PARTÍCULAS DE POLIPEPTIDO ESTABILIZADO EN ESTADO SÓLIDO
Camoo del Invento La presente invención se dirige a formulaciones de polipéptido en estado sólido, en donde el polipéptido está estabilizado contra la degradación a temperaturas elevadas durante un período de tiempo prolongado. En particular, la presente invención proporciona formulaciones y métodos para preparar partículas de polipéptido en estado sólido, en donde los polipéptidos son estabilizados a través de una o más condiciones de estabilización. Antecedentes del Invento Los dispositivos implantables con la capacidad de suministrar dosis deseadas de un agente activo, tales como un polipéptido, durante períodos de tiempo prolongados, son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,728,396, 5,985,305, 6,113,938, 6,156,331, 6,375,978 y 6,395,292 enseñan dispositivos osmóticos implantables con la capacidad de suministrar una formulación de agente activo estable, tal como una solución o una suspensión, y en un rango deseado durante un período de tiempo prolongado (por ejemplo, un período que fluctúa desde aproximadamente dos semanas hasta varios meses o más). Los sistemas de suministro de fármacos implantables, también incluyen materiales tipo depósito, tales como los que se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,468,961, 6,331,311, y 6,130,200. Normalmente los materiales de depósito secuestran el agente dentro de un material de depósito blodeg radable o bioerosionable, de modo que el agente activo se suministra desde el material de depósito implantado con base en la difusión del agente activo o a través de la degradación o erosión del material de depósito. Los materiales de depósito de ejemplo incluyen sistemas a base de PLGA, los cuales normalmente tienen la capacidad de suministrar el agente activo durante períodos que fluctúan desde aproximadamente dos semanas hasta seis meses. Debido a que pueden ser diseñados para suministrar un agente activo deseado en niveles terapéuticos durante un período de tiempo prolongado, los sistemas de suministro implantables pueden administrar de manera conveniente una dosificación terapéutica a largo plazo de un agente activo deseado, sin requerir de visitas frecuentes al especialista o de una auto-medicación repetida. Sin embargo, el suministro de polipéptidos terapéuticos durante un período de tiempo prolongado utilizando un sistema de suministro de fármaco implantable, presenta diversos desafíos técnicos. En particular, se ha probado el reto de mantener la estabilidad de los polipéptidos terapéuticos cargados en un sistema de suministro implantable diseñado para suministrar el polipéptido durante un período de semanas o meses. Con el objeto de lograr un sistema implantable de tamaño adecuado que proporcione un suministro de dosis terapéuticas de un polipéptido durante un período de tiempo prolongado, generalmente es necesario cargar el sistema con una solución o suspensión que contenga una alta concentración del polipéptido que será administrado. Sin embargo, si dicha solución o suspensión se expone a temperaturas que alcancen o excedan las condiciones fisiológicas (por ejemplo, temperaturas que alcancen o excedan los 37°C) durante un período de tiempo prolongado, el polipéptido contenido en la solución o suspensión se degradará, si el polipéptido no está estabilizado. La degradación de polipéptidos expuestos a temperaturas que se aproximan o exceden de las condiciones fisiológicas, pueden proceder a través de diversas trayectorias y pueden alterar, reducir o destruir la actividad biológica del polipéptido. Por consiguiente, con el objeto de lograr un sistema de suministro implantable con la capacidad de administrar en forma exitosa un polipéptido terapéutico durante un período de tiempo prolongado, el polipéptido cargado en I mismo debe estar estabilizado contra la degradación, de modo que el sistema tenga la capacidad de suministrar dosis terapéuticas del polipéptido biológicamente activo durante la vida funcional del sistema implantable.
Se han utilizado azúcares en formulaciones de polipéptido para estabilizar los polipéptidos que están contenidos en los mismos, contra degradación por el tiempo. En particular, se han utilizado los azúcares en la forma de lioprotectores, que trabajan para inhibir la agregación de polipéptido y reduciendo el desdoblamiento molecular durante el proceso de liofilización. Los azúcares también imparten la estabilidad a largo plazo y limitado la movilidad molecular y minimizando las interacciones moleculares durante y después del proceso de liofilización. Sin embargo, cuando se utiliza un azúcar para estabilizar un polipéptido, con frecuencia es necesario utilizar grandes cantidades con el objeto de lograr un grado de esterilización deseado. Tal como se enseña en la Patente Norteamericana No. 6,267,958 de Andya y Asociados, pueden ser necesarias proporciones tan altas como de 100 a 510 del azúcar de estabilización, con el objeto de lograr un efecto de estabilización aceptable, y las formulaciones de polipéptidos que incluyen dichas grandes cantidades de azúcar de estabilización no están bien adaptadas para cargarse en un sistema de suministro de fármaco implantable. Cuando se necesita una alta concentración de azúcar de estabilización para lograr un grado deseado de estabilización del polipéptido mediante un sistema de suministro, el volumen general de la formulación de polipéptido contenida dentro del sistema incrementará, en tanto que disminuirá la concentración máxima de polipéptido que puede ser cargado en el sistema. Conforme disminuye la concentración del polipéptido en la formulación cargada en un sistema implantable, incrementará la cantidad de formulación de polipéptido requerida para lograr un régimen de dosificación deseado y el tamaño mínimo del sistema implantado. Podría ser una mejoría en la técnica, proporcionar formulaciones y métodos para estabilizar polipéptidos terapéuticos que reduzcan o eliminen juntos la necesidad de un azúcar de estabilización. Podría ser una mejoría adicional en la técnica, que tales formulaciones y métodos tuvieran la capacidad de estabilizar polipéptidos hasta un grado en el cual los polipéptidos puedan ser cargados en un sistema de suministro implantable en una alta concentración, y exhiban aún una estabilidad de actividad terapéutica aceptable después de la exposición a temperaturas hasta, o que exceden las condiciones fisiológicas durante un período de tiempo prolongado. Sumario del Invento La presente invención incluye partículas de polipéptido de estado sólido, en donde el polipéptido contenido dentro de las partículas está estabilizado contra degradación a temperaturas de hasta y que exceden las condiciones fisiológicas. Tal como se utilizan en la presente invención, el término "condiciones fisiológicas" se refiere a ambientes que tienen una temperatura de aproximadamente 37°C, y el término "polipéptido" incluye oligopéptidos y proteínas y comprende cualquier compuesto natural o sintético que contiene dos o más aminoácidos enlazados mediante el grupo carboxilo de un aminoácido al grupo amino de otro. En cada modalidad, las partículas del polipéptido de la presente invención incorporan un material de polipéptido que se estabiliza contra degradación a través de una o más condiciones de estabilización. En particular, las partículas de polipéptido de la presente invención son formuladas para estabilizar el polipéptido contenido en las mismas, controlando una o más de las siguientes condiciones de partícula: pH, contenido de azúcar, contenido de tensoactivo, contenido de regulador y concentración de iones de metal. Debido a que las partículas de péptidos de la presente invención pueden ser formuladas para combinar los efectos aditivos de dos o más condiciones de estabilización, cuando las partículas de polipéptido de la presente invención incluye un azúcar de estabilización, se reduce significativamente la cantidad de azúcar de estabilización necesaria para lograr la estabilidad aceptable del polipéptido. En una modalidad preferida, las partículas de polipéptido de la presente invención se formulan para estabilizar el polipéptido contenido en las mismas, sin el uso de un azúcar de estabilización. La presente invención también incluye soluciones de estabilización acuosas. Con el objeto de formar las partículas de polipéptido de estado sólido de la presente invención, se puede formar una solución de estabilización acuosa de acuerdo