
已使用数种策略在非重组宿主细胞、诱变宿主细胞或无细胞系统中的蛋白质中引入非天然氨基酸。关于此方面的其它信息可见于美国专利申请案第11/316,534号中。
X.多肽的非天然氨基酸组分的翻译后修饰
为方便起见，这部分中描述的多肽的非天然氨基酸组分(XA到XJ)的翻译后修饰已经一般性描述和/或用特定实施例加以描述。然而，这部分中所描述的多肽的非天然氨基酸组分的翻译后修饰不应仅限于这部分中所提供的一般性描述或特定实施例，而是这部分中所描述的多肽的非天然氨基酸组分的翻译后修饰同样良好适用于处于式I-XV的范围内的所有化合物和具有结构1-4的化合物，包括处于本发明中的说明书、权利要求以及图式中所描述的式I-XV和具有结构1-4的化合物的范围内的任何子式或特定化合物。
已开发出在蛋白质的活体内翻译期间位点特异性地并入非天然氨基酸的方法、组合物、技术和策略。通过并入具有与天然存在氨基酸的侧链化学正交的侧链化学的非天然氨基酸，此技术允许进行重组蛋白的位点特异性衍生。因此，本发明中描述的方法、组合物、技术和策略的主要优点在于如今可以确定的同源产物形式制备衍生蛋白。然而，本发明中描述的方法、组合物、反应混合物、技术和策略不限于由活体内蛋白质翻译技术形成的非天然氨基酸多肽，而是包括由任何技术所形成的非天然氨基酸多肽，所述技术包括(仅举例来说)表达蛋白质连接、化学合成、基于核糖酶的技术(例如参见本发明中标题为“替代系统中的表达”的部分)。
将非天然氨基酸并入重组蛋白中的能力广泛地扩展可为实现翻译后衍生而执行的化学，其中此衍生发生在活体内或活体外。更明确地说，在多肽的非天然氨基酸部分上利用羰基与肼的反应形成吲哚键联的多肽衍生提供数个优点。第一，天然存在氨基酸(a)不含可与肼基反应形成吲哚键联的羰基，并且(b)不含可与羰基反应形成吲哚键联的肼基，并且经设计用于形成所述键联的试剂因此将与多肽的非天然氨基酸组分位点特异性地反应(当然假设非天然氨基酸与相应试剂已经设计以形成所述键联)，因此与使用文献所记载的方式产生的衍生蛋白的混合物相反，位点选择性衍生蛋白质的能力提供单一均质产物。第二，所述吲哚键联在生物条件下是稳定的，暗示由所述吲哚键联衍生的蛋白质是治疗应用的有效候选者。第三，所得吲哚键联的稳定性可根据已在其上形成吲哚键联的非天然氨基酸的身份(即，官能团和/或结构)加以操纵。在一些实施例中，非天然氨基酸多肽的吲哚键联具有少于1小时的分解半衰期，在其它实施例中少于1天，在其它实施例中为少于2天，在其它实施例中少于1周并且在其它实施例中多于1周。在其它实施例中，所得吲哚键联在适度酸性条件下稳定至少两周，在其它实施例中，所得吲哚键联在适度酸性条件下稳定至少5天。在其它实施例中，非天然氨基酸多肽在介于约2与约8之间的pH值下稳定至少1天；在其它实施例中，在约2到约6的pH值下稳定至少1天；在其它实施例中，在约2到约4的pH值下稳定至少1天。在其它实施例中，使用本发明中描述的策略、方法、组合物和技术，合成出分解半衰期被调节到即将发生的情形(例如，用于诸如持续释放等治疗用途，或诊断用途，或工业用途或军事用途)的非天然氨基酸多肽的吲哚键联。
上述非天然氨基酸多肽适用于(包括，但不限于)新颖治疗剂、诊断剂、催化酶、工业酶、结合蛋白(包括(但不限于)抗体和抗体片段)以及(包括，但不限于)蛋白质结构和功能的研究。例如参见Dougherty，(2000)Unnatural AminoAcids as Probes of Protein Structure and Function，Current Opinion in Chemical Biology，4：645-652。上述非天然氨基酸多肽的其它用途包括(仅举例来说)基于检定的用途、化妆品用途、植物生物学用途、环境用途、能量产生用途和/或军事用途。然而，上述非天然氨基酸多肽可经历进一步修饰以并入新的官能团或经修饰的官能团，所述修饰包括操纵多肽的治疗功效；改良多肽的安全性概况；调节多肽的药物动力学、药理学和/或药效学(例如，增加水溶性、生物可用性；增加血清半衰期；增加治疗半衰期；调节免疫原性；调节生物活性；或延长循环时间)；向多肽提供其它官能团；向多肽中并入标签、标记或可检测信号；易化多肽的分离性质；以及前述修饰的任何组合。
在某些实施例中为易化多肽的分离性质的方法，所述方法包含利用包含至少一个非天然氨基酸的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸是选自由含羰基的非天然氨基酸、含肼的非天然氨基酸组成的群组。在其它实施例中，已通过生物合成将这些非天然氨基酸并入如本发明中所述的多肽中。在其它或替代实施例中，这些非天然氨基酸多肽包含至少一个选自式I-XV的氨基酸的非天然氨基酸。在其它或替代实施例中，这些非天然氨基酸多肽包含至少一个选自具有结构1-4的化合物的氨基酸的非天然氨基酸。
本发明中描述的方法、组合物、策略和技术不限于多肽的特定类型、种类或家族。几乎任何多肽都可包括至少一个本发明中描述的非天然氨基酸。仅举例来说，多肽可与治疗蛋白同源。非天然氨基酸多肽也可与生长激素超基因家族的任何多肽成员同源。
所述修饰包括将其它官能团并入到多肽的非天然氨基酸组分上，所述官能团包括(但不限于)所需官能团。
另外，非天然氨基酸多肽可含有可转化为其它官能团(仅举例来说，羰基或肼)的部分。图23说明将非天然氨基酸多肽化学转化为含羰基的非天然氨基酸多肽和含肼的非天然氨基酸多肽。所得含肼的非天然氨基酸多肽和含羰基的非天然氨基酸多肽可用于或并入用于制备、纯化、表征和使用本发明中描述的非天然氨基酸、非天然氨基酸多肽和经修饰的非天然氨基酸多肽的任何方法、组合物、技术和策略中。可使用文献所记载的方法来实现将化学部分化学转化为其它官能团(仅举例来说，羰基或肼)，所述方法诸如描述于(例如)March，ADVANCED ORGANICCHEMISTRY第5版，(Wiley 2001)；以及Carey和Sundberg，ADVANCED ORGANICCHEMISTRY第4版，A卷和B卷(Plenum 2000，2001)中。
此外，用含肼的试剂对含羰基的非天然氨基酸多肽进行的化学修饰可用于在适当激发下产生含有非天然氨基酸多肽的高荧光吲哚衍生物。图19和图21阐明用含肼的试剂对含羰基的非天然氨基酸多肽进行的化学修饰。另外，含肼的非天然氨基酸多肽可与含羰基的试剂发生化学反应以在适当激发下形成含有非天然氨基酸多肽的高荧光吲哚衍生物。图20和图22阐明用含羰基的试剂对含肼的非天然氨基酸多肽进行的化学修饰。
A-翻译后修饰非天然氨基酸多肽的方法：合成含吲哚的非天然氨基酸多肽
向多肽中并入含经取代羰基的非天然氨基酸和含经取代肼的非天然氨基酸通过形成吲哚键联而提供位点特异性衍生。可用已在衍生步骤之前或衍生步骤之后经纯化的多肽来进行用于衍生和/或进一步修饰的方法。另外，可用已在所述修饰之前或所述修饰之后经纯化的合成聚合物、多糖或多核苷酸来进行用于衍生和/或进一步修饰的方法。另外，衍生步骤可在适度酸性条件(包括(例如)介于约1到约6的pH值之间)下有效发生。
此外，某些吲哚键联允许产生用于多种检测方法中的荧光非天然氨基酸多肽。
图21阐明用含肼的试剂对含羰基的非天然氨基酸多肽进行的位点特异性标记。图22阐明用含羰基的试剂对含肼的非天然氨基酸多肽进行的位点特异性标记。
另外，可使用一端含有羰基或肼基并且另一端含有官能团的试剂来进行衍生。所得含吲哚的非天然氨基酸多肽可进一步经修饰以引入包括(仅举例来说)聚合物、多糖或多核苷酸的分子。图24B呈示含官能团的多肽与PEG衍生物的反应的说明性非限制性实施例。
仅举例来说，式(XVI)的试剂是含羰基或含肼的试剂的类型，其可用于形成含吲哚的非天然氨基酸多肽并且可进一步经修饰以引入其它分子。在一个实施例中，式I到式IV的含肼的化合物可与含羰基的式XVI的试剂反应以形成含吲哚的非天然氨基酸多肽。在另一个实施例中，式V到式XIV的含羰基的化合物可与含肼基的式XVI的试剂反应以形成含吲哚的非天然氨基酸多肽。
Figure A20078004697301681
其中：
X各自独立地为H、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基；
或X各自独立地为所需官能团；
L是各自独立地选自由以下各基团组成的群组：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)NR′C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；
L1是可选的，并且当存在时为-C(R′)p-NR′-C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中p为0、1或2)；
R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
W为
Figure A20078004697301691
和
Figure A20078004697301692
R为H、烷基或经取代烷基。
在式(XVI)的化合物的某些实施例中，X为包含烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基的聚合物。在式(XVI)的化合物的某些实施例中，X为包含聚氧化烯或经取代聚氧化烯的聚合物。在式(XVI)的化合物的某些实施例中，X为包含-[(亚烷基或经取代亚烷基)-O-(氢、烷基或经取代烷基)]x的聚合物，其中x为约20到约10,000。在式(XVI)的化合物的某些实施例中，X为具有介于约2KDa到约40KDa范围内的分子量的m-PEG。在式(XVI)的化合物的某些实施例中，X为选自由肽、蛋白质、酶、抗体、药物、染料、脂质、核苷、寡核苷酸、细胞、病毒、脂质体、微粒和胶束组成的群组的生物活性剂。在式(XVI)的化合物的某些实施例中，X为选自由抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎剂、抗肿瘤剂、心血管剂、抗焦虑剂、激素、生长因子和类固醇剂组成的群组的药物。在式(XVI)的化合物的某些实施例中，X为选自由辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶组成的群组的酶。在式(XVI)的化合物的某些实施例中，X为选自由荧光部分、磷光部分、化学发光部分、螯合部分、电子致密部分、磁性部分、插入部分、放射性部分、发色团部分和能量转移部分组成的群组的可检测标记。在式(XVI)的化合物的某些实施例中，X为由含羰基部分和含肼部分组成的反应性基团。在式(XVI)的化合物的某些实施例中，X为吲哚衍生物。在式(XVI)的化合物的某些实施例中，L是选自由-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)N(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-和-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-组成的群组。
在式(XVI)的化合物的某些实施例中是具有式(XVII)的结构的化合物：
X-L-W  (XVII)，
其中：
W为
Figure A20078004697301701
和
Figure A20078004697301702
R为H、烷基或经取代烷基。
在式(XVII)的化合物的某些实施例中是具有式(XVIII)的结构的化合物：
Figure A20078004697301703
Figure A20078004697301711
Figure A20078004697301712
其中在其它实施例中，所述m-PEG或PEG基团具有介于约5kDa到约30kDa范围内的分子量。
在式(XVII)的化合物的某些实施例中是具有式(XIX)的结构的化合物：
Figure A20078004697301713
其中：
W为
Figure A20078004697301714
和
Figure A20078004697301715
R为H、烷基或经取代烷基。
Y在存在时为烷基或经取代烷基。
L为-(亚烷基或经取代亚烷基)-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-。在式(XVII)的化合物的某些实施例中是具有式(XX)的结构的化合物：
其中在式(XX)的化合物的某些实施例中，所述m-PEG基团具有介于约5kDa到约30kDa范围内的分子量。
在式(XVII)的化合物的某些实施例中是具有式(XXI)的结构的化合物：
Figure A20078004697301721
其中：
W为
Figure A20078004697301722
和
Figure A20078004697301723
R为H、烷基或经取代烷基。
Y在存在时为烷基或经取代烷基。
L为-(亚烷基或经取代亚烷基)-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-。在式(XXI)的化合物的某些实施例中是具有式(XXII)的结构的化合物：
其中在式(XXII)的化合物的其它实施例中，所述m-PEG基团具有介于约5kDa到约30kDa范围内的分子量。
在某些实施例中，式(XVII)的连接子可与含羰基或含肼的多肽在水溶液中在酸性条件下反应。在某些实施例中，所述酸性条件是pH值为约1到约6。
在式(XVII)的化合物的某些实施例中是具有式(XXIII)的结构的化合物：
Figure A20078004697301725
其中：
Z为O或NH，并且n为1、2、3和4；
W为
Figure A20078004697301731
和R为H、烷基或经取代烷基。在式(XXIII)的化合物的某些实施例中是具有式(XXIV)的结构的化合物：
Figure A20078004697301733
在式(XXIII)的化合物的其它实施例中是具有式(XXV)的结构的化合物：
Figure A20078004697301734
在某些实施例中是衍生包含式I-XV的氨基酸和具有结构1-4的化合物(包括在式I-XV的范围内的任何子式或特定化合物)的多肽的方法，其中所述方法包含使包含至少一个式I-XV的氨基酸的多肽与式(XVI)的试剂接触。在某些实施例中，多肽是在与式(XVI)的试剂接触之前或之后经纯化。在其它实施例中，所得多肽包含至少一个式I-XV的含羰基的氨基酸或至少一个式I-XV的含肼的氨基酸。在其它实施例中，所得多肽包含至少一个由式I-XV的化合物与式(XVI)的试剂偶合所产生的含吲哚的多肽。
图26提供合成式(XXIV)的双官能连接子的说明性实施例。其中所述方法包含使两端都含有胺或羟基的间隔基试剂与含有经Boc保护的肼的酸偶合。Boc基团的裂解产生式(XXIV)的连接子。
图27提供用式(XXIV)的试剂对含有羰基非天然氨基酸的多肽进行翻译后修饰以形成含吲哚的多肽的图示。
图28提供用式XX和式XXII的试剂对含有羰基非天然氨基酸的多肽进行翻译后修饰以形成含吲哚的多肽的图示。
图29提供用式XX和式XXII的试剂对含有肼非天然氨基酸的多肽进行翻译后修饰以形成含吲哚的多肽的图示。
图30阐明式(XVIII)的试剂的实施例。
在某些实施例中是通过吲哚键联产生多肽二聚物的方法，其中所述方法由式(XXIII)的连接子与含羰基或含肼的非天然氨基酸多肽的反应组成。图27提供使用式(XXIV)的连接子与含羰基的非天然氨基酸多肽的缩合形成所述二聚物的代表性实施例。
在某些实施例中是通过使用双官能连接子来制备含吲哚部分的多肽的方法，其中所述方法包含：
(i)用双官能连接子衍生包含式(I)的氨基酸的第一多肽，以及
(ii)使步骤(i)的所得衍生蛋白与诸如PEG等第二试剂接触。在某些实施例中，多肽是在与双官能连接子接触之前或之后经纯化。
图24展示所述双官能连接子的说明性实施例以及其用于制备与PEG基团连接的含吲哚的多肽的用途。
仅举例来说，以下是式(XXVI)的双官能连接子的代表性实施例。
Figure A20078004697301741
其中：
W为
Figure A20078004697301742
和
Figure A20078004697301743
R为H、烷基或经取代烷基；并且
L为-(亚烷基或经取代亚烷基)-N(R′)C(O)O-(亚烷基或经取代亚烷基)-。
在一个实施例中，多个连接子化学物质可与含羰基或含肼的非天然氨基酸多肽位点特异性地反应。在一个实施例中，本发明中描述的连接子方法利用在至少一个连接子末端含有肼官能团的连接子(单官能、双官能或多官能)。肼衍生的连接子与经羰基取代的蛋白质的反应产生经吲哚取代的非天然蛋白质。在其它实施例中，本发明中描述的连接子方法利用在至少一个连接子末端含有羰基官能团的连接子(单官能、双官能或多官能)。羰基衍生的连接子与经肼取代的蛋白质的反应产生经吲哚取代的非天然蛋白质。
在某些实施例中是衍生化学合成的多肽的方法，其包含使含羰基或含肼的非天然多肽与含羰基或肼的试剂反应形成吲哚衍生物。
图19提供用含肼的试剂衍生含羰基的尾加压素的说明性实施例。在此说明性实施例中，将含肼的试剂加入到含羰基的尾加压素类似物的缓冲溶液(pH 1-5)中。反应在周围温度下进行数小时到数天。
图20提供用含羰基的试剂衍生含肼的尾加压素的说明性实施例。在此说明性实施例中，将含羰基的试剂加入到含肼的尾加压素类似物的缓冲溶液(pH 1-5)中。反应在周围温度下进行数小时到数天。
在其它实施例中，所述衍生多肽在水溶液中在适度酸性条件下稳定至少1个月。在其它实施例中，所述衍生多肽在适度酸性条件下稳定至少2周。在其它实施例中，所述衍生多肽在适度酸性条件下稳定至少5天。在其它实施例中，所述条件是pH值为约1到约6。在某些实施例中，保持衍生多肽的三级结构。在其它实施例中，所述多肽的衍生进一步包含将衍生多肽与另一多肽连接。在其它实施例中，所述衍生多肽与治疗蛋白同源。
B.添加官能团的实施例：与非天然氨基酸多肽偶合的大分子聚合物
可使用本发明中描述的组合物、方法、技术和策略来实现对本发明中描述的非天然氨基酸多肽的各种修饰。这些修饰包括使其它官能团结合到多肽的非天然氨基酸组分上，所述官能团包括(但不限于)所需官能团。作为本发明中描述的组合物、方法、技术和策略的说明性非限制性实施例，以下描述将集中在将大分子聚合物添加到非天然氨基酸多肽上，同时应了解另外描述的组合物、方法、技术和策略也可应用于添加其它官能团，包括(但不限于)上文列出的那些官能团。
多种大分子聚合物和其它分子可与本发明中描述的非天然氨基酸多肽偶合以调节非天然氨基酸多肽(或相应天然氨基酸多肽)的生物性质，和/或向非天然氨基酸多肽(或相应天然氨基酸多肽)提供新的生物性质。这些大分子聚合物可通过非天然氨基酸或非天然氨基酸的任何官能取代基或添加到非天然氨基酸上的任何取代基或官能团与非天然氨基酸多肽偶合。
