CN109069569B - 使用脂肪酸衍生物的蛋白缀合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种蛋白缀合物，其中生理活性多肽和生物相容性材料通过脂肪酸衍生物相连，因此具有与天然类型相比延长的生理活性持续时间，以及制备所述蛋白缀合物的方法。据证实其中生物相容性材料、脂肪酸和生理活性多肽相连的本发明的蛋白缀合物具有增加的生理活性多肽的半衰期，因此可以广泛用于蛋白药物领域。

Description

使用脂肪酸衍生物的蛋白缀合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白缀合物，其中生理活性多肽和生物相容性材料通过脂肪酸衍生物相连，因此具有与天然类型相比延长的生理活性持续时间，以及制备所述蛋白缀合物的方法。
背景技术
一般来说，生理活性多肽具有低稳定性，因此容易变性，被血液中的蛋白酶降解，并且容易被肾或肝去除。因此，为了维持包含这些生理活性多肽作为药理组分的蛋白药物的血液浓度和滴度，必须经常向患者给药这些蛋白药物。但是，在主要以注射形式向患者给药的蛋白药物的情况下，为了维持生理活性多肽的血液浓度通过注射频繁给药引起患者剧烈疼痛。为了解决这些问题，已作出许多努力，通过增加它们的血液稳定性并长期维持它们的血液浓度在高水平来最大化蛋白药物的效力。蛋白药物的这些长效制剂不应当在增加蛋白药物的稳定性的同时诱导患者的免疫应答。
通常地，作为稳定蛋白以及抑制其在肾中的清除和与蛋白酶接触的方法，已使用蛋白聚乙二醇化方法，其中将高度可溶的聚合物如聚乙二醇(下文，“PEG”)化学地添加至蛋白药物的表面。已知PEG有效稳定蛋白，其通过非特异性结合至靶蛋白的特定位点或各种位点以增加其溶解度而不引起任何特定副作用，并且有效防止蛋白的水解(Sada et al.,J.Fermentation Bioengineering 71:137-139,1991)。虽然由于与PEG结合，蛋白的稳定性可以增加，但是聚乙二醇化方法存在问题，其中生理活性蛋白的滴度可能显著减少，PEG与蛋白的反应性随着PEG分子量的增加而减少，并且蛋白的半衰期增加不足。
此外，通常地，还已使用化学地将脂肪酸添加至生理活性多肽药物表面的方法。同样地，通过连接脂肪酸至其表面难以实现长效药物的效果。
因此，在相关领域，仍然需要开发一种方法，其可以进一步在体内稳定生理活性多肽，抑制肾中的清除，并且维持生理活性多肽的血液半衰期在高水平。
发明公开
技术问题
本发明人已证实通过连接生理活性多肽与生物相容性材料，生理活性多肽可以进一步稳定且可以抑制肾中的清除，从而显著增加生理活性多肽的血液半衰期，通过使用脂肪酸衍生物作为接头的共价键，其可以提高蛋白的体内稳定性，而不是通过聚乙二醇化增加蛋白的稳定性，从而完成本发明。
技术方案
本发明的目的是提供一种蛋白缀合物，其中生理活性多肽和生物相容性材料通过脂肪酸衍生物相连。
本发明的另一目的是提供一种制备所述蛋白缀合物的方法。
本发明的另一目的是提供一种蛋白缀合物，其中生理活性多肽和生物相容性材料通过脂肪酸相连，以便增加生理活性蛋白的血液半衰期。具体地，生理活性多肽和生物相容性材料可以通过作为接头的脂肪酸的反应基团连接。
有利效果
因为证实了其中生物相容性材料、脂肪酸衍生物和生理活性多肽相连的蛋白缀合物具有增加的生理活性多肽血液半衰期，所以所述蛋白缀合物可以广泛用于蛋白药物领域。
附图说明
图1示出关于免疫球蛋白Fc缀合物的SDS-PAGE结果；并且缀合物中可以同时激活GLP-1、胰高血糖素和GPI受体的三重激动剂与免疫球蛋白Fc通过脂肪酸衍生物相连，根据本发明的实施方案制备(M代表标记，泳道1代表未还原的免疫球蛋白Fc缀合物，并且泳道2和3分别代表未还原的蛋白缀合物和还原的蛋白缀合物)。
图2示出关于免疫球蛋白Fc缀合物的体内药代动力学的测量结果；并且缀合物中三重激动剂和免疫球蛋白Fc通过脂肪酸衍生物相连，根据本发明的实施方案制备。具体地，将常规三重激动剂用作比较组以显示药物血液浓度随时间的变化。
发明内容
本发明的一方面提供一种蛋白缀合物，其中生理活性多肽和生物相容性材料通过脂肪酸衍生物相连。
在一具体实施方案中，在本发明的蛋白缀合物中，生理活性多肽和生物相容性材料可以各自通过共价键连接至脂肪酸衍生物。具体地，脂肪酸衍生物可以充当连接生理活性多肽与生物相容性材料的接头。
在另一具体实施方案中，本发明的蛋白缀合物中包含的脂肪酸衍生物可以具有至少两个直接或通过接头连接至脂肪酸骨架的反应基团，并且脂肪酸衍生物可以通过反应基团中的每一个连接至生理活性多肽和生物相容性材料。
在另一具体实施方案中，本发明的蛋白缀合物中包含的脂肪酸衍生物的反应基团可以各自独立地为2,5-二氧代吡咯烷基、2,5-二氧代吡咯基、醛、芳基二硫化物、杂芳基二硫化物、卤代乙酰胺或C7-10炔基。
在另一具体实施方案中，本发明的蛋白缀合物中包含的脂肪酸衍生物的反应基团可以是马来酰亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺，琥珀酰亚胺，C1-4亚烷基醛，邻二硫吡啶(OPSS)，碘乙酰胺(IA)，包含溴、氟、氯或砹代替碘的卤代乙酰胺，二氟环辛炔(DIFO)，二苯并环辛炔(DIBO)，二苯并-氮杂-环辛炔(DIBAC或DBCO)，二芳基氮杂环辛酮(biarylazacyclooctynone)(BARAC)，四甲基硫杂环庚炔(TMTH)，双环壬炔(BCN)Sondheimer二炔，环辛炔(OCT)，单氟化环辛炔(MOFO)，二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)，2,3,6,7-四甲氧基-二苯并环辛炔(TMDIBO)，磺酰化二苯并环辛炔(S-DIBO)，羧甲基单苯并环辛炔(COMBO)，吡咯并环辛炔(PYRROC)或者炔。
在另一具体实施方案中，作为接头包含在本发明的蛋白缀合物中的脂肪酸衍生物可以是C1-3烷基氨基或(C1-3烷氧基)n(C1-3烷基氨基)链。
在另一具体实施方案中，至少一种连接的材料可以缀合至本发明的蛋白缀合物中包含的生物相容性材料,其中所述连接的材料中生理活性多肽和脂肪酸衍生物相连。
在另一具体实施方案中，本发明的蛋白缀合物中包含的生理活性多肽可以是激素、细胞因子、白介素、白介素-结合蛋白、酶、抗体、生长因子、转录因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白或受体、细胞表面抗原、或者受体拮抗剂。
在另一具体实施方案中，本发明的蛋白缀合物中包含的生理活性多肽可以选自：
肠降血糖素，其包括胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素、抑胃肽(GIP)、胃泌酸调节素、Xenin、胰岛素、胆囊收缩素(CCK)、胰淀素、胃泌素、胃生长激素释放素、以及调节胃或肠中的血液葡萄糖水平以及体重的肽YY(PYY)；
脂肪素(adipokine)，其包括分泌自脂肪组织的瘦蛋白、脂连蛋白、adipolin、apelin和cartonectin；
神经肽，其包括分泌自脑的Kisspeptin、Nesfatin-1；
肽或蛋白，其包括分泌自肌肉的鸢尾素、myonectin、饰胶蛋白、促卵泡激素抑释素和肌肉素；以及
血管活性肠肽、利尿钠肽、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人生长激素(hGH)、促红细胞生成素(EPO)、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素、干扰素受体、G蛋白偶联受体、白介素、白介素受体、酶、白介素结合蛋白、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、A蛋白、变态反应抑制因子、坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转移生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、载脂蛋白-E、高糖基化促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、凝血调节蛋白、血液因子VII、血液因子VIIa、血液因子VIII、血液因子IX、血液因子XIII、纤溶酶原激活物、纤维蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、水蛭素、C蛋白、C-反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、血小板衍生生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、血管抑素、血管紧张素、骨形态发生生长因子、骨形态发生蛋白、降钙素、房肽素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织激活因子、组织因子途径抑制物、促卵泡激素、黄体生成素、黄体生成素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺激素、松弛素、促胰液素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、自分泌运动因子、乳铁蛋白、肌生成抑制蛋白、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段。
