KR20020064141A

KR20020064141A - 간실질세포 증식인자 동결건조 제제

Info

Publication number: KR20020064141A
Application number: KR1020017015456A
Authority: KR
Inventors: 치바마사토시
Original assignee: 미쯔비시 가가꾸 가부시끼가이샤
Priority date: 1999-05-31
Filing date: 2000-05-31
Publication date: 2002-08-07
Also published as: EP1180368A1; KR100767473B1; HK1044471A1; JP4635340B2; AU5103200A; CA2375779A1; EP1180368A4; DE60034445T2; CN100448482C; WO2000072873A1; ATE359809T1; EP1180368B1; DE60034445D1; CN1367703A; ES2408784T3

Abstract

간실질세포 증식인자(HGF), 아르기닌 또는 리신 등의 안정화제, 염화나트륨 및 완충제를 함유하는 동결건조 제제로서, 간실질세포 증식인자를 5mg/ml 미만의 농도로 함유하는 수용액으로 제조되고, 및/또는 재용해하여 간실질세포 증식인자를 5mg/ml 미만의 농도로 함유하는 수용액을 제조하기 위한 보존안정성이 우수한 제제.

Description

간실질세포 증식인자 동결건조 제제{Freeze Dried HGF Preparations}

간실질세포 증식인자(hepatocyte growth factor, 이하에서는, 'HGF'라 약칭하는 경우가 있음)는 간실질세포의 증식활성을 가지는 단백질로, 여러 동물종에 있어서 그 존재가 알려져 있고, 다른 아미노산 서열을 가지는 것이 보고되어 있다. 사람 간실질세포 증식인자(이하에서는, 'hHGF'라 약칭하는 경우가 있음)는 다이쿠하라 등에 의해 심한 폐렴환자의 혈장에서 발견되었고(참조: 특개소 63-22526호 공보), 그 후, 기타무라 등에 의해 hHGF 단백질의 아미노산 서열 및 그것을 암호화하는 유전자(cDNA)서열이 밝혀졌다(참조: 특개평 3-72883호 공보). 또한, 이 cDNA를 이용한 hHGF 단백질의 생산방법 및 형질전환체가 보고되어져 있거나(참조: 특개평 3-285693호 공보), hHGF단백질의 대량생산이 가능하게 되고 의약품으로 응용될 것이 기대되고 있다.

hHGF는 당단백질의 일종으로, 분자량은 비환원상태에서 약 80 내지 90KDa, 환원상태에서 약 52 내지 56KDa의 α서브유닛과 약 30 내지 36KDa의 β서브유닛으로 구성되는 헤테로 이량체이다. hHGF는 간세포 증식인자로의 활성 이외에 스캐터 인자(scatter factor, SF) 활성, 신장뇨세관 상피세포 증식인자 활성, 손상조직 수복인자 활성, 혈관내피 세포증식인자 활성 등의 다양한 생물활성을 가지고 있고, 간장질환 치료약, 신장질환 치료약, 뇌신경장해 치료제, 육모 촉진제, 창상 치료약, 항종양 치료약 등의 의약으로서의 개발이 기대되고 있다.

HGF의 제제에 대해서는 WO90/10651호 공보, 특개평 6-247872호 공보 및 특개평 9-25241호 공보에 기재되어 있다. 상기 WO90/10651호 공보에는 HGF와 비교하여 아미노산 5잔기가 결실된 결실형의 HGF(이하, 'TCF'라 함)의 수용액 제제가 개시되어 있고, 알부민, 사람혈청, 젤라틴, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등이 TCF를 수용액 중에서 안정화되는 것이 개시되어 있다. 특개평 6-247872호 공보에서는 염기성 아미노산 등과 TCF를 함께 넣어, TCF를 5 내지 10mg/ml의 고농도로 함유시킨 주사제가 개시되어 있다. 이 간행물에는 TCF의 수용액에서의 용해성이 언급되어 있고, TCF를 고농도로 함유시킨 수용액이 개시되어 있지만, 염기성 아미노산(리신, 아르기닌)은 주사액제의 「용해보조제(solubilizing aid)」로 이용되고 있다.

그러나, HGF의 수용액 제제는 중성 pH에 있어서 용해성이 급격히 저하되고, 저온 또는 실온에서 수일간 보존하면 응집, 탁해짐, 겔화가 진행되는 문제점을 가지고 있다. 또한, 분해물, 중합체가 형성되는 등의 물리화학적 안정성이 낮고, 생물활성이 저하되는 등 제제안정성이 낮고, 생물학적 활성의 관점에서도 장기간의 보존에는 적합하지 않다. 또한, HGF의 수용액 제제는 진탕교반에 의해 거품의 생성 등으로 응집, 탁해짐, 겔화가 발생하게 되고, 장기간의 보존 및 유통, 운반의 경우 제제품질의 저하, 약효의 감소 등이 야기될 수 있다. 이 때문에, HGF의 제제로는 동결건조 제제가 바람직하다.

특개평 9-25241호 공보에서는 HGF(TCF)의 동결건조 제제가 개시되어져 있으나, 본 발명과는 달리, 구연산염을 완충제로 이용하고, 안정화제로 글리신, 알라닌, 솔비톨, 만니톨 등을 이용하여 장기간에 걸친 안정한 고농도의 HGF(TCF)동결건조 제제를 제공할 수 있는 내용이 개시되어 있다. 그러나, 이 동결건조 제제는 완충제으로 구연산을 이용하기 때문에 재용해 후의 pH가 산성조건이고, 용액의 삼투압이 높기 때문에 주사투여시 통증, 투여 부위의 염증반응, 용혈현상이 야기되는 등의 문제점을 가지고 있다.

또한, HGF는 매우 생리활성이 강한 물질로 의약으로 사용하는 경우에는 아주 낮은 농도로 제조되어 임상에 제공될 필요가 있으나, 본 발명자들의 연구에 의하면, 특개평 9-25241호 공보에 기재된 글리신 또는 알라닌을 포함하는 HGF(TCF)의 동결건조 제제에서는 고농도의 HGF를 포함하는 수용액으로 제조한 동결건조 제제 보존시에 중합체의 생성이 적고, 임상적용에 대하여 바람직한 저농도의 HGF(일반적으로는 HGF가 5mg/ml 미만의 농도이고, 예를 들면, 2mg/ml 정도이다)를 포함하는 수용액을 글리신 또는 알라닌의 존재하에서 동결건조한 제제는 보존시에 중합체가 생성되는 것이 확인되었다. 따라서, 특개평 9-25241호 공보에 기재된 글리신 또는 알라닌은 고농도의 HGF를 동결건조하는 경우의 안정화제로서 유용하나, 저농도의 HGF를 동결건조하는 경우의 안정화제로는 불충분하여, 저농도의 HGF를 포함하는 수용액에서 중합체가 잘 생성되지 않으며 장기보존 안정성이 우수한 동결건조 제제를 제조하는 방법의 개발의 필요성이 대두되었다.

