KR20050083841A - 안정화된 고체상태 폴리펩타이드 입자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생리학적 조건에 근접하거나 이를 초과하는 온도에서 분해에 대해 안정화된 폴리펩타이드 물질을 함유하는 고체상태 폴리펩타이드 입자를 포함한다. 각각의 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 입자는 하나 이상의 안정화 조건에 의해 분해에 대해 안정화된 폴리펩타이드 물질을 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드 입자는 2가지 이상의 안정화 조건의 부가 효과가 조합되도록 제형화될 수 있기 때문에, 본 발명의 폴리펩타이드 입자가 안정화 당을 포함하는 경우, 허용되는 폴리펩타이드 안정성을 달성하기 위해 필요한 안정화 당의 양이 현저하게 감소된다.
Description
본 발명은 폴리펩타이드가 연장된 기간에 걸쳐 승온에서의 분해에 대해 안정화된, 고체상태의 폴리펩타이드 제형에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 폴리펩타이드가 하나 이상의 안정화 조건을 통해 안정화되는 고체상태 폴리펩타이드 입자를 제조하기 위한 제형 및 방법을 제공한다.
폴리펩타이드와 같은 활성 제제의 목적하는 용량을 연장된 기간에 걸쳐서 전달할 수 있는 이식가능한 장치는 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,728,396호, 제5,985,305호, 제6,113,938호, 제6,156,331호, 제6,375,978호 및 제6,395,292호에는 용액 또는 현탁액과 같은 안정한 활성 제제 제형을 연장된 기간(즉, 약 2주 내지 수개월 또는 그 이상)에 걸쳐서 목적하는 비율로 전달할 수 있는 이식가능한 삼투압 장치가 교시되어 있다. 이식가능한 약물 전달 시스템은 또한 미국 특허 제6,468,961호, 제6,331,311호 및 제6,130,200호에 기재되어 있는 바와 같은 저장소(depot)형 물질을 포함한다. 저장소 물질은 전형적으로 생분해성 또는 생부식성 물질내에 활성 제제를 격리시켜 활성 제제가 활성 제제의 확산이나 저장소 물질의 분해 또는 부식에 기초하여 이식된 저장소 물질로부터 전달되도록 한다. 예시적 저장소 물질에는 전형적으로 활성 제제를 약 2주 내지 6개월 범위의 기간에 걸쳐서 전달할 수 있는 PLGA-기본 시스템이 포함된다. 이식가능한 전달 시스템은 목적하는 활성 제제를 연장된 기간에 걸쳐서 치료학적 수준으로 전달하도록 고안할 수 있기 때문에, 이는 유리하게도, 의료 공급자들을 빈번하게 방문하거나 반복적으로 자가 투약할 필요 없이 목적하는 활성 제제의 장기간의 치료학적 투여를 제공한다. 그러나, 이식가능한 약물 전달 시스템을 사용하여 연장된 기간에 걸쳐 치료학적 폴리펩타이드를 전달하는 것은 다양한 기술상의 도전에 당면해 있다.
특히, 수주 또는 수개월의 기간에 걸쳐 폴리펩타이드를 전달하도록 고안된 이식가능한 전달 시스템에 부하된 치료학적 폴리펩타이드의 안정성을 유지시키는 것이 흥미로운 것임이 증명되었다. 연장된 기간에 걸쳐 폴리펩타이드의 치료학적 용량을 전달하는 적합한 크기의 이식가능한 시스템을 달성하기 위해서는, 일반적으로 전달될 폴리펩타이드를 고농도로 함유하는 용액 또는 현탁액을 당해 시스템에 부하하는 것이 필수적이다. 그러나, 이러한 용액 또는 현탁액이 연장된 기간에 걸쳐 생리학적 조건에 근접하거나 이를 초과하는 온도(예: 37℃에 근접하거나 이를 초과하는 온도)에 노출된 경우, 이 용액 또는 현탁액에 함유된 폴리펩타이드는 안정화되지 않는다면 분해될 것이다. 생리학적 조건에 근접하거나 이를 초과하는 온도에 노출된 폴리펩타이드의 분해는 다양한 경로를 통해 진행될 수 있으며 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 변경하거나, 감소시키거나, 파괴할 수 있다. 따라서, 치료학적 폴리펩타이드를 연장된 기간에 걸쳐서 성공적으로 전달할 수 있는 이식가능한 전달 시스템을 달성하기 위해서는, 이식가능한 전달 시스템에 부하된 폴리펩타이드는 분해에 대해 안정화되어 이러한 시스템이 이식가능한 시스템의 기능적 수명에 걸쳐서 생물학적 활성 폴리펩타이드의 치료학적 용량을 전달할 수 있어야만 한다.
폴리펩타이드 제형 중에 함유된 폴리펩타이드를 시간에 따른 분해에 대해 안정화시키기 위해, 폴리펩타이드 제형에서 당이 사용되어 왔다. 특히, 당은 동결건조 공정 동안 분자 풀림(unfolding)을 감소시켜 폴리펩타이드 응집을 억제하는 작용을 하는 동결보호제로서 사용되어 왔다. 당은 또한 분자 이동도를 제한하고 동결건조 공정 동안 및 후에 분자 상호작용을 감소시켜 장기간 안정성을 부여한다. 그러나, 폴리펩타이드를 안정화시키기 위해 당을 사용하는 경우에, 목적하는 정도의 안정화를 달성하기 위해 다량으로 사용하는 것이 종종 필수적이다. 미국 특허 제6,267,958호(Andya 등)에 교시된 바와 같이, 허용되는 안정화 효과를 달성하기 위해 100 대 510 몰비만큼 많은 안정화 당이 필요할 수 있으며, 이러한 다량의 안정화 당을 포함하는 폴리펩타이드 제형은 이식가능한 약물 전달 시스템에 부하하기에 적합하지 않다.
전달 시스템내에서 목적하는 정도의 폴리펩타이드 안정화를 달성하기 위해 고농도의 안정화 당이 필요한 경우, 당해 시스템에 함유된 폴리펩타이드 제형의 전체 용적은 증가되는 반면에 당해 시스템에 부하될 수 있는 폴리펩타이드의 최대 농도는 감소된다. 이식가능한 시스템에 부하된 제형 중의 폴리펩타이드의 농도가 감소됨에 따라, 목적하는 투여 섭생을 달성하기 위해 요구되는 폴리펩타이드 제형의 양 및 이식된 시스템의 최소 크기는 증가한다. 따라서, 안정화 당에 대한 요구를 감소시키거나 완전히 해소시키는 치료학적 폴리펩타이드 안정화용 제형 및 방법은 당해 분야의 개선일 것이다. 이러한 제형 및 방법이, 폴리펩타이드가 이식가능한 전달 시스템에 고농도로 부하될 수 있고 생리학적 조건 이하 또는 이를 초과하는 온도에 노출된 후에도 연장된 기간에 걸쳐 허용되는 안정성과 치료학적 활성을 여전히 나타내는 정도로 폴리펩타이드를 안정화시킬 수 있다면, 이는 당해 분야의 추가의 개선일 것이다.
발명의 요약
본 발명은 고체상태 폴리펩타이드 입자내에 함유된 폴리펩타이드가 생리학적 조건 이하 및 이를 초과하는 온도에서의 분해에 대해 안정화된 고체상태 폴리펩타이드 입자를 포함한다. 본원에서 사용되느 바와 같이, "생리학적 조건"이란 용어는 온도가 약 37℃인 환경을 의미하고, "폴리펩타이드"란 용어는 올리고펩타이드와 단백질을 포함하며, 한 아미노산의 카복실 그룹이 다른 아미노산의 아미노 그룹에 연결된 2개 이상의 아미노산을 함유하는 임의의 천연 또는 합성 화합물을 포괄한다. 각각의 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 입자는 하나 이상의 안정화 조건에 의해 분해에 대해 안정화된 폴리펩타이드 물질을 포함한다. 특히, 본 발명의 폴리펩타이드 입자는 이에 함유된 폴리펩타이드를 다음 입자 조건 중 하나 이상을 제어함으로써 안정화되도록 제형화된다: pH, 당 함량, 계면활성제 함량, 완충제 함량 및 금속 이온 농도. 본 발명의 폴리펩타이드 입자를 2가지 이상의 안정화 조건의 부가 효과가 조합되도록 제형화할 수 있기 때문에, 본 발명의 폴리펩타이드 입자가 안정화 당을 포함하는 경우, 허용되는 폴리펩타이드 안정성을 달성하는데 필요한 안정화 당의 양이 현저하게 감소된다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 입자를 안정화 당을 사용하지 않고 제형화하여 당해 폴리펩타이드 입자에 함유된 폴리펩타이드를 안정화시킨다.
본 발명은 또한 수성 안정화 용액을 포함한다. 본 발명의 고체상태 폴리펩타이드 입자를 형성시키기 위해, 안정화될 폴리펩타이드를 함유하는 본 발명에 따른 수성 안정화 용액을 형성시키고 동결건조 또는 분무 건조 공정과 같은 적합한 입자 형성 공정에 적용시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 수성 안정화 용액은, 이 수성 안정화 용액을 입자 형성 공정에 적용시 수성 안정화 용액이 하나 이상의 안정화 조건에 의해 안정화된 폴리펩타이드 물질을 함유하는 고체상태 입자를 산출하도록 제형화된다. 본 발명에 따른 수성 안정화 용액의 pH, 당 함량, 계면활성제 함량, 완충제 함량, 금속 이온 농도 또는 폴리펩타이드 농도를 제어함으로써, 광범위한 목적하는 안정화 특징을 갖는 고체상태 폴리펩타이드 입자를 제조할 수 있다.