在另一具体实施方案中，本发明的生理活性多肽可以同时激活至少两种受体。
在另一实施方案中，本发明的生理活性多肽可以选自天然类型生理活性多肽的衍生物代替天然类型的那些。生理活性多肽的衍生物可以指它们对天然受体的结合亲和力已改变的那些或者它们的物理化学特性已修饰的那些，如增加的水溶解度和减少的免疫原性，通过化学修饰如氨基酸的取代、插入和缺失，聚糖的添加，聚糖的去除，非天然氨基酸的插入，环和甲基残基的插入，并且生理活性多肽的衍生物还可以包含工程化以对至少两种不同受体具有结合亲和力的人工肽。
在另一具体实施方案中，本发明的蛋白缀合物中包含的生物相容性材料可以选自聚乙二醇(PEG)、胆固醇、白蛋白及其片段、白蛋白结合材料、特定氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合材料、体内结缔组织或其衍生物、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖、聚合物及其组合。
在另一具体实施方案中，本发明的蛋白缀合物中包含的FcRn结合材料可以是包含免疫球蛋白Fc区的多肽。
在另一具体实施方案中，本发明的蛋白缀合物中包含的免疫球蛋白Fc区可以是非糖基化的。
在另一具体实施方案中，本发明的蛋白缀合物中包含的免疫球蛋白Fc区可以进一步具有铰链区。
在另一具体实施方案中，本发明的蛋白缀合物中包含的免疫球蛋白Fc区可以选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、其组合及其杂合体。
在另一具体实施方案中，本发明的蛋白缀合物中包含的免疫球蛋白Fc区可以是IgG4Fc片段。
在另一具体实施方案中，本发明的蛋白缀合物中包含的脂肪酸衍生物可以是饱和或不饱和的C1-40脂肪酸。
在另一具体实施方案中，本发明的蛋白缀合物中包含的脂肪酸可以是选自以下的脂肪酸：甲酸(HCOOH)、乙酸(CH3COOH)、丙酸(C2H5COOH)、丁酸(C3H7COOH)、戊酸(C4H9COOH)、己酸(C5H11COOH)、庚酸(C6H13COOH)、辛酸(C7H15COOH)、壬酸(C8H17COOH)、癸酸(C9H19COOH)、十一酸(C10H21COOH)、月桂酸(C11H23COOH)、十三酸(C12H25COOH)、肉豆蔻酸(C13H27COOH)、十五酸(C14H29COOH)、棕榈酸(C15H31COOH)、十七酸(C16H33COOH)、硬脂酸(C17H35COOH)、十九酸(C18H37COOH)、花生酸(C19H39COOH)、山萮酸(C21H43COOH)、二十四酸(C23H47COOH)、蜡酸(C25H51COOH)、二十七酸(C26H53COOH)、褐煤酸(C28H57COOH)、蜂花酸(C29H59COOH)、三十二酸(C31H63COOH)、丙烯酸(CH2＝CHCOOH)、巴豆酸(CH3CH＝CHCOOH)、异巴豆酸(CH3CH＝CHCOOH)、十一烯酸(CH2＝CH(CH2)8COOH)、油酸(C17H33COOH)、反油酸(C17H33COOH)、鲸蜡烯酸(C21H41COOH)、芥酸(C21H41COOH)、巴西烯酸(C21H41COOH)、山梨酸(C5H7COOH,F2)、亚油酸(C17H31COOH,F2)、亚麻酸(C17H29COOH,F3)、花生四烯酸(C19H31COOH,F4)、丙炔酸(CH≡CCOOH)和硬脂炔酸(C17H31COOH,F1)，或其衍生物。
在另一具体实施方案中，本发明的蛋白缀合物中包含的脂肪酸可以是棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸或油酸的脂肪酸，或其衍生物。
本发明的另一方面提供一种制备蛋白缀合物的方法，所述方法包括(a)通过具有至少两个反应基团的脂肪酸衍生物连接生理活性肽和生物相容性材料；以及(b)分离蛋白缀合物，所述蛋白缀合物是步骤(a)的反应产物。
在一具体实施方案中，在本发明的方法中，步骤(a)可以包括
(a1)将生物相容性材料和生理活性多肽中的任一个连接至脂肪酸衍生物的一个反应基团；
(a2)从步骤(a1)的反应混合物分离连接的材料，其中生物相容性材料和生理活性多肽中的任一个连接至脂肪酸衍生物；以及
(a3)将生物相容性材料和生理活性多肽中的另一个连接至步骤(a2)中分离的连接的材料中的脂肪酸衍生物的另一反应基团，并且制备蛋白缀合物，其中脂肪酸的反应基团连接至生理活性多肽和生物相容性材料中的每一个。
在另一具体实施方案中，在本发明的方法中，步骤(a1)和步骤(a3)可以在还原剂的存在下进行。
在另一具体实施方案中，在本发明的方法中，所述还原剂可以是氰基硼氢化钠(NaCNBH3)、硼氢化钠、二甲胺硼烷、甲基吡啶硼烷络合物或硼烷吡啶。
在另一具体实施方案中，在本发明的方法的步骤(a1)中，生理活性多肽与脂肪酸衍生物的反应摩尔比可以在1:1至1:20的范围中，并且生物相容性材料与脂肪酸衍生物的反应摩尔比可以在1:1至1:20的范围中。
在另一具体实施方案中，在本发明的方法的步骤(a3)中，步骤(a2)中分离的连接的材料与生物相容性材料或生理活性多肽的反应摩尔比可以在1:0.5至1:20的范围中。
具体实施方式
本发明的一方面提供一种蛋白缀合物，其中生理活性多肽和生物相容性材料通过脂肪酸衍生物相连。特别地，在本发明的蛋白缀合物中，生理活性多肽和生物相容性材料可以各自通过共价键连接至脂肪酸衍生物。
如本文所用，可以是构成缀合物部分的成分的术语“生理活性多肽”是在体内具有一定生理作用的多肽的一般术语，并且生理活性多肽具有多肽结构的共同特征且具有各种生理活性。生理活性多肽还可以包含具有修正物质的缺乏或过量分泌引起的异常病理状态的多肽，其通过调节基因表达和生理功能参与体内功能调节，并且还可以包含一般蛋白治疗剂。此外，术语“生理活性多肽”是不仅包含天然多肽而且还包含其所有衍生物的概念。
关于本发明的缀合物，生理活性多肽的类型和大小没有特别限制，只要生理活性多肽可以通过本发明的缀合物结构表现出增加的血液半衰期。
本发明的生理活性多肽可以是激素、细胞因子、白介素、白介素-结合蛋白、酶、抗体、生长因子、转录因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白或受体、细胞表面抗原、或者受体拮抗剂。
在另一具体实施方案中，本发明的蛋白缀合物中包含的生理活性多肽可以选自：
肠降血糖素，其包括胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素、抑胃肽(GIP)、胃泌酸调节素、Xenin、胰岛素、胆囊收缩素(CCK)、胰淀素、胃泌素、胃生长激素释放素、以及调节胃或肠中的血液葡萄糖水平以及体重的肽YY(PYY)；
脂肪素，其包括分泌自脂肪组织的瘦蛋白、脂连蛋白、adipolin、apelin和cartonectin；
神经肽，其包括分泌自脑的Kisspeptin、Nesfatin-1；
肽或蛋白，其包括分泌自肌肉的鸢尾素、myonectin、饰胶蛋白、促卵泡激素抑释素和肌肉素；以及