본 발명은 간실질세포 증식인자를 함유하는 동결건조 제제에 관한 것이다.

본 발명의 과제는 저농도의 HGF를 포함하는 수용액을 조제할 수 있는 HGF 동결건조 제제를 제공하는 것이다. 보다 구체적으로는 보존안정성이 우수하고, 재용해시의 응집, 탁해짐, 겔화 등이 발생하지 않는 HGF 동결건조 제제를 제공하는 것이 본 발명의 과제이다. 또한, 동결건조시의 양호하게 고형체(cake)를 형성하고 재용해성이 우수한 동결건조 제제를 제공하는 것도 본 발명의 과제이다. 또한, 주사제로 바람직한 pH 및 삼투압비를 가지는 상기 제제를 제공하는 것도 본 발명의 과제이다.

본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위한 예의 연구를 행한 결과, HGF의 농도를 5mg/ml 미만으로 안정화제, 염화나트륨 및 완충제의 존재하에서 동결건조를 행하면, 고형체의 형성성, 용해성, 장기보존 안정성이 양호한 동결건조 제제를 제조할 수 있는 점과 전기 동결건조 제제의 제조시 및 동결건조 제제의 보존시의 중합체가 형성되지 않고, 전기 동결건조 제제가 매우 높은 안정성을 가지고 있는 점을 알아내었다. 또한, 이 동결건조 제제로부터 제조된 수용액에서는 응집, 탁해짐, 겔화 등이 일어나지 않는 점 및 이러한 미량의 HGF를 포함하는 수용액이 임상적으로 충분한 약효를 발휘할 수 있는 점을 알아내었다. 본 발명은 상기의 지견을 근거로 하여 완성시킨 것이다.

즉, 본 발명에 의해 간실질세포 증식인자, 간실질세포 증식인자의 중합체 생성을 방지하기 위한 안정화제, 염화나트륨 및 완충제를 함유하는 동결건조 제제로 간실질세포 증식인자를 5mg/ml 미만의 농도로 함유하는 수용액으로부터 제조되는제제; 간실질세포 증식인자, 간실질세포 증식인자의 중합체 생성을 방지하기 위한 안정화제, 염화나트륨 및 완충제를 함유하는 동결건조 제제로 재용해하여 간실질세포 증식인자를 5mg/ml 미만의 농도로 함유하는 수용액을 제조하기 위한 제제; 및, 간실질세포 증식인자, 간실질세포 증식인자의 중합체 생성을 방지하기 위한 안정화제, 염화나트륨 및 완충제를 함유하는 동결건조 제제로, 간실질세포 증식인자를 5mg/ml 미만의 농도로 함유하는 수용액으로부터 제조되고 재용해하여 간실질세포 증식인자를 5mg/ml 미만의 농도로 함유하는 수용액을 제조하기 위한 제제가 제공된다.

이들 HGF 동결건조 제제는 동결건조시 및 동결건조후의 장기보존시에도 HGF의 중합체가 생성되지 않고, 우수한 안정성을 가지고 있다. 또한, 동결건조 제제로부터 제조된 수용액으로는 응집, 탁해짐, 겔화 등이 형성되지 않고, 용액을 보존하는 경우에도 중합체가 생성되기 어려운 특징을 가지고 있다.

통상, 바이알 중에 동결건조 제제를 제조하기 위하여 이용될 수 있는 수용액과 수득된 동결건조 제제를 바이알 중에서 용해하여 제조되는 수용액에는 같은 농도의 유효성분이 포함되는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 제제는 바람직하게는 HGF를 5mg/ml 미만의 농도로 함유하는 수용액을 바이알 또는 앰플 중에서 동결건조하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 제제는 동결건조전 및/또는 재용해 후의 수용액이 주사제로 바람직한 5 내지 6.5의 범위의 pH를 가지는 것이 바람직하고, 동결건조전 및/또는 재용해후의 수용액이 주사제로서 바람직한 삼투압, 예를 들면 생체와 거의 등장이거나 주사제의 삼투압비로 허용되는 삼투압비(1 내지 2)를가지는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 태양에 따르면, 안정화제가 아르기닌, 리신, 히스티딘, 글루타민, 프롤린, 글루타민산, 아스파라긴산, 황산화 다당류 및 이들 약리학적으로 허용되는 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 안정화제인 상기 HGF 동결건조 제제; 안정화제가 아르기닌, 리신, 히스티딘, 글루타민산, 아스파라긴산 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 상기 HGF 동결건조 제제; 안정화제가 아르기닌, 리신, 히스티딘 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염으로 구성되는 그룹으로 선택되는 상기 HGF 동결건조 제제; 안정화제가 아르기닌, 리신 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 상기 HGF 동결건조 제제가 제공된다. 이들의 안정화제는 바람직하게는 동결건조시 및/또는 동결건조후의 보존시에 있어서 HGF의 중합체 생성을 방지하기 위한 충분한 양으로 상기 제제 중에 배합된다.

또한, 본 발명의 다른 바람직한 태양에 따르면, 완충제가 인산염인 상기 HGF동결건조 제제; 또한 계면활성제를 함유하는 상기 HGF 동결건조 제제; 계면활성제가 비이온성 계면활성제인 상기 HGF 동결건조 제제; 비 이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌에테르계 계면활성제인 상기 동결건조 제제가 제공된다.

또한, 다른 관점에서는 HGF를 5mg/ml 미만의 농도로 함유하는 수용액을 동결건조하기 위하여 이용하는 HGF의 안정화제로 아르기닌, 리신, 히스티딘, 글루타민, 프롤린, 글루타민산, 아스파라긴산, 황산화 다당류 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 안정화제가 본 발명에 의해 제공된다.바람직한 안정화제는 아르기닌, 리신, 히스티딘, 글루타민산, 아스파라긴산 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택되고, 특히 바람직한 안정화제는 아르기닌, 리신 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 이 안정화제는 HGF를 5mg/ml 미만의 농도로 함유하는 수용액의 동결건조시 및 동결건조후의 보존시에 있어서 HGF의 중합체 생성을 방지할 수 있다.

또한, 본 발명에 의해 상기 안정화제 및 5mg/ml 미만의 농도의 HGF를 함유하는 수용액을 동결건조하여 수득할 수 있고, 재용해하여 5mg/ml 미만의 농도의 HGF를 함유하는 수용액을 제조하기 위한 HGF 동결건조제가 제공된다. 상기의 동결건조 제제의 바람직한 제제는 상기 안정화제(바람직하게는 아르기닌, 리신 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 안정화제), 5mg/ml 미만의 농도의 HGF, 염화나트륨 및 완충제를 함유하는 수용액을 바이알 중에서 동결건조하여 수득할 수 있다.