con la presente invención, la cual contenga el polipéptido que será estabilizado y someterse a un proceso de formación de partícula adecuado, tal como un proceso de liofilización o secado por rocío. La solución de estabilización acuosa de acuerdo con la presente invención, se formula de modo que al someter la solución de estabilización acuosa a un proceso de formación de partículas, la solución de estabilización acuosa produce las partículas de polipéptido de estado sólido que contienen el material de polipéptido estabilizado a través de una o más condiciones de estabilización. Al controlar el pH, el contenido de azúcar, el contenido de tensoactivo, el contenido de regulador, la concentración de iones de metal o concentración de polipéptidos de una solución de estabilización acuosa de conformidad con la presente invención, se pueden producir partículas de polipéptido de estado sólido que tengan un amplio rango de las características de estabilización deseadas. La presente invención incluye además métodos para producir partículas de polipéptido de estado sólido, estabilizadas. El método de la presente invención incluye disolver el polipéptido que será estabilizado en una solución de estabilización acuosa de la presente invención, y reconstituir el polipéptido en partículas de polipéptido de estado sólido. La formulación de las partículas de péptido de estado sólido producidas a través del método de la presente invención, dependerá de la solución de estabilización acuosa utilizada. En una modalidad, el método de la presente invención incluye disolver un polipéptido que será estabilizado en una solución de estabilización ácida. En otra modalidad, el método de la presente invención incluye disolver un polipéptido que será estabilizado en una solución de estabilización ácida en la presencia de un azúcar de estabilización, un ion de metal o tanto un azúcar de estabilización como un ion de metal. Aún en otra modalidad, el método de la presente invención incluye disolver un polipéptido que será estabilizado en una solución de estabilización regulada, casi neutra en la presencia de un tensoactivo, un azúcar de estabilización, un ion de metal o tanto un azúcar de estabilización como un ion de metal. En cada modalidad del método de la presente invención, el paso de reconstituir las partículas de péptido de estado sólido se puede llevar a cabo sometiendo la solución de estabilización acuosa a un proceso de formación de partículas adecuado, tal como un proceso de liofilización o secado por rocío. Aunque el método de la presente invención puede variarse para lograr que las partículas tengan cualquiera de una variedad de formulaciones, en cada caso el método de la presente invención se diseña a la medida para proporcionar partículas de polipéptido de estado sólido, en donde el polipéptido se estabiliza a través de una o más condiciones de estabilización. Las partículas de polipéptido de estado sólido de la presente invención, proporcionan una excelente estabilización de polipéptidos, permiten la recuperación de hasta el 96 % del péptido estabilizado después de dos meses en un almacenamiento a una temperatura de 60°C. Además, las partículas de polipéptido en estado sólido de la presente invención, se pueden cargar en formulaciones de suspensión en concentraciones relativamente altas (por ejemplo, 25% o más de partículas de polipéptido), lo cual facilita la formulación de suspensiones que tienen concentraciones relativamente más altas del polipéptido estabilizado. Las partículas del polipéptido en estado sólido de la presente invención, facilitan por consiguiente la carga de un sistema de suministro de implante diseñado de manera aceptable con una concentración de polipéptido terapéutico, estabilizado que es lo suficientemente alta para permitir el suministro de dosis terapéuticas del polipéptido terapéutico, estabilizado durante un período de tiempo prolongado.
Breve Descripción de los Dibujos La figura 1, proporciona una gráfica que ilustra la degradación total (RP-HPLC) y Agregación (SEC) de PACAP liofilizado (acetato de amonio, app. pH 64) en un almacenamiento a una temperatura de 40°C durante 3 meses.
La figura 2, proporciona una gráfica que ilustra la estabilidad del PACAP liofilizado almacenado a una temperatura de 4°C, 40°C y 60°C durante tres meses. La figura 3, proporciona una gráfica que ilustra la supresión de la formación de agregado PACAP a una temperatura de 40°C, en donde PACAP se formula en partículas de estado sólido que utilizan varios excipientes. La figura 4, proporciona una gráfica que ilustra la supresión de la formación del agregado PACAP a una temperatura de 60°C, en donde PACAP se formula en partículas de estado sólido utilizando varios excipientes. La figura 5, proporciona una gráfica que ilustra el efecto de estabilización de histidina, succinato, y sacarosa en la degradación total PACAP a una temperatura de 40°C. La figura 6, proporciona una gráfica que ilustra el efecto de estabilización de sacarosa en la supresión de la formación de agregado PACAP en una suspensión BA/PVP a una temperatura de 40°C. La figura 7, proporciona una gráfica que ilustra el efecto de estabilización de sacarosa en la supresión de la formación del agregado PACAP en una suspensión L/GML/PVP a una temperatura de 40°C. La figura 8, proporciona una gráfica que ilustra la degradación total de PACAP en diferentes vehículos de suspensión en un almacenamiento a una temperatura de 40°C durante tres meses. La figura 9, ilustra la degradación total, tal como se determina mediante RP HPLC, y la agregación, tal como se determina mediante SEC, del PACAP contenido dentro de las partículas liofilizadas en un pH visible de 4, un pH visible de 4 y un pH visible de 6 en un almacenamiento a una temperatura de 60°C durante 2 meses. La tabla 1, establece los resultados de un estudio llevado a cabo para evaluar la estabilidad de PACAP disperso en varios vehículos de suspensión, al momento de incubar las suspensiones PACAP a una temperatura de 65°C durante 4 horas. La tabla 2 establece los resultados de un estudio llevado a cabo para evaluar la estabilidad de PACAP incubado a una temperatura de 37°C durante un período de 17 días, en donde el PACAP evaluado fue PACAP liofilizado solo o PACAP disperso dentro de uno de tres diferentes vehículos de suspensión. La tabla 3, establece los resultados de un estudio llevado a cabo para evaluar la estabilidad de PACAP incubado a una temperatura de 60°C durante un período de 17 días, en donde el PACAP evaluado fue PACAP liofilizado solo o PACAP disperso dentro de uno de tres vehículos de suspensión. La tabla 4, proporciona los rangos de degradación y agregación estimados de PACAP, en donde el PACAP se incorpora en partículas de estado sólido que incluyen varios excipientes diferentes, y dichas partículas se incuban a una temperatura de 40°C y 60°C. La tala 5 proporciona los rangos de degradación y agregación estimados del PACAP contenido dentro de las partículas en estado sólido formadas de tres diferentes soluciones preparadas en regulador NH4OAc a un pH de 6, en donde cada una de las tres soluciones contiene una diferente cantidad de sacarosa. La tabla 6 establece los resultados de un estudio llevado a cabo para evaluar la estabilización de PACAP logrado formulando las partículas de PACAP en estado sólido y variando el pH y con uno de tres diferentes azúcares. La tabla 7 establece los resultados de un estudio llevado a cabo para evaluar la estabilización aditiva de PACAP que se logra formulando partículas PACAP en estado sólido en diversos pHs y con uno o más excipientes diferentes. La tabla 8 establece los resultados de un estudio llevado a cabo para evaluar la estabilidad de PACAP lograda formulando las partículas PACAP en estado sólido, en un pH diverso con CaCI2, con histidina y tanto con CaCI2 como histldina. Descripción Detallada del Invento En una primera modalidad, las partículas de polipeptido en estado sólido de la presente invención, incluyen un polipéptido que es estable a un pH ácido y se formulan para exhibir una reconstitución ácida del pH. El pH de la solución de estabilización acuosa antes de la formación de partículas (el "pH visible") controla el pH exhibido por las partículas formadas en forma subsecuente (el "pH de reconstitución") y define el estado de protonacion del polipéptido dentro de las partículas de polipéptido en estado sólido. Para los propósitos de la presente invención, las partículas