血管活性肠肽、利尿钠肽、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人生长激素(hGH)、促红细胞生成素(EPO)、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素、干扰素受体、G蛋白偶联受体、白介素、白介素受体、酶、白介素结合蛋白、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、A蛋白、变态反应抑制因子、坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转移生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、载脂蛋白-E、高糖基化促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、凝血调节蛋白、血液因子VII、血液因子VIIa、血液因子VIII、血液因子IX、血液因子XIII、纤溶酶原激活物、纤维蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、水蛭素、C蛋白、C-反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、血小板衍生生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、血管抑素、血管紧张素、骨形态发生生长因子、骨形态发生蛋白、降钙素、房肽素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织激活因子、组织因子途径抑制物、促卵泡激素、黄体生成素、黄体生成素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺激素、松弛素、促胰液素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、自分泌运动因子、乳铁蛋白、肌生成抑制蛋白、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段。
在另一实施方案中，本发明的生理活性多肽可以选自天然类型生理活性多肽的衍生物代替天然类型的那些。生理活性多肽的衍生物可以指它们对天然受体的结合亲和力已改变的那些或者它们的物理化学特性已修饰的那些，如增加的水溶解度和减少的免疫原性，通过化学修饰如氨基酸的取代、插入和缺失，聚糖的添加，聚糖的去除，非天然氨基酸的插入，环和甲基残基的插入，并且生理活性多肽的衍生物还可以包含进行改造以对至少两种不同受体具有结合亲和力的人工肽。
如本文所用，术语如“生理活性多肽”、“生理活性蛋白”、“活性蛋白”和“蛋白药物”表示在体内对生理现象拮抗的多肽或蛋白，并且这些术语可以互相交换使用。
如本文所用，可以是构成缀合物部分的成分的术语“生物相容性材料”是指可以结合至生理活性多肽从而增加其体内半衰期的材料。如本文所用，术语“生物相容性材料”是可以延长体内半衰期的材料，可以表示为“载体”，并且这两个术语可以互相交换使用。生物相容性材料或载体包括所有可以结合至生理活性多肽并延长其半衰期的材料。例如，生物相容性材料或载体可以选自聚乙二醇(PEG)、胆固醇、白蛋白及其片段、白蛋白结合材料、特定氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合材料、体内结缔组织或其衍生物、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖、聚合物及其组合，但是生物相容性材料或载体并不限于此。FcRn结合材料可以是包括免疫球蛋白Fc区如IgG Fc的多肽。生物相容性材料或载体可以通过脂肪酸衍生物结合至生理活性多肽。
当聚乙二醇用作载体时，可以包括使聚乙二醇能够以位置特异性方式连接的Ambrex的技术Recode，并且可以包括Neose Technologies,Inc.的技术糖聚乙二醇化(glycopegylation)。此外，可以使用其中聚乙二醇在体内缓慢清除的可释放PEG技术(但是包括的技术并不限于此)，以及使用PEG增加生物利用度的技术。此外，聚合物如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙基醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物、甲壳质和透明质酸也可以通过以上技术结合至本发明的缀合物。
在本发明中，当白蛋白用作载体时，本发明的蛋白缀合物可以是其中白蛋白或其片段直接共价键合至脂肪酸衍生物的缀合物。此外，本发明的蛋白缀合物可以是这样的缀合物，其中白蛋白结合材料(例如，白蛋白特异性结合抗体或其抗体片段)连接至脂肪酸衍生物以连接至白蛋白，虽然白蛋白本身可以不直接连接至此。此外，本发明的蛋白缀合物可以是这样的缀合物，其中通过将对白蛋白具有结合亲和力的特定肽/蛋白/化合物等连接至脂肪酸衍生物形成连接，或者是这样的蛋白缀合物，其中连接对白蛋白本身具有结合亲和力的脂肪酸，但是蛋白缀合物并不限于此。
在本发明中，抗体或其片段可以用作载体，并且这可以是具有FcRn结合区的抗体或其抗体片段，或者不含FcRn结合区的抗体片段(例如，Fab等)，但是抗体或其片段并不限于此。具体地，在本发明中，免疫球蛋白Fc区可以用作载体。
免疫球蛋白Fc区是体内代谢的生物可降解的多肽，因此，其用作药物载体是安全的。此外，相对于整个免疫球蛋白分子，免疫球蛋白Fc区具有较低的分子量，因此其在缀合物的制备、纯化和收率中具有优势。此外，由于去除因为抗体中氨基酸序列的变化具有高异质性的Fab部分，还预期材料的同质性可以显著增加并且血液中诱导抗原性的可能性可以降低的效果。
如本文所用，术语“免疫球蛋白Fc区”是指不包括免疫球蛋白的重链和轻链可变区、重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区1(CL1)的免疫球蛋白的重链恒定区。但是，Fc片段可以包括重链恒定区中的铰链区。
此外，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是包括部分或整个重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)的延长的Fc区，不包括免疫球蛋白的重链和轻链可变区。
这样的免疫球蛋白Fc区是体内代谢的可生物降解的多肽，因此，其用作药物载体是安全的。此外，相对于整个免疫球蛋白分子，免疫球蛋白Fc区具有较低的分子量，因此其在缀合物的制备、纯化和收率中具有优势。此外，由于去除因为抗体中氨基酸序列的变化具有高异质性的Fab部分，还预期材料的同质性可以显著增加并且血液中诱导抗原性的可能性可以降低的效果。
在本发明中，免疫球蛋白Fc区不仅包括天然类型的氨基酸序列，而且还包括其序列变体。氨基酸序列变体(突变体)是指天然氨基酸序列中的氨基酸序列，由于缺失、插入、非保守或保守取代或其组合，其在至少一个氨基酸残基上具有差异。例如，在IgG Fc中，已知在缀合物中重要的位置214-238、297-299、318-322或327-331处的氨基酸残基可以用作修饰的合适位点。
此外，各种其他种类的变体是可能的，包括缺失能够形成二硫键的区域，或者在天然Fc的N-末端缺失一些氨基酸残基或在天然Fc的N-末端添加甲硫氨酸残基的变体。此外，为了去除效应子功能，缺失可以发生在补体结合位点(例如，C1q结合位点和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点)。制备免疫球蛋白Fc区的这类序列衍生物的技术在国际专利公开号WO 97/34631、WO 96/32478等中公开。
一般不改变分子活性的蛋白和肽中的氨基酸交换是本领域已知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
在某些情况下，可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化(farnesylation)、乙酰化、酰胺化等修饰免疫球蛋白Fc区。
上述Fc变体表现出与本发明的免疫球蛋白Fc片段相同的生物活性，但是具有改进的对热、pH等的结构稳定性。
此外，免疫球蛋白Fc区可以获得自从人和动物如牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、豚鼠等体内分离的天然形式，或者可以是其重组体或衍生物，获得自转化的动物细胞或微生物。在本文中，免疫球蛋白Fc区可以获得自天然免疫球蛋白，通过从活的人体或动物体分离整个免疫球蛋白并用蛋白酶处理分离的免疫球蛋白。等用木瓜蛋白酶处理整个免疫球蛋白时，其切割为Fab和Fc区，而当用胃蛋白酶处理整个免疫球蛋白时，其切割为pF′c和F(ab)2片段。这些片段可以利用大小排阻色谱等分离。