발명의 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 동결건조 제제에 포함되는 HGF의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, HGF를 함유하는 것이 알려져 있는 사람이나, 랫 등의 포유동물 유래의 체액이나, 조직 또는 자발적으로 HGF를 생산하는 세포로부터 천연의 HGF를 분리하여도 무방하고, 유전자 조작법으로 전기 증식인자 cDNA를 세포에 도입하여 수득할수 있는 재조합 HGF를 이용하여도 무방하다. 재조합 HGF를 생산하는 숙주로는 대장균, 고초균, 효모, 사상균, 식물세포, 곤충세포, 동물세포 등을 들 수 있다. 구체적으로 재조합 HGF로 상기 포유동물 유래의 태반, 간 장해 환자 간조직 및 혈액, MRC-5세포, IMR-9 세포 등의 섬유아세포주, 또는 특개평 3-285693호 공보에 기재된 방법에 따라 hHGF를 암호화하는 cDNA를 포함하는 발현벡터를 CHO세포 등의 숙주에 도입한 생산주 등으로부터 수득된 것을 예를 들 수 있다.

또한, HGF로는 시그널 서열을 가지는 단백질 등의 전구체 단백질이나, 간실질세포를 증식시키는 활성을 잃지 않는 범위에 있어서, 일부의 아미노산을 치환, 결실 및/또는 삽입한 수식 단백질이나 당류를 결실 또는 치환한 변이체를 이용하여도 무방하다. 변이체로는 [특개평 2-288899호 공보], [WO90/10651호 공보], [특개평 3-130091호 공보], [동 3-255096호 공보], [동 4-30000호 공보], [Nature, 342:440-443, 1989] 등에 기재된 것을 예로 들 수 있다.

본 발명의 동결건조 제제에 바람직하게 이용될 수 있는 HGF로는 이하의 이화학적 성질을 가지는 단백성 인자를 예로 들 수 있다. 또한, HGF는 사람 유래의 것이면 바람직하고, 특히 바람직한 HGF로는 특개평 3-72883호 공보 및 특개평 4-89499호 공보에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 것을 예로 들 수 있다.

1) SDS-PAGE(비환원조건하)에 의한 추정분자량이 약 76,000 내지 92,000이고,

2) 간실질세포를 증식시키는 활성을 가지며,

3) 헤파린에 대한 강한 친화성을 가지고,

또한, 보다 바람직한 HGF는 상기의 이화학적 성질에 추가하여,

4) 80℃, 10분간의 가열처리하여 상기 활성을 불활성화하며, 및,

5) 트립신에 의한 절단 처리 및 키모트립신에 의한 절단 처리에 의한 상기 활성을 불활성화하는 특징을 가진다.

HGF, 완충제 및 염화나트륨의 3 성분을 포함하는 HGF 동결건조 제제(참조: 특개평 6-247872호 공보 또는 특개평 9-25241호 공보: HGF 농도는 5 내지 20mg/ml)에 있어서, HGF의 침전 등의 문제를 피하기 위하여 HGF의 함유량을 저하시키면 동결건조 공정에서 양호한 고형체가 수득될 수 없는 문제가 있고, 또한, 상기 3 성분으로부터 수득된 동결건조 제제를 재용해한 수용액에서는 응집, 탁해짐, 겔화가 나타나고, 충분한 물리화학적 안정성을 달성할 수 없는 문제가 있다. 따라서, 동결건조에 의해 양호한 고형체 형상을 가지고, 장기간의 보존안정성이 우수한 수용액을 제조할 수 있는 동결건조 제제를 제조하기 위해서는, 고형체 형성성 및 수용액에 있어서 보존안정성의 개선을 목적으로 한 첨가제의 첨가가 필수이다.

본 발명의 동결건조 제제는 HGF를 5mg/ml 미만의 농도로 포함하는 수용액으로부터 제조되고 및/또는 동결건조 제제로부터 제조된 수용액이 HGF를 5mg/ml 미만의 농도로 포함하도록 제조된다. 바람직하게는 동결건조전 및/또는 재용해후의 수용액이 주사제로 바람직한 pH와 생체와 거의 등장이거나 주사제의 삼투압비로 허용되는 삼투압비(1 내지 2)를 가지도록 제조할 수 있다. 본 발명의 동결건조 제제는 보존안정성이 우수한 특징을 가지고 있다. 또한, 동결건조 공정에 의해 양호한 동결건조 고형체를 형성할 수 있고, 동결건조 제제를 재용해한 수용액에서는 응집,탁해짐, 겔화 등의 문제가 없고, 충분한 물리화학적 안정성을 달성할 수 있는 특징이 있다. 또한, 임상적용한 경우에는 소망하는 약리작용을 충분히 발휘할 수 있다.

안정화제로는 아르기닌; 리신; 히스티딘; 글루타민; 프롤린; 글루타민산; 아스파라긴산; 헤파린, 콘드로이친황산, 더마탄황산(dermatan sulfate), 헤파란황산(heparan sulfate), 케타란황산(ketaran sulfate), 덱스트란 황산 등의 황산화 다당류; 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염을 예로 들 수 있고, 약리학적으로 허용되는 염으로는 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염 등을 예로 들 수있다. 이들 안정화제는 2종류 이상 조합하여 사용하여도 무방하다. 바람직한 안정화제로는 아르기닌, 리신, 히스티딘, 글루타민산, 아스파라긴산 등을 예로 들 수있고, 이들 중, 아르기닌, 리신, 히스티딘 또는 이들의 조합이 특히 바람직하다. 안정화제의 첨가량은 HGF의 보존안정성을 가질 수 있는 양이면 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 HGF의 중량에 대하여 0.01 내지 100배의 중량이고, 0.1 내지 30배 중량이 특히 바람직하다.

완충제로는 동결건조전 및 재용해 후의 수용액의 pH를 조정하고, HGF의 용해성을 유지하는 작용을 가지는 것이면 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 인산 완충제, 구연산 완충제, 초산 완충제 등을 이용할 수 있다. 완충제로는 바람직하게는 인산 완충제를 이용할 수 있고, 특히 바람직하게는 인산나트륨 완충제를 이용할 수 있다. 완충제의 첨가량은 예를 들면, 재용해 후의 물의 양에 대하여 1 내지 100mM 정도이다.

염화나트륨은 동결건조전 및 재용해 후의 수용액에 있어서, HGF의 용해성을 향상시키나, 필요 이상으로 첨가하면 삼투압을 높이기 때문에 바람직하지 않다. 일반적으로는, 생체와 등장이 되는 삼투압을 가질 수 있는 양을 첨가하면 무방하고, 특히 주사제의 삼투압비로 허용되는 삼투압비인 1 내지 2가 바람직하고, 예를 들면, 재용해 후의 물의 양에 대하여 140mM이 되는 것이 바람직하다.