que exhiben un pH de reconstitución ácido incluyen partículas de polipéptido que exhiben un pH de reconstitución debajo de aproximadamente pH 5, con partículas que exhiben un pH de reconstitución debajo de un pH 4 como el preferido, y partículas que exhiben un pH de reconstitución que fluctúa desde aproximadamente un pH 2 hasta un pH 4 como el particularmente preferido. El control del pH exhibido por las partículas de polipéptido en estado sólido de la presente invención permite el control en el estado de protonacion de polipéptido incluido en las partículas en estado sólido, y se ha descubierto que la formulación de las partículas de polipéptido en estado sólido de la presente invención a un pH ácido, imparten un efecto de estabilización sustancial. Se considera que la formulación de las partículas de polipéptido en estado sólido de la presente invención en un pH ácido, estabiliza el polipéptido debido a que el ambiente ácido favorece la protonación de los grupos amino incluidos en el polipéptido. Con frecuencia los grupos amino incluidos en un polipéptido están involucrados en la formación intermedia de reactivos que está propensos a reacciones ínter- ó intramoleculares las cuales alteran la naturaleza química de polipéptido, y funcionan como una trayectoria significativa de la degradación del polipéptido. Al mantener el polipéptido en un ambiente que favorece la protonación de grupos amino incluidos en el polipéptido, se considera que las partículas de polipéptido de acuerdo con la presente invención limitan la involucración de los grupos amino en la formación de intermediarios reactivos, y como resultado, no evitan la degradación del polipéptido que resulta de las reacciones inter- e intramoleculares. La adición de iones de metal a partículas en estado sólido de acuerdo con la primera modalidad, proporciona una estabilización de polipéptido aditivo. Cuando las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la primera modalidad se formulan para incluir iones de metal, los iones de metal se proporcionan preferentemente a través de metal divalente, tal como CaCI2, MgCI2, ó ZnCI2. La cantidad precisa de iones de metal incluidos en una partícula de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la primera modalidad, dependerá del péptido en particular que será estabilizado, el pH de la partícula, y la presencia o ausencia de un azúcar de estabilización. Sin embargo, cuando una partícula de péptido en estado sólido de acuerdo con la primera modalidad incluye un ion de metal, la partícula se formula generalmente de modo que la proporción molar de ion de metal a polipéptido estabilizado, sea de entre aproximadamente 1/1 y 10/1, con una proporción molar que fluctúa de aproximadamente 2/1 a aproximadamente 6/1 como la preferida, y una proporción molar de aproximadamente 4/1 como la particularmente preferida. La adición de iones de metal a las partículas de polipéptido en estado sólido de la presente invención reducen la cantidad de dimerización de polipéptido con el tiempo, e imparten de este modo una estabilización de polipéptido aditiva. Se considera que los iones de metal trabajan para reducir la dimerización del polipéptido a través de la formación de enlaces iónicos o puentes de sal con las moléculas de polipéptido, en donde los enlaces iónicos o los puentes de sal limitan la oportunidad de interacción entre las moléculas de polipéptido. La adición de un azúcar de estabilización a las partículas de péptido en estado sólido de acuerdo con la primera modalidad, también proporciona una estabilización de péptido aditiva. La inclusión de un azúcar de estabilización imparte estabilización del polipéptido aditiva, limitando la movilidad molecular del polipéptido y reduciendo la interacción molecular entre las moléculas de polipéptido. Sin embargo, debido a que las partículas de polipéptido en estado sólido de la presente invención pueden ser formuladas para estabilizar el polipéptido a través de dos o más condiciones de estabilización aditivas, en donde las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la presente invención se formulan para incluir un azúcar de estabilización, el azúcar se reduce en forma significativa la cantidad de azúcar requerida para lograr un nivel de estabilidad aceptable. En particular, cuando las partículas de polipéptido de estado sólido de acuerdo con la primera modalidad se formulan para incluir un azúcar de estabilización, el azúcar generalmente se incluye en una cantidad que fluctúa desde aproximadamente 0.1/1 p/p hasta aproximadamente 1/1 p/p en forma relativa al polipéptido estabilizado. En modalidades preferidas, las partículas de polipéptido en estado sólido de la presente invención, incluyendo el azúcar de estabilización, incluirán el azúcar de estabilización en cantidades que fluctúan desde aproximadamente 0.1/1 p/p hasta aproximadamente 0.5/1 p/p o desde aproximadamente 0.1/1 p/p hasta aproximadamente 0.25/1 p/p en forma relativa al polipéptido estabilizado. Cuando las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la primera modalidad se formulan para incluir tanto el azúcar de estabilización como los iones de metal, las cantidades de azúcar y iones de metal requeridas para lograr el grado de estabilización del polipéptido deseado pueden ser formulaciones relativas reducidas que incluyen el azúcar de estabilización sin iones de metal o iones de metal sin el azúcar de estabilización. Dicha ventaja potencial se puede lograr debido a los efectos de estabilización aditiva del azúcar, los iones de metal y el pH del ambiente ácido. Aunque los azúcares sin reducción generalmente son útiles como azúcares de estabilización en partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que no todos los azúcares son adecuados para la estabilización de una partícula de péptido de acuerdo con la primera modalidad. En forma específica, se ha descubierto que la sacarosa, un azúcar comúnmente utilizado en la estabilización de polipéptidos, no es adecuada para utilizarse bajo condiciones ácidas. De hecho, cuando la sacarosa se utiliza bajo dichas condiciones, se ha descubierto que se produce un efecto de desestabilización. Se considera que dicho efecto de desestabilización se genera debido a que la sacarosa en sí no es química estable en un ambiente ácido. En particular, la sacarosa pasa por hidrólisis en glucosa y fructosa en un pH ácido. Aunque la trehalosa es una sacarosa similar a un disacárido, la trehalosa es químicamente estable bajo condiciones ácidas y a temperaturas elevadas. El metil-manopiranosida ("metil-MP"), un monosacárido, también es químicamente estable en un ambiente ácido. Además, se ha descubierto que tanto la trehalosa como el metil-MP proporcionan una estabilización de polipéptído aditiva significativa cuando se incluyen en partículas de polipéptído en estado sólido formuladas para exhibir un pH sólido. Por consiguiente, cuando las partículas de polipéptído en estado sólido de acuerdo con la primera modalidad se formulan para incluir un azúcar de estabilización, el azúcar incluido en la formulación debe ser estable bajo condiciones ácidas y es preferentemente estable bajo condiciones ácidas a temperaturas de hasta, y que exceden las condiciones fisiológicas. Las partículas de polipéptído en estado sólido de acuerdo con la primera modalidad, se pueden preparar a partir de una solución de estabilización acuosa. Para preparar una solución de estabilización acuosa adecuada para preparar partículas de polipéptído en estado sólido de acuerdo con la primera modalidad, se disuelve elpolipéptido que será estabilizado en una solución ácida. Se puede lograr una solución de estabilización acuosa ácida a través de la adición de un ácido adecuado, tal como HCI, en una cantidad que proporcione una solución que tenga un pH deseado. El pH de una solución de estabilización acuosa de acuerdo con la presente invención juega un papel crucial en la estabilización del polipéptido contenido dentro de las partículas de polipéptido en estado sólido que se producen utilizando la solución de estabilización acuosa. Con el objeto de lograr las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la primera modalidad (es decir, que tienen un pH de reconstitución ácida) puede ser necesario preparar la solución de estabilización acuosa en un pH visible que es significativamente inferior al pH de reconstitución objetivo. Una solución de estabilización acuosa adecuada para preparar partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la primera modalidad, también puede incluir una sal de metal o un azúcar de estabilización disuelto en la misma. Puede variar la cantidad de sal de metal o azúcar de estabilización disuelto en la solución de estabilización acuosa adecuada para producir partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la primera modalidad. Sin embargo, cuando la solución de estabilización acuosa que será utilizada para preparar partículas de polipéptido en estado sólido que incluyen un azúcar de estabilización, la solución de estabilización acuosa incluirá preferentemente el azúcar de estabilización deseada en una cantidad que fluctúa desde aproximadamente 0.1/1 p/p hasta aproximadamente 1/1 p/p en forma relativa al polipéptido que será estabilizado. Además, cuando la solución de estabilización acuosa será utilizada para preparar partículas de polipéptido en estado sólido que incluyen un ion de metal, la solución de estabilización acuosa se prepara preferentemente para incluir el ion de metal deseado en una proporción molar de ion de metal a polipéptido que fluctúa desde aproximadamente 1/1 hasta aproximadamente 10/1. Con el objeto de formar partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la primera modalidad a partir de una solución de estabilización acuosa acida, la solución de estabilización se somete a un proceso de formación de partículas conocido. Por ejemplo, una solución de estabilización acuosa de acuerdo con la presente invención puede ser procesada utilizando un proceso de liofilización o secado por rocío para regular las partículas de péptido en estado sólido. En una modalidad específica, las partículas de polipéptido de acuerdo con la presente invención se preparan a partir de una solución de estabilización acuosa de acuerdo con la presente invención utilizando un ciclo de liofilización que incluye congelar la solución de estabilización a una temperatura de 4°C durante 30 minutos y a una temperatura de -50°C durante 3 horas (con un rango de enfriamiento de 2.5°C/min). Después de la congelación de la solución de estabilización acuosa tal como se describe, se lleva a cabo un ciclo de secado primario a una presión de cámara de 50 mT a una temperatura de -30°C durante 10 minutos, y posteriormente una temperatura de 0°C durante 10 horas. El ciclo de secado primario está seguido de un ciclo de secado secundario a una presión de cámara de 200 mT a una temperatura de 0°C durante 3 horas y posteriormente una temperatura de 20°C durante 12 horas, y a una temperatura de 30°C durante 6 horas, con todos los niveles de temperatura elevados a 0.5°C/min. Sin embargo, la presente invención no se limita a partículas de polipéptido e estado sólido producidas mediante el proceso de liofilización preciso descrito en la presente invención. En la técnica de la formación de partículas de proteína se conocen diversos procesos de liofilización y secado por rocío adecuados, se pueden aplicar para proporcionar partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la presente invención. En una segunda modalidad, las partículas de polipéptido en estado sólido de la presente invención se formulan para exhibir un pH de reconstitución casi neutro. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "casi neutral" se refiere a un pH que fluctúa de pH 5 a aproximadamente pH 8. Preferentemente, las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad se formulan para exhibir un pH de reconstitución de entre aproximadamente pH 5 y pH 7. Las partículas de polipéptido de acuerdo con la segunda modalidad de la presente invención incluyen un regulador, e incluyen además un tensoactivo, un azúcar de estabilización, un ion de metal o tanto un azúcar de estabilización como un ion de metal. Se ha descubierto que la formulación de las partículas de polipéptido en estado sólido exhiben un pH de reconstitución casi neutro e incluyen excipientes de regulación que estabilizan en forma significativa el material de polipéptido incluido en las partículas de estado sólido. Se considera que en un pH casi neutro un regulador puede servir para estabilizar el polipéptido incluido en las partículas en estado sólido a través de un efecto de contra ion. En particular, se considera que el material de regulación puede interactuar con o enlazar a uno o más sitios incluidos en el polipéptido que exhiben una tendencia a reaccionar en forma ínter- ó intermolecular, de tal forma que tales sitios ya no están disponibles para reaccionar. Los reguladores adecuados para utilizarse en la formulación de partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad, son aquellos que regulan en un pH casi neutro. Los ejemplos específicos de reguladores que se pueden utilizar en las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad, incluyen reguladores de aminoácido o péptido, tales como regulador de histidina (His-6) o regulador de ácido de histidina-glutámico (His-Glu), y reguladores inorgánicos, tales como reguladores de succinato y citrato. Las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad, se formulan generalmente con hasta aproximadamente el 20% en peso de regulador, con partículas de polipéptido que incluyen hasta el 15% en peso de regulador como el porcentaje preferido. Sin embargo, la cantidad precisa de regulador incluido en las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad, puede variar de acuerdo con la cantidad y tipo de polipéptido incluido en las partículas. Además, también se puede ajustar la cantidad y tipo de regulador utilizado para formular las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad, con el objeto de lograr partículas de polipéptido en estado sólido que exhiban un pH de reconstitución deseado. Al formular partículas en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad, que incluyen un azúcar de estabilización, un ion de metal o tanto un azúcar de estabilización como un ion de metal, la estabilización del polipéptido incluido en las partículas se incrementa más de lo que se puede lograr formulando simplemente el polipéptido en un ambiente casi neutro en la presencia de un regulador.
Cuando las partículas de polipéptido en estado sólido se formulan de acuerdo con la segunda modalidad e incluyen un azúcar de estabilización, un ion de metal o tanto un azúcar de estabilización como un ion de metal, la cantidad de azúcar y ion de metal incluida en las partículas cae preferentemente dentro de los rangos detallados con relación a las partículas de péptido en estado sólido de la primera modalidad. En particular, si las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad se formulan para incluir un azúcar de estabilización, la cantidad de azúcar de estabilización incluida en las partículas fluctúa preferentemente desde aproximadamente 0.1/1 p/p hasta aproximadamente 1/1 p/p en forma relativa al polipéptido que será estabilizado. Nuevamente, los azúcares de reducción son generalmente útiles como azúcares de estabilización en partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la presente invención, aunque debido a que se formulan a un pH casi neutro, las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad, pueden incorporar sin embargo, azúcares de estabilización tales como sacarosa los cuales no son estables en un ambiente ácido. Además, sí las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad se formulan para incluir un ion de metal, las partículas se formulan preferentemente para incluir el ion de metal deseado en una proporción molar de ion de metal a polipéptido que fluctúa desde aproximadamente 1/1 hasta aproximadamente 10/1. Cuando las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad se formulan para incluir tanto un azúcar de estabilización como iones de metal, las cantidades de azúcar y iones de metal requeridas para lograr un grado de estabilización de polipéptido deseado, pueden reducirse en forma relativa a las formulaciones que incluyen un azúcar de estabilización sin iones de metal o iones de metal sin azúcar de estabilización. Se puede lograr dicha ventaja potencial debido a los efectos de estabilización aditivos del azúcar, los iones de metal, y las condiciones del regulador a un pH casi neutro. En donde las partículas de péptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad, se formulan para incluir un tensoactivo, el tensoactivo utilizado es preferentemente un tensoactivo aniónico, tal como sulfato dodecilo de sodio (SDS). La cantidad de