优选地，免疫球蛋白Fc区是获得自关于人衍生的Fc区的微生物的重组免疫球蛋白Fc区。
此外，免疫球蛋白Fc区可以为天然聚糖形式，与天然类型相比增加或减少的聚糖，或者去糖基化形式。免疫球蛋白Fc聚糖的增加、减少或去除可以通过常规方法完成，如化学方法、酶促方法和利用微生物的遗传工程方法。通过从Fc区去除聚糖获得的免疫球蛋白Fc区表现出对补体(C1q部分)的结合亲和力显著减少以及减少或去除抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性，因此其不诱导体内不必要的免疫应答。在这方面，去糖基化或非糖基化免疫球蛋白Fc区中的免疫球蛋白Fc区可为更合适的药物载体形式，满足本发明的最初目的。
如本文所用，术语“去糖基化的Fc区”是指其中酶促去除糖部分的Fc区，而术语“非糖基化的Fc区”是指未糖基化且在原核生物优选大肠杆菌(E.coli)中产生的Fc区。
同时，免疫球蛋白Fc区可以源自人或动物，包括牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠，并且优选地，其源自人。此外，免疫球蛋白(Ig)Fc区可以源自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其组合或其杂合体。优选地，其源自IgG或IgM，是人血液中最丰富的蛋白，并且最优选地，其源自IgG，已知其增加配体结合蛋白的半衰期。
同时，如本文所用，术语“组合”表示编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽连接至二聚体或多聚体形式的不同来源的单链多肽。即，二聚体或多聚体可以制备自选自IgG Fc、IgAFc、IgM Fc、IgD Fc和IgE Fc片段的两个或更多个片段。
如本文所用，术语“杂合体”表示对应于不同来源的两个或更多个免疫球蛋白Fc片段的序列存在于单链免疫球蛋白Fc片段中。在本发明中，各种杂合体形式是可能的。即，杂合体结构域可以由选自IgG Fc、IgM Fc、IgAFc、IgE Fc和IgD Fc的CH1、CH2、CH3和CH4的1-4个结构域组成，并且可以包括铰链区。
同时，IgG还可以分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类，并且本发明可以包含其组合或杂合体。优选地，IgG是IgG2和IgG4亚类，并且最特别地，很少具有效应子功能如补体依赖性细胞毒性(CDC)的IgG4的Fc区。特别地，包含在本发明的蛋白缀合物中用作载体的免疫球蛋白Fc区可以是源自人IgG4的非糖基化的Fc片段。与非人源性Fc片段相比，人源性Fc片段可以表现出优异的效果，非人源性Fc片段在活的人体内充当抗原，从而引起不期望的免疫应答如产生新抗体。
在本发明中，肽或蛋白片段可以用作载体用于增加体内半衰期。待使用的肽或蛋白片段可以是由特定氨基酸序列组合的重复单元的聚合物组成的弹性蛋白样多肽(ELP)，并且可以包含已知具有高体内稳定性的转铁蛋白，是结缔组织的构成组分的纤连蛋白，及其衍生物，但是片段并不限于此，并且增加体内半衰期的任何肽或蛋白包括在本发明的范围中。
如本文所用，术语“脂肪酸”可以是构成缀合物部分的成分，是指具有一个羧基(-COOH)的烃链，并且具有式R-COOH的单价羧酸统称为脂肪酸。本发明的脂肪酸可以是饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸，取决于形成烃链的碳骨架之间的键。不饱和脂肪酸是指在形成烃链的碳骨架的键中具有至少一个双键的脂肪酸，而其中碳骨架的所有键都是单键的脂肪酸是饱和脂肪酸。
此外，本发明的脂肪酸可以是具有正常链结构的脂肪酸或者在烷基中具有侧链的脂肪酸。脂肪酸可以分为短链/中链/长链脂肪酸，取决于给定烃链的碳数量。一般来说，脂肪酸可以分为具有1-6个碳原子的短链脂肪酸，具有6-12个碳原子的中链脂肪酸，以及具有14或更多个碳原子的长链脂肪酸。此外，在不饱和脂肪酸的情况下，特征可以根据双键的位置变化。
此外，如本文所用，术语“脂肪酸衍生物”可以指其中两个或更多个反应基团直接或通过接头连接至上述脂肪酸骨架的材料。例如，反应基团的实例可以包括2,5-二氧代吡咯烷基、2,5-二氧代吡咯基、醛、芳基二硫化物、杂芳基二硫化物、卤代乙酰胺和C7-10炔基。具体地，反应基团可以是马来酰亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺，琥珀酰亚胺，甲醛，乙醛，丙醛，丁醛，邻二硫吡啶(OPSS)，碘乙酰胺，包含溴、氟、氯或砹代替碘的卤代乙酰胺，二氟环辛炔(DIFO)，二苯并环辛炔(DIBO)，二苯并-氮杂-环辛炔(DIBAC或DBCO)，二芳基氮杂环辛酮(BARAC)，四甲基硫杂环庚炔(TMTH)，双环壬炔(BCN)Sondheimer二炔，环辛炔(OCT)，单氟化环辛炔(MOFO)，二甲氧基氮杂环辛炔(DIMAC)，2,3,6,7-四甲氧基-二苯并环辛炔(TMDIBO)，磺酰化二苯并环辛炔(S-DIBO)，羧甲基单苯并环辛炔(COMBO)，吡咯并环辛炔(PYRROC)或者炔，但是反应基团并不限于此。
此外，反应基团可以通过包括C1-3烷基氨基和(C1-3烷氧基)n(C1-3烷基氨基)链(其中n是1-3的整数)在内的接头连接至脂肪酸骨架，但是接头的种类并不限于此。
本发明的脂肪酸可以是具有式R-COOH的羧酸，其中R基团可以包括线性或支化的饱和烃基、饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸、短链脂肪酸、中链脂肪酸和长链脂肪酸。具体地，本发明的脂肪酸可以是具有1-40个碳原子，更具体的4-30个碳原子构成烃的脂肪酸，但是本发明的脂肪酸并不限于此。例如，本发明的脂肪酸可以是选自以下的脂肪酸：甲酸(HCOOH)、乙酸(CH3COOH)、丙酸(C2H5COOH)、丁酸(C3H7COOH)、戊酸(C4H9COOH)、己酸(C5H11COOH)、庚酸(C6H13COOH)、辛酸(C7H15COOH)、壬酸(C8H17COOH)、癸酸(C9H19COOH)、十一酸(C10H21COOH)、月桂酸(C11H23COOH)、十三酸(C12H25COOH)、肉豆蔻酸(C13H27COOH)、十五酸(C14H29COOH)、棕榈酸(C15H31COOH)、十七酸(C16H33COOH)、硬脂酸(C17H35COOH)、十九酸(C18H37COOH)、花生酸(C19H39COOH)、山萮酸(C21H43COOH)、二十四酸(C23H47COOH)、蜡酸(C25H51COOH)、二十七酸(C26H53COOH)、褐煤酸(C28H57COOH)、蜂花酸(C29H59COOH)、三十二酸(C31H63COOH)、丙烯酸(CH2＝CHCOOH)、巴豆酸(CH3CH＝CHCOOH)、异巴豆酸(CH3CH＝CHCOOH)、十一烯酸(CH2＝CH(CH2)8COOH)、油酸(C17H33COOH)、反油酸(C17H33COOH)、鲸蜡烯酸(C21H41COOH)、芥酸(C21H41COOH)、巴西烯酸(C21H41COOH)、山梨酸(C5H7COOH,F2)、亚油酸(C17H31COOH,F2)、亚麻酸(C17H29COOH,F3)、花生四烯酸(C19H31COOH,F4)、丙炔酸(CH≡CCOOH)和硬脂炔酸(C17H31COOH,F1)，或其衍生物，并且更具体地，棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸或油酸，但是本发明的脂肪酸并不限于此。
此外，本发明的脂肪酸可以是上文解释的脂肪酸的衍生物、类似物等，并且特别地，可以是变体，其中除了线性或支化基团，构成脂肪酸的烃包括环状基团。烃中可以包含的环状基团可以是饱和的同素环、杂环、芳香缩合或非缩合的同素环或杂环，并且可以具有醚键、不饱和键和取代基。
此外，美国专利号8,1293,43，国际专利公开号WO 2015/067715、WO 2015/055801、WO 2013/041678、WO 2014/133324、WO 2014/009316和WO 2015/052088中描述的脂肪酸衍生物可以用作本发明的脂肪酸，但是本发明的脂肪酸并不限于此。例如，本发明的脂肪酸可以包括但不限于包括两个或更多个羧基的多脂肪酸，包括羧酸(生物)等排体、磷酸或磺酸代替脂肪酸的羧基的材料，脂肪酸酯等。