HGF는 중성 pH가 HGF의 등전점(pI=7 내지 8)이기 때문에 용해도가 급격히 저하되는 문제를 가지고 있다. 예를 들면, 140mM 염화나트륨을 함유하는 10mM 인산나트륨 완충제(PBS, 실온)에 있어서, pH 7.0 내지 7.5 부근에서는 1.0mg/ml 정도의 낮은 용해도를 나타내지만, pH 5.0부근에서는 5mg/ml이상의 용해도를 나타내고, HGF의 용해도는 pH가 낮을 때 높아진다. 또한, 염화나트륨 농도 0.14M에서는 HGF의 용해도는 1mg/ml정도이고, 0.3M 이상이 되면, HGF는 5mg/ml 이상의 농도에서 용해한다. 따라서, HGF의 용해도를 상승시키기 위해서는 pH를 5 이하의 산성조건으로 하거나, 염화나트륨 농도를 0.3M 이상으로 올리는 것을 생각할 수 있다. 본 발명의 제제에 있어서는 동결건조전 및/또는 재용해 후의 수용액의 pH를 약산성 영역, 구체적으로는 pH 4.0 내지 6.5, 바람직하게는 pH 5.0 내지 6.5에 조정하는 것이 바람직하다. 이러한 pH 영역에 있어서 중합체 생성이 억제된다.

또한, 본 발명의 HGF 동결건조 제제에서는 계면활성제를 첨가하는 것이 바람직하다. HGF는 용기의 재질인 유리나 수지 등의 흡착이 쉽고, 특히 저농도에서 HGF의 용기에의 흡착은 투여약액 중의 약물 함유의 저하와 연결된다. 계면활성제를 첨가하여 재용해 후의 HGF의 용기에의 흡착을 방지할 수 있다. 계면활성제로는예를 들면, 폴리솔베이트 80, 폴리솔베이트 20, HCO-40, HCO-60, 플루로닉 F-68, 폴리에틸글리콜 등의 비이온성 계면활성제를 들 수 있고, 이들을 2종 이상 조합하여 이용하여도 무방하다. 계면활성제로는 특히 바람직하게는 폴리옥시에틸렌에테르계 계면활성제(폴리솔베이트 80 등)를 이용할 수 있다. 계면활성제의 첨가량은 예를 들면, 재용해 후의 물 중량에 대해서 0.001 내지 2.0%의 범위이다.

본 발명의 HGF 동결건조 제제는 HGF를 함유하는 수용액을 통상의 방법으로 동결건조하여 제조할 수 있다. 예를 들면, HGF, 안정화제, 염화나트륨 및 완충제를 주사용 증류수에 용해하고, 필요에 따라 계면활성제를 첨가한 후, 여과멸균하여 바이알 또는 앰플 등의 용기에 분주하여 동결건조할 수 있다. 본 발명의 HGF 동결건조 제제는 제제화에 필요한 다른 첨가제 예를 들면, 산화방지제, 방부제, 부형제, 통증경감제 등을 포함하고 있어도 무방하다. 동결건조 방법으로는 예를 들면, (1) 상압하에서 냉각동결하는 동결과정, (2) 용질에 구속되지 않는 자유수(free water)를 감압하에서 승화 건조하는 일차건조과정, (3) 용질 고유의 흡착수(adsorbed water)나 결정수(crystal water)를 제거하는 2차원 건조과정의 3개의 단위조작에 의한 방법을 들 수 있으나(참조: Pharm. Tech. Japan, 8(1):75-87, 1992), 본 발명의 동결건조 제제의 제조방법은 이들 방법에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 동결건조 제제는 사용할 때에 HGF농도가 5mg/ml 미만이 되도록 주사용 증류수 등으로 용매를 가하여 용해하여도 무방하다.

이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 저농도 HGF 동결건조 제제의 제조(비교예)

140mM 염화나트륨, 0.01% 폴리솔베이트 80을 함유하는 10mM 인산완충제(pH 6.5)에 HGF 1mg/ml이 되도록 용해하고, 무균여과한 후에 HGF 수용액을 수득하였다. 본 수용액의 pH를 조정한 후에 무균상태에서 바이알 병에 2ml씩 충진하고, 표 1에 나타낸 조건에 따라 동결건조하여 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다. 표에서 「→」는 온도를 변화시키는 것을 의미한다.

표 1

	동결 과정	1차건조 과정	2차건조 과정
온도(℃)	20 →-40	-40	-40 →-20	-20	-20 →20	20
시간(Hr)	1	5	3	48	2	24
압력(mmHg)	760	760	<1	<1	<1	<1

실시예 2: 저농도 HGF 동결건조 제제의 제조(비교예)

140mM 염화나트륨, 0.01% 폴리솔베이트 80을 함유하는 10mM 인산완충제(pH 6.5)에 HGF 5mg/ml이 되도록 가온 용해하고, 무균 여과한 후, HGF 수용액을 수득하였다. 본 수용액의 pH를 조정한 후에 무균상태에서 바이알 병에 2ml씩 충진하고,표 1에 나타낸 조건에 따라 동결건조하여 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 3: 고농도 HGF 동결건조 제제의 제조(비교예)

140mM 염화나트륨, 100mM 아르기닌, 0.01% 폴리솔베이트 80을 함유하는 10mM 인산완충제(pH 6.5)에 HGF 10mg/ml이 되도록 용해하고, 무균 여과한 후, HGF 수용액을 수득하였다. 본 수용액의 pH를 조정한 후에 무균상태에서 바이알 병에 2ml씩 충진하고, 표 1에 나타낸 조건에 따라 동결건조하여 고농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 4: 저농도 HGF 동결건조 제제의 제조(비교예)

300mM 염화나트륨, 0.01% 폴리솔베이트 80을 함유하는 10mM 구연산 완충제(pH 5.0)에 HGF 1mg/ml이 되도록 용해하고, 무균 여과한 후, HGF 수용액을 수득하였다. 본 수용액의 pH를 조정한 후에 무균상태에서 바이알 병에 2ml씩 충진하고, 표 1에 나타낸 조건에 따라 동결건조하여 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 5: 저농도 HGF 동결건조 제제의 제조(비교예)

300mM 염화나트륨, 5% 글리신, 0.01% 폴리솔베이트 80을 함유하는 10mM 구연산 완충제(pH 5.0)에 HGF 1mg/ml이 되도록 용해하고, 무균 여과한 후, HGF 수용액을 수득하였다. 본 수용액의 pH를 조정한 후에 무균상태에서 바이알 병에 2ml씩 충진하고, 표 1에 나타낸 조건에 따라 동결건조하여 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 6: 저농도 HGF 동결건조 제제의 제조(비교예)

300mM 염화나트륨, 5% 알라닌, 0.01% 폴리솔베이트 80을 함유하는 10mM 구연산 완충제(pH 5.0)에 HGF 1mg/ml이 되도록 용해하고, 무균 여과한 후, HGF 수용액을 수득하였다. 본 수용액의 pH를 조정한 후에 무균상태에서 바이알 병에 2ml씩 충진하고, 표 1에 나타낸 조건에 따라 동결건조하여 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 7: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

140mM 염화나트륨, 100mM 아르기닌을 함유하는 10mM 인산완충제(pH 6.5)에 HGF 1mg/ml이 되도록 용해하고, 무균 여과한 후, HGF 수용액을 수득하였다. 본 수용액의 pH를 조정한 후에 무균상태에서 바이알 병에 2ml씩 충진하고, 실시예 1의동결건조 조건과 같은 조건에서 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다. 이 제제는 사용시에 2ml의 주사용 증류수에 용해하여 HGF를 1mg/ml 함유하고, 주사제로 허용되는 pH 및 삼투압비(1.5, 거의 등장성)를 가지는 주사액으로 제조할 수 있다.