水溶性聚合物可与本发明中描述的并入多肽(天然或合成)、多核苷酸、多糖或合成聚合物中的非天然氨基酸偶合。水溶性聚合物可通过并入多肽中的非天然氨基酸或非天然氨基酸的任何官能团或取代基，或添加到非天然氨基酸上的任何官能团或取代基进行偶合。在一些情况下，本发明中描述的非天然氨基酸多肽包含一个或一个以上与水溶性聚合物偶合的非天然氨基酸以及一个或一个以上与水溶性聚合物键联的天然存在氨基酸。亲水性聚合物与生物活性分子的共价连接代表一种增加生物活性分子(包括蛋白质、肽以及尤其疏水性分子)的水溶性(诸如在生理环境中)、生物可用性、增加血清半衰期、增加治疗半衰期、调节免疫原性、调节生物活性或延长循环时间的方法。所述亲水性聚合物的其它重要特征包括生物相容性、无毒性以及无免疫原性。对于最终产品制剂的治疗用途，聚合物优选应为医药学上可接受的。
亲水性聚合物的实施例包括(但不限于)：聚烷基醚和其烷氧基封端的类似物(例如，聚氧乙二醇、聚氧乙二醇/聚氧丙二醇，以及其甲氧基或乙氧基封端的类似物，尤其聚氧乙二醇，后者也被称为聚乙二醇或PEG)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯基烷基醚；聚噁唑啉、聚烷基噁唑啉和聚羟烷基噁唑啉；聚丙烯酰胺、聚烷基丙烯酰胺和聚羟烷基丙烯酰胺(例如，聚羟基丙基甲基丙烯酰胺和其衍生物)；聚羟烷基丙烯酸酯；聚唾液酸和其类似物；亲水性肽序列；多糖和其衍生物，包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，例如，羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖、氨基葡聚糖；纤维素和其衍生物，例如，羧甲基纤维素、羟烷基纤维素；甲壳质和其衍生物，例如，壳聚糖、丁二酰基壳聚糖、羧甲基甲壳质、羧甲基壳聚糖；透明质酸和其衍生物；淀粉；海藻酸盐；硫酸软骨素；白蛋白；支链淀粉和羧甲基支链淀粉；聚氨基酸和其衍生物，例如，聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚天冬酰胺；马来酸酐共聚物，诸如：苯乙烯马来酸酐共聚物、二乙烯基乙基醚马来酸酐共聚物；聚乙烯醇；其共聚物；其三元共聚物；其混合物；以及前述物质的衍生物。水溶性聚合物可为任何结构形式，包括(但不限于)线性、叉状或分枝。在一些实施例中，具有2到约300个末端的水溶性聚合物主链尤其适用。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有两个末端的线性聚合物，其中每一末端都与可能相同或不同的官能团键结。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。聚合物的分子量可在所需聚合物分子量范围内。关于实质上水溶性主链的前述列举决非详尽的并且仅具说明性，并且预期具有上述品质的所有聚合材料都适用于本发明中描述的方法和组合物中。
如上所述，亲水性聚合物的一个实施例是聚乙二醇(缩写为PEG)，其已广泛用于药物、人工植入物，以及生物相容性、无毒性和无免疫原性具有重要性的其它应用中。本发明中描述的聚合物：多肽实施例将使用PEG作为例示性亲水性聚合物，其中应了解其它亲水性聚合物可类似地用于这些实施例中。
PEG为水溶性聚合物，其可购得或可根据文献所记载的方法由乙二醇的开环聚合来制备(Sandler和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York，第3卷，第138-161页)。PEG通常透明、无色、无味、可溶于水中、对热稳定、对许多化学剂呈惰性、不会水解或变质，并且一般无毒。认为聚乙二醇具有生物相容性，这就是说PEG能够与活组织或生物体共存而不造成危害。更明确地说，PEG实质上具有非免疫原性，这就是说PEG在体内并不趋向于产生免疫反应。当连接到在体内具有一些所需功能的分子(诸如生物活性剂)上时，PEG趋向于掩蔽药剂并且可减少或消除任何免疫反应以便生物体可耐受药剂的存在。PEG接合物趋向于不会产生重大免疫反应或不会造成凝血或其它不需要的作用。
广泛使用术语“PEG”来涵盖任何聚乙二醇分子(不考虑大小或在PEG末端的修饰)，并且当与非天然氨基酸多肽键联时，所述术语可由下式表示：
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y，
其中n为2到10,000，并且X为H或末端修饰，所述末端修饰包括(但不限于)C1-4烷基、保护基或末端官能团。术语PEG包括(但不限于)其任何形式的聚乙二醇，包括双官能PEG、多臂PEG、衍生PEG、叉状PEG、支化PEG(其中各链具有约1kDa到约100kDa、约1kDa到约50kDa或约1kDa到约20kDa的分子量)、侧接PEG(即具有一个或一个以上与聚合物主链侧接的官能团的PEG或相关聚合物)，或其中具有可降解键联的PEG。在一个实施例中，n为约20到约2000的PEG适用于本发明中描述的方法和组合物中。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚乙二醇部分。PEG聚合物的分子量可具有宽泛范围，包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或100,000Da以上之间。PEG聚合物的分子量可在所需聚合物分子量范围内。多种PEG分子描述于(包括，但不限于)Shearwater Polymers，Inc.目录、Nektar Therapeutics目录中，所述目录是以引用的方式并入本发明中。
文献中末端官能团的特定实施例包括(但不限于)碳酸N-丁二酰亚胺酯(例如参见美国专利第5,281,698号、第5,468,478号)、胺(例如参见Buckmann等人，Makromol.Chem.182：1379(1981)；Zalipsky等人，Eur.Polym.J.19：1177(1983))、酰肼(例如参见Andresz等人，Makromol.Chem.179：301(1978))、丙酸丁二酰亚胺酯和丁酸丁二酰亚胺酯(例如参见Olson等人，在Poly(ethylene glycol)Chemistry & Biological Applications中第170-181页，Harris和Zalipsky编，ACS，Washington，D.C.，1997；也参见美国专利第5,672,662号)、丁二酸丁二酰亚胺酯(例如参见Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.7：175(1984)以及Joppich等人，Makromol.Chem.180：1381(1979))、丁二酰亚胺酯(例如参见美国专利第4,670,417号)、碳酸苯并三唑(例如参见美国专利第5,650,234号)、缩水甘油醚(例如参见Pitha等人，Eur.J Biochem.94：11(1979)；Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13：354(1991))、氧基羰基咪唑(例如参见Beauchamp等人，Anal.Biochem.131：25(1983)；Tondelli等人，J.Controlled Release 1：251(1985))、碳酸对硝基苯酯(例如参见Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.，11：141(1985)；以及Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech.，27：45(1991))、醛(例如参见Harris等人，J.Polym.Sci.Chem.Ed.22：341(1984)；美国专利第5,824,784号；美国专利第5,252,714号)、马来酰亚胺(例如参见Goodson等人，Bio/Technology 8：343(1990)；Romani等人，在Chemistry of Peptides and Proteins 2：29(1984)中；以及Kogan，Synthetic Comm.22：2417(1992))、邻吡啶基二硫化物(例如参见Woghiren等人，Bioconj.Chem.4：314(1993))、丙烯醇(例如参见Sawhney等人，Macromolecules，26：581(1993))、乙烯基砜(例如参见美国专利第5,900,461号)。所有上述参考文献和专利都是以全文引用的方式并入本发明中。
在一些情况下，PEG一端以羟基或甲氧基封端，即，X为H或CH3(“甲氧基PEG”)。或者，PEG可以反应性基团封端，从而形成双官能聚合物。典型反应性基团可包括通常用于与20种常见氨基酸中存在的官能团(包括(但不限于)马来酰亚胺基团、活化碳酸酯(包括(但不限于)对硝基苯酯)、活化酯(包括(但不限于)N-羟基丁二酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)反应的那些反应性基团以及对20种常见氨基酸呈惰性但与非天然氨基酸中存在的互补官能团特异性反应的官能团(包括(但不限于)苯基肼和羰基)。
应注意，上式中由Y表示的PEG的另一端应通过非天然氨基酸与多肽(合成或天然)、多核苷酸、多糖或合成聚合物直接或间接地连接。如果Y为苯基肼基团，那么含苯基肼的PEG试剂可与多肽中含羰基的非天然氨基酸反应以通过吲哚键联形成与多肽键联的PEG基团。如果Y为羰基，那么含羰基的PEG试剂可与多肽中含苯基肼的非天然氨基酸反应以通过吲哚键联形成与多肽键联的PEG基团。图30呈示含羰基和含肼的PEG试剂的非限制性实施例。
在一些实施例中，肼可与非天然氨基酸中存在的羰基反应以形成吲哚。或者，肼可通过非天然氨基酸并入多肽中并且用于优先与水溶性聚合物中存在的羰基反应。一般来说，PEG分子的至少一个末端可用于与非天然氨基酸反应。
因此，在一些实施例中，包含非天然氨基酸的多肽是通过非天然氨基酸的侧链与诸如聚乙二醇(PEG)等水溶性聚合物键联。本发明中描述的非天然氨基酸方法和组合物提供用PEG衍生物对蛋白质进行选择性修饰的高效方法，所述方法涉及回应选择密码子而将非天然氨基酸(包括(但不限于)含有20种天然并入氨基酸中不存在的官能团或取代基的那些氨基酸)选择性并入蛋白质中以及用适当反应性PEG衍生物对那些氨基酸进行后续修饰。多种文献所记载的方法适用于本发明中描述的非天然氨基酸方法和组合物以将水溶性聚合物并入蛋白质中。
聚合物主链可为线性或支化的。支化聚合物主链一般已为文献所记载。通常，支化聚合物具有中心分枝核部分和多个与所述中心分枝核键联的线性聚合物链。PEG是以支化形式使用，其可通过将环氧乙烷添加到各种多元醇(诸如丙三醇、丙三醇寡聚物、季戊四醇和山梨糖醇)上来制备。中心分枝部分也可衍生自诸如赖氨酸等多种氨基酸。支化聚乙二醇可以通用形式表示为R(-PEG-OH)m，其中R是衍生自诸如丙三醇、丙三醇寡聚物或季戊四醇等核部分，并且m表示臂的数目。多臂PEG分子(诸如美国专利第5,932,462号、第5,643,575号、第5,229,490号、第4,289,872号、美国专利申请案2003/0143596、WO 96/21469以及WO 93/21259中描述的那些PEG分子，所述文献的每一个都是以引用的方式并入本发明中以揭示前述揭示内容)也可用作聚合物主链。
支化PEG也可呈由PEG(-YCHZ2)n表示的叉状PEG的形式，其中Y为键联基团，并且Z为通过确定长度的原子链键联到CH上的活化末端基团。另一支化形式(侧接PEG)沿PEG主链而非在PEG链的末端处具有诸如羧基等反应性基团。
除PEG的这些形式之外，也可制备在主链中具有弱键或可降解键的聚合物。举例来说，可制备在聚合物主链中具有酯键的PEG，所述酯键可经历水解。如本发明中所示，此水解使得聚合物裂解为较低分子量的片段：
-PEG-CO2-PEG-+H2O→PEG-CO2H+HO-PEG-。
术语聚乙二醇或PEG表示或包括文献所记载的所有形式，包括(但不限于)本发明中揭示的那些形式。聚合物的分子量可在宽泛范围内，包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或100,000Da以上之间。聚合物的分子量可在所需聚合物分子量范围内。
为最大化PEG的所需性质，连接到生物活性分子上的一种或一种以上PEG聚合物的总分子量以及水合状态应足够高以赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征(诸如增加的水溶性和循环半衰期)，而不会不利地影响母体分子的生物活性。
本发明中描述的方法和组合物可用于制备聚合物：蛋白质接合物的实质上均质制剂。如本发明中所使用的“实质上均质”表示观测到聚合物：蛋白质接合物分子超出总蛋白质的一半。聚合物：蛋白质接合物具有生物活性，并且本发明中所提供的本发明的“实质上均质”的PEG化多肽制剂为足够均质以显示均质制剂的优点(例如，易于临床应用于预测各批次之间的药物动力学)的那些制剂。
也可选择制备聚合物：蛋白质接合物分子的混合物，并且本发明中所提供的优点在于可选择包括在混合物中的单聚合物：蛋白质接合物的比例。因此，必要时，可制备各种蛋白质与所连接的各种数目的聚合物部分(即，二聚物部分、三聚物部分、四聚物部分等)的混合物并且将所述接合物与使用本发明中描述的方法制备的单聚合物：蛋白质接合物组合，并且使混合物具有预定比例的单聚合物：蛋白质接合物。
聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例会随着其在反应混合物中的浓度而改变。一般来说，最佳比率(就反应效率来说在于存在最小过量的未反应蛋白质或聚合物)可由所选聚乙二醇的分子量和可用的可用反应性基团的数目来确定。就分子量来说，通常聚合物的分子量越高，可连接到蛋白质上的聚合物分子的数目越少。类似地，当优化这些参数时，应考虑到聚合物的支化。通常，分子量越高(或分枝越多)，聚合物：蛋白质比率越高。
如本发明中所使用，并且当涵盖亲水性聚合物：多肽/蛋白质接合物时，术语“治疗有效量”进一步指代向患者提供所需益处的增加的量。所述量会随着不同个体而改变并且应取决于多种因素，所述因素包括患者的整体身体状态和所欲治疗的疾病、病症或病状的潜在病因。
可调节本发明中描述的键联到经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽上的水溶性聚合物的数目(即，PEG化或糖基化的程度)以提供改变的(包括(但不限于)增加的或降低的)药理学、药物动力学或药效学特征，诸如活体内半衰期。在一些实施例中，多肽的半衰期比未经修饰的多肽增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、两倍、五倍、10倍、50倍或至少约100倍。
在一个实施例中，用含有与PEG主链直接键联的末端芳基肼部分的PEG衍生物修饰包含含羰基的非天然氨基酸的多肽。
在一个实施例中，用含有与PEG主链直接键联的末端肼部分的PEG衍生物修饰包含含羰基的非天然氨基酸的多肽。
在另一个实施例中，用含有与PEG主链直接键联的末端羰基部分的PEG衍生物修饰包含含肼的氨基酸的多肽。
在一些实施例中，羰基末端PEG衍生物具有以下结构：
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-C(O)-R，
其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，并且n为100-1,000(即，平均分子量介于5kDa-40kDa之间)。聚合物的分子量可在宽泛范围内，包括(但不限于)介于约100Da与约100,000Da或100,000Da以上之间。聚合物的分子量可在所需聚合物分子量范围内。
可获得关于PEG的官能化和接合的若干评述和专论。例如，参见Harris，Macromol.Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology 135：30-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14：866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6：150-165(1995)。
关于聚合物活化的方法也可见于WO 94/17039、美国专利第5,324,844号、WO 94/18247、WO 94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO 90/13540、美国专利第5,281,698号以及WO 93/15189中，并且用于活化聚合物与酶之间的接合的方法包括(但不限于)凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、载氧分子(美国专利第4,412,989号)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11：141-152(1985))，所有这些文献都是以引用的方式并入本发明中以揭示前述揭示内容。
必要时，可通过文献所记载的方法进一步纯化从疏水性色谱获得的本发明中描述的PEG化非天然氨基酸多肽，所述方法包括(但不限于)亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包括，但不限于)DEAE SEPHAROSE)；二氧化硅色谱；反相HPLC；凝胶过滤(使用(包括，但不限于)SEPHADEX G-75)；疏水性相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合物色谱；超滤/渗滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱；电泳程序(包括(但不限于)制备型等电聚焦)、差异溶解性(包括(但不限于)硫酸铵沉淀)或萃取。可通过GPC经由与球状蛋白质标准物进行比较来估算表观分子量(Preneta AZ，PROTEIN PURIFICATIONMETHODS，A PRACTICAL APPROACH(Harris和Angal编)IRL Press 1989，293-306)。可通过蛋白水解降解(包括(但不限于)胰蛋白酶裂解)、接着质谱分析来分析(非天然氨基酸多肽)：PEG接合物的纯度。Pepinsky RB.等人，J.Pharmacol.& Exp.Ther.297(3)：1059-66(2001)。
与本发明中描述的多肽的非天然氨基酸键联的水溶性聚合物可不加限制地进一步进行衍生或经取代。