此外，关于本发明的脂肪酸，本领域已知的上述脂肪酸的衍生物和类似物以及现有技术中可以容易地制备的衍生物和类似物也在本发明的范围内。本发明的脂肪酸的分子量可以在0.1kDa-100 kDa的范围中，特别是0.1kDa-30 kDa。作为本发明的脂肪酸，不仅可以使用单一种类的聚合物，而且可以使用不同种类聚合物的组合，但是本发明的脂肪酸并不限于此。
本发明的蛋白缀合物中包含的脂肪酸衍生物的两个或更多个反应基团可以互相相同或不同。例如，脂肪酸衍生物可以在一个反应基团具有马来酰亚胺，并且在另一反应基团具有烷基醛基团如醛基、丙醛基或丁醛基。在两个反应基团具有羟基的脂肪酸衍生物的情况下，本发明的缀合物可以这样制备，通过已知的化学方法激活羟基为上述各种反应基团或者使用可商购的具有修饰的一种或多种反应基团的脂肪酸。
本发明的蛋白缀合物可以是这样的，其中脂肪酸连接至位于生理活性多肽的中间而不是N-末端或C-末端的氨基酸残基或者多肽的末端，同时生物相容性材料连接至脂肪酸的部分，所述脂肪酸的部分连接至生理活性多肽。N-末端或C-末端包括由N-末端或C-末端的1-25个氨基酸组成的区域而不是末端本身。
本发明的蛋白缀合物可以包括至少一种[生理活性多肽–脂肪酸衍生物–生物相容性材料]结构，且构成所述结构的元件可以通过共价键以线性或支化类型连接，并且本发明的蛋白缀合物可以包括每种元件中的至少一个。因为本发明的脂肪酸包含至少两个反应基团，所以脂肪酸可以通过反应基团中的每一个共价连接至生理活性多肽和生物相容性材料。此外，其中生理活性多肽和脂肪酸衍生物相连的至少一种缀合物通过共价键缀合至一种生物相容性材料，从而利用生物相容性材料作为介质形成生理活性多肽的单体、二聚体或多聚体，并且通过生物相容性材料，可以更有效地实现生理活性多肽的体内活性和稳定性的增加。
在本发明的蛋白缀合物中，生理活性多肽和生物相容性材料可以以各种摩尔比组合。
本发明的另一方面提供一种制备蛋白缀合物的方法，所述方法包括(a)通过脂肪酸衍生物连接生理活性肽和生物相容性材料；以及(b)分离蛋白缀合物，所述蛋白缀合物是步骤(a)的反应产物。
生理活性肽、生物相容性材料和脂肪酸衍生物与上文解释的相同。
在步骤(a)中，3个组分可以通过共价键连接，并且共价键可以顺序或同时存在。例如，在生理活性多肽和生物相容性材料各自连接至具有至少两个反应基团的脂肪酸衍生物的反应基团的情况下，顺序进行反应是有利的，首先将生理活性多肽和生物相容性材料中的任一个连接至脂肪酸衍生物的反应基团之一，然后将生理活性多肽和生物相容性材料中的另一个连接至脂肪酸衍生物的另一反应基团，以便最小化除靶蛋白缀合物以外的副产物的产生。
因此，步骤(a)可以包括：
(a1)将生物相容性材料和生理活性多肽中的任一个连接至脂肪酸衍生物的一个反应基团；
(a2)从步骤(a1)的反应混合物分离连接的材料，其中生物相容性材料和生理活性多肽中的任一个连接至脂肪酸衍生物；以及
(a3)将生物相容性材料和生理活性多肽中的另一个连接至步骤(a2)中分离的连接的材料中的脂肪酸衍生物的另一反应基团，并且制备蛋白缀合物，其中脂肪酸的反应基团连接至生理活性多肽和生物相容性材料中的每一个，
但是所述方法并不限于此。
考虑参与反应的脂肪酸衍生物的反应基团的类型，在必要时，步骤(a1)和步骤(a3)的反应可以在还原剂的存在下进行。还原剂的具体实例可以包括氰基硼氢化钠(NaCNBH3)、硼氢化钠、二甲胺硼烷、甲基吡啶硼烷络合物、硼烷吡啶等。
在上文中，考虑特征如需要的纯度以及所得产物的分子量和电荷，在必要时，步骤(a2)和(b)可以通过选择用于蛋白分离的常规方法中的适当方法进行。例如，可以应用各种已知方法，包括大小排阻色谱或离子交换色谱，并且在需要时，许多不同方法可以组合使用以便以更高纯度纯化。
在步骤(a1)中，生理活性多肽与脂肪酸衍生物的反应摩尔比以及生物相容性材料与脂肪酸衍生物的反应摩尔比可以各自在1:1至1:20范围中选择。具体地，生理活性多肽与脂肪酸衍生物的反应摩尔比可以在1:2至1:10的范围中，并且生物相容性材料与脂肪酸衍生物的反应摩尔比可以在1:4至1:20的范围中。同时，在步骤(a3)中，步骤(a2)中分离的连接的材料与生物相容性材料或生理活性多肽的反应摩尔比可以在1:0.5至1:20的范围中，但是反应摩尔比并不限于此。
本发明的另一方面提供通过制备本发明的蛋白缀合物的方法制备的蛋白缀合物，以及包含制备的蛋白缀合物的药物组合物。本发明的药物组合物可以是与天然类型的生理活性多肽相比具有增加的体内持续时间和稳定性的长效制品。
包含本发明的缀合物的药物组合物可以包括药学可接受的载体。对于口服给药，药学可接受的载体可以包含粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、调味剂等。对于可注射制品，药学可接受的载体可以包含缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。对于局部给药的制品，药学可接受的载体可以包含基底、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。本发明的药物组合物可以与上述药学可接受的载体组合配制为各种剂型。例如，对于口服给药，药物组合物可以配制为片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、薄片等。对于可注射制品，药物组合物可以配制为单剂量安瓿或多剂量形式。药物组合物还可以配制为溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂等。
此外，适合的制剂载体、赋形剂和稀释剂的实例可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。
此外，本发明的药物组合物可以进一步包含填料、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、调味剂、防腐剂等。
实施例
在下文中，参考以下实施例更详细地描述本发明。但是，以下实施例仅用于说明目的而不意图限制本发明的范围。
制备例1：中间体(1)，2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-N-(2-(2-(2,2-二甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基)乙酰胺的合成，用于制备具有至少两个反应基团的脂肪酸衍生物
[反应路线1]
Figure BDA0001751809580000181
步骤1.2-(2-羟基乙氧基)乙基氨基甲酸苄酯的制备
将2-(2-氨基乙氧基)乙醇(150mL,1.459mol)溶于四氢呋喃(THF,5L)中之后，向其添加三乙胺(229mL,1.645mol)和氯甲酸苄酯(211mL,1.495mol)并将混合物搅拌12小时。将固体滤出，用乙酸乙酯洗涤，并且将滤液浓缩。将浓缩液通过柱色谱纯化以给出标题化合物(202g)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.37-7.29(m,5H),5.25(br,1H),5.10(s,2H),4.13-4.11(m,2H),3.57-3.54(m,4H),3.43-3.38(m,2H),2.24(br,1H).
步骤2.3-氧代-1-苯基-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二烷-12-酸叔丁酯的制备
将步骤1中获得的2-(2-羟基乙氧基)乙基氨基甲酸苄酯(129g,0.539mol)溶于THF(2L)中之后，在0℃下向其逐滴添加叔丁醇钾(60.5g,0.593mol)。30分钟之后，向其添加溴乙酸叔丁酯，将混合物在0℃下搅拌3小时并在室温下进一步搅拌15小时。通过向反应溶液添加水终止反应，将所得物浓缩并用乙酸乙酯萃取。将有机层在无水硫酸镁上干燥并过滤。将滤液浓缩并通过柱色谱纯化以给出标题化合物(87.5g)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.36-7.30(m,5H),5.38(br,1H),5.10(s,2H),4.00(s,2H),3.70-3.64(m,4H),3.60-3.56(m,2H),3.43-3.40(m,2H),1.46(s,9H).