본 발명은 추가로 안정화된 고체상태 폴리펩타이드 입자의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 안정화될 고체상태 폴리펩타이드를 본 발명의 수성 안정화 용액 속에 용해시키고 고체상태 폴리펩타이드 입자 중의 폴리펩타이드를 재구성함을 포함한다. 본 발명의 방법으로 제조된 고체상태 폴리펩타이드 입자의 제형은 사용되는 수성 안정화 용액에 따라 좌우될 것이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 안정화될 폴리펩타이드를 산성 안정화 용액 속에 용해시킴을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 방법은 안정화될 폴리펩타이드를 안정화 당 또는 금속 이온 또는 안정화 당과 금속 이온 둘다의 존재하에 산성 안정화 용액 속에 용해시킴을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 방법은 안정화될 폴리펩타이드를 계면활성제, 안정화 당 또는 금속 이온 또는 안정화 당과 금속 이온 둘다의 존재하에 완충된 거의 중성인 안정화 용액 속에 용해시킴을 포함한다. 본 발명의 방법의 각 양태에서, 고체상태 펩타이드 입자를 재구성하는 단계는 수성 안정화 용액을 동결건조 또는 분무 건조 공정과 같은 적합한 입자 형성 공정에 적용시켜 수행할 수 있다. 다양한 제형 중 어느 하나를 갖는 입자를 달성하기 위해 본 발명의 방법을 변화시킬 수 있지만, 각각의 경우에 본 발명의 방법은 폴리펩타이드가 하나 이상의 안정화 조건을 통해 안정화된 고체상태 폴리펩타이드 입자를 제공하는데 적합하도록 변용시킨다.
본 발명의 고체상태 폴리펩타이드 입자는 60℃에서 2개월 동안 저장한 후 96% 이하의 안정화된 펩타이드가 회수될 수 있도록 하는 우수한 폴리펩타이드 안정화를 제공한다. 게다가, 본 발명의 고체상태 폴리펩타이드 입자는 비교적 고농도로 현탁액 제형에 부하될 수 있으며(즉, 25% 폴리펩타이드 입자 또는 그 이상), 이는 안정화된 폴리펩타이드의 농도가 비교적 높은 현탁액의 제형화를 촉진한다. 따라서, 본 발명의 고체상태 폴리펩타이드 입자는 안정화된 치료학적 폴리펩타이드의 치료학적 용량이 연장된 기간에 걸쳐 전달될 수 있을 정도로 충분히 높은 농도의 안정화된 치료학적 폴리펩타이드가 허용되는 크기의 이식장치 시스템에 부하되는 것을 용이하게 한다.
도 1은 40℃에서 3개월 동안 저장시 동결건조된 PACAP(암모늄 아세테이트, 약 pH 6.4)의 전체 분해(RP-HPLC) 및 응집(SEC)을 예시하는 그래프를 제공한다.
도 2는 4℃, 40℃ 및 60℃에서 3개월 동안 저장시 동결건조된 PACAP의 안정성을 예시하는 그래프를 제공한다.
도 3은 PACAP를 다양한 부형제를 사용하여 고체상태 입자로 제형화하는 경우에 40℃에서 PACAP 응집물 형성의 억제를 예시하는 그래프를 제공한다.
도 4는 PACAP를 다양한 부형제를 사용하여 고체상태 입자로 제형화하는 경우에 60℃에서 PACAP 응집물 형성의 억제를 예시하는 그래프를 제공한다.
도 5는 40℃에서 전체 PACAP 분해에 대한 히스티딘, 석시네이트 및 슈크로스의 안정화 효과를 예시하는 그래프를 제공한다.
도 6은 40℃에서 BA/PVP 현탁액 중의 PACAP 응집물 형성의 억제에 대한 슈크로스의 안정화 효과를 예시하는 그래프를 제공한다.
도 7은 40℃에서 LL/GML/PVP 현탁액 중의 PACAP 응집물 형성의 억제 대한 슈크로스의 안정화 효과를 예시하는 그래프를 제공한다.
도 8은 40℃에서 3개월 동안 저장시 상이한 현탁액 비히클 중의 PACAP의 전체 분해를 예시하는 그래프를 제공한다.
도 9는 60℃에서 2개월 동안 저장시, 겉보기 pH 2, 겉보기 pH 4 및 겉보기 pH 6에서 동결건조된 입자내에 함유된 PACAP의 RP HPLC로 측정된 전체 분해 및 SEC로 측정된 응집을 예시한다.
표 1에는 50℃에서 4시간 동안 PACAP 현탁액을 항온처리시 다양한 현탁액 비히클 중에 분산된 PACAP의 안정성을 평가하기 위해 수행된 연구의 결과가 제시한다.
표 2에는 17일에 걸쳐서 37℃에서 항온처리된 PACAP의 안정성을 평가하기 위해 수행된 연구의 결과를 제시하며, 이때 평가된 PACAP는 단독의 동결건조된 PACAP 또는 3가지의 상이한 현탁액 비히클 중 하나에 분산된 PACAP였다.
표 3에는 17일에 걸쳐서 60℃에서 항온처리된 PACAP의 안정성을 평가하기 위해 수행된 연구의 결과를 제시하며, 이때 평가된 PACAP는 단독의 동결건조된 PACAP 또는 3가지 상이한 현탁액 비히클 중 하나에 분산된 PACAP였다.
표 4에는 PACAP를 다양한 상이한 부형제를 포함하는 고체상태 입자에 혼입시키고 이러한 입자를 40℃ 및 60℃에서 항온처리하는 경우에 PACAP의 산정된 분해 속도 및 응집 속도를 제공한다.
표 5에는 pH 6에서 NH4OAc 완충액 중에서 제조된 3가지의 상이한 용액으로부터 형성된 고체상태 입자내에 함유된 PACAP의 산정된 분해 속도 및 응집 속도를 제공하며, 이때 이들 3가지 용액 각각은 상이한 양의 슈크로스를 함유한다.
표 6에는 다양한 pH에서 3가지 상이한 당 중 하나를 사용하여 고체상태 PACAP 입자를 제형화하여 달성한 PACAP의 안정화를 평가하기 위해 수행된 연구의 결과를 제시한다.
표 7에는 다양한 pH에서 하나 이상의 상이한 부형제를 사용하여 고체상태 PACAP 입자를 제형화하여 달성한 PACAP의 안정화를 평가하기 위해 수행된 연구의 결과를 제시한다.
표 8에는 다양한 pH에서 CaCl2, 히스티딘 및 CaCl2와 히스티딘 둘다를 사용하여 고체상태 PACAP 입자를 제형화하여 달성한 PACAP의 안정화를 평가하기 위해 수행된 연구의 결과를 제시한다.
제1 양태에서, 본 발명의 고체상태 폴리펩타이드 입자는 산성 pH에서 안정하고 산성 재구성 pH를 나타내도록 제형화된 폴리펩타이드를 포함한다. 입자 형성 전에 수성 안정화 용액의 pH("겉보기 pH")는 후속적으로 형성된 입자에 의해 나타난 pH("재구성 pH")를 제어하며 고체상태 폴리펩타이드 입자내의 폴리펩타이드의 양성자첨가 상태를 정의한다. 본 발명의 목적상, 산성 재구성 pH를 나타내는 입자는 약 pH 5 이하의 재구성 pH를 나타내는 폴리펩타이드 입자, 바람직하게는 약 pH 4 이하의 재구성 pH를 나타내는 폴리펩타이드 입자, 특히 바람직하게는 약 pH 2 내지 약 pH 4범위의 재구성 pH를 나타내는 폴리펩타이드 입자를 포함한다. 본 발명의 고체상태 폴리펩타이드 입자에 의해 나타난 pH를 제어함으로써 고체상태 입자내에 포함된 폴리펩타이드의 양성자첨가 상태를 제어할 수 있으며, 본 발명의 고체상태 폴리펩타이드 입자를 산성 pH에서 제형화하면 상당한 안정화 효과가 부여된다는 것이 밝혀졌다. 본 발명의 고체상태 폴리펩타이드 입자를 산성 pH에서 제형화하면 폴리펩타이드가 안정화되는데, 이는 산성 환경이 폴리펩타이드에 포함된 아미노 그룹의 양성자첨가에 유리하기 때문인 것으로 사료된다. 흔히, 폴리펩타이드내에 포함된 아미노 그룹은 펩타이드의 화학적 성질을 변경시키고 폴리펩타이드 분해의 중요한 경로로서 작용하는 분자내 또는 분자간 반응을 하는 경향이 있는 반응성 중간체의 형성에 관여한다. 폴리펩타이드내에 포함된 아미노 그룹의 양성자첨가에 유리한 환경에서 폴리펩타이드를 유지시킴으로써, 제1 양태에 따른 폴리펩타이드 입자는 아미노 그룹의 반응성 중간체 형성에의 관여를 제한하고 그 결과로서 분자내 또는 분자간 반응으로부터 야기된 폴리펩타이드의 분해를 제한하는 것으로 사료된다.
제1 양태에 따른 고체상태 입자에의 금속 이온의 첨가는 부가적 폴리펩타이드 안정화를 제공한다. 제1 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 금속 이온을 포함하도록 제형화하는 경우, 금속 이온은 바람직하게는 2가 금속 염, 예를 들어, CaCl2, MgCl2 또는 ZNCl2에 의해 제공된다. 고체상태 폴리펩타이드에 포함된 금속 이온의 정확한 양은 안정화될 특정한 펩타이드, 당해 입자의 pH 및 안정화 당의 존재 또는 부재에 따라 좌우될 것이다. 그러나, 제1 양태에 따른 고체상태 펩타이드 입자가 금속 이온을 포함하는 경우, 당해 입자는 일반적으로 금속 이온 대 안정화될 폴리펩타이드의 몰비가 약 1/1 내지 10/1, 바람직하게는 약 2/1 내지 약 6/1의 범위, 특히 바람직하게는 약 4/1이 되도록 제형화한다. 본 발명의 고체상태 폴리펩타이드 입자에 금속 이온을 첨가하면 시간에 따라 폴리펩타이드의 이량체화 양이 감소되고 이로써 부가적 폴리펩타이드 안정화가 부여된다. 금속 이온은 폴리펩타이드 분자와의 이온 결합 또는 염 브릿지의 형성을 통해 폴리펩타이드 이량체화를 감소시키는 작용을 하며, 이러한 이온 결합 또는 염 브릿지는 폴리펩타이드 분자 간의 상호작용에 대한 기회를 제한한다.