C.增强对血清白蛋白的亲和性
也可将多种分子与本发明中描述的非天然氨基酸多肽融合以调节血清中的半衰期。在一些实施例中，将分子与本发明中描述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽键联或融合以增强对动物中的内源血清白蛋白的亲和性。
举例来说，在一些情况下，进行多肽与白蛋白结合序列的重组融合。例示性白蛋白结合序列包括(但不限于)来自链球菌蛋白G的白蛋白结合域(例如参见Makrides等人，J.Pharmacol Exp.Ther.277(1)：534-542(1996)以及sjolander等人，J，Immunol.Methods 201：115-123(1997))，或白蛋白结合肽，诸如描述于(例如)Dennis等人，J.Biol.Chem.277(38)：35035-35043(2002)中的那些白蛋白结合肽。
在其它实施例中，用脂肪酸使本发明中描述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽酰化。在一些情况下，脂肪酸促进与血清白蛋白的结合。例如参见Kurtzhals等人，Biochem.J.312：725-731(1995)。
在其它实施例中，使本发明中描述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽直接与血清白蛋白(包括(但不限于)人类血清白蛋白)融合。也可使多种其它分子与如本发明中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽键联以调节与血清白蛋白或其它血清组分的结合。
A.本发明中描述的非天然氨基酸多肽的糖基化
本发明中描述的方法和组合物包括结合有一个或一个以上带有糖残基的非天然氨基酸的多肽。糖残基可为天然(包括(但不限于)N-乙酰基葡糖胺)或非天然的(包括(但不限于)3-氟半乳糖)。所述糖可通过N或O键联的糖苷键(包括(但不限于)N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸)或非天然键(包括(但不限于)杂环(包括含氮杂环)键联或相应C或S键联的糖苷)键联到非天然氨基酸上。
可在活体内或活体外将糖(包括(但不限于)糖基)部分添加到非天然氨基酸多肽上。在一些实施例中，用由芳基肼基团衍生的糖修饰包含含羰基的非天然氨基酸的多肽以产生通过吲哚键联所键联的相应糖基化多肽。在其它实施例中，用由羰基衍生的糖修饰包含含芳基肼的非天然氨基酸的多肽以产生通过键联所键联的相应糖基化多肽。一旦将糖连接到非天然氨基酸上，就可通过用糖基转移酶和其它酶处理来进一步精制所述糖以产生结合到非天然氨基酸多肽上的寡糖。例如参见H.Liu等人，J.Am.Chem.Soc.125：1702-1703(2003)。
图26呈示合成双官能同型连接子(其中所述连接子具有两个相同末端，即肼基)的说明性实施例。此类连接子可用于形成含羰基的非天然氨基酸多肽的同型二聚物以形成两个吲哚键联。或者，如果此类连接子的一个末端经保护，那么此部分经保护的连接子可用于通过吲哚键联使未经保护的肼末端与含羰基的非天然氨基酸多肽结合，而留下另一个经保护的末端在脱保护之后用于其它键联反应。或者，对试剂的化学计量的仔细操作可提供类似的结果(异质二聚物)，即使在所述结果中所需异质二聚物可能会受到一些同型二聚物污染。
图27呈示通过经由双官能同型连接子偶合两个蛋白质来进行蛋白质二聚化的说明性实施例。
图25呈示使用异型双官能连接子的说明性实施例，其中所述连接子具有两个不同末端，仅举例来说，羰基和反应性基团。另外，图25呈示在多步合成中使用异型双官能连接子来连接PEG基团与非天然氨基酸多肽的说明性实施例。在第一步中，如此说明性图式中所示，含肼的非天然氨基酸多肽与含羰基的双官能连接子反应形成含吲哚的非天然氨基酸多肽。然而，双官能连接子仍保留反应性官能团，所述官能团在第二步中与PEG试剂反应以通过杂环键联形成PEG化非天然氨基酸多肽。
本发明中描述的方法和组合物也提供多肽组合，诸如同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物(即，三聚物、四聚物等)。仅举例来说，以下描述着重于GH超基因家族成员，但这个部分中所描述的方法、技术和组合物也可应用于呈二聚物和多聚物形式的几乎任何其它可提供益处的多肽，包括(仅举例来说)治疗蛋白。
因此，本发明中描述的方法、技术和组合物中涵盖直接结合到多肽主链上或通过连接子结合到另一GH超基因家族成员或其变异体或非GH超基因家族成员的任何其它多肽或其变异体上的含有一个或一个以上非天然氨基酸的GH超基因家族成员多肽。由于与单体相比分子量有所增大，所以GH超基因家族成员二聚物或多聚物接合物可展现新颖或需要的性质，包括(但不限于)相对于单体GH超基因家族成员展现不同的药理学、药物动力学、药效学、经调节的治疗半衰期或经调节的血浆半衰期。在一些实施例中，本发明中描述的GH超基因家族成员二聚物将调节GH超基因家族成员受体的二聚化。在其它实施例中，本发明中描述的GH超基因家族成员二聚物或多聚物将充当GH超基因家族成员受体拮抗剂、激动剂或调节剂。
在一些实施例中，GH超基因家族成员多肽是(包括，但不限于)通过Asn-Lys酰胺键或Cys-Cys二硫键直接键联。在一些实施例中，键联的GH超基因家族成员多肽和/或键联的非GH超基因家族成员将包含不同的非天然氨基酸来促进二聚化，其包括(但不限于)第一GH超基因家族成员，和/或键联的非GH超基因家族成员，包含与包含含肼的非天然氨基酸的第二GH超基因家族成员多肽接合的含羰基的非天然氨基酸的多肽，并且所述多肽是通过形成相应吲哚来进行反应。
或者，两种GH超基因家族成员多肽和/或键联的非GH超基因家族成员是通过连接子键联。可使用任何异型双官能连接子或同型双官能连接子来连接两种GH超基因家族成员，和/或键联的非GH超基因家族成员、多肽，这些多肽可具有相同或不同的一级序列。在一些情况下，用于将GH超基因家族成员和/或键联的非GH超基因家族成员、多肽束缚在一起的连接子可为双官能PEG试剂。
在一些实施例中，本发明中描述的方法和组合物提供具有哑铃结构的水溶性双官能连接子，所述结构包括：a)在聚合物主链的至少第一末端上的叠氮化物、炔、肼、二胺、酰肼、羟胺或含有羰基(包括二羰基)的部分；以及b)至少一个在聚合物主链的第二末端上的第二官能团。第二官能团可与第一官能团相同或不同。在一些实施例中，第二官能团不与第一官能团反应。在一些实施例中，本发明中描述的方法和组合物提供包含支化分子结构的至少一个臂的水溶性化合物。举例来说，支化分子结构可为树枝状。
在一些实施例中，本发明中描述的方法和组合物提供通过与具有以下结构的水溶性活化聚合物反应而形成的包含一种或一种以上GH超基因家族成员的多聚物：
R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X，
其中n为约5到约3,000，m为2-10，X可为叠氮化物、炔、肼、二胺、酰肼、羟胺、乙酰基，或含有羰基(包括二羰基)的部分，并且R为封端基团、官能团，或可与X相同或不同的离去基团。R可为(例如)选自由以下各基团组成的群组的官能团：羟基、经保护羟基、烷氧基、N-羟基丁二醯亚胺酯、1-苯并三唑基酯、碳酸N-羟基丁二醯亚胺酯、碳酸1-苯并三唑基酯、缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨基氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯，以及三氟乙基磺酸酯、烯和酮。在另一个实施例中，连接子基团可用于键联转录因子。基因需要多个转录因子以有效地起始编码蛋白质的表达。用非天然氨基酸合成的转录因子可通过如上所述的连接子进行键联，并且用于增强靶向基因的人工活化。所键联的转录因子可在不存在正常活化信号级联的情况下结合标靶DNA并促进RNA聚合酶的募集，因而在无所需信号的情况下表达基因。在另一个实施例中，细胞受体的配体可经键联以有效活化受体。血小板衍生生长因子(PDGF)形成二聚物以结合其受体。含有非天然氨基酸的PDGF可在二聚物形成时通过如上所述的连接子进行键联，并且经投与以提供与PDGF受体的有效结合。键联蛋白质的其它实施例包括键联抗体。两种不同抗体(各自对相同或相邻标靶上的唯一抗原决定基具特异性)可经键联以增强刺激、结合或中和作用。举例来说，对HIV的gp120和相缔合gp40上存在的两种不同抗原决定基具特异性的抗体可经键联以提供更有效的标靶中和作用。类似地，所键联抗体可用于刺激细胞表面受体。举例来说，T细胞受体的CD3抗体以及CD4抗体可经键联以提供对受体活化的必要刺激。另一实施例包括与核酸键联的肽。举例来说，可将结合细胞表面的细胞受体或蛋白质的配体与投与所需标靶的治疗性核酸键联。所键联配体促进核酸的摄取，所述核酸随后在细胞中表达以发挥其治疗作用。类似地，可将肽与核酸键联以促进核酸的包装或浓缩。
连接子上的官能团不必一致，其也不需为苯基肼基。本说明书中详述的化学允许设计至少一个官能团可与非天然氨基酸多肽反应形成吲哚基团的连接子；在一些实施例中，连接子上的其它官能团利用文献所记载的其它方法，包括基于亲核试剂/亲电子试剂的化学。
C.添加官能团的实施例：易化多肽的分离性质
天然存在或非天然氨基酸多肽可能因包括(但不限于)多肽的溶解性或结合特征的多种原因而难以从样本中分离。举例来说，在制备用于治疗用途的多肽时，可能从已经工程化设计以过度生产此类多肽的重组系统中分离所述多肽。然而，由于多肽的溶解性或结合特征，通常证实难以达到所需程度的纯度。本发明中描述的方法、组合物、技术和策略提供这种情形的解决办法。
本发明中描述的方法、组合物、技术和策略允许制备与所需多肽同源的含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽，其中所述含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽具有改良的分离特征。在一个实施例中，通过生物合成制备同源非天然氨基酸多肽。在另一个或另外的实施例中，非天然氨基酸已将其结构并入本发明中描述的一种非天然氨基酸中。在另一个或另外的实施例中，在末端或内部位置处并入非天然氨基酸并且进一步位点特异性并入非天然氨基酸。
在一个实施例中，如通过生物合成所制备的所得非天然氨基酸已经具有所需的改良分离特征。在其它或另外的实施例中，所述非天然氨基酸包含与提供改良分离特征的基团键联的杂环(包括含氮杂环)键联。在其它或另外的实施例中，进一步修饰非天然氨基酸以形成含有经修饰的杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽，其中所述修饰提供与提供改良分离特征的基团键联的杂环(包括含氮杂环)。在一些实施例中，所述基团是直接键联到非天然氨基酸上，并且在其它实施例中，所述基团是通过连接子基团与非天然氨基酸键联。在某些实施例中，所述基团是通过单一化学反应连接到非天然氨基酸上，在其它实施例中，需要一系列化学反应将所述基团连接到非天然氨基酸上。优选在所利用的反应条件下将赋予改良分离特征的基团位点特异性地键联到非天然氨基酸多肽中的非天然氨基酸上，而并非键联到天然存在氨基酸上。
在其它或另外的实施例中，所得非天然氨基酸多肽与GH超基因家族成员同源，然而，这个部分中所描述的方法、技术和组合物也可应用于可从改良分离特征获益的几乎任何其它多肽，所述多肽包括(仅举例来说)治疗蛋白。
在其它或另外的实施例中，赋予改良分离特征的基团改良多肽的水溶性；在其它实施例中，所述基团改良多肽的结合性质；在其它实施例中，所述基团向多肽提供新的结合性质(包括(仅举例来说)生物素基团或生物素结合基团)。在所述基团改良多肽的水溶性的实施例中，所述基团是选自本发明中描述的水溶性聚合物，包括(仅举例来说)本发明中描述的任何PEG聚合物基团。
B.添加官能团的实施例：检测多肽的存在
天然存在或非天然氨基酸多肽在样本(包括活体内样本和活体外样本)中可能因包括(但不限于)缺乏可易于与多肽结合的试剂或标记的多种原因而难以检测。本发明中描述的方法、组合物、技术和策略提供这种情形的解决办法。
本发明中描述的方法、组合物、技术和策略允许制备与所需多肽同源的含有杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽，其中所述含有杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽允许检测在活体内样本和活体外样本中的多肽。在一个实施例中，通过生物合成制备同源非天然氨基酸多肽。在另一个或另外的实施例中，非天然氨基酸已将其结构并入本发明中描述的一种非天然氨基酸中。在另一个或另外的实施例中，在末端或内部位置处并入非天然氨基酸并且进一步位点特异性并入非天然氨基酸。
在一个实施例中，如通过生物合成所制备的所得非天然氨基酸多肽已经具有所需的检测特征。在其它或另外的实施例中，所述非天然氨基酸多肽包含至少一个选自由含羰基的非天然氨基酸、含肼的非天然氨基酸(包括含吲哚的氨基酸)组成的群组的非天然氨基酸以提供改良的检测特征。在其它实施例中，这些非天然氨基酸已如本发明中所述通过生物合成并入多肽中。在其它或替代实施例中，非天然氨基酸多肽包含至少一个选自式I-XV的氨基酸的非天然氨基酸。在其它或替代实施例中，非天然氨基酸多肽包含至少一个选自结构1-4的化合物的氨基酸的非天然氨基酸。在其它或另外的实施例中，非天然氨基酸包含提供改良的检测特征的吲哚键联。在其它或另外的实施例中，进一步修饰非天然氨基酸以形成经修饰的含吲哚的非天然氨基酸多肽，其中所述修饰提供与提供改良检测特征的基团键联的含吲哚的键联。在一些实施例中，所述基团是直接键联到非天然氨基酸上，并且在其它实施例中，所述基团是通过连接子基团与非天然氨基酸键联。在某些实施例中，所述基团是通过单一化学反应连接到非天然氨基酸上，在其它实施例中，需要一系列化学反应将所述基团连接到非天然氨基酸上。优选在所利用的反应条件下将赋予改良检测特征的基团位点特异性地键联到非天然氨基酸多肽中的非天然氨基酸上，而并非键联到天然存在氨基酸上。
在其它或另外的实施例中，所得非天然氨基酸多肽与GH超基因家族成员同源，然而，这个部分中所描述的方法、技术和组合物也可应用于在活体内样本和活体外样本中需要检测的几乎任何其它多肽，所述多肽包括(仅举例来说)治疗蛋白。
在其它或另外的实施例中，赋予改良检测特征的基团是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；亲和性标记；光亲和性标记；自旋标记；荧光团；放射性部分；结合有重原子的部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；发色团；能量转移剂；可检测标记；以及其任何组合。
在一个实施例中，使抗体经工程化设计以含有吲哚非天然氨基酸，并且所述抗体识别癌细胞上的独特抗原。在通过本发明中描述的方法用吲哚标记或修饰抗体并且纯化经标记抗体后，将其投与到疑似患有可由经标记抗体识别的癌症的个体中。在投与经标记抗体后，经标记抗体在患者体内的存在和位置可鉴别癌组织的存在。投与经标记抗体允许检测患者内的癌症，个体内的转移和/或个体内癌症治疗的功效。
在另一个实施例中，使与细胞表面上的抗原结合的肽经工程化设计以含有染料(包括(但不限于)荧光染料)，其可用于在将肽投与到个体后追踪所述肽。染料是通过位于肽内的非天然氨基酸与肽连接，并且将肽投与到个体。利用文献所记载的成象或检测技术来实现肽与其配体的结合的定位。
在另一个实施例中是检测患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一个具有化合物1-4的结构的非天然氨基酸：
Figure A20078004697301891
Figure A20078004697301901
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、经取代亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为在一端处与含吲哚的部分键联的连接子，所述连接子选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
n为0、1、2或3，并且m为0、1、2或3，条件是n或m中的至少一个不为0；
其中，具有相缔合Ra基团的结构1、2、3和4中的各环可含有0、1或2个Ra基团，并且Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基；或当存在一个以上Ra基团时，两个Ra可视情况形成芳基、环烷基或杂环烷基；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或R3与R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5各自独立地为H、卤素、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、OH、NH2、CN、NO2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基或经取代芳烷基，或当存在一个以上R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；
或R5为L-X，其中，X是选自由以下各物组成的群组：标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；糖类、水溶性树枝状聚合物、环糊精、生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团、含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；光化辐射可激发的部分；配体；可光致异构化部分；生物素；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳键联的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；抑制性核糖核酸；放射性核苷酸；中子俘获剂；生物素的衍生物；量子点；纳米传递素；放射性传递素；抗体酶、活化复合激活剂、病毒、佐剂、糖苷配基、过敏原、血管抑素、抗激素、抗氧化剂、适体、向导RNA、皂角苷、穿梭载体、大分子、拟抗原决定基、受体、反胶束和其任何组合；并且L是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