tensoactivo incluida en las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad, pueden variar de acuerdo con la cantidad y tipo de polipéptido que será estabilizado, así como la naturaleza y cantidad de otros excipientes incluidos en las partículas. Sin embargo, cuando las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad se formulan a partir de una solución de estabilización acuosa que contiene el tensoactivo deseado en una cantidad que fluctúa desde aproximadamente 0.02% en peso hasta aproximadamente 0.2% en peso. Las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad se pueden preparar a partir de una solución de estabilización acuosa. Para preparar una solución de estabilización acuosa adecuada para preparar las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad, el polipéptido que será estabilizado se disuelve en una solución que exhibe un pH visible casi neutro e incluye un tensoactivo, una sal de metal, un azúcar de estabilización o tanto una sal de metal como un azúcar de estabilización, según se desee. Se puede lograr una solución de estabilización casi neutra a través de la adición de un regulador adecuado, tal como aquellos reguladores ya mencionados, en una cantidad que proporcione una solución que tenga un pH visible deseado. Como es con las soluciones de estabilización acuosas utilizadas para preparar las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la primera modalidad, el pH visible de una solución de estabilización acuosa utilizada para crear partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad, controla el pH de reconstitución de las partículas de polipéptido en estado sólido producidas utilizando la solución de estabilización acuosa. Por consiguiente, la cantidad y tipo de regulador utilizado en una solución de estabilización acuosa para producir partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad, se pueden variar con el objeto de lograr un pH visible deseado y un pH de reconstitución deseado. Además, con el objeto de lograr partículas de polipéptido en estado sólido que estén caracterizadas por un contenido de regulador dentro de los rangos descritos en la presente invención, la cantidad de regulador incluida en la solución de estabilización acuosa variará dependiendo, entre otros factores, del tipo de regulador utilizado, la cantidad precisa de regulador deseada en las partículas en estado sólido, y la naturaleza y cantidades del polipéptido y de otros excipientes que serán incluidos en las partículas en estado sólido. Por ejemplo, en los ejemplos que se detallan más adelante, las soluciones de estabilización caracterizadas por una concentración de regulador de histidina 10mM proporcionaron partículas de polipéptido en estado sólido que contienen 14% en peso de material regulador. La cantidad de sal de metal o azúcar de estabilización disuelta en una solución de estabilización acuosa adecuada para producir partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad, también pueden variar dependiendo de la cantidad y naturaleza del polipéptido que será estabilizado, así como la naturaleza de la sal de metal o azúcar de estabilización. Sin embargo, cuando una solución de estabilización acuosa para preparar las partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad incluyen un azúcar de estabilización, la solución de estabilización acuosa incluirá preferentemente el azúcar de estabilización deseada en una cantidad que cae dentro de los rangos ya descritos (es decir desde aproximadamente 0.1/1 p/p hasta aproximadamente 1/1 p/p con relación al polipéptido que será estabilizado, con los rangos de desde aproximadamente 0.1/1 p/p hasta aproximadamente 0.5/1 p/p y desde aproximadamente 0.1/1 p/p y 0.25/1 p/p como los preferidos). Además, cuando una solución de estabilización acuosa para la preparación de partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad, incluye un ¡on de metal, la solución de estabilización acuosa se prepara preferentemente para incluir el ion de metal deseado en una proporción molar de ion de metal a polipéptido que cae dentro de los rangos ya descritos (es decir, una proporción molar de ion de metal a polipéptido que fluctúa de aproximadamente 1/1 a aproximadamente 10/1, siendo preferido el rango desde aproximadamente 2/1 hasta aproximadamente 6/1, y siendo particularmente preferida la proporción molar de aproximadamente 4/1. Con el objeto de formar partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad a partir de una solución de estabilización acuosa casi neutra, la solución de estabilización casi neutra se somete a un proceso de formación de partículas conocido. Tal como se describe con relación a la formación de partículas de acuerdo con la primera modalidad, las partículas sólidas de acuerdo con la segunda modalidad pueden formarse a partir de una solución de estabilización acuosa formulada de manera adecuada, utilizando un proceso de liof i lización o secado por rocío. Por ejemplo, el proceso de liofilización aquí descrito es adecuado para proporcionar partículas de polipéptido en estado sólido de acuerdo con la segunda modalidad a partir de una solución de estabilización acuosa. Sin embargo, nuevamente la presente invención no se limita al uso del proceso de liofilización en particular detallado. La formación de partículas a través de procesos de liofilización y secado por rocío es bien conocido en la técnica, y se puede aplicar cualquier proceso de liofilización o secado por rocío adecuado a las soluciones de estabilización acuosa de la presente invención, para proporcionar partículas de polipéptido de estado sólido de acuerdo con la presente invención. Las partículas de polipéptido en estado sólido, las soluciones de estabilización acuosa y los métodos de la presente invención están particularmente bien adaptados a la estabilización de los péptidos que pertenecen a la superfamilia de péptidos que incluyen Polipéptido de Ciclasa de Adenilato de Pituitaria ("PACAP") y glucagon. En humanos, ia superfamilia de péptidos PACAP/glucagon incluye al menos nueve diferentes tipos de péptidos bioactivos: PACAP-27; PACAP-38; glucagon; péptidos en forma de glucagon, tales como GLP-1 y GLP-2; factor de liberación de hormona de crecimiento ("GRF"); polipéptido intestinal vasoactivo ("VIP"); metionina de histidina de péptido ("PHM"); secretina; y polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa ("GIP"). Ocho de estos nueve diferentes tipos de péptidos bioactivos, se encuentran en el cerebro y se clasifican como neuropéptidos. Además muchos miembros de la superfamilia PACAP/glucagon se encuentran en los órganos gastrointestinales, pancreáticos y gonadales (Ver, The origin and function of the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP)/glucagon superfamily, Edocrine Reviews, 21 (6):619-670). Los péptidos incluidos en la superfamilia PACAP/glucagon están relacionados a la estructura por sus aminoácidos de termina-N, y los genes y moléculas precursoras utilizadas en la producción celular de diversos péptidos diferentes incluidos en la superfamilia PACAP/glucagon son similares en estructura. Es de particular interés un análogo agonista PACAP-R3 sintético ("el análogo PACAP") fabricado por Bayer Corporation ("Bayer"). Este péptido sintético se define por la siguiente secuencia de 31 aminoácidos: HSDAVFTDNY TRLRKQVAAK KYLQSIKNKR Y. Bayer construyó el análogo PACAP para potencia y selectividad para el receptor R3 en el páncreas. Para mejorar la estabilidad del análogo PACAP, la metionina original en la posición 17 se reemplazó con una valina y la asparagina localizada originalmente en la posición 24, se reemplazó con una glutamina. El análogo PACAP es útil para tratar diabetes tipo II, y podría ser recomendable suministrar el análogo PACAP a partir de un sistema de suministro de fármaco implantable con la capacidad de suministrar el análogo PACAP a un sujeto (humano) en dosis terapéuticas durante un período de al menos tres meses, y preferentemente al menos seis meses. Sin embargo, si se mantiene en un estado sólido o se disuelve en soluciones de solvente orgánico o acuosas, el análogo PACAP no protegido es inestable a temperaturas que alcanzan o exceden condiciones fisiológicas. Por consiguiente, con el objeto de cargar el análogo PACAP en una suspensión adecuada para suministro a partir de sistemas de suministro de liberación prolongada, implantables, las partículas análogas PACAP en estado sólido debe ser estabilizadas contra