제1 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자에의 안정화 당의 첨가도 또한 부가적 폴리펩타이드 안정화를 제공한다. 안정화 당의 포함은 폴리펩타이드 분자 이동도를 제한하고 폴리펩타이드 분자 간의 분자간 상호작용을 감소시켜 부가적 폴리펩타이드 안정화를 부여한다. 그러나, 본 발명의 고체상태 폴리펩타이드 입자를 2가지 이상의 부가적 안정화 조건을 통해 폴리펩타이드를 안정화시키도록 제형화할 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 안정화 당을 포함하도록 제형화하는 경우, 허용되는 안정성 수준을 달성하기 위해 요구되는 당의 양이 현저하게 감소된다. 특히, 제1 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 안정화 당을 포함하도록 제형화하는 경우, 당은 일반적으로 안정화될 폴리펩타이드에 대해 약 0.1/1 중량/중량 내지 약 1/1 중량/중량의 범위의 양으로 포함된다. 바람직한 양태에서, 안정화 당을 포함하는 본 발명의 고체상태 폴리펩타이드 입자는 안정화 당을 안정화될 폴리펩타이드에 대해 약 0.1/1 중량/중량 내지 약 0.5/1 중량/중량 또는 약 0.1/1 중량/중량 내지 약 0.25/1 중량/중량의 양으로 포함할 것이다. 제1 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 안정화 당과 금속 이온을 둘다 포함하도록 제형화하는 경우, 목적하는 정도의 폴리펩타이드 안정화를 달성하기 위해 요구되는 당과 금속 이온의 양은 금속 이온 없이 안정화 당을 포함하거나 안정화 당 없이 금속 이온을 포함하는 제형에 비해 감소될 수 있다. 이러한 잠재적 잇점은 당, 금속 이온 및 산성 환경 pH의 부가적 안정화 효과로 인해 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자 중의 안정화 당으로서 일반적으로 비환원 당이 유용하지만, 모든 당이 제1 양태에 따른 펩타이드 입자의 안정화에 적합한 것은 아니라는 것이 밝혀졌다. 구체적으로, 폴리펩타이드의 안정화에서 통상적으로 사용되는 당인 슈크로스는 산성 조건하에서 사용하기에 적합하지 않은 것으로 밝혀졌다. 사실, 슈크로스를 이러한 조건하에 사용하는 경우, 탈안정화 효과를 발생시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 탈안정화 효과는 슈크로스 자체가 산성 조건에서 화학적으로 안정하지 않기 때문에 발생하는 것으로 사료된다. 특히, 슈크로스는 산성 pH에서 글루코스 및 프럭토스로 가수분해된다. 트레할로스가 슈크로스와 같은 이당류이나, 트레할로스는 산성 조건하에 승온에서 화학적으로 안정하다. 단당류인 메틸-만노피라노시드("메틸-MP")도 또한 산성 조건에서 화학적으로 안정하다. 게다가, 트레할로스와 메틸-MP는 둘다 산성 pH를 나타내도록 제형화된 고체상태 폴리펩타이드에 포함된 경우에 현저한 부가적 폴리펩타이드 안정화를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 제1 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 안정화 당을 포함하도록 제형화하는 경우, 제형내에 포함된 당은 산성 조건하에 안정해야 하며, 바람직하게는 생리학적 조건 이하 및 이를 초과하는 온도에서 산성 조건하에 안정하다.
제1 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자는 수성 안정화 용액으로부터 제조할 수 있다. 제1 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자 제조에 적합한 수성 안정화 용액을 제조하기 위해, 안정화될 폴리펩타이드를 산성 용액 속에 용해시킨다. 산성 수성 안정화 용액은 HCl과 같은 적합한 산을 목적하는 pH를 갖는 용액을 제공하는 양으로 첨가함으로써 달성할 수 있다. 본 발명에 따른 수성 안정화 용액의 pH는 수성 안정화 용액을 사용하여 제조한 고체상태 폴리펩타이드 입자내에 함유된 폴리펩타이드를 안정화시키는데 있어 결정적 역할을 한다. 제1 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자(즉, 산성 재구성 pH를 갖는 입자)를 달성하기 위해서는, 목적으로 하는 재구성 pH보다 현저하게 낮은 겉보기 pH에서 수성 안정화 용액을 제조하는 것이 필수적일 수 있다. 제1 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 제조하기에 적합한 수성 안정화 용액은 이 수성 안정화 용액속에 용해된 금속 염 또는 안정화 당을 포함할 수도 있다. 제1 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 제조하기에 적합한 수성 안정화 용액 속에 용해된 금속 염 또는 안정화 당의 양은 다양할 수 있다. 그러나, 수성 안정화 용액을 안정화 당을 포함하는 고체상태 폴리펩타이드 입자를 제조하는데 사용할 경우, 당해 수성 안정화 용액은 바람직하게는 목적하는 안정화 당을 안정화될 폴리펩타이드에 대해 약 0.1/1 중량/중량 내지 약 1/1 중량/중량의 범위의 양으로 포함할 것이다. 또한, 수성 안정화 용액이 금속 이온을 포함하는 고체상태 폴리펩타이드 입자를 제조하기 위해 사용될 경우, 당해 수성 안정화 용액은 바람직하게는 목적하는 금속 이온을 약 1/1 내지 약 10/1 범위의 금속 이온 대 폴리펩타이드의 몰비로 포함하도록 제조한다.
산성 수성 안정화 용액으로부터 제1 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 형성시키기 위해, 안정화 용액을 공지된 입자 형성 공정에 적용시킨다. 예를 들어, 본 발명에 따른 수성 안정화 용액을 동결건조 또는 분무 건조 공정을 사용하여 가공하여 고체상태 펩타이드 입자를 달성할 수 있다. 구체적 양태에서, 본 발명에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자는 안정화 용액을 4℃에서 30분 동안 동결시키고 -50℃에서 3시간 동안 동결시킴을 포함하는 동결건조 주기(이때 냉각율은 2.5℃/분이다)를 사용하여 본 발명에 따른 수성 안정화 용액으로부터 제조한다. 상기한 수성 안정화 용액을 동결시킨 후, 1차 건조 주기를 50mT의 챔버 압력에서 -30℃에서 10분 동안 수행한 다음, 0℃에서 10시간 동안 수행한다. 1차 건조 주기 다음에 2차 건조 주기를 200mT에서 0℃에서 3시간 동안 수행한 다음, 20℃에서 12시간 동안 및 30℃에서 6시간 동안 수행하고, 이때 모든 온도 수준의 증감량은 0.5℃/분이다. 그러나, 본 발명은 본원에서 기술하는 정확한 동결건조 공정으로 제조된 고체상태 폴리펩타이드 입자로 제한되지 않는다. 몇몇 적합한 동결건조 및 분무 공정이 단백질 입자 제형 분야에 공지되어 있으며 본 발명에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 제공하기 위해 적용할 수 있다.
제2 양태에서, 본 발명의 고체상태 폴리펩타이드 입자는 거의 중성인 구성 pH를 나타내도록 제형화한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "거의 중성"이란 용어는 pH 5 내지 약 pH 8 범위의 pH를 의미한다. 바람직하게는, 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자는 약 pH 5 내지 pH 7의 재구성 pH를 나타내도록 제형화한다. 본 발명의 제2 양태에 따른 폴리펩타이드 입자는 완충제를 포함하고, 계면활성제, 안정화 당, 금속 염 또는 안정화 당과 금속 이온 둘다를 추가로 포함한다. 고체상태 폴리펩타이드 입자를 거의 중성인 재구성 pH를 나타내고 완충 부형제를 포함하도록 제형화하면 이 고체상태 입자에 포함된 폴리펩타이드 물질이 현저하게 안정화된다는 것이 밝혀졌다. 거의 중성인 pH에서 완충제는 반대이온 효과를 통해 고체상태 입자에 포함된 폴리펩타이드를 안정화시키는 작용을 할 수 있는 것으로 사료된다. 특히, 완충제 물질은 분자내 또는 분자간 반응하는 경향을 나타내는 폴리펩타이드내에 포함된 하나 이상의 부위와 상호작용하거나 결합하여 이러한 부위가 더이상 반응할 수 없게 할 수 있다고 사료된다.
제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 제형화하는데 사용하기에 적합한 완충제는 거의 중성인 pH에서 완충하는 완충제이다. 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자에서 사용할 수 있는 완충제의 구체적 예에는 아미노산 또는 펩타이드 완충제, 예를 들어, 히스티딘 완충제(His-6) 또는 히스티딘-글루탐산(His-Glu) 완충제 및 무기 완충제, 예를 들어, 석시네이트 및 시트레이트 완충제가 포함된다. 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자는 일반적으로 약 20중량%이하의 완충제를 포함하며, 바람직하게는 약 15중량% 이하의 완충제를 포함한다. 그러나, 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자에 포함된 완충제의 정확한 양은 당해 입자에 포함된 폴리펩타이드의 양과 유형에 따라 달라질 수 있다. 게다가, 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 제형화하는데 사용되는 완충제의 양과 유형을 조정하여 목적하는 재구성 pH를 나타내는 고체상태 폴리펩타이드 입자를 달성할 수도 있다.