当存在一个以上R5基团时，两个邻位R5基团可视情况形成杂环烷基或芳香族杂环烷基；
或含-B-吲哚的部分合起来形成包含至少一个吲哚部分的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或其活性代谢物、盐或医药学上可接受的前药或溶剂化物。
在另一个实施例中是检测患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一个具有化合物1-4的结构的非天然氨基酸，其中在多肽内的特定位点处并入所述至少一个非天然氨基酸。在另一个实施例中是检测患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一个具有化合物1-4的结构的非天然氨基酸，其中使用翻译系统并入所述非天然氨基酸。在另一个实施例中是检测患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一个具有化合物1-4的结构的非天然氨基酸，其中使用翻译系统和翻译后修饰系统将所述非天然氨基酸并入多肽中。在另一个实施例中是检测患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一个具有化合物1-4的结构的非天然氨基酸，其中所述至少一个非天然氨基酸在水溶液中稳定至少1个月。在另一个实施例中是检测患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一个具有化合物1-4的结构的非天然氨基酸，其中所述至少一个非天然氨基酸稳定至少2周。在另一个实施例中是检测患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一个具有化合物1-4的结构的非天然氨基酸，其中所述至少一个非天然氨基酸稳定至少5天。
在另一个实施例中是检测患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一个具有化合物1-4的结构的非天然氨基酸，其中所述多肽是与选自由以下各物组成的群组的治疗蛋白同源的蛋白质：α-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配体、c-kit配体、胶原蛋白、菌落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞激活肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞激活肽、红细胞生成素(EPO)、剥脱性毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维粘连蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白、血红蛋白、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经素、中性粒细胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效营养因子、蛋白质A、蛋白质G、pth、致热外毒素A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原激活剂、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体和皮质酮。
在另一个实施例中，含吲哚的部分是通过位于肽、多肽或蛋白质内的非天然氨基酸与所述肽、多肽或蛋白质连接。通过文献所记载的方法将经适当标记的肽、多肽或蛋白质投与到所需个体以进行检测和成象。通过这些经标记肽、多肽或蛋白质，可使多种疾病、代谢途径、生理结构或细胞组分成象。举例来说，可使用荧光成象显微术来检测个体内经标记肽、多肽或蛋白质的存在。
C.添加官能团的实施例：改良多肽的治疗性质
天然存在或非天然氨基酸多肽应能够向患有特定病症、疾病或病状的患者提供某种治疗益处。此治疗益处应取决于多种因素，包括(仅举例来说)：多肽的安全性概况，以及多肽的药物动力学、药理学和/或药效学(例如，水溶性、生物可用性、血清半衰期、治疗半衰期、免疫原性、生物活性或循环时间)。另外，向诸如连接的细胞毒性化合物或药物等多肽提供其它官能团可为有利的，或可能需要与其它多肽连接以形成本发明中描述的同型多聚物和异型多聚物。优选这些修饰不破坏原始多肽的活性和/或三级结构。本发明中描述的方法、组合物、技术和策略提供这些问题的解决办法。
所描述的方法、组合物、技术和策略允许制备与所需多肽同源的含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽，其中所述含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽具有改良的治疗特征。在一个实施例中，通过生物合成制备同源非天然氨基酸多肽。在另一个或另外的实施例中，非天然氨基酸已将其结构并入本发明中描述的一种非天然氨基酸中。在另一个或另外的实施例中，在末端或内部位置处并入非天然氨基酸并且进一步位点特异性并入非天然氨基酸。
在一个实施例中，如通过生物合成所制备的所得非天然氨基酸已经具有所需的改良治疗特征。在其它或另外的实施例中，非天然氨基酸包含与提供改良治疗特征的基团键联的杂环(包括含氮杂环)键联。在其它或另外的实施例中，进一步修饰非天然氨基酸以形成经修饰的含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽，其中所述修饰提供与提供改良治疗特征的基团键联的杂环(包括含氮杂环)键联。在一些实施例中，所述基团是直接键联到非天然氨基酸上，并且在其它实施例中，所述基团是通过连接子基团与非天然氨基酸键联。在某些实施例中，所述基团是通过单一化学反应连接到非天然氨基酸上，在其它实施例中，需要一系列化学反应将所述基团连接到非天然氨基酸上。优选在所利用的反应条件下将赋予改良治疗特征的基团位点特异性地键联到非天然氨基酸多肽中的非天然氨基酸上，而并非键联到天然存在氨基酸上。
在其它或另外的实施例中，所得非天然氨基酸多肽与GH超基因家族成员同源，然而，这个部分中所描述的方法、技术和组合物也可应用于可从改良治疗特征获益的几乎任何其它多肽，所述多肽包括(仅举例来说)治疗蛋白。
在其它或另外的实施例中，赋予改良治疗特征的基团改良多肽的水溶性；在其它实施例中，所述基团改良多肽的结合性质；在其它实施例中，所述基团向多肽提供新的结合性质(包括(仅举例来说)生物素基团或生物素结合基团)。在所述基团改良多肽的水溶性的实施例中，所述基团是选自本发明中描述的水溶性聚合物，包括(仅举例来说)PEG聚合物基团。在其它或另外的实施例中，所述基团为细胞毒性化合物，而在其它实施例中，所述基团为药物。在其它实施例中，所键联的药物或细胞毒性化合物可从非天然氨基酸多肽上裂解以将药物或细胞毒性化合物传递到所需治疗位置。在其它实施例中，所述基团为第二多肽，其包括(举例来说)含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽，其进一步包括(例如)具有与第一非天然氨基酸多肽相同的氨基酸结构的多肽。
在其它或另外的实施例中，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽为经修饰的含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽。在其它或另外的实施例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽来说，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽增加多肽的生物可用性。在其它或另外的实施例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽来说，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽增加多肽的安全性概况。在其它或另外的实施例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽来说，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽增加多肽的水溶性。在其它或另外的实施例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽来说，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽增加多肽的治疗半衰期。在其它或另外的实施例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽来说，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽增加多肽的血清半衰期。在其它或另外的实施例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽来说，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽延长多肽的循环时间。在其它或另外的实施例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽来说，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽调节多肽的生物活性。在其它或另外的实施例中，相对于同源天然存在氨基酸多肽来说，含杂环(包括含氮杂环)的非天然氨基酸多肽调节多肽的免疫原性。
XI.经修饰多肽的治疗用途
为方便起见，这个部分中所描述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽已经一般性描述和/或用特定实施例加以描述。然而，这个部分中所描述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽不应仅限于这个部分中所提供的一般描述或特定实施例，而是这个部分中所描述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽同样良好适用于处于式I-XV的范围内的所有经修饰或未经修饰的包含至少一个非天然氨基酸的非天然氨基酸多肽和具有结构1-4的化合物，包括处于本发明中的说明书、权利要求以及图式中所描述的式I-LXV的范围内的任何子式或特定化合物。
本发明中描述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽(包括其同型多聚物和异型多聚物)存在多种用途，包括(但不限于)：治疗用途、诊断用途、基于检定的用途、工业用途、化妆品用途、植物生物学用途、环境用途、能量产生用途、消费品用途和/或军事用途。作为非限制性说明，提供经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的以下治疗用途。
本发明中描述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽适用于治疗多种病症、病状或疾病。投与本发明中描述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽产品在人类中产生由市售多肽制剂所显示的任何活性。经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽产品的平均量可改变，并且尤其应根据合格医师的建议和处方而改变。经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的确切量应优先根据以下因素进行选择：诸如所治疗病状的确切类型、所治疗患者的病状，以及组合物中的其它成分。所欲给予的量可根据使用经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的疗法来确定。
A.投药和医药组合物
如本发明中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽(包括(但不限于)合成酶、包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质等)视情况用于治疗用途，包括(但不限于)与合适医药载剂组合。这些组合物(例如)包含治疗有效量的如本发明中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽，以及医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包括(但不限于)生理食盐水、缓冲生理食盐水、右旋糖、水、丙三醇、乙醇和/或其组合。进行调配以适应投药模式。一般来说，投与蛋白质的方法可应用于投与如本发明中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽。
根据文献所记载的方法，视情况在一种或一种以上患病的适当活体外和/或活体内动物模型中测试包含一种或一种以上如本发明中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的治疗组合物，以确定功效、组织代谢并估算剂量。具体来说，最初可通过非天然氨基酸相对于天然氨基酸同源物(包括(但不限于)将经修饰以包括一个或一个以上非天然氨基酸的多肽与天然氨基酸多肽加以比较)的活性、稳定性或其它合适量度(即，在相关检定中)来确定剂量。
通过通常用于引入分子以最终与血液或组织细胞接触的任何途径来进行投药。如本发明中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽是视情况与一种或一种以上医药学上可接受的载剂一起以任何合适方式投与。可获得向患者投与如本发明中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的合适方法，并且尽管可使用一种以上的途径来投与特定组合物，但特定途径通常可比另一种途径提供更直接并且更有效的作用或反应。
医药学上可接受的载剂在某种程度上由所投与的特定组合物以及由用于投与所述组合物的特定方法确定。因此，存在多种本发明中描述的医药组合物的合适调配物。
可通过适用于蛋白质或肽的任何途径来投与本发明中描述的非天然氨基酸多肽和包含这些多肽的组合物，所述途径包括(但不限于)不经肠投与，例如注射，其包括(但不限于)经皮下注射或经静脉内注射或注射或输注的任何其它形式。可通过众多途径来投与多肽医药组合物(包括本发明中描述的各种非天然氨基酸多肽)，所述途径包括(但不限于)经口、静脉内、腹膜内、肌肉内、经皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。也可通过脂质体来投与包含如本发明中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物。本发明中描述的非天然氨基酸多肽也可单独使用或与其它合适组分(包括(但不限于)医药载剂)组合使用。
也可将单独或与其它合适组分组合的如本发明中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽制成可通过吸入投与的气雾剂调配物(即，其可“雾化”)。可将气雾剂调配物置入加压的可接受推进剂(诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等)中。
适用于不经肠投与(举例来说，通过关节内(在关节内)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径)的调配物包括水性和非水性等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使调配物与预期接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。经包装核酸的调配物可以单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)呈递。
不经肠投药和静脉内投药为优选投药方法。具体来说，已用于天然氨基酸同源物治疗剂的投药途径(包括(但不限于)通常用于EPO、IFN、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白细胞介素、抗体和/或任何其它医药传递蛋白质的那些投药途径)以及目前使用的调配物提供用于如本发明中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的优选投药途径和调配物。
在本发明中描述的组合物和方法的情形下，投与到患者中的剂量足以随时间在患者中产生有益治疗反应。剂量由特定调配物的功效和所使用的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者的病状，以及所欲治疗的患者的体重或表面积来确定。也通过在特定患者中投与特定调配物等所伴随的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定剂量大小。
在确定在治疗或预防疾病(包括(但不限于)癌症、遗传疾病、糖尿病、AIDS等)时所欲投与的调配物的有效量时，医师评估循环血浆水平、调配物毒性、疾病的进展和/或(如果相关)抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。
投与到(例如)70公斤的患者中的剂量通常在等效于关于相关组合物的改变的活性或血清半衰期所调节的目前所用治疗蛋白的剂量的范围内。本发明中描述的医药调配物可补充多种疗法(包括抗体投与，疫苗投与，细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应调节剂等的投与)。
对于投药来说，本发明中描述的医药调配物是以由相关调配物的LD-50或ED-50和/或对在各种浓度(包括(但不限于)当应用于患者的质量和总体健康状况时)下经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的任何副作用的观测所确定的速率来投与。可通过单次给药或分次给药来实现投药。