步骤3.3-氧代-1-苯基-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二烷-12-酸的制备
将步骤2中获得的3-氧代-1-苯基-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二烷-12-酸叔丁酯(22.0g,62.249mol)溶于二氯甲烷(138mL)中之后，向其添加三氟乙酸(138mL)并将混合物在室温下搅拌5小时。将反应溶液过滤并浓缩以给出标题化合物(13.0g)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.36-7.31(m,5H),5.11(s,2H),4.15(s,2H),3.74-3.58(m,6H),3.42-3.40(m,2H).
步骤4.3-氧代-1-苯基-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二烷-12-酸乙酯的制备
将步骤1中获得的2-(2-羟基乙氧基)乙基氨基甲酸苄酯(15.0g,62.691mmol)溶于THF(240mL)中之后，在0℃下向其逐滴添加叔丁醇钾(7.0g,62.691mmol)。30分钟之后，向其添加溴乙酸乙酯，将混合物在0℃下搅拌3小时并在室温下进一步搅拌15小时。通过向反应溶液添加水终止反应，将所得物浓缩并用乙酸乙酯萃取。将有机层在无水硫酸镁上干燥并过滤。将滤液浓缩并通过柱色谱纯化以给出标题化合物(8.6g)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.36-7.30(m,5H),5.32(br,1H),5.10(s,2H),4.19(q,2H),4.12(s,2H),3.72-3.65(m,4H),3.59-3.56(m,2H),3.41-3.38(m,2H),1.26(t,3H).
步骤5.2-(2-(2,2-二甲氧基乙氧基)乙氧基)乙-l-胺的制备
将步骤4中获得的3-氧代-1-苯基-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二烷-12-酸乙酯(5.0g,15.368mmol)溶于无水THF(30mL)中之后，在氩气气氛下向其缓慢地逐滴添加二异丁基铝氢化物(DIBAL-H,23.0mL,23.051mmol)并将混合物在0℃下搅拌1小时。向反应溶液添加10％盐酸，在0℃下搅拌30分钟并将混合物用乙酸乙酯萃取。将有机层在无水硫酸镁上干燥并过滤，并且将滤液浓缩。在氩气气氛下将所得产物溶于甲醇(18mL)中之后，向其添加原甲酸三甲酯(13.4mL,122.941mmol)和对甲苯磺酸(146mg,0.768mmol)并将混合物在室温下搅拌2小时。然后，向其添加乙酸乙酯并且将混合物萃取。将有机层在无水硫酸镁上干燥，过滤，浓缩并通过柱色谱纯化。将产物再次溶于甲醇(10mL)中之后，向其添加10％Pd/C(76mg,0.4wt％)并将混合物在室温下于氢气气氛下搅拌3小时。将反应溶液过滤，将滤液浓缩并在减压下干燥以给出标题化合物(673mg)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ4.53(t,1H),3.68-3.62(m,6H),3.56-3.50(m,2H),3.40(s,6H),2.87(t,2H).
步骤6.2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-N-(2-(2-(2,2-二甲氧基乙氧基)乙氧基) 乙基)乙酰胺的制备
将步骤3中获得的3-氧代-1-苯基-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十二烷-12-酸(952mg,3.204mmol)溶于乙腈(30mL)中之后，向其添加(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP,1.6g,3.522mmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,1.7mL,9.606mmol)并将混合物在室温下搅拌30分钟。向其添加步骤5中获得的2-(2-(2,2-二甲氧基乙氧基)乙氧基)乙-l-胺(650mg,3.364mmol)并将混合物在室温下搅拌3小时。在反应完成时，向其添加乙酸乙酯并将混合物用碳酸氢钠洗涤。然后，将所得物在无水硫酸镁上干燥并过滤，将滤液浓缩并通过柱色谱纯化。将产物再次溶于甲醇(8mL)中之后，向其添加10％Pd/C(104mg,0.4wt％)并将混合物在室温下于氢气气氛下搅拌3小时。将反应溶液过滤，将滤液浓缩并在减压下干燥以给出中间化合物1(173mg)。
1H NMR(300MHz,MeOD)δ4.52(t,1H),4.03(s,2H),3.71-3.32(m,22H),2.97(t,2H).
制备例2：中间体(2)(S)-24-(叔丁氧基羰基)-3-甲氧基-12,21,26-三氧代-2,5,8,14,17-五氧杂-11,20,25-三氮杂四十三烷-43-酸的合成，用于制备具有至少两个反应基团的脂肪酸衍生物
[反应路线2]
Figure BDA0001751809580000211
步骤1.18-(苄氧基)-18-氧代十八烷酸的制备
将十八烷二酸(100g,318mmol)、对甲苯磺酸(756mg,3.975mmol)和苄醇(26.4mL,254.4mol)添加至甲苯(3.7L)并将混合物蒸馏。将硅藻土添加至反应溶液，并且将其冷却至40℃，搅拌1小时，然后通过硅胶过滤。将滤液在减压下浓缩并在50℃下添加庚烷。将固体滤出，用庚烷洗涤并干燥以给出标题化合物(67.9g)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.36-7.34(m,5H),5.11(s,2H),2.35(t,4H),1.64(t,4H),1.25(s,24H).
步骤2.18-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)十八烷酸-1-苄酯的制备
将步骤1中获得的18-(苄氧基)-18-氧代十八烷酸(20.0g,49.43mmol)溶于N-羟基琥珀酰亚胺(6.8g,59.319mmol)中并将N,N′-二异丙基碳二亚胺(DIC,12.24g,59.312mmol)溶于N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP,200mL)中之后，将混合物在60℃下搅拌2.5小时。在反应完成时，将反应溶液冷却至室温并将固体滤出。向滤液添加水，将所得固体滤出并用水洗涤。将固体从异丙醇中重结晶以给出标题化合物(21.6g)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.37-7.31(m,5H),5.11(s,2H),2.83(s,2H),2.60(t,2H),2.35(t,2H),1.77-1.53(m,6H),1.25(s,24H).
步骤3.(S)-5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)2-(18-(苄氧基)-18-氧代-十八烷酰氨 基)戊二酸-1-叔丁酯的制备
将步骤2中获得的18-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)十八烷酸-1-苄酯(10.0g,19.934mmol)和L-谷氨酸5-叔丁酯(4.3g,20.931mmol)添加至NMP(80mL)并将混合物在50℃下搅拌4小时。在反应完成时，将反应溶液冷却至室温，向其添加水(230mL)、0.5M硫酸氢钾(34mL)和乙酸乙酯并将混合物萃取。将有机层在无水硫酸镁上干燥并过滤，并且将滤液浓缩。将产物溶于NMP(75mL)中之后，向其添加N-羟基琥珀酰亚胺(3.7g,31.894mmol)和DCC(N,n’-二环己基碳二亚胺,5.4g,25.914mmol)并将混合物在室温下搅拌16小时。将固体过滤并将滤液用水洗涤。将有机层在无水硫酸镁上干燥并过滤，并且将滤液浓缩。将浓缩液通过柱色谱纯化以给出标题化合物(7.1g)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.36-7.31(m,5H),6.19(d,1H),5.11(s,2H),4.64-4.57(m,1H),2.83(s,4H),2.73-2.62(m,2H),2.35(t,2H),2.24-2.17(m,2H),1.66-1.55(m,4H),1.48(s,9H),1.24(s,26H).
步骤4.(S)-24-(叔丁氧基羰基)3-甲氧基-12,21,26-三氧代-2,5,8,14,17-五氧 杂-11,20,25-三氮杂四十三烷-43-酸的制备
将步骤3中获得的(S)-5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)2-(18-(苄氧基)-18-氧代-十八烷酰氨基)戊二酸-1-叔丁酯(329mg,0.478mmol)、根据制备例1制备的中间体1(170mg,0.502mmol)和三乙胺(0.2mL,1.435mmol)添加至乙腈(8mL)，并且将混合物在室温下搅拌16小时。在反应完成时，将反应溶液浓缩并通过柱色谱纯化。将产物溶于甲醇(10mL)中之后，向其添加10％Pd/C(140mg,0.4wt％)并将混合物在室温下于氢气气氛下搅拌3小时。将反应溶液过滤，将滤液浓缩并在减压下干燥以给出中间化合物2(300mg)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.87(br,1H),6.63(d,1H),4.52(t,1H),4.41(m,1H),4.04(s,2H),3.70-3.47(m,18H),3.41(s,6H),2.35-2.20(m,7H),1.93-1.86(m,1H),1.63-1.53(m,4H),1.46(s,9H),1.26(s,24H).