la degradación que de otra forma podría resultar de la exposición prolongada a temperaturas que se aproximan o exceden las condiciones fisiológicas. Ya que el análogo PACAP en estado sólido se expone a temperaturas que se aproximan o exceden las condiciones fisiológicas, la fuente de degradación más significativa ha sido determinada como una formación de agregado. En particular, al utilizar el análogo PACAP liofilizado, se determinó que los productos de degradación mayores para el análogo PACAP liofilizado, no protegido, son dímeros covalentes, aducios PACAP-OAc y dímero-OAc. Actualmente se considera que la degradación del análogo PACAP en dichos productos agregados procede a través de la formación de imidas cíclicas intramoleculares reactivas seguido del ataque nucleofílico a través de iones de acetato, a través de otra molécula del análogo PACAP, o a través de ambos. Probablemente los sitios de modificación para estas trayectorias de degradación propuestas están en los aminoácidos Asp3Ala4 y Gln24Ser25 de la molécula análoga PACAP. También se ha determinado en forma adicional que la disociación de enlace de péptido de terminal-N también ocurre para degradar el análogo PACAP no protegido, de estado sólido. Esta proteólisis se encontró predominantemente con un pH 4 y ocurre presumiblemente a través del cierre de anillo intramolecular auxiliado de la cadena lateral de carboxilo Asp3. Sin embargo, tal como se detalla en los ejemplos que se encuentran a continuación, diversas de las modalidades de las partículas de polipéptido en estado sólido de la presente invención son efectivas para estabilizar el análogo PACAP contra la degradación, incluso cuando las partículas se mantienen a temperaturas de 40°C y 60°C durante un período de meses. Aunque diversas modalidades diferentes del método de las partículas de polipéptido en estado sólido de la presente invención, proporcionan una estabilización efectiva del análogo PACAP, tres modalidades proporcionan una estabilización superior. En una modalidad, las partículas análogas PACAP en estado sólido son liofilizadas a partir de una solución de estabilización que exhibe un pH visible de 2. El solvente para la solución de estabilización se forma utilizando H20 que tenga un pH ajustado al valor deseado utilizando HCI diluido. Las partículas análogas PACAP en estado sólido de acuerdo con esta modalidad, permiten el 92% de la recuperación del análogo PACAP inicial y permiten únicamente el 1.1% de la formación de dímero después de dos meses de almacenamiento a una temperatura de 60°C. La figura 9 presenta los resultados de estabilidad de dos meses, los cuales demuestran la estabilidad altamente mejorada de las partículas PACAP en estado sólido preparadas a partir de una solución de estabilización que tiene un pH visible de 2. En una segunda modalidad, las partículas de polipéptido en estado sólido se formulan en un pH ácido e incluyen trehalosa y análogo PACAP en una proporción de 0.55/1 p/p (trehalosa/análogo PACAP). Estas partículas permiten el 96% de recuperación del análogo PACAP inicial y permiten únicamente el 0.7% de formación de dímero, incluso después de dos meses de almacenamiento a una temperatura de 60°C. Para formar las partículas análogas PACAP en estado sólido caracterizadas por un pH ácido e incluyendo trehalosa y el análogo PACAP en una proporción de 0.55/1 p/p, se puede utilizar una solución de estabilización acuosa ácida. El pH de dicha solución (el pH visible) se ajusta preferentemente a un pH de aproximadamente 2 y la trehalosa y el análogo PACAP se disuelven en la solución a una proporción deseada de 0.55/1 p/p. La solución preparada puede someterse posteriormente a un proceso de liofilización o secado por rocío, para proporcionar las partículas del análogo PACAP en estado sólido deseadas. En una tercera modalidad, las partículas de polipéptido en estado sólido se formulan nuevamente en un pH ácido e incluyen el análogo PACAP y los iones Ca2+ e una proporción molar 4/1 (Ca2+/análogo PACAP). Después de dos meses de almacenamiento a una temperatura de 60°C, las partículas formadas de acuerdo con esta formulación proporcionan el 95% de recuperación del análogo PACAP inicial y permiten únicamente el 0.8% de formación de dímeros. Para formular las partículas de análogo PACAP en estado sólido caracterizadas por un pH ácido y que incluyen Ca2+ y el análogo PACAP en una proporción molar de 4/1, se puede preparar una solución de estabilización acuosa ácida. Nuevamente, dicha solución puede prepararse utilizando un ácido adecuado, tal como HCI diluido, y el pH de la solución se ajusta preferentemente a un pH aproximadamente de 2. La cantidad apropiada de iones Ca2+ y análogo PACAP, se puede proporcionar en una solución disolviendo cantidades de CaCI2 y PACAP que den como resultado una solución que tenga una proporción molar de Ca2+ al análogo PACAP de 4/1. Posteriormente la solución de estabilización preparada puede someterse a un proceso de liofilización o secado por rocío para proporcionar las partículas de análogo PACAP en estado sólido deseadas. Aunque la estabilidad del análogo PACAP contenido dentro de las partículas descritas en la presente invención ha sido evaluada durante un período máximo de dos meses a una temperatura máxima de 60°C, los descubrimientos proporcionados por dichas evaluaciones y una comparación de cinéticas de degradación a una temperatura de 40°C, indican que el método de la presente invención es adecuado para proporcionar del análogo PACAP en estado sólido que son estabilizadas contra degradación durante más de dos meses a temperaturas que se aproximan a la temperatura fisiológica (por ejemplo, 40°C). Específicamente, se ha descubierto que el rango total de degradación del análogo PACAP contenido dentro de las partículas es aproximadamente cinco veces mayor a una temperatura de 60°C que a 40°C. Además, el rango de agregación o dimerización dentro de las partículas PACAP en estado sólido producidas de acuerdo con la presente invención, es 10 veces mayor a una temperatura de 60°C que a 40°C. Por consiguiente, cuando las partículas del análogo PACAP en estado sólido producidas por el método de la presente invención se mantienen a una temperatura aproximadamente de 37°C, se anticipa que el análogo PACAP contenido dentro de las partículas demostrará una estabilidad aceptable durante hasta seis meses y probablemente más tiempo. Aunque los ejemplos que siguen se dirigen a la estabilización del análogo PACAP, la presente invención no está limitada. Por ejemplo, el método de la presente invención se puede utilizar para proporcionar partículas en estado sólido estabilizadas de otros miembros de la superfamilia PACAP/glucagon, particularmente aquellos miembros de la familia, tales como VIP humano y factor de liberación de hormona de crecimiento humano, las cuales tienen secuencias de aminoácidos substancialmente homologas. Sin embargo, el método de la presente invención tampoco se limita a una estabilización de miembros de la superfamilia PACAP/glucagon. Las partículas de polipéptido en estado sólido, las soluciones de estabilización acuosa y los métodos de la presente invención pueden ser útiles para estabilizar cualesquiera polipéptidos que exhiban degradación debido a proteólisis o formación de agregado o que tengan estructuras primarias propensas a trayectorias de degradación, tales como las que se observan para PACAP. EJEMPLO 1 Debido a la naturaleza de los vehículos de suspensión utilizados en sistemas de suministro de fármacos implantables, el mezclado del volumen de la formulación de suspensión y la carga subsecuente de la formulación de suspensión en los sistemas implantables, con frecuencia conducen a temperaturas elevadas. Para evaluar la estabilidad del análogo PACAP (o simplemente "PACAP") suspendido en diversos vehículos de suspensión a temperaturas elevadas, se suspendió el PACAP liofilizado no protegido en cuatro diferentes vehículos de suspensión (LL/GML/PVP, BA/PP, EHL/PVP, y PEG/PVP). Para suspender el PACAP en los vehículos de suspensión se mezclaron manualmente 3.3 mg de acetato de PACAP en cada una de las diferentes suspensiones para lograr un contenido de PACAP de aproximadamente 3%. La estabilidad de las formulaciones de la suspensión PACAP se evaluó posteriormente después de la incubación a una temperatura de 65°C durante 4 horas. La estabilidad de las suspensiones PACAP preparadas se evaluó mediante RP-HPLC y SEC, y tal como se puede