如果经历调配物输注的患者出现发热、发冷或肌肉痛，那么就使其接受适当剂量的阿斯匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、醋氨酚(acetaminophen)或其它疼痛/发热控制药物。使经历输注反应(诸如发热、肌肉痛以及发冷)的患者在未来输注之前30分钟服用阿斯匹林、醋氨酚或(包括，但不限于)苯海拉明(diphenhydramine)。对于对退热剂和抗组胺剂无迅速反应的更严重的发冷和肌肉痛，使用度冷丁(Meperidine)。根据反应的严重性来减缓或停止细胞输注。
可直接将如本发明中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽投与到哺乳动物个体。通过通常用于将多肽引入个体中的任何途径进行投药。如本发明中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽包括适于经口、经直肠、局部、吸入(包括(但不限于)通过气雾剂)、口腔(包括(但不限于)舌下)、经阴道、不经肠(包括(但不限于)皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、大脑内、动脉内或静脉内)、局部(即，皮肤与粘膜表面(包括气管表面))以及经皮投与的多肽，尽管在任何给定情况下最合适的途径应视所治疗病状的性质和严重性而定。投药可为局部或全身性的。调配物可以单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)呈递。如本发明中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽可与医药学上可接受的载剂一起制成呈单位剂量可注射形式(包括(但不限于)溶液、悬浮液或乳液)的混合物。也可通过连续输注(使用(包括，但不限于)诸如渗透泵等微型真空泵)、单一大丸剂或缓慢释放储槽式调配物来投与如本发明中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽。
适于投与的调配物包括水性和非水性溶液、等张无菌溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使调配物等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。可由无菌粉末、颗粒以及先前描述种类的片剂来制备溶液和悬浮液。
冷冻干燥(Freeze-drying)是通常使用的用于呈递蛋白质的技术，其用于从所关注的蛋白质制剂中去除水。冷冻干燥或冻干(lyophilization)是首先将所欲干燥的物质冷冻并且随后通过在真空环境中升华来去除冰或冷冻溶剂的过程。在预先冻干的调配物中可包括赋形剂以增强冷冻干燥过程中的稳定性和/或改良冻干产物在储存时的稳定性。Pikal，M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa等人，Pharm.Res.8(3)：285-291(1991)。
药物的喷雾干燥已为文献所记载。举例来说，参见Broadhead，J.等人，″TheSpray Drying of Pharmaceuticals，″Drug Dev.Ind.Pharm，18(11和12)，1169-1206(1992)。除小分子药物之外，多种生物材料也已经喷雾干燥并且这些材料包括：酶、血清、血浆、微生物和酵母。喷雾干燥是一种有用的技术，因为其可以一步法将液体医药制剂转化为精细、无尘或凝聚的粉末。基本技术包含以下四个步骤：a)将原料溶液雾化成喷雾；b)喷雾-空气接触；c)使喷雾干燥；以及d)将经干燥的产物与干燥空气分离。美国专利第6,235,710号和第6,001,800号(其都是以引用的方式并入本发明中以揭示前述揭示内容)描述通过喷雾干燥来制备重组红细胞生成素。
本发明中描述的医药组合物可包含医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。医药学上可接受的载剂在某种程度上由所投与的特定组合物以及用于投与所述组合物的特定方法确定。因此，存在多种本发明中描述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的医药组合物(包括可选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)的合适调配物(例如参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版(Easton，Pa.：Mack Publishing Company，1995)；Hoover，John E.，Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania 1975；Liberman，H.A.和Lachman，L.编，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版(Lippincott Williams & Wilkins，1999))。合适的载剂包括：缓冲剂，其含有丁二酸盐、磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐、咪唑、乙酸盐、碳酸氢盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括(但不限于)抗坏血酸；低分子量多肽，包括(但不限于)小于约10个残基的那些多肽；蛋白质，包括(但不限于)血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，包括(但不限于)甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸或组氨酸衍生物、蛋氨酸、谷氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括(但不限于)海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，包括(但不限于)EDTA和乙二胺四乙酸二钠；二价金属离子，包括(但不限于)锌、钴或铜；糖醇，包括(但不限于)甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，包括(但不限于)钠；和/或非离子表面活性剂，包括(但不限于)TweenTM(包括(但不限于)Tween 80(聚山梨醇酯80)和Tween 20(聚山梨醇酯20))、PluronicsTM和其它普洛尼克酸(pluronic acid)(包括(但不限于)普洛尼克酸F68(帕洛沙姆188(poloxamer 188)))或PEG。合适的表面活性剂包括(例如，但不限于)基于聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯(即，(PEO-PPO-PEO))，或聚氧化丙烯-聚氧化乙烯-聚氧化丙烯(即，(PPO-PEO-PPO))，或其组合的聚醚。PEO-PPO-PEO和PPO-PEO-PPO是以商标名PluronicsTM、R-PluronicsTM、TetronicsTM和R-TetronicsTM(BASF WyandotteCorp.，Wyandotte，Mich.)市售，并且进一步描述于美国专利第4,820,352号(其是以全文引用的方式并入本发明中)中。其它乙烯/聚丙烯嵌段聚合物也可为合适的表面活性剂。表面活性剂或表面活性剂的组合可用于使PEG化非天然氨基酸多肽稳定对抗一种或一种以上应力(包括(但不限于)来自搅拌的应力)。一些上述表面活性剂可称作“膨胀剂”。一些也可称作“张力调节剂”。也可将抗菌防腐剂应用于产品稳定性和抗菌效力；合适的防腐剂包括(但不限于)苄醇、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯、甲酚和苯酚或其组合。
也可通过持续释放系统或作为持续释放系统的一部分来投与如本发明中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽(包括键联到诸如PEG等水溶性聚合物上的非天然氨基酸多肽)。持续释放组合物包括(包括，但不限于)呈成形物品(包括(但不限于)薄膜或微胶囊)形式的半渗透性聚合物基质。持续释放基质包括生物相容性材料，诸如聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.，12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)、聚交酯(聚乳酸)(美国专利第3,773,919号；EP 58,481)、聚乙交酯(乙醇酸的聚合物)、聚交酯-共-乙交酯(乳酸与乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(U.Sidman等人，Biopolymers，22，547-556(1983))、聚(原酸)酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(诸如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯烷酮以及聚硅氧。持续释放组合物也包括脂质体包封的化合物。含有化合物的脂质体是通过诸如以下方法制备：DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号、第4,619,794号和第4,544,545号；以及EP 102,324。
可通过以下文献中描述的方法来制备脂质体包封的多肽：例如，DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号、第5,021,234号和第4,544,545号；以及EP 102,324。脂质体的组成和大小是文献所记载的方法。。脂质体的一些实施例描述于(例如)Park JW等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：1327-1331(1995)；Lasic D和Papahadjopoulos D(编)：MEDICAL APPLICATIONSOF LIPOSOMES(1998)；Drummond DC等人，Liposomal drug delivery systems forcancer therapy，Teicher B(编)：CANCER DRUG DISCOVERY ANDDEVELOPMENT(2002)；Park JW等人，Clin.Cancer Res.8：1172-1181(2002)；Nielsen UB等人，Biochim.Biophys.Acta 1591(1或2)：109-118(2002)；Mamot C等人，Cancer Res.63：3154-3161(2003)中。
在本发明中描述的组合物、调配物和方法的情形下投与到患者的剂量应足以随时间在个体中产生有益的反应。一般来说，每一剂量不经肠投与的如本发明中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的总医药有效量在每天每公斤患者体重约0.01μg到约100μg，或约0.05mg到约1mg的范围内，但其应经受治疗判断。给药频率也应经受治疗判断，并且可比经批准用于人类的市售产品的频率更高或频率更低。通常，可通过上述任一种投药途径来投与聚合物：多肽接合物(包括(仅举例来说)如本发明中所述的PEG化多肽)。
XII.经修饰多肽的结构-功能关系
如本发明中所述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽(包括(但不限于)合成酶、包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质等)将对其所归属的多肽赋予不同的物理和化学特征。所述特征的有用性将视非天然氨基酸的结构、非天然氨基酸上修饰的结构或两者而定，并且可通过分析测试多肽的结构-功能关系的实验模型进行评估。
在任何给定的实验模型中，非天然氨基酸将取代所需多肽或蛋白质中的天然氨基酸。在含有非天然氨基酸的肽或蛋白质表达后，用替代R基团库衍生蛋白质。使这些R基团与多肽或蛋白质中所包含的非天然氨基酸反应。通过其与所置换氨基酸的R基团的结构或化学相似性来选择R基团库。在将新颖R基团添加到蛋白质内的非天然氨基酸上之后，接着关于适当测试系统内的功能或活性来筛检蛋白质。举例来说，用非天然氨基酸置换蛋白质内的苯丙氨酸。然后，将与苯丙氨酸的R基团具有类似特征的替代R基团库添加到非天然氨基酸上。将单一替代R基团添加到非天然R基团上，所添加的R基团包括环、杂环、共轭环或赋予(但不限于)类似化学和结构特征的其它化学部分。随后，通过在适当实验模型中进行测试而关于一种或一种以上与新取代的非天然氨基酸的添加有关的功能来筛检衍生蛋白质。实验模型的实施例包括(但不限于)基础检定、无细胞检定、基于细胞的检定、组织培养物模型和动物模型。
在另一个实施例中，使吲哚在非天然氨基酸上进行取代以获得药物发现中的药效团活性或作为检测中有用的荧光核。为促进所述添加，通过在水性缓冲液中在室温下用优化的两步反应进行吲哚形成而将基于吲哚的R基团或适于吲哚合成的R基团添加到非天然氨基酸上。在此反应后，关于所需活性来筛检衍生蛋白。
举例来说，可在患有庞倍氏病(Pompe disease)的小鼠模型中评估酸性α-葡糖苷酶(GAA)中非天然氨基酸取代对缓解庞倍氏病的影响。可产生在酶内的所选位点处含有多个氨基酸取代的GAA分子库，并且通过本发明中所揭示的方法和组合物进行表达。接着，可评估含有非天然氨基酸的酶在患有庞倍氏病的小鼠模型(经饲养到关于GAA(GAA-/-)遗传失效的小鼠)中的活性，所述酶呈未经修饰形式或如本发明中所揭示的翻译后修饰形式。可通过静脉内、经口或允许有效的蛋白质转运和吸收的任何其它投药途径来投与含有非天然氨基酸的酶。举例来说，可通过小鼠中糖原降解和/或清除的测量结果、血清GAA水平的分析、心脏扩大症、心肌病、骨骼肌病变的改变或降低来评估投药功效、酶半衰期和庞倍氏病的缓解。
本发明中描述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽适用于多种工业应用。使用本发明中描述的经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽产品在工业应用中产生市售多肽制剂所展现的任何活性。
举例来说，可用非天然氨基酸修饰用于制备乙醇的酶，并且检定所述酶的功能变化。可产生含有多个非天然氨基酸取代的醇脱氢酶II和丙酮酸脱羧酶的库，并通过本发明中所揭示的方法和组合物进行表达。接着，可关于由非天然氨基酸取代所赋予或由非天然氨基酸取代所产生的乙醇产生效率的变化来筛检经非天然氨基酸修饰的酶。可通过文献所记载的方法来筛检(但不限于)对底物的亲和性以及转化率的增加，并且将所述增加应用到乙醇的工业制造中。
本发明中所揭示的方法和组合物的工业应用的其它实施例包括除草剂和杀虫剂的环境清除。通过使阿特拉津(atrazine)代谢的酶来促进从受污染的土壤中去除常用的除草剂阿特拉津，从而使土壤无毒。可产生含有非天然氨基酸取代的经修饰的阿特拉津氯水解酶的库，并通过本发明中所揭示的方法和组合物进行表达。接着，可关于环境中所见的使阿特拉津脱氯的能力的变化以及由非天然氨基酸取代所赋予或由非天然氨基酸取代所产生的阿特拉津的任何新颖代谢模式来筛检经非天然氨基酸修饰的阿特拉津氯水解酶的库。如先前所述，可通过文献所记载的方法来分析酶效率的变化，包括(但不限于)阿特拉津或中间物的代谢的增加。
实施例
实施例1
Figure A20078004697302051
的合成
所用合成是描述于以下反应流程中：
Figure A20078004697302052
a)
Figure A20078004697302053
的合成
在0℃下，向1-对甲苯基肼(5.0g，31mmol)在吡啶(50mL)中的溶液中加入Ac2O(30mL，318mmol)。将混合物在室温下搅拌整夜，并用MeOH(100mL)中止反应。在真空中去除溶剂后，通过快速色谱(二氧化硅，20％-50％EtOAc/己烷)纯化残余物，得到无色油状物(6.72g，87％)：1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.28(d，J＝8.4Hz，2H)，7.24(d，J＝8.4Hz，2H)，2.47(s，6H)，2.40(s，3H)，2.14(s，3H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ171.8，169.5，139.1，138.8，130.4，126.4，25.4，22.3，21.3。
b)
Figure A20078004697302061
的合成
向N′，N′-二乙酰基-N-对甲苯基乙酰肼(6.4g，25.8mmol)在CCl4(300mL)中的溶液中加入N-溴代丁二酰亚胺(5.1g，28.7mmol)。将混合物在回流下加热。加入2，2′-偶氮二异丁腈(AIBN，0.2g，1.2mmol)。将所得混合物在回流下搅拌36小时并冷却到室温。将混合物用H2O和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到呈棕色油状的溴化物(8.62g)。粗产物无需纯化而直接用于下一步骤。
c)
Figure A20078004697302062
的合成
向EtONa(2.3g，32.1mmol)在EtOH(80mL)中的溶液中加入2-乙酰胺基丙二酸二乙酯(6.3g，29.0mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌20分钟。以整份加入N′，N′-二乙酰基-N-(4-(溴甲基)苯基)乙酰肼(8.62g，26.4mmol)。将混合物在80℃下加热整夜并冷却到室温。将柠檬酸(10g，50mmol)加入反应混合物中。在去除大部分溶剂后，用EtOAc(500mL)稀释残余物。将混合物用H2O和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过快速色谱(二氧化硅，15％-80％EtOAc/己烷)纯化残余物，得到呈黄色油状的2-(4-(乙酰胺基)苄基)-2-乙酰胺基丙二酸二乙酯(4.17g，对于两个步骤为35％)：1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.23(d，J＝8.0Hz.2H)，7.03(d，J＝8.0Hz，2H)，6.57(s，1H)，4.29-4.20(m，4H)，3.65(m，2H)，2.41(s，6H)，2.08(s，3H)，2.01(s，3H)，1.27(t，J＝3.6Hz，6H)；13C NMR(125MHz，CDCl，)δ171.7，169.3，169.2，167.4，140.3，136.4，131.3，126.2，67.2，63.0，37.4，25.3，23.2，22.3，14.2。