안정화 당, 금속 이온 또는 안정화 당과 금속 이온 둘다를 포함하는 제2 양태에 따른 고체상태 입자를 제형화함으로써, 입자에 포함된 폴리펩타이드의 안정화는 완충제의 존재하에 거의 중성인 환경에서 폴리펩타이드를 단순히 제형화하여 달성되는 것보다 증가된다. 고체상태 폴리펩타이드 입자가 제2 양태에 따라 제형화되고 안정화 당, 금속 이온 또는 안정화 당과 금속 이온 둘다를 포함하는 경우, 당해 입자에 포함된 당과 금속 이온의 양은 제1 양태의 고체상태 펩타이드 입자와 관련하여 상세히 기재한 범위내에 포함된다. 특히, 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 안정화 당을 포함하도록 제형화하는 경우, 당해 펩타이드에 포함된 안정화 당의 양은 바람직하게는 안정화될 폴리펩타이드에 대해 약 0.1/1 중량/중량 내지 약 1/1 중량/중량의 범위이다. 다시, 본 발명에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자에서 안정화 당으로서 일반적으로 비환원 당이 유용하지만, 거의 중성인 pH에서 제형화하기 때문에 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자는 산성 환경에서 안정하지 않은 슈크로스와 같은 안정화 당을 포함할 수 있다. 또한, 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 금속 이온을 포함하도록 제형화하는 경우, 당해 입자는 바람직하게는 목적하는 금속 이온을 약 1/1 내지 약 10/1 범위의 금속 이온 대 폴리펩타이드의 몰비로 포함하도록 제형화한다. 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 안정화 당과 금속 이온 둘다를 포함하도록 제형화하는 경우, 목적하는 정도의 폴리펩타이드 안정화를 달성하기 위해 요구되는 당과 금속 이온의 양을, 금속 이온 없이 안정화 당을 포함하거나 안정화 당 없이 금속 이온을 포함하는 제형에 비해서 감소시킬 수 있다. 이러한 잠재적 잇점은 거의 중성인 pH에서의 당, 금속 이온 및 완충제 조건의 부가적 안정화 효과로 인해 달성될 수 있다.
제2 양태에 따른 고체상태 펩타이드 입자를 계면활성제를 포함하도록 제형화하는 경우, 사용되는 계면활성제는 바람직하게는 나트륨 도데실 설페이트(SDS)와 같은 음이온성 계면활성제이다. 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자에 포함된 계면활성제의 양은 안정화될 폴리펩타이드의 양과 유형 뿐만 아니라, 당해 입자에 포함된 다른 부형제의 성질과 양에 따라 달라질 수 있다. 그럼에도 불구하고, 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자는 목적하는 계면활성제를 약 0.02중량% 내지 약 0.2중량% 범위의 양으로 함유하는 수성 안정화 용액으로부터 제형화한다.
제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자는 수성 안정화 용액으로부터 제조할 수 있다. 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 제조하기에 적합한 수성 안정화 용액을 제조하기 위해, 안정화될 폴리펩타이드를 거의 중성인 겉보기 pH를 나타내고 계면활성제, 금속 염, 안정화 당 또는 경우에 따라 금속 염과 안정화 당 둘다를 포함하는 용액 속에 용해시킨다. 거의 중성의 안정화 용액은 이미 논의한 완충제와 같은 적합한 완충제를 목적하는 겉보기 pH를 갖는 용액을 제공하는 양으로 첨가함으로써 달성할 수 있다. 제1 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 제조하는데 사용되는 수성 안정화 용액에 적용되는 바와 같이, 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 제조하는데 사용되는 수성 안정화 용액의 겉보기 pH는 수성 안정화 용액을 사용하여 제조한 고체상태 폴리펩타이드 입자의 재구성 pH를 제어한다. 따라서, 목적하는 겉보기 pH와 목적하는 재구성 pH를 달성하기 위해 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자 제조용 수성 안정화 용액에서 사용되는 완충제의 양과 유형은 달라질 수 있다. 게다가, 본원에서 기술하는 범위내의 완충제 함량을 특징으로 하는 고체상태 폴리펩타이드 입자를 달성하기 위해, 수성 안정화 용액에 포함된 완충제의 양은, 다른 요인 중에서도 사용되는 완충제의 유형, 고체상태 입자내의 바람직한 완충제의 정확한 양, 및 고체상태 입자에 포함될 폴리펩타이드와 다른 부형제의 성질과 양에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 하기에서 상세히 기술하는 실시예에서, 10mM 농도의 히스티딘 완충제를 특징으로 하는 안정화 용액은 14중량%의 완충제 물질을 함유하는 고체상태 폴리펩타이드 입자를 제공하였다.
제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 제조하기에 적합한 수성 안정화 용액 속에 용해된 금속 염 또는 안정화 당의 양은 안정화될 폴리펩타이드의 양과 성질 뿐만 아니라 금속 염 또는 안정화 당의 성질에 따라서도 달라질 수 있다. 그러나, 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자의 제조를 위한 수성 안정화 용액이 안정화 당을 포함하는 경우, 당해 수성 안정화 용액은 바람직하게는 목적하는 안정화 당을 이미 기술한 범위내에 포함되는 양(즉, 안정화될 폴리펩타이드에 대해 약 0.1/1 중량/중량 내지 약 1/1 중량/중량, 바람직하게는 약 0.1/1 내지 약 0.5/1 중량/중량 및 약 0.1/1 내지 약 0.5/1 중량/중량의 범위)으로 포함한다. 또한, 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자 제조용 수성 안정화 용액이 금속 염을 포함하는 경우, 당해 수성 안정화 용액은 바람직하게는 목적하는 금속 이온을 이미 기술한 범위내에 포함되는 목적하는 금속 이온 대 폴리펩타이드의 몰비(즉, 약 1/1 내지 약 10/1의 금속 이온 대 폴리펩타이드 몰비, 바람직하게는 약 2/1 내지 약 6/1의 범위, 특히 바람직하게는 약 4/1의 몰비)로 포함한다.
거의 중성인 수성 안정화 용액으로부터 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 형성시키기 위해, 거의 중성인 안정화 용액을 공지된 입자 형성 공정에 적용시킨다. 제1 양태에 따른 입자의 형성과 관련하여 기술한 바와 같이, 제2 양태에 따른 고체 입자는 동결건조 또는 분무 건조 공정을 사용하여 적절히 제형화된 수성 안정화 용액으로부터 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기술하는 동결건조 공정은 수성 안정화 용액으로부터 제2 양태에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 제공하기에 적합하다. 그러나, 본 발명은 상세히 기술한 특정한 동결건조 공정의 용도로 제한되지 않는다. 동결건조 및 분무 건조 공정을 통한 입자 형성은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 어떠한 적합한 동결건조 또는 분무 건조 공정이라도 본 발명의 수성 안정화 용액에 적용하여 본 발명에 따른 고체상태 폴리펩타이드 입자를 제공할 수 있다.
본 발명의 고체상태 폴리펩타이드 입자, 수성 안정화 용액 및 방법은 특히 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드("PACAP") 및 글루카곤을 포함하는 펩타이드 슈퍼패밀리(superfamily)에 속하는 펩타이드의 안정화에 매우 적합하다. 사람에서, 펩타이드의 PACAP/글루카곤 슈퍼패밀리는 9개 이상의 상이한 유형의 생활성 펩타이드: PACAP-27; PACAP-38; 글루카곤; 글루카곤-유사 펩타이드, 예를 들어, GLP-1및 GLP-2; 성장 호르몬 방출 인자("GRF"); 혈관활성 장 폴리펩타이드("VIP"); 펩타이드 히스티딘 메티오닌("PHM"); 세크레틴; 및 글루코스-의존적 인슐린자극성 폴리펩타이드(glucose-dependent insulinotropic polypeptide, "GIP")를 포함한다. 이들 9가지 유형의 생활성 펩타이드 중 8개는 뇌에서 발견되며 신경펩타이드로서 분류된다. 또한, PACAP/글루카곤 슈퍼패밀리의 다수의 구성원들은 위장관, 췌장 및 생식 기관[참조: The origin and function of the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP)/glucagon superfamily, Endocrine Reviews, 21(6): 619-670]에 존재한다. PACAP/글루카곤 슈퍼패밀리에 포함되는 펩타이드는 N-말단 아미노산에 의해 구조적으로 관련되며, PACAP/글루카곤 슈퍼패밀리에 포함되는 각종 상이한 펩타이드의 세포내 생산에 사용되는 유전자 및 전구체 분자는 구조적으로 유사하다.
바이엘 코포레이션(Bayer Corporation, "바이엘")에 의해 제조된 합성 PACAP-R3 작용제 유사체("PACAP 유사체")이 특히 관심대상이다. 상기 합성 펩타이드는 다음의 31개의 아미노산 서열로 정의된다: HSDAVFTDNY TRLRKQVAAK KYLQSIKNKR Y. 바이엘은 효능 및 췌장내 R3 수용체에 대한 선택성에 대해 PACAP 유사체를 조작하였다. PACAP 유사체의 안정성을 향상시키기 위해, 17번 위치에 있는 본래 메티오닌을 발린으로 대체시키고, 본래 24번 위치에 위치하는 아스파라긴을 글루타민으로 대체시켰다. PACAP 유사체는 II형 당뇨병을 치료하는데 유용하며, PACAP 유사체를 3개월 이상, 바람직하게는 6개월 이상에 걸쳐서 치료학적으로 용량으로 피험자(사람)에게 전달할 수 있는 이식가능한 약물 전달 시스템으로부터 PACAP를 전달하는 것이 바람직할 것이다. 그러나, PACAP 유사체가 고체상태로 유지되는지 또는 수성 또는 유기 용매 용액 속에 용해되는지에 관계없이, 비보호된 PACAP 유사체는 생리학적 조건에 근접하거나 이를 초과하는 온도에서는 불안정하다. 따라서, 이식가능한 연장된 방출 전달 시스템으로부터 전달하기에 적합한 현탁액 중에 PACAP를 부하하기 위해, 고체상태 PACAP 유사체 입자를 생리학적 조건에 근접하거나 이를 초과하는 온도에 대한 연장된 노출로부터 야기되는 분해에 대해 안정화시켜야 한다.