apreciar con referencia a la tabla 1, los resultados mostraron que el PACAP fue estable a lo largo de un período de incubación de 4 horas, y por consiguiente, debe sobrevivir las condiciones de temperatura normalmente asociadas con los procesos de fabricación de formulación de suspensión. Posteriormente las suspensiones PACAP se incubaron a una temperatura de 37°C y 65°C durante 17 días adicionales. Después del período de incubación de 17 días adicionales, se observó una pérdida de estabilidad marginal en las suspensiones incubadas a una temperatura de 37°C (tabla 2), aunque se observó una degradación relativamente más agresiva en las suspensiones incubadas a una temperatura de 65°C (tabla 3). Los resultados revelaron una agregación enlazada en forma covaiente como la principal trayectoria de degradación en las suspensiones PACAP evaluadas. El hecho de que la degradación ocurriera con y sin la presencia de vehículo, sugiere que el vehículo de la suspensión no fue el responsable de la auto-asociación resultante. Además otra degradación química contribuyó a la pérdida de PACAP liofilizado. EJEMPLO 2 Los descubrimientos preliminares a partir de estudio de procesamiento condujeron a la evaluación del efecto de estabilización del azúcar (sacarosa) y tensoactivo no iónico (Tween 80) sobre liofilos y suspensiones PACAP. Con el objeto de llevar a cabo la evaluación, se prepararon muestras con PACAP en NH4OAc 10 mM (pH 6.4) en tres niveles de Tween 80 (0, 0.5, 0.2% en peso) y sacarosa (0, 0.5/1, 1/1, p/p). También se preparó una solución de PACAP en 10 mM de histidina (pH 6.4) y succinato de sodio (pH 5.6). Cada una de las soluciones PACAP se liofilizaron para obtener partículas PACAP en estado sólido reconstituidas y se proporcionaron frascos individuales con muestras de 3.3 mg del material reconstituido a partir de cada una de las soluciones, con las muestras que contienen (1) no aditivo, (2) 0.2% en peso de Tween 80, (3) 0.2% en peso de Tween 80 + 0.5:1, p/p de sacarosa, y (4) 1:1, p/p de sacarosa. Las diversas muestras de 3.3 mg se mezclaron en forma manual con LL/GML/PVP y BA/PVP para proporcionar formulaciones de suspensión que tienen un contenido PACAP de aproximadamente el 3 %, y las formulaciones de suspensión se sometieron a 4 horas de incubación a una temperatura de
65°C. Después del período de incubación inicial, se almacenaron las diversas formulaciones de suspensión tal como se describirá más adelante y se evaluaron mediante RP-HPLC y SEC. Temperatura/Tiempo I 0 I 24 días I 3 meses de Almacenamiento 2-8°C 40°C 60°C La figura 1 muestra que la sacarosa suprimió la agregación PACAP aunque la presencia de Tween 80 no tuvo efecto. La estabilidad general, evaluada mediante el porcentaje de PACAP restante, también incrementó de manera correspondiente. El grado de agregación PACAP demostró ser una función de la temperatura de almacenamiento (figura 2). El PACAP liofilizado sin un estabilizador fue estable durante al menos 3 meses a una temperatura de 4°C y se agregó substancialmente más rápido a una temperatura de 60°C en comparación con una temperatura de 40°C. Este estudio demostró que la sacarosa estabilizó el PACAP liofilizado tanto a temperaturas fisiológicas (40°C) como aceleradas (60°C). Las figuras 3 y 4 muestran un incremento lineal de la formación de agregado PACAP durante 3 meses a una temperatura de 40 y 60°C, respectivamente, para las formulaciones liofilizadas preparadas con diversos excipientes diferentes. La histidina y el succinato de sodio probaron ser mejores estabilizadores que el acetato de amonio. Excepto en las muestras que contienen 1:1 p/p de sacarosa, el rango de agregación a una temperatura de 60°C fue de aproximadamente 10 veces más rápido que el que se observó a una temperatura de 40°C, y el rango de degradación total fue de aproximadamente 5 veces más rápido a una temperatura de 60°C que lo que se observada a una temperatura de 40°C (tabla 4). Estos resultados indican que el alto contenido de sacarosa incrementó la estabilidad térmica disminuyendo la movilidad molecular general y la interacción de proteína-proteína. La degradación total, por otra parte, siguió una relación menos lineal durante un período de tiempo de 3 meses (figura 5). Este experimento demostró que el PACAP liofilizado (preparado a un pH visible de 6.4 en acetato de amonio) que contiene una cantidad igual de sacarosa (p/p) dio como resultado la mejor estabilidad (aunque no estable), con un estimado del 8.4% de la gradación total en 6 meses a una temperatura de 40°C. Además, este experimento mostró que la sacarosa suprimió la formación de agregado de las suspensiones PACAP en BA/PP y LL/GML/PVP (figuras 6 y 7) en forma similar a las formulaciones PACAP liofilizadas solas. El efecto de estabilización de la sacarosa con respecto a la formación de agregado pareció ser reducida en la suspensión BA/PVP. También se necesitó una mayor cantidad de sacarosa para una estabilidad similar a largo plazo de PACAP en BA/PVP (figura 8). Con el objeto de caracterizar los productos de degradación y elucidar las trayectorias de degradación, la muestra de estabilidad reconstituida (PACAP liofilizado almacenado a una temperatura de 60°C durante 24 días) fue analizado mediante espectrometría de masa de electro-rocío de tiempo de vuelo y los productos de degradación se identificaron utilizando un proceso RP-HPLC. Se asignó un peso molecular (MW) de 3743 amu al PACAP intacto. Con base en el análisis RP-HPLC, los productos de degradación principales fueron identificados como aductos de dímero covalente y dímero-OAc. En forma significativa, una agrupación de picos, los cuales se eluyen después del pico principal pero antes de la elución de los picos de dímero, todos tienen una masa que es igual a la del aducto PACAP-OAc (es decir, 3785 amu,). Los resultados combinados del RP-HPLC y los análisis de espectrometría de masa de electro-rocío de tiempo de vuelo sugieren que ambas degradaciones fueron los mismos intermediarios reactivos. Con base en este análisis, el mecanismo de degradación potencial se puede postular como se indica a continuación: Esquema 1: Mecanismo Hi potetizado.
Formación de imída L- Racemización espontánea Adiciones cíclica (¡mida D-cíclica) nucleofílicas (aductos PACAP- OAc + dímeros)
Se puede hipotetizar que la degradación procede de u n mecanismo de dos pasos mediante la formación de intermediarios de amida cíclica limitados al rango seguido de una adición nucleofílica de un ion de acetato, otra molécula PACAP o ambos. Ya que el contenido de agua fue inferior para todas noches (<1%), la desaminación como resultado la adición de nucleofílica del agua no fue predominante. EJEMPLO 3 Se prepararon partículas PACAP en estado sólido a través de un proceso de liofílización (detención FTS Duro) a partir de tres diferentes soluciones de polipéptido preparadas en regulador NH40Ac a un pH de 6. Cada una de las tres diferentes soluciones contenían una cantidad diferente de sacarosa, e donde la primera no tuvo contenido de sacarosa, la segunda contenía una proporción en peso de sacarosa A PACAP de 0.5/1, y la tercera contenía una proporción de peso sacarosa a PACAP 1/1. Las partículas PACAP en estado sólido preparadas a partir de cada una de las tres soluciones se almacenaron a una temperatura de control que fluctúa de 2°C a 8°C, una temperatura que se aproxima a la temperatura fisiológica (40°C) y una temperatura que excede la temperatura fisiológica (60°C). La estabilidad del PACAP contenido dentro de cada grupo de partículas PACAP en estado sólido, fue evaluada a los 24 días y a los 3 meses. Para evaluar la estabilidad PACAP dentro de cada grupo de partículas, las partículas fueron reconstituidas en agua y analizadas mediante RT-HPLC de fase inversa (elución de gradiente de acetonitrilo con una fase móvil que contiene 0.1% de ácido trifluoroacético y una detección UV a 214 nm) y un HPLC de exclusión por tamaño (SEC, elución ¡socrática, 30% de acetonitrilo mezclado con 70% de una solución acuosa que contiene 0.1% de ácido trifluoroacético y 200 mM de cloruro de sodio, y una detección UV a 220 nm). Se descubrió el rango de agregación (evaluado mediante SEC) como 10 veces mayor a una temperatura de 60°C y a 40°C en todas las formulaciones probadas (tabla 7). Excepto en partículas PACAP en estado sólido preparadas con una proporción de peso de PACAP a sacarosa de 1/1, el rango de degradación total (evaluado mediante RP HPLC) observado en las