d)
Figure A20078004697302071
的合成
向2-(4-(乙酰胺基)苄基)-2-乙酰胺基丙二酸二乙酯(572mg，1.24mmol)在二噁烷(15mL)中的溶液中加入HCl(12N，15mL)。将所得混合物在回流下加热整夜，并在真空中浓缩。向残余物中加入MeOH(1mL)。加入乙醚(200mL)以沉淀出呈固体状的产物(231mg，81％)：1H NMR(500MHz，D2O)δ7.28(d，J＝8.5Hz，2H)，7.00(d，J＝8.5Hz，2H)，4.21(dd，J＝7.4，5.7Hz，1H)，3.26(dd，J＝9.2，5.7Hz，1H)，3.15(dd，J＝14.7，7.4Hz，1H)；13C NMR(125MHz，D2O)δ171.5，142.9，130.3，129.0，115.7，54.1，34.7。
实施例2
此含羰基的氨基酸的合成遵循标准方法。
Figure A20078004697302072
实施例3
此含羰基的氨基酸的合成遵循标准方法。
Figure A20078004697302073
实施例4：芳基肼与醛之间的反应
图3、图4、图5、图6和图7中呈示两个分子之间形成吲哚的典型反应。两种起始物质中的任一种都可以侧链形式呈现于非天然氨基酸多肽上，条件是另一种试剂表示用于衍生前述侧链的化合物上的官能团。也就是说，非天然氨基酸多肽上的侧链可为芳基肼基，并且反应性部分为与水溶性聚合物、至少一个氨基酸或可检测标记连接的醛。相反地，非天然氨基酸多肽上的侧链可为醛基，并且反应性部分为与水溶性聚合物、至少一个氨基酸或可检测标记连接的芳基肼。
Figure A20078004697302081
实施例5：芳基肼与酮之间的反应
图8、图9、图10、图11、图13和图14中呈示两个分子之间形成吲哚的典型反应。两种起始物质中的任一种都可以侧链形式呈现于非天然氨基酸多肽上，条件是另一种试剂表示用于衍生前述侧链的化合物上的官能团。也就是说，非天然氨基酸多肽上的侧链可为芳基肼基，并且反应性部分为与水溶性聚合物、至少一个氨基酸或可检测标记连接的酮。相反地，非天然氨基酸多肽上的侧链可为酮基，并且反应性部分为与水溶性聚合物、至少一个氨基酸或可检测标记连接的芳基肼。
实施例6：含有芳基肼非天然氨基酸的尾加压素类似物
图20中呈示在“X”位置处包括具有芳基肼侧链的非天然氨基酸的尾加压素类似物。使用标准技术来化学合成所述化合物。应了解，侧链或者可包括酮、醛或经保护羰基侧链(示意性展示于图21中)。
实施例7：用于衍生非天然氨基酸的吲哚形成
图20、图21、图22、图24、图28和图29中呈示如何由可用于衍生非天然氨基酸多肽的芳基肼与羰基的反应形成吲哚部分的实施例。这些图中所示的蛋白质“草图”可为尾加压素、人类生长激素、胰岛素、抗体、激酶、红细胞生成素或本发明中描述或文献中可用的任何其它多肽或蛋白质。
实施例8
这个实施例详述经修饰多肽在大肠杆菌中的克隆和表达。使用包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的所引入的翻译系统来表达含有非天然氨基酸的多肽。O-RS优先用非天然氨基酸使O-tRNA氨酰基化。接下来，翻译系统回应编码的选择密码子而将非天然氨基酸插入多肽中。氨基酸和适用于并入非天然氨基酸的O-tRNA和O-RS的多核苷酸序列描述于标题为“In vivoIncorporation of Unnatural Amino Acids”的美国专利申请案第10/126,927号以及标题为“Methods and Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-AminoacyltRNA Synthetase Pairs”的美国专利申请案第10/126,931中，所述专利申请案是以引用的方式并入本发明中。
  SEQ ID NO：1   詹氏甲烷球菌mtRNACUA Tyr   tRNA
SEQ ID NO：2   HLAD03；优化的琥珀抑制tRNA tRNA
SEQ ID NO：3   HL325A；优化的AGGA移码抑制tRNA tRNA
SEQ ID NO：4   用于并入对叠氮基-L-苯丙氨酸的氨酰基tRNA合成酶p-Az-PheRS(6) RS
SEQ ID NO：5   用于并入对苯甲酰基L-苯丙氨酸的氨酰基tRNA合成酶p-BpaRS(1) RS
SEQ ID NO：6   用于并入炔丙基-苯丙氨酸的氨酰基tRNA合成酶炔丙基-PheRS RS
SEQ ID NO：7   用于并入炔丙基-苯丙氨酸的氨酰基tRNA合成酶炔丙基-PheRS RS
SEQ ID NO：8   用于并入炔丙基-苯丙氨酸的氨酰基tRNA合成酶炔丙基-PheRS RS
SEQ ID NO：9   用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的氨酰基tRNA合成酶p-Az-PheRS(1) RS
SEQIDNO：10   用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的氨酰基tRNA合成酶p-Az-PheRS(3) RS
SEQ ID NO：11   用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的氨酰基tRNA合成酶p-Az-PheRS(4) RS
SEQ ID NO：12   用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的氨酰基tRNA合成酶p-Az-PheRS(2) RS
SEQ ID NO：13   用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的氨酰基tRNA合成酶(LW1) RS
SEQ ID NO：14   用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的氨酰基tRNA合成酶(LW5) RS
SEQ ID NO：15   用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的氨酰基tRNA合成酶(LW6) RS
SEQ ID NO：16   用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的氨酰基tRNA合成酶(AzPheRS-5) RS
SEQ ID NO：17   用于并入对叠氮基-苯丙氨酸的氨酰基tRNA合成酶(AzPheRS-6) RS
用含有经修饰基因和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对(对所需非天然氨基酸具有特异性)的质粒转化大肠杆菌允许将非天然氨基酸位点特异性并入多肽中。在37℃下在含有介于0.01mM-100mM之间的特定非天然氨基酸的培养基中生长的经转化的大肠杆菌以高保真性和效率表达经修饰的多肽。经His标记的含有非天然氨基酸的多肽是由大肠杆菌宿主细胞以包涵体或聚集体形式产生。这些聚集体在变性条件下在6M盐酸胍中溶解并经亲和性纯化。通过在50mM TRIS-HCl(pH 8.0)、40μM CuSO4和2％(w/v)N-十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)中在4℃下透析整夜来进行再折叠。随后，用20mM TRIS-HCl(pH 8.0)、100mM NaCl、2mM CaCl2对所述物质进行透析，接着去除His标签。参见Boissel等人，J.Biol.Chem.，(1993)268：15983-93。通过SDS-PAGE、Western Blot分析或电喷雾电离离子阱质谱等证实纯化多肽的方法。
以下实施例描述测量并比较经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽的活体外和活体内活性与治疗活性天然氨基酸多肽的活体外和活体内活性的方法。
实施例9：细胞结合检定
在0℃下，在不存在或存在各种浓度(体积：10μl)的未经标记GH、hGH或GM-CSF的情况下和在存在125I-GH(约100,000cpm或1ng)的情况下将细胞(3×106)在PBS/1％BSA(100μl)中双重复培育90分钟(总体积：120μl)。随后，使细胞再悬浮并在350μl塑胶离心管中的200μl冰冷FCS上分层并且离心(1000g；1分钟)。通过切断管的底部来收集离心块，并以γ计数器(Packard)对离心块和上清液分别计数。
以在不存在竞争者的情况下的总结合(双重复的平均值)减去在存在100倍过量的未经标记的GH的情况下的结合(cpm)(非特异性结合)的形式来测定特异性结合(cpm)。对所使用的每一种细胞类型测量非特异性结合。实验是使用相同125I-GH制剂在隔开的天数进行并且应显示内部一致性。125I-GH证实与产生GH受体的细胞的结合。未经标记的天然GH或hGH以剂量依赖性方式抑制结合，但GM-CSF或其它阴性对照无法抑制结合。hGH竞争结合天然125I-GH(类似于天然GH)的能力暗示所述受体同样良好地识别两种形式。
实施例10：通过吲哚键联PEG化的hGH的活体内研究
将PEG-hGH、未经修饰的hGH和缓冲溶液投与到小鼠或大鼠。结果展示与未经修饰的hGH相比，本发明中所述的PEG化hGH具有优良的活性和延长的半衰期，其是由体重显著增加所指示。
实施例11：接合hGH和未接合hGH以及其变异体的活体内半衰期的测量
所有动物实验都是在AAALAC质量合格设施中并按照由圣路易斯大学(St.Louis University)的实验动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)所认可的方案进行。在室内在12小时灯光/黑暗的循环下将大鼠个别圈养在笼中。使动物能够随意取用合格的Purina啮齿动物食物5001和水。对于切除垂体的大鼠，饮用水额外含有5％葡萄糖。
实施例12：药物动力学研究
在进入动物实验之前，通过三次检定来评估每一种PEG化突变体hGH的品质。通过用非还原性条件下的MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)电泳4％-12％丙烯酰胺NuPAGE Bis-Tris凝胶来研究PEG-hGH(通过吲哚键联进行PEG化)的纯度。用考马斯蓝(Coomassie blue)将凝胶染色。根据密度测定扫描，PEG-hGH条带的纯度大于95％。通过使用来自Charles River Laboratories(Wilmington，MA)的KTA2试剂盒的动力学LAL检定来测试每一种PEG-hGH中的内毒素含量，并且每一剂量的内毒素含量小于5EU。用IM-9pSTAT5生物检定来分析PEG-hGH的生物活性，并且证实EC50值小于15nM。
在获自Charles River Laboratories的雄性Sprague-Dawley大鼠(261g-425g)中彼此比较经PEG修饰的生长激素化合物的药物动力学性质，并将其与非PEG化生长激素进行比较。通过手术将导管安装于颈动脉中以用于血液采集。在导管成功安装之后，将动物分配成治疗组(每组三到六只)，接着给药。以0.41-0.55ml/kg的给药体积经皮下向动物投与1mg/kg的化合物。在各个时间点通过留置导管采集血样，并且使其进入经EDTA涂布的微离心管中。在离心后收集血浆，并将其储存在-80℃下直到分析。使用来自BioSource International(Camarillo，CA)或Diagnostic Systems Laboratories(Webster，TX)的抗体夹层生长激素ELISA试剂盒来测量化合物浓度。使用对应于所给与的类似物的标准来计算浓度。使用建模程序WinNonlin(Pharsight，4.1版)来估算药物动力学参数。使用具有线性-上/对数-下梯形积分的非间室分析(Noncompartmental analysis)，并且均一加权浓度数据。
在大鼠中单次皮下给药之后，以规则时间间隔获得血浆浓度。对大鼠(每组n＝3-6)给予每千克蛋白质1mg的单一大丸药剂量。将hGH野生型蛋白(WHOhGH)、经His标记的hGH多肽(his-hGH)或包含在六个不同位置中的每一位置处与30kDa PEG共价键联的非天然氨基酸吲哚的经His标记的hGH多肽与WHOhGH和(his)-hGH进行比较。在规定时间间隔内获取血浆样本，并且按照所述内容来检定所注射的化合物。通过非间室分析(Pharsight，4.1版)来评估浓度对时间的曲线。展示的值为平均值(+/-标准偏差)。Cmax：最大浓度；末期t1/2：末期半衰期；AUC0-＞inf：外推到无穷大的浓度-时间曲线下的面积；MRT：平均滞留时间；Cl/f：表观总血浆清除率；Vz/f：在末期阶段期间的表观分布体积。
实施例13：药效学研究
切除垂体的雄性Sprague-Dawley大鼠是获自Charles River Laboratories。在3-4周龄时通过手术去除垂体。将动物驯化3周时期，在此期间监测体重。包括在研究开始之前7天的时期体重增加0g-8g的动物，并将其随机分成治疗组。对大鼠投与大丸药剂量或每天经皮下给药。在整个研究中，每天并且依次对大鼠称重、麻醉、放血并给药(适当时)。使用肝素化毛细管从眶窦采集血液，并将其置于经EDTA涂布的微离心管中。通过离心分离血浆，并将其储存在-80℃下直到分析。绘制平均(+/-S.D.)血浆浓度对时间间隔的曲线。
肽IGF-1是生长调节素或类胰岛素生长因子家族的成员。IGF-1介导生长激素的许多促进生长的作用。使用针对所提供的大鼠/小鼠IGF-1标准的竞争性结合酶免疫检定试剂盒(Diagnosic Systems Laboratories)来测量IGF-1浓度。切除大鼠的垂体。经皮下对大鼠(每组n＝5-7)给予单次剂量或日剂量。每天依次对动物称重、麻醉、放血并给药(适当时)。获得安慰剂治疗、野生型hGH(hGH)、经His标记的hGH((his)hGH)和包含在位置35和92处与30kDa PEG共价键联的吲哚的hGH多肽的体重结果。
实施例14：包含非天然编码氨基酸的PEG化hGH(通过吲哚键联进行PEG 化)的安全性和/或功效的人类临床试验
使用以下临床试验的实施例来治疗儿童和成人的生长激素不足、特纳综合症(Turner syndrome)、慢性肾衰竭、普达-威利综合症(Prader-Willi syndrome)、宫内生长迟缓的儿童、特发性身材矮小、与长期高剂量糖皮质激素使用相关的生长障碍、移植后生长障碍、性联低血磷性佝偻病(X-linked hypophosphatemic rickets)、发炎性肠病、努南综合症(Noonan syndrome)、骨发育不良、与腹腔疾病相关的生长障碍、与(例如)晚期获得性免疫缺陷综合症相关的肌肉萎缩，促进烧伤伤口愈合，治疗肥胖个体的剧烈饮食的副作用、肌肉纤维疼痛(fybromyalgia)、慢性疲劳综合症、与衰老相关的衰弱，以及用于人类生长激素的其它用途。
目的为比较经皮下投与的PEG化的包含非天然编码氨基酸的重组人类hGH与一种或一种以上的市售hGH产品(包括(但不限于)HumatropeTM(Eli Lilly &Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono))的安全性和药物动力学。
患者研究中招收18名年龄在8岁-40岁范围内并且体重介于20kg-90kg之间的健康志愿者(例如，儿童用于儿科适应症以及成人用于成人适应症)。个体不应具有血液学或血清化学以及阴性尿液毒性筛检、HIV筛检和乙型肝炎(hepatitisB)表面抗原的临床显著异常实验值。其不应具有任何以下迹象：高血压；任何原发性血液疾病史；重大肝病、肾病、心血管疾病、胃肠疾病、泌尿生殖系统疾病、代谢疾病、神经病史；贫血或癫痫病史；对细菌或哺乳动物来源的产品、PEG或人类血清白蛋白具有已知敏感性；含咖啡因的饮料的习惯性以及重度消费者；在进入研究的30天内参与任何其它临床试验或经输血或献血；在进入研究的3个月内已暴露于hGH；在进入研究的7天内患病；以及在进入研究的14天内对研究前身体检查或临床实验室评估具有显著异常。对所有个体评估安全性，并且定时采集用于药物动力学分析的所有血液采集物。在机构伦理委员会批准以及患者同意的情况下进行所有研究。
研究设计其应为在健康男性志愿者中的第I阶段、单中心、开放标记、随机化、两周期交叉研究。将18名个体随机指派到两个治疗序列组中的一组中(每组9名个体)。使用相等剂量的包含非天然编码氨基酸的PEG化hGH和所选市售产品，在大腿上部以快速皮下注射形式经两个单独给药时期投与GH。投与市售产品的剂量和频率是按照包装标签中的说明来进行。可通过包括其它个体组而在研究中加入使用市售产品的其它剂量、给药频率或所需的其它参数。每一给药时期由14天的平衡期隔开。对于两个给药时期中的每一时期，在给药之前至少12小时和给药后72小时将个体限定在研究中心，但在给药时期之间无需如此。如果存在其它剂量、频率或其它参数，那么也可添加额外个体组来测试PEG化hGH。经批准用于人类用途的多种GH调配物可用于此研究中。HumatropeTM(Eli Lilly &Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono)为经批准用于人类用途的市售GH产品。hGH的实验调配物为包含非天然编码氨基酸的PEG化hGH。
血液取样在投与hGH之前和之后，通过直接静脉穿刺连续取血。在给药前约30分钟、20分钟和10分钟(3个基线样本)且在给药后大致以下时间：30分钟和1小时、2小时、5小时、8小时、12小时、15小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、60小时以及72小时，获得用于测定血清GH浓度的静脉血样(5mL)。将每一血清样本分为两个等分试样。将所有血清样本储存在-20℃下。以干冰运输血清样本。在第1天初始给药之前即刻、第4天早晨、第16天给药之前即刻以及第19天早晨进行禁食临床实验测试(血液学、血清化学，以及验尿)。
生物分析方法使用ELISA试剂盒程序(Diagnostic Systems Laboratory[DSL]，Webster TX)来测定血清GH浓度。