制备例3：作为生物相容性材料的免疫球蛋白Fc片段的制备
免疫球蛋白Fc片段用作蛋白缀合物的生物相容性材料。根据韩国专利号10-0824505公开的免疫球蛋白Fc区的批量制备方法制备免疫球蛋白Fc片段，其中去除起始甲硫氨酸残基，所述专利是本发明人以前的专利申请。
实施例1：具有两个反应基团作为接头的脂肪酸衍生物(1)(S)-22-(18-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基氨基)-18-氧代十八烷酰氨基)-1,10,19-三氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18-二氮杂二十三烷-23-酸的制备
将根据制备例2制备的中间体2(150mg,0.183mmol)溶于乙腈(5mL)中之后，向其添加1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧六氟磷酸酯(1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxidhexafluorophosphate)(HATU,77mg,0.201mmol)、DIPEA(0.1mL,0.549mmol)，并且将混合物在室温下搅拌20分钟。将N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(32mg,0.183mmol)添加至反应溶液并将混合物在室温下搅拌12小时。在反应完成时，向其添加乙酸乙酯并将混合物用碳酸氢钠洗涤，将所得物在无水硫酸镁上干燥并过来，将滤液浓缩并通过柱色谱纯化。将产物溶于二氯甲烷中之后，向其添加三氟乙酸(0.16mL,2.123mmol)并将混合物在室温下搅拌16小时。将反应溶液在减压下浓缩并用二乙醚重结晶以给出标题化合物(15mg)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.71(s,1H),7.20(br,1H),6.97(br,1H),6.73(s,2H),5.84(br,1H),4.48-4.44(m,1H),4.05(s,2H),3.72-3.45(m,22H),2.26-2.07(m,8H),1.62-1.57(m,4H),1.25(s,24H)；
MS(ESI+):[M+H]+m/z 840.5.
Figure BDA0001751809580000231
实施例2：具有两个反应基团作为接头的脂肪酸衍生物(2)(S)-22-(18-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-18--氧代十八烷酰氨基)-1,10,19-三氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18-二氮杂二十三烷-23-酸的制备
将根据制备例2制备的中间体2(150mg,0.183mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中之后，向其添加N-羟基琥珀酰亚胺(23g,0.201mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC,42mg,0.219mmol)，并且将混合物在室温下搅拌16小时。在反应完成时，将所得物用碳酸氢钠洗涤，在无水硫酸镁上干燥并过滤，将滤液浓缩并通过柱色谱纯化。将产物溶于二氯甲烷中之后，向其添加三氟乙酸(0.17mL,2.181mmol)并将混合物在室温下搅拌16小时。将反应溶液在减压下浓缩并用二乙醚重结晶以给出标题化合物(25mg)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.70(s,1H),7.21(d,1H),7.06(br,1H),4.53-4.46(m,1H),4.05(s,2H),3.76-3.49(m,16H),2.84(s,4H),2.60(t,4H),2.48-2.41(m,2H),2.23(t,2H),2.12-2.04(m,2H),1.78-1.72(m,2H),1.65-1.62(m,2H),1.25(s,24H)；
MS(ESI+):[M+H]+m/z 815.5.
Figure BDA0001751809580000241
实施例3：其中生理活性多肽和免疫球蛋白Fc通过作为接头的脂肪酸衍生物相连的缀合物的制备
为了将根据实施例1或2制备的包含马来酰亚胺基团和醛基团作为反应基团的脂肪酸衍生物接头连接至三重激动剂(SEQ ID NO:1)的半胱氨酸残基，所述三重激动剂是生理活性多肽之一并表现出对所有GLP-1、GIP和胰高血糖素受体的活性，将三重激动剂和脂肪酸衍生物接头以1:1-2的摩尔比混合并在4℃-8℃下反应约1-2小时。特别地，三重激动剂的浓度在3mg/mL-5mg/mL的范围中，并且反应在20mM Tris(pH 7.0-pH 8.0)和异丙醇的存在下进行。利用包含柠檬酸盐(pH 3.0)和乙醇的缓冲液作为反应溶液以及SP-HP柱(GE,U.S.A.)采用氯化钾浓度梯度纯化以1:1的摩尔比连接至脂肪酸衍生物接头的三重激动剂。
然后，使其中脂肪酸衍生物接头和三重激动剂相连的纯化的缀合物与免疫球蛋白Fc片段在4℃-8℃下以1:2-5的摩尔比反应12-18小时，其中总蛋白浓度在20mg/mL-35mg/mL的范围中。特别地，反应溶液具有6.0-6.5的pH，并且添加20mM氰基硼氢化钠(SCB)作为还原剂。在反应完成时，将反应溶液应用至Source Q柱(GE,U.S.A.)(其使用bis-Tris缓冲液(pH6.5)和氯化钙浓度梯度)和Source ISO(GE,U.S.A.)(其使用硫酸铵和20mM Tris(pH 7.5)浓度梯度)，从而纯化其中三重激动剂和免疫球蛋白Fc通过脂肪酸衍生物接头相连的缀合物。通过SDS-PAGE证实制备的蛋白缀合物，并且结果在图1中示出。
实施例4：根据脂肪酸的种类制备蛋白缀合物
使用具有1-100个碳原子构成脂肪酸骨架烃链的脂肪酸衍生物制备蛋白缀合物。具体地，使用具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个碳原子的脂肪酸衍生物制备蛋白缀合物。
具体地，通过实施例1-3的方法使用各种脂肪酸衍生物制备蛋白缀合物。
实验例1：蛋白缀合物的体内药代动力学的证实
证实了根据实施例4制备的蛋白缀合物，特别是其中表现出对所有GLP-1、GIP和胰高血糖素受体的活性的三重激动剂与免疫球蛋白Fc通过脂肪酸衍生物相连的缀合物的体内药代动力学，并且比较了与现有三重激动剂相比这些蛋白缀合物的体内持续时间的增加。具体地，将广泛用作常规动物模型的ICR小鼠用于证实药代动力学。在3天适应期之后将非禁食的8周龄ICR小鼠分为以下两组并给药受试材料：
第1组；以49.2nmol/kg的剂量单次皮下注射三重激动剂；以及
第2组；以5.5nmol/kg的剂量单次皮下注射缀合物，其中三重激动剂和免疫球蛋白Fc通过脂肪酸衍生物相连。
第1组，给药三重激动剂，由15个个体组成。使用眶静脉在0.25、0.5、1、2和4小时从这些个体交叉采集0.3mL血液。同时，第2组，给药缀合物，其中三重激动剂和免疫球蛋白Fc通过脂肪酸衍生物相连，由12个个体组成。以与第1组相同的方式，在1、4、8、24、48、72、96、120、144和168小时从这些个体交叉采集血液样品。通过离心(10,000rpm，10分钟，Eppendorf)从采集的样品分离血清并储存在-20℃冰箱中。
通过使用三重激动剂特异性抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)定量三重激动剂或者缀合物的浓度，其中各三重激动剂和免疫球蛋白Fc通过脂肪酸衍生物相连。通过非房室方法使用PhoenixTM
Figure BDA0001751809580000261
7.0(Pharsight,U.S.A.)程序基于A、B和C的小时血清浓度计算药代动力学参数。通过基本数据证实最大血液浓度(Cmax)和到达时间(Tmax)，并且通过对数线性梯形求和计算随时间的药物浓度曲线下面积(AUC)。还使用该程序计算其他药代动力学参数如半衰期(t1/2)、分布容积(Vd)和清除(CL)，并且药物血液浓度随时间的变化在图2中示出。
如图2所示，与现有三重激动剂的结果相比，其中各三重激动剂和免疫球蛋白Fc通过脂肪酸衍生物相连的本发明的实施例2的缀合物表现出显著增加的血液半衰期持续时间。
这些结果表明本发明公开的新建议，连接生理活性多肽和生物相容性材料的脂肪酸接头可以显著增加连接的生理活性多肽的持续时间，从而提供能够减少给药剂量和频率的新药物平台的状态。
基于上文，本发明涉及领域的技术人员能够理解本发明可以体现在其他具体形式中而不修改本发明的技术概念或本质特征。在这方面，本文公开的示例性实施方案仅为了说明目的而不应当理解为限制本发明的范围。相反，本发明不仅意图覆盖示例性实施方案，而且还覆盖可以包括在如所附权利要求书定义的本发明的精神和范围内的各种替代物、修改、等同物和其他实施方案。
序列表
<110> 韩美药品株式会社
<120> 使用脂肪酸衍生物的蛋白缀合物及其制备方法
<130> OPA16297-PCT
<150> 10-2015-0170929
<151> 2015-12-02
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Trigonal glucagon/GLP-1/GIP receptor agonist
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)
<223> Xaa = alpha-methyl-glutamic aicd or aminoisobutyric acid
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(20)
<223> amino acids at position 16 and position 20 form a ring