고체상태 PACAP 유사체가 생리학적 조건에 근접하거나 이를 초과하는 온도에 노출되는 경우, 가장 중요한 분해원은 응집물 형성인 것으로 결정되었다. 특히, 동결건조된 PACAP 유사체를 사용함으로써, 비보호된 동결건조된 PACAP 유사체의 주된 분해 산물은 공유적 이량체, 이량체-OAc 및 PACAP-OAc 부산물인 것으로 결정되었다. 현재로서는 이러한 분해 산물로의 PACAP 유사체의 분해는 반응성 분자내 사이클릭 이미드 형성 후의 아세테이트 이온 또는 PACAP 유사체의 다른 분자 또는 이들 둘다에 의한 친핵성 공격을 통해 진행되는 것으로 사료된다. 아마도 이러한 제안된 분해 경로에 대한 변형 부위는 PACAP 유사체 분자의 Asp3Ala4 및 Gln24Ser25 아미노산이 될 것이다. 추가로, N-말단 펩타이드 결합 절단이 또한 일어나서 고체상태의 비보호된 PACPA 유사체를 분해시키는 것으로 결정되었다. 이러한 단백질분해는 주로 pH 4에서 발견되며 Asp3 카복실 측쇄의 보조된 분자내 폐환을 통해 일어나는 것으로 추측된다. 그러나, 하기 실시예에 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명의 고체상태 폴리펩타이드 입자의 다양한 양태는, 심지어 당해 입자가 수개월 동안 40℃ 및 60℃의 온도에서 유지되는 경우에도 분해에 대해 PACAP 유사체를 안정화시키는데 효과적이다.
본 발명의 고체상태 폴리펩타이드 입자의 몇가지 상이한 양태가 PACAP 유사체의 효과적 안정화를 제공하지만, 3가지 양태가 우수한 안정화를 제공한다. 하나의 양태에서, 고체상태 PACAP 유사체 입자를 겉보기 pH 2를 나타내는 안정화 용액으로부터 동결건조시킨다. 용액 안정화용 용매는 희석된 HCl을 사용하여 pH를 목적하는 값으로 조정한 H2O를 사용하여 형성시킨다. 이러한 양태에 따른 고체상태 PACAP 유사체 입자로, 60℃에서 2개월간 저장한 후에도 초기 PACAP 유사체의 92%가 회수될 수 있으며 1.1%의 이량체만이 형성된다. 도 9에는 2개월간의 안정성 결과가 제시되어 있으며, 이는 겉보기 pH가 2인 안정화 용액으로부터 제조된 고체상태 PACAP 입자의 안정성이 크게 향상되었음을 입증한다.
제2 양태에서, 고체상태 폴리펩타이드 입자는 산성 pH에서 제형화되며, 트레할로스와 PACAP 유사체를 0.55/1 중량/중량 비(트레할로스/PACAP 유사체)로 포함한다. 이러한 입자로, 60℃에서 2개월간 저장한 후에도 초기 PACAP 유사체의 96%가 회수될 수 있으며 0.7%의 이량체만이 형성된다. 산성 pH를 특징으로 하며 트레할로스와 PACAP 유사체를 0.55/1 중량/중량 비로 포함하는 고체상태 PACAP 유사체 입자를 제형화하기 위해, 산성의 수성 안정화 용액을 사용할 수 있다. 이러한 안정화 용액은 희석된 HCl과 같은 적합한 산을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 용액의 pH(겉보기 pH)는 바람직하게는 약 2의 pH로 조정하고, 트레할로스와 PACAP 유사체는 목적하는 0.55/1 중량/중량 비로 용해시킨다. 이어서, 제조된 용액을 동결건조 또는 분무 건조 공정에 적용시켜 목적하는 고체상태 PACAP 유사체 입자를 제조할 수 있다.
제3 양태에서, 고체상태 폴리펩타이드 입자는 다시 산성 pH에서 제형화되고 PACAP 유사체와 Ca2+ 이온을 4/1 몰비(Ca2+/PACAP 유사체)로 포함한다. 60℃에서 2개월간 저장한 후, 이러한 제형화에 따라 형성된 입자는 95%의 초기 PACAP 유사체 회수율을 제공하고 0.8%의 이량체만을 형성시킨다. 산성 pH를 특징으로 하며 Ca2+ 및 PACAP 유사체를 4/1 몰비로 포함하는 고체상태 PACAP 유사체 입자를 제형화하기 위해, 산성의 수성 안정화 용액을 제조할 수 있다. 다시, 이러한 용액은 희석된 HCl과 같은 적합한 산을 사용하여 제조할 수 있으며, 당해 용액의 pH는 바람직하게는 약 pH 2로 조정한다. 용액이 4/1의 Ca2+ 대 PACAP 유사체의 몰비를 갖도록 하는 양의 CaCl2 및 PACAP를 용해시켜 적당량의 Ca2+ 이온 및 PACAP 유사체를 용액중에 제공할 수 있다. 이어서, 제조된 안정화 용액을 동결건조 또는 분무 건조 공정에 적용시켜 목적하는 고체상태 PACAP 유사체 입자를 제조할 수 있다.
본원에서 기술하는 입자에 함유된 PACAP 유사체의 안정성이 최대 온도 60℃에서 최대 기간 2개월 동안 평가되었다 해도, 이러한 평가와 40℃에서의 반분해 반응 속도론의 비교에 의해 제공된 발견은, 본 발명의 방법이 생리학적 온도에 근접한 온도(즉, 40℃)에서 2개월 이상 분해에 대해 안정화되는 고체상태 PACAP 유사체 입자를 제공하기에 적합함을 나타낸다. 구체적으로는, 입자에 함유된 PACAP 유사체의 전체 분해 속도는 40℃보다 60℃에서 약 5배 높다. 게다가, 본 발명에 따라 제조된 고체상태 PACAP 입자내의 응집 속도 또는 이량체화 속도는 40℃보다 60℃에서 약 10배 높다. 따라서, 본 발명의 방법으로 제조된 고체상태 PACAP 유사체 입자를 약 37℃에서 유지시키는 경우, 당해 입자내에 함유된 PACAP 유사체는 최대 6개월 및 그 이상 동안 허용되는 안정성을 나타낼 것으로 예상된다.
하기 실시예는 PACAP 유사체의 안정화에 관한 것이나, 본 발명은 이로써 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 사용하여 PACAP/글루카곤 슈퍼패밀리의 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 갖는 다른 구성원, 특히 사람 VIP 및 사람 성장 호르몬 방출 인자와 같은 패밀리 구성원의 안정화된 고체상태 입자를 제공할 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법은 또한 PACAP/글루카곤 슈퍼패밀리의 구성원의 안정화로만 제한되지는 않는다. 고체상태 폴리펩타이드 입자, 수성 안정화 용액 및 본 발명의 방법은 단백질분해 또는 응집물 형성으로 인해 분해를 나타내거나 PACAP에서 관찰된 경로와 같은 분해 경로로 도입되기 쉬운 1차 구조를 갖는 어떠한 폴리펩타이드라도 안정화시키는데 유용할 수 있다.
실시예 1
이식가능한 약물 전달 시스템에서 사용되는 현탁액 비히클의 성질로 인해 현탁액 제형의 대랑 혼합 및 후속적인 이식가능한 시스템내로의 현탁액 제형의 부하는 흔히 승온하에 수행된다. 승온하에 다양한 현탁액 비히클 속에 현탁된 PACAP 유사체(또는 단순히 "PACAP")의 안정성을 평가하기 위해, 비보호된 동결건조된 PACAP를 4가지의 상이한 현탁액 비히클(LL/GML/PVP, BA/PVP, EHL/PVP 및 PEG/PVP) 속에 현탁시켰다. PACAP를 현탁액 비히클 속에 현탁시키기 위해, PACAP 아세테이트 3.3mg를 각각의 상이한 현탁액과 수동으로 혼합하여 약 3%의 PACAP 함량을 달성하였다. 이어서, PACAP 현탁액 제형의 안정성을 65℃에서 4시간 동안 항온처리한 후에 평가하였다. 제조된 PACAP 현탁액의 안정성을 RP-HPLC 및 SEC로 평가하고, 표 1을 참조로 하여 알 수 있는 바와 같이, 당해 결과는 PACAP가 4시간의 항온처리 기간 전반에 걸쳐 안정하였으며 따라서 전형적으로 현탁액 제형 제조 공정과 관련되는 온도 조건을 견디어냄을 보여주었다.
이어서, PACAP 현탁액을 37℃ 및 65℃에서 추가로 17일 동안 항온처리하였다. 추가의 17일간의 항온처리 기간 후에, 최저한의 안정성 손실이 37℃에서 항온처리된 현탁액(표 2)에서 관찰된 반면에, 비교적 보다 활발한 분해가 65℃에서 항온처리된 현탁액(표 3)에서 관찰되었다. 당해 결과는 공유결합된 응집이 평가된 PACAP 현탁액에서의 주요 분해 경로임을 보여주었다. 응집이 비히클의 존재 및 부재하에 일어났다는 사실은 현탁액 비히클이 생성된 자가-결합의 원인이 아니었음을 제시한다. 또한, 다른 화학적 분해가 동결건조된 PACAP의 손실에 기여하였다.