실시예 8: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

140mM 염화나트륨, 100mM 아르기닌, 0.01% 폴리솔베이트 80을 함유하는 10mM 인산완충제(pH 6.5)에 HGF 1mg/ml이 되도록 용해하고, 무균 여과한 후, HGF 수용액을 수득하였다. 본 수용액의 pH를 조정한 후에 무균상태에서 바이알 병에 2ml씩 충진하고, 실시예 1의 동결건조 조건과 같은 조건에서 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 9: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

140mM 염화나트륨, 100mM 아르기닌, 0.01% 폴리솔베이트 80을 함유하는 10mM 인산완충제(pH 6.5)에 HGF 2mg/ml이 되도록 용해하고, 무균 여과한 후, HGF 수용액을 수득하였다. 본 수용액의 pH를 조정한 후에 무균상태에서 바이알 병에 2ml씩 충진하고, 실시예 1의 동결건조 조건과 같은 조건에서 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 10: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

140mM 염화나트륨, 100mM 아르기닌, 0.01% 폴리솔베이트 80을 함유하는 10mM 인산완충제(pH 6.5)에 HGF 3mg/ml이 되도록 용해하고, 무균 여과한 후, HGF 수용액을 수득하였다. 본 수용액의 pH를 조정한 후에 무균상태에서 바이알 병에 2ml씩 충진하고, 실시예 1의 동결건조 조건과 같은 조건에서 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 11: 저농도 동결건조 제제의 제조

140mM 염화나트륨, 100mM 아르기닌, 0.01% 폴리솔베이트 80을 함유하는 10mM 인산완충제(pH 6.5)에 HGF 4mg/ml이 되도록 가온 용해하고, 무균 여과한 후, HGF 수용액을 수득하였다. 본 수용액의 pH를 조정한 후에 무균상태에서 바이알 병에 2ml씩 충진하고, 실시예 1의 동결건조 조건과 같은 조건에서 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 12: 저농도 동결건조 제제의 제조(비교예)

140mM 염화나트륨, 100mM 아르기닌, 0.01% 폴리솔베이트 80을 함유하는 10mM인산완충제(pH 6.5)에 HGF 5mg/ml이 되도록 용해하고, 무균 여과한 후, HGF 수용액을 수득한다. 본 수용액의 pH를 조정한 후에 무균상태에서 바이알 병에 2ml씩 충진하고, 실시예 1의 동결건조 조건과 같은 조건에서 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 13: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

실시예 8에 있어서, 10mM 인산 완충용액(pH 6.5) 대신 10mM 인산 완충용액(pH 6.0)을 이용하여, HGF 1mg/ml이 되도록 용해하여 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 14: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

실시예 8에 있어서, 10mM 인산 완충용액(pH 6.5) 대신 10mM 인산 완충용액(pH 5.5)을 이용하여, HGF 1mg/ml이 되도록 용해하여 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 15: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

실시예 8에 있어서, 10mM 인산 완충용액(pH 6.5) 대신 10mM 인산완충용액(pH 5.0)을 이용하여, HGF 1mg/ml이 되도록 용해하여 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 16: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

실시예 8에 있어서, 10mM 인산 완충용액(pH 6.5) 대신 10mM 인산 완충용액(pH 7.2)을 이용하여, HGF 1mg/ml이 되도록 용해하여 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 17: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

실시예 8에 있어서, 10mM 인산 완충용액(pH 6.5) 대신 10mM 인산 완충용액(pH 7.0)을 이용하여, HGF 1mg/ml이 되도록 용해하여 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 18: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

실시예 8에 있어서, 100mM 아르기닌 대신 50mM 아르기닌을 이용하여, 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 19: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

실시예 8에 있어서, 아르기닌 대신 리신을 이용하여, 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 20: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

실시예 8에 있어서, 아르기닌 대신 히스티딘을 이용하여, 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 21: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

실시예 8에 있어서, 아르기닌 대신 글루타민을 이용하여, 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 22: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

실시예 8에 있어서, 아르기닌 대신 시스테인을 이용하여, 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 23: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

실시예 8에 있어서, 아르기닌 대신 프롤린을 이용하여, 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 24: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

실시예 8에 있어서, 아르기닌 대신 글루타민산나트륨을 이용하여, 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 25: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

실시예 8에 있어서, 아르기닌 대신 아스파라긴산나트륨을 이용하여, 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 26: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

실시예 8에 있어서, 아르기닌 대신 글리신을 이용하여, 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 27: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

실시예 8에 있어서, 바이알 병에 2ml 대신 5ml을 충진하여, 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

실시예 28: 저농도 동결건조 제제의 제조(본 발명)

140mM 염화나트륨, 0.01% 폴리솔베이트 80을 함유하는 10mM 인산나트륨 완충제(pH 6.5)에 덱스트란 황산나트륨 50mg/ml 및 HGF 1mg/ml이 되도록 용해하고, 무균 여과한 후, HGF 수용액을 수득하였다. 본 수용액의 pH를 조정한 후에 무균상태에서 바이알 병에 2ml씩 충진하고, 실시예 1의 동결건조의 조건과 같은 조건에서 저농도 HGF 동결건조 제제를 수득할 수 있었다.

시험예 1: HGF의 용해도에 관한 평가

(1) HGF의 용해도의 평가방법

HGF를 폴리프로필렌제 튜브에 무게를 달고, 각종 농도의 염화나트륨 및 안정화제, 0.01% 폴리솔베이트 80을 함유하는 10mM 인산 나트륨완충제을 첨가한 후, 튜브를 바로 세워 일정온도에서 24시간 동안 유지하고, HGF를 용해하였다. 용해 후바로 세워서 원심분리(15,000rpm, 10분간, 일정온도)를 행하고, HGF 포화용액과 미용해 HGF를 완전히 분리하고, 상층을 수득하였다. 저 단백 흡착성 필터; 밀리포어 GV(친수성 듀러포어, 0.22㎛)로 여과하고, 수득된 포화용액 중의 HGF의 농도를 HPLC법(겔 여과법)으로 정량하고, HGF의 포화용해도를 구하였다.