安全性测定在每一次给药(第1天和第16天)之前以及每一次给药后6小时、24小时、48小时和72小时立即记录生命体征。安全性测定是基于不利事件的发生率和类型以及临床实验测试自基线的变化。另外，评估生命体征测量结果(包括血压)和身体检查结果与研究前的变化。
数据分析通过由给药后的每一个值减去通过将给药前30分钟、20分钟和10分钟时采集的三个样本的GH水平平均化而测定的平均基线GH浓度而关于给药前基线GH浓度来修正给药后血清浓度值。如果给药前血清GH浓度低于检定的定量水平，那么其不包括在平均值的计算中。由关于基线GH浓度所修正的血清浓度数据测定药物动力学参数。使用BIOAVL软件的最新版本，通过利用DigitalEquipment Corporation VAX 8600计算机系统的不依赖于模型的方法来计算药物动力学参数。测定以下药物动力学参数：峰值血清浓度(Cmax)；到达峰值血清浓度的时间(tmax)；通过使用线性梯形规则计算的从时间零点到最后血液取样时间(AUG0-72)的浓度-时间曲线下的面积(AUC)；以及由消除速率常数计算的末端消除半衰期(t1/2)。在对数-线性浓度-时间曲线的末端线性区域内，通过连续数据点的线性回归来估算消除速率常数。对于每一治疗，计算药物动力学参数的平均标准偏差(SD)和变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(保持调配物/非保持调配物)。
安全性结果在各治疗组中，不利事件的发生率分布相同。与基线或研究前临床实验测试或血压相比无临床上显著变化，并且身体检查结果和生命体征测量结果与研究前相比也无显著变化。两个治疗组的安全性概况看来应相似。
药物动力学结果在所测量的每一时间点下，将所有18名个体在接受单次剂量的一种或一种以上的市售hGH产品(包括(但不限于)HumatropeTM(Eli Lilly& Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)和Saizen/SerostimTM(Serono))后的平均血清GH浓度-时间曲线(未关于基线GH水平进行修正)与包含非天然编码氨基酸的PEG化hGH进行比较。所有个体都应具有在正常生理范围内的给药前基线GH浓度。由关于给药前平均基线GH浓度所修正的血清数据测定药物动力学参数，并且测定Cmax和tmax。所选的临床比较物(HumatropeTM(Eli Lilly & Co.)、NutropinTM(Genentech)、NorditropinTM(Novo-Nordisk)、GenotropinTM(Pfizer)、Saizen/SerostimTM(Serono))的平均tmax比包含非天然编码氨基酸的PEG化hGH的tmax显著更短。与包含非天然编码氨基酸的PEG化hGH的末端半衰期相比，所测试的市售hGH产品的末端半衰期值显著更短。
尽管本发明的研究是在健康男性个体中进行，但预期在其它患者群体(诸如患有癌症或慢性肾衰竭的男性或女性患者、小儿肾衰竭患者、自体预存程序中的患者，或预定选择性手术的患者)中可具有类似的吸收特征和安全性概况。
总之，经皮下投与的单一剂量的包含非天然编码氨基酸的PEG化hGH应为安全的，并且健康男性个体对其良好耐受。根据不利事件的相对发生率，市售形式的hGH和包含非天然编码氨基酸的PEG化hGH的临床实验值、生命体征以及身体检查结果、安全性概况应相当。包含非天然编码氨基酸的PEG化hGH潜在地对患者和健康护理提供者提供较大临床效用。
实施例15：PEG化hGH和非PEG化hGH的水溶性比较
通过测定可溶解于100μL水中的各别多肽的量来获得hGH野生型蛋白(WHO hGH)、经His标记的hGH多肽(his-hGH)或包含在位置92处与30kDa PEG共价键联的非天然氨基酸吲哚的经His标记的hGH多肽的水溶性。PEG化hGH的量大于WHO hGH和hGH的量，这说明非天然氨基酸多肽的PEG化增加水溶性。
实施例16：经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽的活体内研究
将前列腺癌肿瘤异种移植物植入小鼠中，随后将其分为两组。一组每天用经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽治疗，而另一组每天用治疗活性天然氨基酸多肽治疗。每天测量肿瘤大小，并且如用经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽治疗的组的肿瘤大小的减小所指示，与治疗活性天然氨基酸多肽相比，经修饰的治疗活性非天然氨基酸多肽具有改良的治疗功效。
实施例17：非天然氨基酸多肽活性和亲和性的测量
这个实施例详述非天然氨基酸多肽的活性以及非天然氨基酸多肽对其受体、结合搭配物或配体的亲和性的测量。
根据文献所记载的方法表达并分离非天然氨基酸多肽受体、结合搭配物或配体的蛋白质。使用BiocoreTM系统来分析非天然氨基酸多肽与其受体的结合。类似地，结合搭配物或配体也可用于此检定中。
如制造商所推荐，使用胺偶合程序，将大约600-800RU的可溶性受体固定在BiacoreTM CM5芯片上。以40μl/min的流动速率将各种浓度的在HBS-EP缓冲液(BiacoreTM，Pharmacia)中的野生型或经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽在表面上注射4-5分钟，并且在注射后15分钟监测解离。通过4.5M MgCl2的15秒脉冲使表面再生。在至少100个再生周期后仅观测到结合亲和性的极小损失(1-5％)。使用未固定有受体的参考细胞来扣除任何缓冲液体积影响和非特异性结合。
用BiaEvaluation 4.1软件(BIACORETM)处理根据经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽滴定实验所获得的动力学结合数据。以个体速率常数的比率(koff/kon)形式计算平衡解离常数(Kd)。
形成表达非天然氨基酸多肽的受体、结合搭配物或配体的稳定细胞系。用含有受体、结合搭配物或配体cDNA的构筑体对细胞进行电穿孔。使转染细胞恢复48小时，接着克隆。通过用针对受体的抗体染色的表面来鉴别表达转染物的受体、结合搭配物或配体，并用FACS Array(BD Biosciences，San Diego，CA)进行分析。在对所需转染物进行其它回合的重复亚克隆后形成稳定转染的细胞克隆。将所述细胞用于细胞结合检定中。
在0℃下，在不存在或存在各种浓度(体积：10μl)的未经标记天然氨基酸多肽或阴性对照多肽的情况下并且在存在125I-(经修饰)非天然氨基酸多肽(约100,000cpm或1ng)的情况下将细胞(3×106)在PBS/1％BSA(100μl)中双重复培育90分钟(总体积：120μl)。随后，使细胞再悬浮并在350μl塑胶离心管中的200μl冰冷FCS上分层并且离心(1000g；1分钟)。通过切断管的底部来收集离心块，并以γ计数器(Packard)对离心块和上清液分别计数。
以在不存在竞争者的情况下的总结合(双重复的平均值)减去非特异性结合来测定特异性结合(cpm)。对所使用的每一种细胞类型测量非特异性结合。实验是使用相同125I-(经修饰)非天然氨基酸多肽制剂以隔开的天数进行并且应显示内部一致性。125I-(经修饰)非天然氨基酸多肽展现与受体、结合蛋白或产生配体的细胞结合。未经标记的天然氨基酸多肽以剂量依赖性方式抑制结合，但阴性对照多肽无法抑制结合。
应了解，本发明中所述的实施例和实施例只是说明性目的，并且根据其各种修改或改变应包括在本申请案的精神和权限以及随附权利要求的范围内。
序列表
Figure A20078004697302181
Figure A20078004697302191
Figure A20078004697302201
Figure A20078004697302211

Claims (43)

1.一种具有化合物1-4的结构的化合物：
Figure A2007800469730002C1
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、经取代亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为一端与含吲哚的部分键联的连接子，所述连接子选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基或至少一个氨基酸；并且
R2为OH、酯保护基或至少一个氨基酸；
n为0、1、2或3，并且m为0、1、2或3，条件是n或m中的至少一个不为0；
其中，具有相缔合Ra基团的结构1、2、3和4中的各环可含有0、1或2个Ra基团，并且Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基；或当存在一个以上Ra基团时，两个Ra可视情况形成芳基、环烷基或杂环烷基；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或R3与R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5各自独立地为H、卤素、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、OH、NH2、CN、NO2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基，或当存在一个以上R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；
或R5为L-X，其中，X是选自由以下各物组成的群组：水溶性聚合物；聚氧化烯；聚乙二醇；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；至少一个氨基酸；至少一个糖基；至少一个核苷酸；至少一个核苷；配体；生物素；生物素类似物；可检测标记；和其任何组合；并且L是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
当存在一个以上R5基团时，两个邻位R5基团可视情况形成杂环烷基或芳香族杂环烷基；
或含-B-吲哚的部分合起来形成包含至少一个吲哚部分的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或其活性代谢物、盐或医药学上可接受的前药或溶剂化物。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中A为键、经取代或未经取代的低碳亚烷基，或未经取代或经取代的选自由亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基或亚噻吩基组成的群组的亚芳基。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中A为键。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中B为键、低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R″)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R″)CO-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R″)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)(亚烷基或经取代亚烷基)-或-S(O)2(亚烷基或经取代亚烷基)-。
5.根据权利要求5所述的化合物，其中B为键。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中R1为至少一个氨基酸。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中R2为至少一个氨基酸。
8.根据权利要求7所述的化合物，其中R1为至少一个氨基酸。
9.根据权利要求1所述的化合物，其中X为至少一个氨基酸。
10.根据权利要求1所述的化合物，其中X为选自由荧光部分、磷光部分、化学发光部分、螯合部分、电子致密部分、磁性部分、插入部分、放射性部分、发色团部分和能量转移部分组成的群组的可检测标记。
11.根据权利要求1所述的化合物，其中X为水溶性聚合物。
12.根据权利要求11所述的化合物，其中所述水溶性聚合物包含聚氧化烯或经取代聚氧化烯。
13.根据权利要求11所述的化合物，其中所述水溶性聚合物包含-[(亚烷基或经取代亚烷基)-O-(氢、烷基或经取代烷基)]x，其中x为20-10,000。
14.根据权利要求11所述的化合物，其中所述水溶性聚合物是具有介于约2KDa到约40KDa范围内的分子量的m-PEG。
15.一种制备结构1或2的化合物的方法，其包含使式(II)化合物与含羰基的化合物反应，其中所述式(II)化合物为：
Figure A2007800469730005C1
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、经取代亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为一端与含吲哚的部分键联的连接子，所述连接子选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、＝N-O-(亚烷基或经取代亚烷基)、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-；并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基或至少一个氨基酸；并且
R2为OH、酯保护基或至少一个氨基酸；
Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、CN、NO2、-N(R′)2、-C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k为1、2或3)组成的群组，并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R3和R4独立地为氢或胺保护基，包括(但不限于)：
Figure A2007800469730006C1
16.根据权利要求15所述的方法，其中A为键。
17.根据权利要求16所述的方法，其中B为键。
18.根据权利要求15所述的方法，其中R1为至少一个氨基酸。
19.根据权利要求15所述的方法，其中R2为至少一个氨基酸。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述式(II)化合物具有式(IV)的结构：
Figure A2007800469730006C2
其中，Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、CN、NO2、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
21.一种制备结构3或4的化合物的方法，其包含使式(V)化合物与含肼的试剂反应；其中所述式(V)化合物为：
Figure A2007800469730007C1
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、低碳亚杂烯基、经取代低碳亚杂烯基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-(其中k为1、2或3)、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-N(R′)CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-和-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
J为
Figure A2007800469730007C2
Figure A2007800469730007C3
R为H、烷基、经取代烷基、环烷基或经取代环烷基；
R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基或保护基，或当存在一个以上R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；
R1为H、氨基保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；并且
R2为OH、酯保护基、树脂、至少一个氨基酸、多肽或多核苷酸；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或R3与R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
或-A-B-J-R基团合起来形成包含至少一个羰基(包括一个羰基)、经保护羰基(包括一个经保护羰基)或经掩蔽羰基(包括一个经掩蔽羰基)的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或-J-R基团合起来形成包含至少一个羰基(包括一个羰基)、经保护羰基(包括一个经保护羰基)或经掩蔽羰基(包括一个经掩蔽羰基)的单环或双环环烷基或杂环烷基。
22.根据权利要求21所述的方法，其对应于式(VI)：
Figure A2007800469730008C1
23.根据权利要求21所述的方法，其对应于式(VII)：
Figure A2007800469730008C2
其中，Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
24.根据权利要求21所述的方法，其对应于式(X)：
Figure A2007800469730008C3
其中，Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
Y和Z是独立地选自由-OH、经氧取代的烷基、-SH或经硫取代的烷基组成的群组，并且Y和Z合起来可形成杂环烷基环。
25.根据权利要求21所述的方法，其对应于式(XI)：
Figure A2007800469730009C1
其中，Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