| 65℃에서 4시간 동안 가열시 PACAP의 안정성 | |||
| 현탁액 비히클 | 회수(SEC에 의한 회수량%) | RP-HPLC에 의한 초기 PACAP% | SEC에 의한 응집물% |
| LL/GML/PVP | 95.4±0.5 | 99.5±0.9 | <0.5 |
| BA/PVP | 95.5±0.8 | 99.6±0.1 | <0.5 |
| EHL/PVP | 96.2±0.5 | 99.8±0.3 | <0.5 |
| PEG400/PVP | 91.5±4.9 | 99.9±0.4 | 1.1±0.2 |
| * 샘플은 pH 6에서 10mM 히스티딘으로 재구성하고, 4℃에서 밤새 항온처리하고, 여액을 분석하였다. n=3개의 각 샘플 | |||
| 37℃에서 17일 동안의 PACAP의 안정성 | |||
| 현탁액 비히클 | 회수(SEC에 의한 회수량%) | RP-HPLC에 의한 초기 PACAP% | SEC에 의한 응집물% |
| 동결건조된 PACAP | 99±1.3 | 99±0.7 | 0.4±0.03 |
| LL/GML/PVP | 93±2.6 | 101±0.3 | 0.7±0.03 |
| EHL/PVP | 96±1.7 | 99±0.2 | 0.8±0.2 |
| PEG400/PVP | 88 | 99 | 1.8 |
| * BA/PVP 현탁액에 대한 샘플은 없다. | |||
| 65℃에서 17일 동안의 PACAP의 안정성 | |||
| 현탁액 비히클 | 회수(SEC에 의한 회수량%) | RP-HPLC에 의한 초기 PACAP% | SEC에 의한 응집물% |
| 동결건조된 PACAP | 95±1.6 | 85±1.9 | 2.9±0.02 |
| LL/GML/PVP | 93±0.6 | 96±0.4 | 2.4±0.1 |
| EHL/PVP | 94±0.2 | 95±0.3 | 4.0±0.1 |
| PEG400/PVP | 87±2.9 | 98±0.5 | 2.9±0.1 |
| * BA/PVP 현탁액에 대한 샘플은 없다. | |||
실시예 2
처리 연구로부터의 예비 발견은 PACAP 동결건조물 및 현탁액에 대한 당(슈크로스)와 비이온성 계면활성제(Tween 80)의 안정화 효과의 평가를 유도하였다. 평가를 수행하기 위해, 3가지 수준의 Tween 80(0, 0.05, 0.2중량%) 및 슈크로스(0, 0.5/1, 1/1, 중량/중량)에서 10mM NH4OAc(pH 6.4) 중의 PACAP로 샘플을 제조하였다. 10mM의 히스티딘(pH 6.4) 및 나트륨 석시네이트(pH 5.6) 중의 PACAP 용액을 또한 제조하였다. 각각의 PACAP 용액을 동결건조시켜 재구성된 고체상태 PACAP 입자를 수득하고, 개개의 바이알에 각각의 용액으로부터 재구성된 물질의 샘플 3.3mg을 제공하였는데, 이때 샘플은 첨가제를 함유하지 않는 샘플(1), 0.2중량% Tween 80을 함유하는 샘플(2), 0.2중량% Tween 80 + 0.5:1, 중량/중량 슈크로스를 함유하는 샘플(3) 및 1:1, 중량/중량 슈크로스를 함유하는 샘플(4)이었다. 다양한 샘플 3.3mg을 LL/GML/PVP 및 BA/PVP와 수동으로 혼합하여 약 3%의 PACAP 함량을 갖는 현탁액 제형을 수득하고, 이 현탁액 제형을 4시간 동안 65℃에서 항온처리하였다. 초기 항온처리 기간 후, 다양한 현탁액 제형을 하기와 같이 저장하고 RP-HPLC 및 SEC로 평가하였다.
| 저장 온도/시간 | 0 | 24일 | 3개월 |
| 2 내지 8℃ | X | - | X |
| 40℃ | - | X | X |
| 60℃ | - | X | X |
도 1은 슈크로스가 PACAP 응집을 억제한 반면, Tween 80의 존재는 첨가된 효과를 갖지 않았음을 제시한다. PACAP 잔류량 %로 평가한 전체 안정성도 또한 그에 상응하게 증가하였다. PACAP 응집 정도는 저장 온도의 함수인 것으로 나타났다(도 2). 안정화제 없이 동결건조된 PACAP는 4℃에서 3개월 이상 안정하였으며 40℃에 비해 60℃에서 실질적으로 보다 신속하게 응집하였다. 본 연구는 슈크로스가 생리학적 온도(40℃) 및 증가된 온도(60℃) 둘다에서 동결건조된 PACAP를 안정화시켰음을 입증하였다.
도 3 및 4는 각종 상이한 부형제를 사용하여 제조한 동결건조된 제형에 있어 각각 40℃ 및 60℃에서 3개월에 걸친 PACAP 응집물 형성의 선형 증가를 제시한다. 히스티딘 및 나트륨 석시네이트는 암모늄 아세테이트보다 우수한 안정화제인 것으로 입증되었다. 1:1 중량/중량 슈크로스를 함유하는 샘플의 경우를 제외하고는, 60℃에서의 응집 속도는 40℃에서 관찰된 응집 속도보다 약 10배 빨랐으며, 전체 분해 속도는 40℃에서 관찰된 속도보다 60℃에서 약 5배 빨랐다(표 4). 이러한 결과는 높은 슈크로스 함량이 전체 분자 이동도 및 단백질-단백질 상호작용을 감소시켜 열적 안정성을 증가시켰음을 나타낸다.
반면에, 전체 분해는 3개월의 기간에 걸쳐 덜 선형적 관계에 따랐다(도 5). 본 실험은 동량의 슈크로즈(중량/중량)를 함유하는 동결건조된 PACAP(암모늄 아세테이트 중에서 겉보기 pH 6.4에서 제조됨)이, 40℃에서 6개월 동안의 산정된 전체 분해가 8.4%로서 최상(그러나 허용되는 않는)의 안정성을 제공하였음을 입증하였다.
또한, 본 실험은 슈크로스가 단독의 동결건조된 PACAP 제형과 유사하게 BA/PVP 및 LL/GML/PVP(도 6 및 7) 중의 PACAP 제형에서 응집물 형성을 억제하였음을 제시하였다. 응집물 형성과 관련하여 슈크로스의 안정화 효과는 BA/PVP 현탁액에서 감소되는 것으로 보였다. 또한, BA/PVP 중의 PACAP의 유사한 장기간 안정성을 위해 보다 높은 양의 슈크로스가 필요하였다(도 8).
분해 산물을 특성화하고 분해 경로를 규명하기 위해, 재구성된 안정성 샘플(60℃에서 24일 동안 저장한, 동결건조된 PACAP)를 전기분무-이동시보 질량분광분석법(electrospray-time-of-flight mass spectrometry)으로 분석하고, 분해 산물을 RP-HPLC 공정을 사용하여 확인하였다.
3743의 분자량(MW)을 온전한 PACAP의 분자량으로 정하였다. RP-HPLC 분석을 토대로 하여, 주요 분해 산물은 공유적 이량체 및 이량체-OAc 부산물임이 확인되었다. 중요하게도, 주 피크 후, 그러나 이량체 피크의 용출 전에 용출되는 일단의 피크는 모두 질량이 PACAP-OAc 부산물의 질량(즉, 3785amu)과 동일하다. RP-HPLC와 전기분무-이동시보 질량분광분석법로부터의 조합된 결과는 두 분해 모두 동일한 반응성 중간체(들)을 통해 이루어졌음을 제시한다. 이러한 분석을 토대로 하여, 잠재적 분해 기작은 다음과 같이 가정될 수 있다:
반응식 1: 가정된 기작
분해는 속도-제한 사이클릭 이미드 중간체 형성 후에 아세트 이온 또는 다른 PACAP 분자 또는 둘다의 친핵제 첨가를 경유해 2단계 기작에 의해 진행된다고 가정될 수 있다. 모든 샘플에서 함수량이 낮았기 때문에(<1%), 물의 친핵성 첨가의 결과인 탈아미드화는 우세하지 않았다.
| 부형제 | 응집(응집물%/개월) | 전체 분해(분해물%/개월) | ||
| 40℃ | 60℃ | 40℃ | 60℃ | |
| 암모늄 아세테이트 | 1.06 | 11.2 | ~3.3 | ~18.3 |
| 나트륨 석시네이트 | 0.61 | 6.2 | ~3.0 | ~13.3 |
| 히스티딘 | 0.45 | 3.9 | ~2.7 | ~11.0 |
| NH4OAc+0.5/1 슈크로스 | 0.27 | 3.2 | ~1.4 | ~8.5 |
| NH4OAc+1/1 슈크로스 | 0.16 | 0.9 | 1.4 | ~3.4 |
| * "~"는 추정된 선형 증가를 나타낸다(도 5 참고) | ||||
실시예 3
pH 6에서 NH4OAc 중에서 제조한 3가지 상이한 폴리펩타이드 용액으로부터 동결건조 공정(FTS Duro stop)을 통해 고체상태 PACAP 입자를 제조하였다. 3가지의 상이한 용액은 각각 상이한 양의 슈크로스를 함유하였으며, 제1 용액은 슈크로스를 함유하지 않았고, 제2 용액은 슈크로스를 0.5/1의 슈크로스 대 PACAP의 중량비로 함유하였고, 제3 용액은 슈크로스를 1/1의 슈크로스 대 PACAP의 중량비로 함유하였다. 각각의 3가지 용액으로부터 제조한 고체상태 PACAP 입자를 2℃ 내지 8℃ 범위의 대조 온도, 생리학적 온도에 근접한 온도(40℃) 및 생리학적 온도를 초과하는 온도(60℃)에서 저장하였다. 고체상태 PACAP 입자의 각 그룹에 함유된 PACAP의 안정성을 24일째 및 3개월째에 평가하였다. 각 입자 그룹에서의 PACAP 안정성을 평가하기 위해, 입자를 물로 재구성하고 역상 RP-HPLC(0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 이동상을 이용한 아세토니트릴 구배 용출 및 214nm에서의 UV 검출) 및 크기 배제 HPLC(SEC, 등용매 용출, 0.1% 트리플루오로아세트산과 200mM의 염화나트륨을 함유하는 70%의 수용액과 혼합된 30% 아세토니트릴 및 220nm에서의 UV 검출)로 분석하였다.