HPLC에 의한 분석 조건

컬럼: TOSOH TSK G-3000SWXL(φ0.78 X 30cm)

유속: 0.3ml/min

검출 파장: OD 280nm

온도: 30℃

담체: 0.3M NaCl, 50mM 인산나트륨, 0.1% SDS, pH 7.5

분석량: 50㎕

HGF의 유지시간: 24.0min

(2) HGF의 용해도에 따른 pH의 영향

140mM 염화나트륨, 0.01% 폴리솔베이트 80을 함유하는 10mM 인산나트륨 완충제으로 pH가 다른 용액을 제조하고, 4℃ 및 20℃의 HGF의 용해도를 (1)의 방법으로 측정하고, 그 결과를 표 2에 나타내었다. pH의 저하에 수반하여 HGF의 용해도는 서서히 증가하고, pH 5.0 이하에서 현저한 용해도의 향상이 확인되었다. 또한, 모든 경우에 온도상승에 의존한 용해도의 증가가 확인되었다.

표 2

	20℃	4℃
pH 7.5	0.8	0.4
pH 7.0	1.8	1.0
pH 6.0	2.3	1.3
pH 5.0	5.9	4.2

(HGF의 용해도를 mg/ml로 나타냄)

(3) HGF의 용해도에 미치는 염화나트륨 농도의 영향

여러 농도의 염화나트륨, 0.01% 폴리솔베이트 80을 함유하는 10mM 인산나트륨 완충제(pH 7.5)를 제조하고, 4℃ 및 20℃에서 HGF 용해도를 (1)의 방법으로 측정하고, 그 결과를 표 3에 나타내었다. 염화나트륨 농도를 상승시킴에 따라, HGF의 현저한 용해도의 증가가 확인되었다. 또한, 모든 경우에서 온도 상승에 의존한 HGF 용해도의 증가가 확인되었다.

표 3

	20℃	4℃
무첨가	0.3	0.1
+140mM NaCl	0.8	0.4
+230mM NaCl	3.2	1.4
+300mM NaCl	8.5	4.0
+900mM NaCl	>190	-

(HGF의 용해도를 mg/ml로 나타냄)

(4) HGF의 용해도에 미치는 각종 안정화제의 영향

각종 의약품 첨가제의 HGF 용해도에 미치는 영향에 대하여 검토하였다. 각종의 농도의 첨가제, 140mM 염화나트륨, 0.01% 폴리솔베이트 80을 함유하는 10mM 인산나트륨 완충제(pH 6.8 내지 7.5)에서 HGF 1mg/ml이 되도록 용해하고, HGF 수용액을 수득하였다. 90웰 마이크로플레이트에 각 웰당 200㎕씩 분주하고, 4℃에서 48시간 유지한 후, 플레이트 리더(plate reader)에서 OD 450nm를 측정하여 HGF 수용액의 탁도를 구하였다. HGF의 용해도가 저하되거나, HGF가 응집, 침전없이 용액의 탁도가 상승하였다.

첨가물로는, L-아미노산 20 종류(아르기닌, 리신, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파라긴산나트륨, 글루타민산나트륨, 시스테인, 글리신, 프롤린, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 발린), 당류 7 종류(만니톨, 과당, 트레할로스, 포도당, 솔비톨, 슈크로스, 유당), 고분자류 3 종류(덱스트란 황산, 덱스트란, PEG), 단백질류 3 종류(사람 혈청 알부민, 산성 젤라틴, 염기성 젤라틴), 계면활성제 3 종류(폴리솔베이트 80, 폴리솔베이트 20, HCO-40, HCO-60)에 대하여 HGF의 용해도에 미치는 영향을 평가하였는 바, 하기의 물질에 HGF의 용해도를 유지하는 안정화 작용이 확인되었다.

① 아미노산 류: 아르기닌, 리신, 히스티딘, 글루타민산나트륨, 아스파라긴산나트륨, 글루타민, 시스테인, 프롤린(0.05M에서 효과가 확인되었다)

② 다당류: 덱스트란 황산(0.1%에서 효과가 확인되었다)

현저한 효과가 확인된 아미노산에 대해서 여러 농도의 아미노산, 140mM 염화나트륨, 0.01% 폴리솔베이트 80을 함유하는 10mM 인산나트륨 완충제(pH 7.0)를 제조하고, 4℃에서 HGF의 용해도를 (1)의 방법으로 측정하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

표 4

첨가제 없음	포화용해도	삼투압비
첨가제 없음	1.0	1.0
+L-Arg	50mM	7.3	1.3
+L-Lys	50mM	4.5	1.3
+L-His	50mM	3.2	1.2
+L-GluNa	50mM	2.2	1.3

+L-Arg	100mM	>10	1.6
+L-Lys	100mM	>10	1.6
+L-His	100mM	4.8	1.4
+L-GluNa	100mM	3.2	1.6

(HGF의 용해도를 mg/ml로 나타냄)

시험예 2: 동결건조전후의 HGF 수용액의 성상

동결건조 과정에서 HGF의 물리적 안정성의 변화를 확인하기 위하여, 동결건조전의 HGF 수용액 및 동결건조후 그대로 정제수로 재용해한 HGF 수용액을 4℃에서 24시간 보존한 후, 용해 후의 용액의 성상(탁도)를 육안으로 관찰하였다. 동결건조 제제의 재용해에 걸리는 시간 및 삼투압력에 대해서도 평가하고, 그 결과를 표 5에 나타내었다.

실시예 1 및 22의 제제에서, 동결건조 제제를 재용해한 후 4℃에서 24시간 유지하여 탁해졌으나, 그 외 실시예의 제제의 성상에 관하여서는 안정하였다.

표 5

제제	동결건조전의 수용액	재용해후의 수용액	삼투압비
실시예 1	탁해짐	즉용성, 탁해짐	1.0
실시예 4	맑음	즉용성, 맑음	2.0
실시예 5	맑음	난용성, 맑음	4.0
실시예 6	맑음	난용성, 맑음	3.9
실시예 8	맑음	즉용성, 맑음	1.5
실시예 19	맑음	즉용성, 맑음	1.6
실시예 20	맑음	즉용성, 맑음	1.4
실시예 21	맑음	즉용성, 맑음	1.3
실시예 22	맑음	난용성, 탁해짐	1.7
실시예 23	맑음	즉용성, 맑음	1.3
실시예 24	맑음	즉용성, 맑음	1.5
실시예 25	맑음	즉용성, 맑음	1.5
실시예 26	맑음	즉용성, 맑음	1.3
실시예 28	맑음	즉용성, 맑음	1.3

시험예 3: 동결건조 제제 용해 후의 성상

실시예에서 제조한 동결건조 제제를 동결건조 직후 및 25℃, 40℃, 50℃에서 1개월 보존후, 재용해에 걸리는 시간, 재용해 후의 용액의 성상(탁도)을 평가하였다. 정제수로 동결건조 제제를 용해하고, 실온에서 성상을 평가하여, 그 결과를 표 6에 나타내었다.

25℃ 보존시, 실시예 22의 제제에서 동결건조 제제를 재용해 직후에는 탁해졌으나, 그 외 모든 실시예의 제제에서도 성상에 관하여서는 안정하였다. 또한, 40℃ 및 50℃의 보존시에는 실시예 1, 22, 23, 24 및 25의 제제는 용해 직후에는 탁해졌으나, 그 외의 모든 경우의 실시예의 제제의 성상에 관하여서는 안정하였다.