diversas partículas PACAP en estado sólido, fue aproximadamente 5 veces más rápido a una temperatura de 60°C que a 40°C. EJEMPLO 4 Se evaluó el efecto del pH en la estabilidad de las moléculas PACAP con el tiempo. Con el objeto de llevar a cabo dicha evaluación, se disolvió primero el material crudo PACAP en H20 en tres diferentes soluciones, teniendo la primera solución un pH de 2, teniendo la segunda solución un pH de 4, y teniendo la tercera solución un pH de 6. El pH de cada solución se ajustó al valor deseado utilizando HCI diluido. Cada una de las tres soluciones se colocó en frascos de liofilización, y se produjeron partículas PACAP en estado sólido de cada una de las dos soluciones a través del proceso de liofilización descrito anteriormente. Las partículas de cada una de las tres soluciones, se almacenaron posteriormente durante dos meses a una temperatura de 60°C y la estabilidad del PACAP incluido en las partículas en estado sólido se evaluó posteriormente utilizando RP-HPLC y SEC. La figura 9 presenta los resultados de estabilidad en dos meses, los cuales demuestra la estabilidad altamente mejorada de las partículas PACAP en estado sólido preparadas en un pH ácido. EJEMPLO 5 Se evaluó la estabilidad de PACAP incluida en las partículas PACAP en estado sólido preparadas en diversos pHs con una cantidad de azúcar de estabilización. En cada caso las partículas PACAP en estado sólido consistieron de un equivalente molar de 7.3 de uno de tres diferentes azúcares: sacarosa; trehalosa y metil-manopiranosida (todos de Sigma). Las partículas PACAP en estado sólido evaluadas, se prepararon a partir de ocho diferentes soluciones acuosas. Las primeras dos soluciones acuosas se prepararon disolviendo el PACAP en una primera solución que tiene un pH ajustado a 2 y una segunda solución que tiene un pH ajustado a 6 (como anteriormente el pH de las diversas soluciones descritas en este ejemplo se ajustó utilizando HCI diluido). La tercera y cuarta soluciones acuosas se prepararon disolviendo tanto PACAP como metil-MP e una solución que tiene un pH ajustado a 2 en una solución que tiene un pH ajustado a 6. La quinta y sexta soluciones de agua se prepararon disolviendo tanto PACAP como trehalosa en una solución que tiene un pH ajustado a 2 en una solución que tiene un pH ajustado a 6. Y la séptima y octava soluciones acuosas se prepararon disolviendo tanto PACAP como sacarosa en una solución que tiene un pH ajustado a 2 en una solución que tiene un pH ajustado a 6. Se prepararon partículas PACAP en estado sólido a partir de cada una de las ocho soluciones a través de liofilización, tal como ya se describió, y partículas PACAP en estado sólido producidas a partir de cada una de las ocho soluciones se almacenaron posteriormente a una temperatura de 60°C durante dos meses. Después de exponer las diversas partículas PACAP en estado sólido a una temperatura de 60°C durante dos meses, se evaluó la estabilidad del PACAP incluido en las diversas partículas utilizando procesos RT PLC y SEC. Los análisis HPLC indicaron que los tres azúcares investigados mostraron una estabilidad mejorada cuando se incluyeron en las partículas PACAP preparadas a un pH de 6. En particular, en el pH de 6, la sacarosa proporcionó una mejoría rigurosa de seis veces en la prevención de formación de agregados y la trehalosa proporcionó una mejoría rigurosa de 4 veces en la misma medida. Además, tanto la trehalosa como el MP de metilo proporcionaron estabilidad aditiva al PACAP incluido en las partículas preparadas a un pH de 2 (tabla 6) relativo a las partículas de PACAP preparadas en un pH de 2, sin la adición de un azúcar de estabilización. Sin embargo, cuando se incluyeron en las partículas PACAP preparadas a un pH de 2, la sacarosa exhibió un efecto de desestabilización significativo. El efecto de desestabilización de la sacarosa para el PACAP preparado en un pH de 2, se consideró como un resultado de la descomposición de sacarosa durante el proceso de producir las partículas PACAP a partir de una solución que tiene un pH ácido. EJEMPLO 6 Las partículas PACAP que contienen un regulador de histidina (Sigma) y las partículas PACAP que contienen un regulador de histidina en combinación con cloruro de calcio (CaCI2, JT Baker), sacarosa y sulfato dodecilo de sodio (SDS, Pierce) se prepararon y se evaluó la estabilización de PACAP proporcionada por dichas partículas. Para preparar las partículas PACAP evaluadas, se prepararon seis diferentes soluciones acuosas. Cada solución incluía una cantidad deseada de PACAP disuelta en la misma, y el pH de cada una de las seis soluciones preparadas ajustó a 6 a través de la adición de HCI diluido. La primera solución acuosa se preparó sin aditivos (regulador de histidina, CaCI2, sacarosa, ó SDS). La segunda solución acuosa se preparó con una concentración de regulador de histidina de 10 mM. La tercera solución acuosa se formuló con una concentración de regulador de histidina de 10 mM así como una concentración de CaCI2 de 10 mM. La cuarta solución acuosa se formuló con una concentración de regulador de histidina de 10 mM y se incluyó sacarosa en una proporción de peso de 0.5/1 (sacarosa/PACAP) relativo al PACAP. La quinta solución acuosa se preparó con una concentración de regulador de histidina de 10 mM, una concentración de CaCI2 desde 10 mM, y una cantidad de sacarosa que proporciona una proporción de peso de 0.5/1 (sacarosa/PACAP) con relación al PACAP. La quinta solución acuosa se preparó con una concentración de regulador de histidina de 10 mM, una concentración de CaCI2 de 10 mM, y una cantidad de sacarosa que proporciona una proporción de peso de 0.5/1 (sacarosa/PACAP) con relación al PACAP. La sexta solución acuosa se formuló con una concentración de regulador de histidina de 10 mM y 0.02% en peso de SDS. Las partículas PACAP en estado sólido se produjeron posteriormente a partir de cada una de las seis soluciones utilizando el proceso de liofilización ya descrito en la presente invención. Las partículas PACAP producidas a partir de cada solución, se almacenaron posteriormente a una temperatura de 60°C durante 2 meses, y la estabilidad del PACAP contenido dentro de las diferentes partículas se evaluó utilizando procesos RP- HPLC y SEC después de dicho almacenamiento. Tal como se puede apreciar en la tabla 7, la presencia del regulador de histidina suprime en gran medida la formación de agregado PACAP (una disminución rigurosa de 6 veces en la formación de agregado). Además, la sacarosa, CaCI2 y SDS estabilizaron adicionalmente el péptido, proporcionando rigurosamente disminuciones de 14 y 20 veces en la formación del agregado. EJEMPLO 7 Para evaluar el efecto de estabilización de CaCI2 en las partículas PACAP preparadas con un pH ácido y casi neutro, se formularon cuatro diferentes tipos de partículas, almacenadas a una temperatura de 60°C durante 2 meses, y posteriormente se analizaron con respecto a la degradación PACAP. Las cuatro diferentes formulaciones de partículas se prepararon a partir de cuatro diferentes soluciones acuosas. Cada una de las cuatro soluciones incluyeron una cantidad deseada de PACAP disuelto en el mismo, y se ajustó el pH de cada solución al nivel deseado utilizando HCI diluido. La primera solución acuosa se formuló sin aditivos (histidina ó CaCI2), y el pH de la primera solución se ajustó a 2. La segunda solución acuosa se formuló con una concentración de CaCI2 de 10 mM, y el pH de la segunda solución se ajustó a 2. La tercera solución acuosa se formuló con una concentración de regulador de histidina de 10 mM y la cuarta solución acuosa se formuló con una concentración de regulador de histidina de 10 mM, así como una concentración de CaCI2 de 10 mM. Las partículas PACAP en estado sólido se prepararon a partir de cada una de las cuatro soluciones (la composición de cada una de las diferentes partículas se establece en la tabla 8) utilizando el proceso de liofilización ya descrito, y las partículas PACAP producidas a partir de cada una de las cuatro soluciones se almacenaron a una temperatura de 60°C durante dos meses. Después de almacenar las partículas a una temperatura de 60°C durante dos meses, se evaluó la estabilidad de PACAP incluido en las partículas utilizando procesos RP-HPLC y SEC. Tal como se puede apreciar en la tabla 8, los resultados de dicha evaluación demostraron que el CaCI2 mejoró en forma adicional la estabilidad de las partículas PACAP en pHs tanto de 2 como de 6 (tabla 8).