응집 속도(SEC로 평가함)는 시험된 모든 제형에 있어 40℃보다 60℃에서 10배 높은 것으로 밝혀졌다(표 5). PACAP 대 슈크로스 중량비를 1/1로 하여 제조한 고체상태 PACAP 입자를 제외하고는, 다양한 고체상태 PACAP 입자에서 관찰된 전체 분해 속도(RP HPLC로 평가함)는 40℃보다 60℃에서 약 5배 빨랐다.
| 부형제 | 응집(응집물%/개월) | 전체 분해(분해물%/개월) | ||
| 40℃ | 60℃ | 40℃ | 60℃ | |
| 첨가제가 없음 | 1.06 | 11.2 | ~3.3 | ~18.3 |
| 슈크로스 0.5/1(중량/중량) | 0.27 | 3.2 | ~1.4 | ~8.5 |
| 슈크로스 1/1(중량/중량) | 0.16 | 0.9 | 1.4 | ~3.4 |
| * "~"는 추정된 선형 증가 속도를 나타낸다. | ||||
실시예 4
시간에 따른 PACAP 분자의 안정성에 대한 pH의 효과를 평가하였다. 이러한 평가를 수행하기 위해, PACAP 원료를 먼저 3가지의 상이한 용액 중의 H2O에 희석시켰는데, 이때 제1 용액의 pH는 2이고, 제2 용액의 pH는 4이며, 제3 용액의 pH는 6이었다. 각 용액의 pH를 희석된 HCl을 사용하여 목적하는 값으로 조정하였다. 각각의 3가지 용액을 동결건조 바이알에 놓고, 고체상태 PACAP 입자를 본원에서 이미 기술한 동결건조 공정을 통해서 각각의 3가지 용액으로부터 제조하였다. 이어서, 각각의 3가지 용액으로부터의 입자를 60℃에서 2개월 동안 저장하고, 이후에 고체상태 입자에 포함된 PACAP의 안정성을 RP-HPLC 및 SEC를 사용하여 평가하였다. 도 9에는 산성 pH에서 제조한 고체상태 PACAP 입자의 안정성이 크게 향상되었음을 입증하는 2개월 안정성 결과를 제시한다.
실시예 5
다양한 pH에서 상당량의 잠재적 안정화 당으로 제조한 고체상태 PACAP 입자에 포함된 PACAP의 안정성을 평가하였다. 각각의 경우에, 고체상태 PACAP는 다음의 3가지 당 중 하나의 7.3몰당량으로 이루어졌다: 슈크로스; 트레할로스; 및 메틸 만노피라노시드(모두 Sigma로부터 입수함). 평가한 고체상태 PACAP 입자는 8개의 상이한 수용액으로부터 제조하였다. 첫번째 2개의 수용액은 PACAP를 pH가 2로 조정된 제1 용액 및 pH가 2로 조정된 제2 용액(상기한 바와 같이 본 실시예에서 기술한 다양한 용액의 pH는 희석된 HCl을 사용하여 조정하였다)에 용해시켜 제조하였다. 제3 및 제4 수용액은 PACAP와 메틸-MP 둘다를 pH가 2로 조정된 용액 및 pH가 6으로 조정된 용액에 용해시켜 제조하였다. 제5 및 제6 수용액은 PACAP와 트레할로스 둘다를 pH가 2로 조정된 용액 및 pH가 6으로 조정된 용액에 용해시켜 제조하였다. 제7 및 제8 수용액은 PACAP와 슈크로스 둘다를 pH가 2로 조정된 용액 및 pH가 6으로 조정된 용액에 용해시켜 제조하였다.
고체상태 PACAP 입자를 이미 기술한 바와 같이 각각의 8가지 용액으로부터 동결건조를 통해 제조한 다음, 각각의 8가지 용액으로부터 제조한 고체상태 PACAP 입자를 60℃에서 2개월 동안 저장하였다. 다양한 고체상태 PACAP 입자를 60℃에서 2개월에 걸쳐 노출시킨 후, 다양한 입자에 포함된 PACAP의 안정성을 RP HPLC 및 SEC 방법을 사용하여 평가하였다.
HPLC 분석은 조사된 모든 3가지 당이 pH 6에서 제조한 PACAP 입자에 포함된 경우에 향상된 안정성을 보여주었음을 나타냈다. 특히, pH 6에서, 슈크로스는 응집물 형성을 방지하는데 있어 약 6배의 향상을 제공하였으며, 트레할로스는 동일한 척도에서 약 4배의 향상을 제공하였다. 게다가, 트레할로스와 메틸 MP는 둘다 이러한 안정화 당을 첨가하지 않고 pH 2에서 제조한 PACAP(표 6)에 상대적으로 pH 2에서 제조한 입자에 포함된 PACAP의 부가적 안정성을 제공하였다. 그러나, pH 2에서 제조한 PACAP 입자에 포함된 경우, 슈크로스는 현저한 탈안정화 효과를 나타냈다. pH 2에서 제조한 PACAP에 대한 슈크로스의 탈안정화 효과는 산성 pH를 갖는 용액으로부터의 PACAP 입자의 제조 공정 동안 슈크로스 분해의 결과인 것으로 사료되었다.
| 60℃에서 2개월 동안 pH 2 내지 6에서 당의 안정화 효과 | ||||
| 첨가제 | 응집물% | 초기 PACAP% | ||
| pH 2 | pH 6 | pH 2 | pH 6 | |
| 첨가제 없음 | 1.1 | 26 | 92 | 61 |
| 메틸 MP | 0.8 | 17 | 94 | 73 |
| 트레할로스 | 0.7 | 6.3 | 96 | 88 |
| 슈크로스 | 24 | 4.2 | 13 | 91 |
실시예 6
히스티딘 완충제(제조원; Sigma)를 함유하는 PACAP 입자 및 히스티딘 완충제와 함께 염화칼슘(CaCl2, JT Baker), 슈크로스와 나트륨 도데실 설페이트(SDS, Pierce)를 함유하는 PACAP 입자를 제조하고, 이러한 입자에 의해 제공된 PACPA의 안정화를 평가하였다. 평가할 PACAP 입자를 제조하기 위해, 6가지의 상이한 수용액을 제조하였다. 각각의 용액은 이 용액에 용해된 목적하는 양의 PACAP를 포함하였고, 각각의 6가지 용액의 pH는 희석된 HCl을 첨가하여 6으로 조정하였다. 제1 수용액은 첨가제(히스티딘 완충제, CaCl2, 슈크로스 또는 SDS)를 사용하지 않고 제조하였다. 제2 수용액은 10mM 농도의 히스티딘 완충제를 사용하여 제조하였다. 제3 용액은 10mM 농도의 히스티딘 완충제와 10mM 농도의 CaCl2를 사용하여 제조하였다. 제4 수용액은 10mM 농도의 히스티딘 완충제를 사용하여 제형화하였으며 슈크로스를 PACAP에 대한 0.5/1 중량비(슈크로스/PACAP)로 포함하였다. 제5 수용액은 10mM 농도의 히스티딘 완충제, 10mM 농도의 CaCl2 및 PACAP에 대한 0.5/1 중량비(슈크로스/PACAP)를 제공하는 양의 슈크로스를 사용하여 제조하였다. 제6 수용액은 10mM 농도의 히스티딘 완충제 및 0.02중량% SDS를 사용하여 제형화하였다. 이어서, 고체상태 PACAP 입자를 본원에서 이미 기술한 동결건조 공정을 사용하여 각각의 6가지 용액으로부터 제조하였다. 이어서, 각각의 용액으로부터 제조한 PACAP 입자를 60℃에서 2개월 동안 저장하고, 이렇게 저장한 후 다양한 상이한 입자내에 함유된 PACAP의 안정성을 RP-HPLC 및 SEC 공정을 사용하여 평가하였다. 표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 히스티딘 완충제의 존재는 PACAP 응집물 형성을 크게 억제하였다(응집물 형성이 약 6배 감소함). 또한, 슈크로스, CaCl2 및 SDS는 펩타이드를 추가로 안정화하였으며, 응집물 형성을 약 14배 내지 20배 감소시켰다.
| 60℃에서 6개월 동안 저장된 pH 6 PACPA에 대한 히스티딘, 슈크로스, CaC12 및 SDS의 안정화 및 부가적 안정화 효과 | ||
| 첨가제 | 응집물% | 초기 PACAP% |
| 첨가제 없음 | 26 | 61 |
| 히스티딘 | 4.2 | 87 |
| CaC12(10mM) 및 히스티딘 | 1.6 | 92 |
| 슈크로스(0.5/1 중량비) 및 히스티딘 | 1.4 | 92 |
| 슈크로스(0.25/1 중량비), CaC12(5mM) 및 히스티딘 | 1.3 | 92 |
| SDS(0.02%) 및 히스티딘 | 1.8 | 88 |
| * 히스티딘 농도는 모든 제형에서 10mM이었다. | ||
실시예 7
산성 pH 및 거의 중성 pH에서 제조한 PACAP 입자 중의 CaCl2의 안정화 효과를 평가하기 위해, 4가지의 상이한 유형의 입자를 제형화하고 60℃에서 2개월 동안 저장한 다음, PACAP 분해에 대해 분석하였다. 4가지의 상이한 입자 제형을 4가지의 상이한 수용액으로부터 제조하였다. 각각의 4가지 용액은 이 용액에 용해된 목적하는 양의 PACAP를 포함하였고, 각각의 용액의 pH는 희석된 HCl을 사용하여 목적하는 수준으로 조정하였다. 제1 수용액은 첨가제(히스티딘 또는 CaCl2)를 사용하지 않고 제조하고, 제1 용액의 pH는 2로 조정하였다. 제2 수용액은 10mM 농도의 CaCl2를 사용하여 제조하고, 제2 용액의 pH는 2로 조정하였다. 제3 용액은 10mM 농도의 히스티딘 완충제를 사용하여 제조하고, 제4 용액은 10mM 농도의 히스티딘 완충제와 10mM 농도의 CaCl2를 사용하여 제조하였다. 고체상태 PACAP 입자를 이미 기술한 동결건조 공정을 사용하여 각각의 4가지 수용액(각각의 상이한 입자의 조성은 표 8에 개요되어 있다)으로부터 제조하고, 각각의 4가지 용액으로부터 제조한 PACAP 입자를 60℃에서 2개월 동안 저장하였다. 입자들을 60℃에서 2개월 동안 저장한 후, 입자에 포함된 PACAP의 안정성을 RP-HPLC 및 SEC 공정을 사용하여 평가하였다. 표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 각각의 평가 결과는 CaCl2가 pH 2 및 6 둘다에서 PACAP 입자의 안정성을 추가로 향상시켰음을 입증하였다.
| 60℃에서 6개월 동안 저장된 PACPA 입자에 대한 pH 2 및 pH 6에서의 CaC12 및 히스티딘의 안정화 및 부가적 안정화 효과 | ||
| 첨가제 | 응집물% | 초기 PACAP% |
| pH 2, 첨가제 없음 | 1.1 | 92 |
| pH 2, CaC12 존재 | 0.8 | 95 |
| pH 6, 히스티딘 존재 | 4.2 | 87 |
| pH 6, CaC12 및 히스티딘 존재 | 1.6 | 92 |
| * CaC12 및 히스티딘의 농도는 모든 제형에서 10mM이었다. | ||
Claims (35)
- 폴리펩타이드와, 금속 이온 및 생리학적 조건 이하 또는 이를 초과하는 온도에서 산성 조건하에 안정한 당으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 안정화제를 포함하는, 산성 재구성 pH를 나타내도록 제형화된 안정화된 폴리펩타이드 입자.