<400> 1
Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Leu Asp His His Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Gln Pro Pro Pro Ser Cys
35 40

Claims (14)

1.一种蛋白缀合物，其中生理活性多肽和生物相容性材料通过脂肪酸衍生物相连，
其中所述脂肪酸衍生物具有至少两个直接或通过接头连接至脂肪酸骨架的反应基团，并且所述脂肪酸衍生物通过所述反应基团连接至生理活性多肽和生物相容性材料中的每一个，
其中在形成所述缀合物前，所述脂肪酸衍生物具有以下任意的结构：
Figure FDA0003987864450000011
以及
其中所述生物相容性材料是包含免疫球蛋白Fc区的多肽，
其中所述生理活性多肽选自：
调节胃和肠中的血液葡萄糖水平以及体重的肠降血糖素，其包括胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素、抑胃肽(GIP)、胃泌酸调节素、Xenin、胰岛素、胆囊收缩素(CCK)、胰淀素、胃泌素、胃生长激素释放素、以及肽YY(PYY)；
分泌自脂肪组织的脂肪素，其包括瘦蛋白、脂连蛋白、adipolin、apelin和cartonectin；
分泌自脑的神经肽，其包括Kisspeptin、Nesfatin-1；
分泌自肌肉的多肽，其包括鸢尾素、myonectin、饰胶蛋白、促卵泡激素抑释素和肌肉素；以及
血管活性肠肽、利尿钠肽、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人生长激素(hGH)、促红细胞生成素(EPO)、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素、干扰素受体、G蛋白偶联受体、白介素、白介素受体、酶、白介素结合蛋白、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、A蛋白、变态反应抑制因子、坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转移生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、载脂蛋白-E、高糖基化促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、凝血调节蛋白、血液因子VII、血液因子VIIa、血液因子VIII、血液因子IX、血液因子XIII、纤溶酶原激活物、纤维蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、水蛭素、C蛋白、C-反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、血小板衍生生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、血管抑素、血管紧张素、骨形态发生生长因子、骨形态发生蛋白、降钙素、胰岛素、房肽素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织激活因子、组织因子途径抑制物、促卵泡激素、黄体生成素、黄体生成素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺激素、松弛素、促胰液素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、自分泌运动因子、乳铁蛋白、肌生成抑制蛋白、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段。
2.权利要求1的蛋白缀合物，其中所述生理活性多肽和所述生物相容性材料各自通过共价键连接至所述脂肪酸衍生物。
3.权利要求1的蛋白缀合物，其中将至少一种连接的材料缀合至所述生物相容性材料，所述连接的材料中生理活性多肽和脂肪酸衍生物相连。
4.权利要求1的蛋白缀合物，其中所述生理活性多肽是三重激动剂，其表现出对GLP-1、GIP和胰高血糖素受体中所有的活性，并由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。
5.权利要求1的蛋白缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是非糖基化的。
6.权利要求1的蛋白缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区进一步包含铰链区。
7.权利要求1的蛋白缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、其组合及其杂合体。
8.权利要求1的蛋白缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG4 Fc片段。
9.一种制备权利要求1-8中任一项所述蛋白缀合物的方法，所述方法包括：
(a)通过具有至少两个反应基团的脂肪酸衍生物连接生理活性肽和生物相容性材料，
其中在形成所述缀合物前，所述脂肪酸衍生物具有以下任意的结构：
Figure FDA0003987864450000031
以及
(b)分离所述蛋白缀合物，所述蛋白缀合物是步骤(a)的反应产物，
其中所述脂肪酸衍生物具有至少两个直接或通过接头连接至脂肪酸骨架的反应基团，并且所述脂肪酸衍生物通过所述反应基团连接至生理活性多肽和生物相容性材料中的每一个，
其中所述生物相容性材料是包含免疫球蛋白Fc区的多肽，
其中所述生理活性多肽选自：
调节胃和肠中的血液葡萄糖水平以及体重的肠降血糖素，其包括胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰高血糖素、抑胃肽(GIP)、胃泌酸调节素、Xenin、胰岛素、胆囊收缩素(CCK)、胰淀素、胃泌素、胃生长激素释放素、以及肽YY(PYY)；
分泌自脂肪组织的脂肪素，其包括瘦蛋白、脂连蛋白、adipolin、apelin和cartonectin；
分泌自脑的神经肽，其包括Kisspeptin、Nesfatin-1；
分泌自肌肉的多肽，其包括鸢尾素、myonectin、饰胶蛋白、促卵泡激素抑释素和肌肉素；以及
血管活性肠肽、利尿钠肽、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人生长激素(hGH)、促红细胞生成素(EPO)、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素、干扰素受体、G蛋白偶联受体、白介素、白介素受体、酶、白介素结合蛋白、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、A蛋白、变态反应抑制因子、坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转移生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、载脂蛋白-E、高糖基化促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、凝血调节蛋白、血液因子VII、血液因子VIIa、血液因子VIII、血液因子IX、血液因子XIII、纤溶酶原激活物、纤维蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、水蛭素、C蛋白、C-反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、血小板衍生生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、血管抑素、血管紧张素、骨形态发生生长因子、骨形态发生蛋白、降钙素、胰岛素、房肽素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织激活因子、组织因子途径抑制物、促卵泡激素、黄体生成素、黄体生成素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺激素、松弛素、促胰液素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、自分泌运动因子、乳铁蛋白、肌生成抑制蛋白、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段。
10.权利要求9的方法，其中步骤(a)包括：
(a1)将所述生物相容性材料和所述生理活性多肽中的任一个连接至所述脂肪酸衍生物的一个反应基团；
(a2)从步骤(a1)的反应混合物分离连接的材料，其中所述生物相容性材料和所述生理活性多肽中的任一个连接至所述脂肪酸；以及
(a3)将所述生物相容性材料和所述生理活性多肽中的另一个连接至步骤(a2)中分离的连接的材料中的脂肪酸衍生物的另一反应基团，并且制备缀合物，其中所述脂肪酸的反应基团连接至生理活性多肽和生物相容性材料中的每一个。
11.权利要求10的方法，其中步骤(a1)和步骤(a3)在还原剂的存在下进行。
12.权利要求11的方法，其中所述还原剂是氰基硼氢化钠(NaCNBH3)、硼氢化钠、二甲胺硼烷、甲基吡啶硼烷络合物或硼烷吡啶。
13.权利要求10的方法，其中，在步骤(a1)中，所述生理活性多肽与所述脂肪酸衍生物的反应摩尔比在1:1至1:20的范围中，并且所述生物相容性材料与所述脂肪酸的反应摩尔比在1:1至1:20的范围中。
14.权利要求10的方法，其中，在步骤(a3)中，步骤(a2)中分离的连接的材料与所述生物相容性材料或所述生理活性多肽的反应摩尔比在1:0.5至1:20的范围中。
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