표 6

제제	1개월 보존품
	25℃	40℃	50℃
실시예 1	즉용성, 맑음	즉용성, 맑음	즉용성, 맑음
실시예 4	즉용성, 맑음	즉용성, 맑음	즉용성, 맑음
실시예 5	난용성, 맑음	난용성, 맑음	난용성, 맑음
실시예 6	난용성, 맑음	난용성, 맑음	난용성, 맑음
실시예 8	즉용성, 맑음	즉용성, 맑음	즉용성, 맑음
실시예 19	즉용성, 맑음	즉용성, 맑음	즉용성, 맑음
실시예 20	즉용성, 맑음	즉용성, 맑음	즉용성, 맑음
실시예 21	즉용성, 맑음	즉용성, 맑음	즉용성, 맑음
실시예 22	난용성, 탁해짐	난용성, 탁해짐	난용성, 탁해짐
실시예 23	즉용성, 맑음	즉용성, 탁해짐	즉용성, 탁해짐
실시예 24	즉용성, 맑음	즉용성, 탁해짐	즉용성, 탁해짐
실시예 25	즉용성, 맑음	즉용성, 탁해짐	즉용성, 탁해짐
실시예 26	즉용성, 맑음	즉용성, 맑음	즉용성, 맑음
실시예 28	즉용성, 맑음	즉용성, 맑음	즉용성, 맑음

시험예 4: 동결건조 제제에 있어서 중합체 함량변화

각 실시예에서 제조된 동결건조 제제를 동결건조 직후(initial) 및 25℃, 40℃, 50℃에서 1개월 보존하고, 그 동결건조 제제에 포함되는 중합체 함량과 HGF 함량의 비를 측정하였다. 시험예 1(1)의 방법(겔 여과법)을 사용하고, 그 결과를 표 7 및 표 8에 나타내었다.

중합체의 유지시간: 20.4min, 21.8min

HGF의 유지시간: 24.0min

보존온도의 상승에 수반하여 중합체 생성이 증가되는 경향이 관찰되었지만, 특히 실시예 8, 19 및 20의 동결건조 제제는 중합체의 생성이 극단적으로 적고 물리화학적으로 안정하였다. 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 첨가하면 고온 보존하여도 중합체의 생성은 적고(중합체 생성율: 40℃에서 약 3% 이하, 50℃에서 약 5 내지 9% 이하), 보존안정성이 향상되는 것이 판명되었다. 또한, 비교예로 아르기닌을 포함하지 않는 점 이외에는 같은 성분 및 방법으로 제조되어져 있는 실시예 1의 동결건조 제제를 이용하여 같은 실험을 실시한 바, 보존 온도의 상승에 수반하는 중합체 생성의 대폭 증가가 관찰되었다.

또한, 표 8에서 보듯이, HGF 농도를 저농도화(5mg/ml 미만)하면, 중합체 생성은 촉진되고, 보존안정성이 저하되는 것이 나타났다. 동결건조 제제의 안정화제로는 특개평 9-25411호 공보에서 기재된 글리신 및 알라닌을 이용한 경우에는 고농도 HGF 동결건조 제제(특개평 9-25411호 공보의 실시예 5 및 6: 20mg/ml)에 비하여, 저농도 HGF 동결건조 제제(실시예 5, 6 및 26: 1mg/ml)에서는 중합체의 생성이 촉진되고 보존안정성이 저하되는 것으로 판명되었다.

한편, 동결건조 제제의 안정화제로서 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 이용한 실시예 8, 19 및 20의 동결건조 제제는 저농도 HGF 동결건조 제제(1mg/ml)에서도 중합체의 생성이 현저하게 억제되고 보존안정성이 향상되는 것이 나타났다.

표 7

제제	1개월 보존품
	동결건조직후	25℃	40℃	50℃
실시예 1	0.48	5.50	24.27	40.63
실시예 4	0.35	0.48	3.80	11.24
실시예 5	0.31	0.69	4.40	9.58
실시예 6	0.30	0.54	3.20	9.53
실시예 8	0.30	0.11	0.18	0.60
실시예 19	0.31	0.16	1.74	4.48
실시예 20	0.31	0.18	0.28	0.88
실시예 21	0.31	0.54	2.77	16.89
실시예 22	-	-	-	-
실시예 23	0.32	0.31	3.24	11.24
실시예 24	0.32	2.19	4.90	6.39
실시예 25	0.34	1.11	4.80	7.73
실시예 26	0.36	0.33	6.21	22.66
실시예 28	2.74	3.48	13.30	32.87
실시예 1*	1.07			6.17
실시예 5*	0.92			4.09
실시예 6*	0.93			2.90
실시에 9*	1.78			14.01
* 특개평 9-25241호 공보의 표 4 및 표 6에서 인용

표 8

제제	50℃에서 1개월 보존시, 동결건조 제제의 중합체 함량/HGF함량
[아미노산을 함유하지 않는 제제]
실시예 1	(HGF 1mg/ml)	40.63
실시예 4	(HGF 1mg/ml)	11.24
실시예 9*	(HGF 10mg/ml)	14.01
실시예 1*	(HGF 20mg/ml)	6.17
[글리신을 함유하는 제제]
실시예 5	(HGF 1mg/ml)	9.58
실시예 5*	(HGF 20mg/ml)	4.09
[알라닌을 함유하는 제제]
실시예 6	(HGF 1mg/ml)	9.53
실시예 6*	(HGF 20mg/ml)	2.90
* 특개평 9-25241호 공보의 표 4 및 표 6에서 인용

시험예 5: 동결건조 제제에 있어서 중합체 함량 변화 - pH의 중합체 생성에 미치는 영향

실시예 8, 13, 14, 16 및 17에서 제조된 각종 pH를 가지는 동결건조 제제를 동결건조직후(initial) 및 50℃에서 1개월, 2개월, 3개월 보존한 후, 그 동결건조 제제에 포함되는 중합체 함량과 HGF 함량의 비를 측정하였다. 시험예 1(1)의 방법(겔 여과법)을 사용하였고, 그 결과를 표 9에 나타내었다.

중합체의 유지시간: 20.4min, 21.8min

HGF의 유지시간: 24.0min

pH 7.0 및 7.2를 가지는 실시예 16 및 17의 동결건조 제제는 50℃의 보존에서 경시적으로 중합체 생성이 증가되었으나, pH 6.5이하의 pH를 가지는 실시예 8, 13 및 14의 제제에서는 중합체 생성이 적고, 약산성의 pH에 있어서 안정성이 향상되는 것으로 판명되었다.