- 제1항에 있어서, 폴리펩타이드, 금속 이온 및 생리학적 조건 이하 및 이를 초과하는 온도에서 산성 pH에서 안정한 당을 포함하는 폴리펩타이드 입자.
- 제1항에 있어서, 안정화제가 생리학적 조건 이하 및 이를 초과하는 온도에서 산성 조건하에 안정한 이당류 및 단당류로부터 선택되는 폴리펩타이드 입자.
- 제3항에 있어서, 안정화제가 트레할로스 및 메틸-만노피라노시드로부터 선택되는 폴리펩타이드 입자.
- 제1항에 있어서, 안정화제가 생리학적 조건 이하 및 이를 초과하는 온도에서 산성 조건하에 안정한 이당류 및 단당류로부터 선택되고, 약 0.1/1 내지 약 1/1의 범위인 안정화제 대 폴리펩타이드의 중량/중량 비로 폴리펩타이드 입자내에 포함되어 있는 것인, 폴리펩타이드 입자.
- 제1항에 있어서, 안정화제가 생리학적 조건 이하 및 이를 초과하는 온도에서 산성 조건하에 안정한 이당류 및 단당류로부터 선택되고, 약 0.1/1 내지 약 0.5/1의 범위인 안정화제 대 폴리펩타이드의 중량/중량 비로 폴리펩타이드 입자내에 포함되어 있는 것인, 폴리펩타이드 입자.
- 제1항에 있어서, 안정화제가 생리학적 조건 이하 및 이를 초과하는 온도에서 산성 조건하에 안정한 이당류 및 단당류로부터 선택되고, 약 0.1/1 내지 약 0.25/1의 범위인 안정화제 대 폴리펩타이드의 중량/중량 비로 폴리펩타이드 입자내에 포함되어 있는 것인, 폴리펩타이드 입자.
- 제1항에 있어서, 안정화제가 2가 금속 이온 염으로부터 유도된 금속 이온을 포함하는 폴리펩타이드 입자.
- 제1항에 있어서, 안정화제가 CaCl2, MgCl2 및 ZnCl2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2가 금속 이온 염으로부터 유도된 금속 이온을 포함하는 폴리펩타이드 입자.
- 제1항에 있어서, 안정화제가 금속 이온을 포함하고, 폴리펩타이드 입자에 포함된 안정화제 대 폴리펩타이드의 몰비가 약 1/1 내지 약 10/1의 범위인 폴리펩타이드 입자.
- 제1항에 있어서, 안정화제가 금속 이온을 포함하고, 폴리펩타이드 입자에 포함된 안정화제 대 폴리펩타이드의 몰비가 약 2/1 내지 약 6/1의 범위인 폴리펩타이드 입자.
- 제1항에 있어서, 안정화제가 금속 이온을 포함하고, 폴리펩타이드 입자에 포함된 안정화제 대 폴리펩타이드의 몰비가 약 4/1인 폴리펩타이드 입자.
- 제1항에 있어서, 폴리펩타이드가 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드/글루카곤 슈퍼패밀리(superfamily)로부터 선택되는 폴리펩타이드 입자.
- 제1항에 있어서, 폴리펩타이드가 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩타이드, 성장 호르몬 방출 인자, 혈관활성 장 폴리펩타이드, 펩타이드 히스티딘 메티오닌, 세크레틴 및 글루코스-의존적 인슐린자극성 폴리펩타이드(glucose-dependent insulinotropic polypeptide)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리펩타이드 입자.
- 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드와, 트레할로스 및 메틸 만노피라노시드로부터 선택되는 안정화 당을, 약 0.55/1의 안정화 당 대 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드의 중량/중량 비로 포함하는, 산성 재구성 pH를 나타내도록 제형화된 안정화된 폴리펩타이드 입자.
- 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드와, Ca2+, Mg2+ 및 Zn2+로부터 선택되는 안정화 금속 이온을, 약 4/1의 금속 이온 대 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드의 몰비로 포함하는, 산성 재구성 pH를 나타내도록 제형화된 안정화된 폴리펩타이드 입자.
- 폴리펩타이드와, 금속 이온, 계면활성제, 완충제, 및 생리학적 조건 이하 및 이를 초과하는 온도에서 거의 중성인 pH 환경에서 안정한 당으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 안정화제를 포함하는, 거의 중성인 재구성 pH를 나타내도록 제형화된 폴리펩타이드 입자.
- 제18항에 있어서, 폴리펩타이드가 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드/글루카곤 슈퍼패밀리로부터 선택되는 폴리펩타이드 입자.
- 제18항에 있어서, 폴리펩타이드가 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩타이드, 성장 호르몬 방출 인자, 혈관활성 장 폴리펩타이드, 펩타이드 히스티딘 메티오닌, 세크레틴 및 글루코스-의존적 인슐린자극성 폴리펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리펩타이드 입자.
- 제18항에 있어서, 안정화 당과, 아미노산 완충제, 펩타이드 완충제 및 무기 완충제로부터 선택되는 완충제를 포함하는 폴리펩타이드 입자.
- 제21항에 있어서, 안정화 당 대 폴리펩타이드의 중량/중량 비가 약 0.25/1 내지 약 1/1인 폴리펩타이드 입자.
- 제18항에 있어서, 아미노산 완충제 및 펩타이드 완충제로부터 선택되는 완충제와 안정화 금속 이온을 포함하는 폴리펩타이드 입자.
- 제23항에 있어서, 금속 이온 대 폴리펩타이드의 몰비가 약 2/1 내지 약 10/1의 범위인 폴리펩타이드 입자.
- 제18항에 있어서, 아미노산 완충제 및 펩타이드 완충제로부터 선택된 완충제와 계면활성제를 포함하는 폴리펩타이드 입자.
- 제25항에 있어서, 계면활성제가 폴리펩타이드 입자의 약 0.02중량% 내지 약 0.2중량%를 구성하는 폴리펩타이드 입자.
- 제18항에 있어서, 아미노산 완충제 및 펩타이드 완충제로부터 선택된 완충제, 계면활성제, 금속 이온 및 안정화 당을 포함하는 폴리펩타이드 입자.
- 제18항에 있어서, 계면활성제가 나트륨 도데실 설페이트를 포함하는 폴리펩타이드 입자.
- 제25항에 있어서, 계면활성제가 나트륨 도데실 설페이트를 포함하고, 폴리펩타이드 입자의 약 0.02중량% 내지 약 0.2중량%를 구성하는 폴리펩타이드 입자.
- 제18항에 있어서, 폴리펩타이드가 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드이고, 폴리펩타이드 입자가 아미노산 완충제 및 펩타이드 완충제로부터 선택된 완충제, 및 약 0.25/1 내지 약 1/1 범위인 안정화 당 대 폴리펩타이드의 중량/중량 비로 포함된 안정화 당, 및 약 2/1 내지 약 10/1의 범위인 금속 이온 대 폴리펩타이드의 몰비로 포함된 금속 이온으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 안정화제, 및 폴리펩타이드 입자의 약 0.02중량% 내지 약 0.2중량%를 구성하는 계면활성제를 포함하는 폴리펩타이드 입자.
- 산성 조건하에 안정한 폴리펩타이드를 포함하는, 산성 재구성 pH를 나타내도록 제형화된 안정화된 폴리펩타이드 입자.
- 제30항에 있어서, pH 5 이하의 재구성 pH를 나타내도록 제형화된 안정화된 폴리펩타이드 입자.
- 제30항에 있어서, 약 pH 2 내지 pH 4의 재구성 pH를 나타내도록 제형화된 안정화된 폴리펩타이드 입자.
- 제30항에 있어서, 폴리펩타이드가 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩타이드, 성장 호르몬 방출 인자, 혈관활성 장 폴리펩타이드, 펩타이드 히스티딘 메티오닌, 세크레틴 및 글루코스-의존적 인슐린자극성 폴리펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리펩타이드를 포함하는, pH 5 이하의 재구성 pH를 나타내도록 제형화된 안정화된 폴리펩타이드 입자.
- 제30항에 있어서, 폴리펩타이드가 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩타이드, 성장 호르몬 방출 인자, 혈관활성 장 폴리펩타이드, 펩타이드 히스티딘 메티오닌, 세크레틴 및 글루코스-의존적 인슐린자극성 폴리펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리펩타이드를 포함하는, 약 pH 2 내지 pH 4의 재구성 pH를 나타내도록 제형화된 안정화된 폴리펩타이드 입자.
- 제30항에 있어서, 폴리펩타이드가 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드 유사체를 포함하고, 60℃에서 2개월 동안 저장한 후에 90%를 초과하는 초기 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 폴리펩타이드 유사체가 회수되고 2% 미만의 이량체가 형성되도록 제형화된 안정화된 폴리펩타이드 입자.
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