Y是独立地选自由OR″、NR″R″、NC(O)R″组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基。
26.根据权利要求21所述的方法，其对应于式(XII)：
Figure A2007800469730009C2
其中，Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基；或当存在一个以上Ra基团时，两个Ra可视情况形成环烷基或杂环烷基；
R3和R4独立地为H、卤素、CN、NO2、烷基、经取代烷基、N(R′)2、C(O)kR′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′(其中k为1、2或3)，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
X为C、N或S，条件是当X为O或S时，R4不可为H、卤素、CN、NO2、烷基、经取代烷基、N(R′)2、C(O)R′、-C(O)N(R′)2、-OR′和-S(O)kR′；其中k为1、2或3，并且n为0、1或2。
27.根据权利要求21所述的方法，其对应于式(XIII)：
Figure A2007800469730010C1
其中，Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基组成的群组；
Y和Z是独立地选自由-OH、经氧取代的烷基、-SH或经硫取代的烷基组成的群组，并且Y和Z合起来可形成环烷基环。
28.根据权利要求21所述的方法，其对应于式(XIV)：
Figure A2007800469730010C2
其中，Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
其中B进一步包含-CH＝N-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-；
n为1、2或3；并且
Y是独立地选自由OR″、NR″R″、NC(O)R″组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基、经取代烷基。
29.根据权利要求15所述的方法，其中所述化合物可与含羰基的试剂在水溶液中在适度条件下反应。
30.根据权利要求21所述的方法，所述反应是在水溶液中在适度条件下进行。
31.一种治疗病症、病状或疾病的方法，所述方法包含投与治疗有效量的具有结构式1、2、3或4的药剂：
Figure A2007800469730011C1
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、经取代亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为一端与含吲哚的部分键联的连接子，所述连接子选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基或至少一个氨基酸；并且
R2为OH、酯保护基或至少一个氨基酸；
n为0、1、2或3，并且m为0、1、2或3，条件是n或m中的至少一个不为0；
其中，具有相缔合Ra基团的结构1、2、3和4中的各环可含有0、1或2个Ra基团，并且Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基；或当存在一个以上Ra基团时，两个Ra可视情况形成芳基、环烷基或杂环烷基；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或R3与R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5各自独立地为H、卤素、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、OH、NH2、CN、NO2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基，或当存在一个以上R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；
或R5为L-X，其中，X是选自由以下各物组成的群组：水溶性聚合物；聚氧化烯；聚乙二醇；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；至少一个氨基酸；至少一个糖基；至少一个核苷酸；至少一个核苷；配体；生物素；生物素类似物；可检测标记；和其任何组合；并且L是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
当存在一个以上R5基团时，两个邻位R5基团可视情况形成杂环烷基或芳香族杂环烷基；
或含-B-吲哚的部分合起来形成包含至少一个吲哚部分的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或其活性代谢物、盐或医药学上可接受的前药或溶剂化物。
32.根据权利要求31所述的方法，其进一步包含投与医药学上可接受的载剂。
33.根据权利要求31所述的方法，其中X为聚氧化烯。
34.根据权利要求31所述的方法，其中X为至少一个氨基酸。
35.根据权利要求34所述的方法，其中X的所述至少一个氨基酸包括非天然氨基酸。
36.根据权利要求31所述的方法，其中X为可检测标记。
37.一种治疗病症、病状或疾病的方法，其包含投与治疗有效量的具有结构式5、6、7或8的药剂：
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、经取代亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为一端与含吲哚的部分键联的连接子，所述连接子选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基或至少一个氨基酸；并且
R2为OH、酯保护基或至少一个氨基酸；
n为0、1、2或3，并且m为0、1、2或3，条件是n或m中的至少一个不为0；
其中，具有相缔合Ra基团的结构1、2、3和4中的各环可含有0、1或2个Ra基团，并且Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基；或当存在一个以上Ra基团时，两个Ra可视情况形成芳基、环烷基或杂环烷基；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或R3与R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5各自独立地为H、卤素、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、OH、NH2、CN、NO2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基，或当存在一个以上R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；
或R5为L-X，其中，X是选自由以下各物组成的群组：水溶性聚合物；聚氧化烯；聚乙二醇；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；至少一个氨基酸；至少一个糖基；至少一个核苷酸；至少一个核苷；配体；生物素；生物素类似物；可检测标记；和其任何组合；并且L是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
当存在一个以上R5基团时，两个邻位R5基团可视情况形成杂环烷基或芳香族杂环烷基；
或含-B-吲哚的部分合起来形成包含至少一个吲哚部分的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或其活性代谢物、盐或医药学上可接受的前药或溶剂化物。
38.根据权利要求37所述的方法，其进一步包含投与医药学上可接受的载剂。
39.根据权利要求37所述的方法，其中R1与R2都是至少一个氨基酸。
40.根据权利要求37所述的方法，其中X为聚氧化烯。
41.根据权利要求37所述的方法，其中X为至少一个氨基酸。
42.一种检测患者中多肽的存在的方法，所述方法包含投与有效量的同源非天然氨基酸多肽，所述非天然氨基酸多肽包含至少一个具有化合物1-4的结构的非天然氨基酸：
Figure A2007800469730017C1
其中：
A是可选的，并且当存在时为低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚环烷基、经取代低碳亚环烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、亚炔基、经取代亚炔基、低碳亚杂烷基、经取代亚杂烷基、低碳亚杂环烷基、经取代低碳亚杂环烷基、亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、亚烷芳基、经取代亚烷芳基、亚芳烷基或经取代亚芳烷基；
B是可选的，并且当存在时为一端与含吲哚的部分键联的连接子，所述连接子选自由以下各基团组成的群组：低碳亚烷基、经取代低碳亚烷基、低碳亚烯基、经取代低碳亚烯基、低碳亚杂烷基、经取代低碳亚杂烷基、-亚芳基、经取代亚芳基、亚杂芳基、经取代亚杂芳基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-NS(O)2-、-OS(O)2-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)C(NCN)N(R′)-、-N(R′)C(NNO2)N(R′)-、-N(R′)C(NCOOR′)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，并且R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
R1为H、氨基保护基或至少一个氨基酸；并且
R2为OH、酯保护基或至少一个氨基酸；
n为0、1、2或3，并且m为0、1、2或3，条件是n或m中的至少一个不为0；
其中，具有相缔合Ra基团的结构1、2、3和4中的各环可含有0、1或2个Ra基团，并且Ra是各自独立地选自由H、卤素、烷基、经取代烷基、-N(R″)2、-C(O)R″、-C(O)N(R″)2、-OR″和-S(O)kR″(其中k为1、2或3)组成的群组，其中R″各自独立地为H、烷基或经取代烷基；或当存在一个以上Ra基团时，两个Ra可视情况形成芳基、环烷基或杂环烷基；
R3与R4各自独立地为H、卤素、低碳烷基或经取代低碳烷基，或R3与R4或两个R3基团视情况形成环烷基或杂环烷基；
R5各自独立地为H、卤素、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、烷氧基、经取代烷氧基、烷基烷氧基、经取代烷基烷氧基、聚氧化烯、经取代聚氧化烯、芳基、经取代芳基、杂芳基、经取代杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基、-(亚烷基或经取代亚烷基)-ON(R″)2、OH、NH2、CN、NO2、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)SR″、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-(芳基或经取代芳基)、-C(O)R″、-C(O)2R″或-C(O)N(R″)2，其中R″各自独立地为氢、烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、烷氧基、经取代烷氧基、芳基、经取代芳基、杂芳基、烷芳基、经取代烷芳基、芳烷基、经取代芳烷基，或当存在一个以上R″基团时，两个R″视情况形成杂环烷基；
或R5为L-X，其中，X是选自由以下各物组成的群组：水溶性聚合物；聚氧化烯；聚乙二醇；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；至少一个氨基酸；至少一个糖基；至少一个核苷酸；至少一个核苷；配体；生物素；生物素类似物；可检测标记；和其任何组合；并且L是可选的，并且当存在时为选自由以下各基团组成的群组的连接子：亚烷基、经取代亚烷基、亚烯基、经取代亚烯基、-O-、-O-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S-、-S-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-S(O)k-(其中k为1、2或3)、-S(O)k(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)-、-C(O)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(S)-、-C(S)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)-、-NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-C(O)N(R′)-、-CON(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-CSN(R′)-、-CSN(R′)-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)CO-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-N(R′)C(O)O-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-O-N＝CR′-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-C(O)NR′-(亚烷基或经取代亚烷基)-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S(O)k-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-、-(亚烷基或经取代亚烷基)-S-S-、-S(O)kN(R′)-、-N(R′)C(O)N(R′)-、-N(R′)C(S)N(R′)-、-N(R′)S(O)kN(R′)-、-N(R′)-N＝、-C(R′)＝N-、-C(R′)＝N-N(R′)-、-C(R′)＝N-N＝、-C(R′)2-N＝N-和-C(R′)2-N(R′)-N(R′)-，其中R′各自独立地为H、烷基或经取代烷基；
当存在一个以上R5基团时，两个邻位R5基团可视情况形成杂环烷基或芳香族杂环烷基；
或含-B-吲哚的部分合起来形成包含至少一个吲哚部分的双环或三环环烷基或杂环烷基；
或其活性代谢物、盐或医药学上可接受的前药或溶剂化物。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述多肽为与治疗蛋白同源的蛋白质，所述治疗蛋白选自由以下各物组成的群组：α-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗体、载脂蛋白(apolipoprotein)、脱辅基蛋白(apoprotein)、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降血钙素(calcitonin)、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-iβ、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配体、c-kit配体、胶原蛋白、菌落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞激活肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞激活肽、红细胞生成素(EPO)、剥脱性毒素(exfoliating toxin)、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤维粘连蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、grf、刺猬蛋白(hedgehog protein)、血红蛋白、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素、人类生长激素(hGH)、人类血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质细胞生长因子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经素(neurturin)、中性粒细胞抑制因子(NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、paracitonin、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效营养因子(pleiotropin)、蛋白质A、蛋白质G、pth、致热外毒素A、致热外毒素B、致热外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM 1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素(somatotropin)、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合症毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原激活剂、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾丸激素受体、醛固酮受体、LDL受体和皮质酮。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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