표 9

제제	50℃보존품
제제	동결건조직후	1개월 보존	2개월 보존	3개월 보존
실시예 14(pH 5.5)	0.48	0.38	0.56	0.76
실시예 13(pH 6.0)	0.35	0.91	0.51	1.31
실시예 8(pH 6.5)	0.31	1.40	1.58	1.28
실시예 17(pH 7.0)	0.30	1.26	2.16	2.96
실시예 16(pH 7.2)	0.30	5.64	7.63	12.71

시험예 6: 동결건조 제제의 생물활성 변화(비활성)

실시예 1, 8에서 제조한 동결건조 제제를 25℃, 50℃에서 2개월 보존, 또는 10℃, 25℃에서 1.5년 보존하고, 그 동결건조 제제를 재용해한 수용액의 생물활성을 하기에 나타낸 생물활성 측정방법으로 측정하였고, 그 결과를 표 10에 나타내었다.

생물활성 측정방법

사람 간세포 중 PLC/PRF/5를 대수증식기까지 배양하고, 세포생존율을 확인한 후, 0.7 X 10⁵개/ml이 되도록 세포용액을 제조한다. HGF 시료 및 표준품을 첨가한 96웰 에세이 플레이트에 세포용액을 100㎕씩 첨가하고, 세포수가 한 웰당 0.7 X 10⁴가 되도록 접종하였다(n=4). 5% CO₂배양기 내에서 37℃, 20시간 전배양한 후, 다시, [³H-티미딘]을 첨가하고, 6시간 배양을 계속하였다. 배양완료 후, 파마시아사 베타플레이트 시스템을 사용하여 세포를 회수하고, 세포내에 들어가 있는 [³H]의 양을 측정하였다. 측정결과를 평행선 검정법으로 HGF 시료의 비활성(specific activity)을 표준품(standard)의 비활성으로 나누어 역가(%)를 구하였다.

실시예 8의 아르기닌을 첨가한 동결건조 제제에 있어서는 고온 보존하여도생물활성에 거의 변화가 없고, 생물활성의 면에서 안정하였다. 또한, 비교예로 아르기닌을 포함하지 않는 점 이외에는 같은 성분 및 방법으로 제조되어 있는 실시예 1의 동결건조 제제를 이용하여 같은 시험을 하였으나, 보존온도의 상승에 수반하는 생물활성의 대폭적인 저하가 관찰되었다.

표 10

	2개월 보존품	1.5년 보존품
	25℃	50℃	10℃	25℃
실시예 1	64.5%	10.2%	-	-
실시예 8	87.1%	71.0%	72.6%	66.1%

본 발명의 동결건조 제제는 임상적으로 유용한 저농도의 HGF를 포함하는 수용액을 제조할 수 있고, 동결건조시 및 동결건조후 보존시에 중합체의 생성이 적고, 안정성이 우수하다. 또한, 동결건조시에 양호하게 고형체를 형성하며, 재용해성이 우수한 특징을 가지고 있고, 주사제로 바람직한 pH 및 삼투압비를 가지는 제제로 조제할 수도 있다.

Claims

간실질세포 증식인자, 간실질세포 증식인자의 중합체 생성을 방지하기 위한 안정화제, 염화나트륨 및 완충제를 함유하는 동결건조 제제로서, 간실질세포 증식인자를 5mg/ml 미만의 농도로 함유하는 수용액으로부터 제조되는 제제.
간실질세포 증식인자, 간실질세포 증식인자의 중합체 생성을 방지하기 위한 중합체 생성을 방지하기 위한 안정화제, 염화나트륨 및 완충제를 함유하는 동결건조 제제로서, 재용해하여 간실질세포 증식인자를 5mg/ml의 농도로 함유하는 수용액을 제조하기 위한 제제.
간실질세포 증식인자, 간실질세포 증식인자의 중합체 생성을 방지하기 위한 안정화제, 염화나트륨 및 완충제를 함유하는 동결건조 제제로서, 간실질세포 증식인자를 5mg/ml 미만의 농도로 함유하는 수용액으로부터 제조되고 재용해하여 간실질세포 증식인자를 5mg/ml 미만의 농도로 함유하는 수용액을 제조하기 위한 제제.
제 1항 내지 3항의 어느 한 항에 있어서,

안정화제는 아르기닌, 리신, 히스티딘, 글루타민, 프롤린, 글루타민산, 아스파라긴산, 황산화 다당류 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 안정화제인

동결건조 제제.
제 1항 내지 3항의 어느 한 항에 있어서,

안정화제는 아르기닌, 리신, 히스티딘, 글루타민산, 아스파라긴산 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는

동결건조 제제.
제 1항 내지 3항의 어느 한 항에 있어서,

안정화제는 아르기닌, 리신, 히스티딘 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는

동결건조 제제.
제 1항 내지 6항의 어느 한 항에 있어서,

완충제는 인산염인

동결건조 제제.
제 1항 내지 7항의 어느 한 항에 있어서,

동결건조전의 수용액은 주사제로 바람직한 pH 및 삼투압비(osmotic pressure ratio)를 가지는

동결건조 제제.
제 1항 내지 7항의 어느 한 항에 있어서,

재용해후의 수용액은 주사제로 바람직한 pH 및 삼투압비(osmotic pressure ratio)를 가지는

동결건조 제제.
제 8항 또는 9항에 있어서,

동결건조전의 수용액의 pH는 5 내지 6.5의 범위인

동결건조 제제.
제 8항 또는 9항에 있어서,

재용해후의 수용액의 pH는 5 내지 6.5의 범위인

동결건조 제제.
제 1항 내지 11항의 어느 한 항에 있어서,

계면활성제를 추가로 함유하는

동결건조 제제.
제 12항에 있어서,

계면활성제가 비이온성 계면활성제인

동결건조 제제.
제 13항에 있어서,

비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 에테르계 계면활성제인

동결건조 제제.
제 1항 내지 14항의 어느 한 항에 있어서,

바이알 또는 앰플 내에 제조된

동결건조 제제.
제 1항 내지 15항의 어느 한 항에 있어서,

동결건조시 및/또는 동결건조후의 보존시 HGF의 중합체 생성을 방지 하기 위한 충분한 양의 안정화제를 포함하는

동결건조 제제.
HGF를 5mg/ml 미만의 농도로 함유하는 수용액을 동결건조하기 위하여 이용하는 HGF의 안정화제로서, 아르기닌, 리신, 히스티딘, 글루타민, 프롤린, 글루타민산, 아스파라긴산, 황산화 다당류 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염으로 구성되는 그룹에서부터 선택되는 안정화제.
제 17항에 있어서,

동결건조시 및/또는 동결건조후의 보존시에 HGF의 중합체 생성을 방지할 수 있는

안정화제.
제 17항에 있어서,

동결건조시 및/또는 동결건조후의 보존시에 HGF의 중합체 생성을 방지 하기 위하여 충분한 양으로 이용될 수 있는

안정화제.
제 17항 내지 19항의 어느 한 항에 있어서,

아르기닌, 리신, 히스티딘, 글루타민산, 아스파라긴산 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는

안정화제.
제 17항 내지 19항의 어느 한 항에 있어서,

아르기닌, 리신 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는

안정화제.