KR20120036468A

KR20120036468A - 펩타이드 약물의 안정화를 위한 펩타이드 이온 컴플렉스

Info

Publication number: KR20120036468A
Application number: KR1020100098168A
Authority: KR
Inventors: 나동희; 안재화; 박은지; 강재선
Original assignee: 경성대학교 산학협력단
Priority date: 2010-10-08
Filing date: 2010-10-08
Publication date: 2012-04-18

Abstract

본 발명은 생리활성 펩타이드 약물의 안정화를 위한 펩타이드 이온 컴플렉스 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 자세하게는 생체 분해성 합성 폴리머인 폴리락타이드 (polylactide, 이하 PLA라 함) 또는 폴리락타이드-코-글라이코라이드 (poly(lactide-co-glycolide), 이하 PLGA라 함)를 이용하여 제조되는 서방성 약물 제제에 함유되는 펩타이드 약물이 제제 내에서 PLA 또는 PLGA와의 아실화 반응 (acylation)에 의해 아실화 펩타이드 (acylated peptide)를 생성하는 문제점을 펩타이드-이온 컴플렉스 (peptide-ion complex)를 이용하여 해결하는 기술에 대한 것이다.

Description

펩타이드 약물의 안정화를 위한 펩타이드 이온 컴플렉스{Peptide-ion complex for stabilizing peptide drug}

마이크로스피어 제제는 펩타이드 약물을 인체에 적용시 짧은 생체내 반감기 (short half-life)로 인해 빈번히 주사해야하는 문제점을 극복하기 위하여 고안된 약물방출제어 (controlled drug release) 시스템이다 (Okada and Toguchi, 1995). 이 제제는 펩타이드를 폴리락타이드 (PLA) 또는 폴리락타이드-코-글라이코라이드 (PLGA)와 같은 생분해성 고분자 (biodegradable polymer)로 이루어진 매트릭스내에 봉입하여 생체내에서 장기간 (1~6개월)에 걸쳐 약물 방출을 지속시킴으로써 오랜 기간동안 약물 치료를 필요로 하는 만성 질환에 매우 유용하게 사용되어지고 있다.

현재 FDA의 허가를 받아 생체에 안전하게 사용할 수 있는 생분해성 합성고분자로는 PLA와 PLGA 밖에 없으며, 현재 출시된 제품들도 모두 이들 고분자들을 이용하여 제조되었다. 그러나 최근 PLA나 PLGA로 제조된 마이크로스피어 제제가 체내에서 분해되는 과정에서 고분자와 펩타이드간의 acylation 반응에 의해 불순물로 여겨지는 펩타이드 부산물 (acylated peptide)이 생성된다는 것이 발견되었다 (Lucke et al ., 2002a; Na et al ., 2003a). 이 아실화된 펩타이드(acylated peptide)는 펩타이드의 친핵성 반응성(nucleophilic reactivity)이 강한 N-말단이나 라이신(lysine) 잔기의 일차 아민(primary amine) 등이 PLA나 PLGA의 골격을 이루는 카르보닐 그룹(carbonyl group)과 반응하여 생성되는 것으로 추정되고 있다 (도3).

2002년에 처음 보고된 이래로 최근 4년간 살몬 칼시토닌(salmon calcitonin, sCT), 휴먼 에이트리얼 나트리유레틱 펩타이드(human atrial natriuretic peptide, ANP), 휴먼 파라타이로이드 호르몬(human parathyroid hormone, hPTH), 옥트레오타이드(octreotide) 등 주요 활성 펩타이드들의 마이크로스피어내 아실화된 펩타이드(acylated peptide) 생성에 대한 연구 결과들이 보고되었다.

Lucke et al .은 sCT와 ANP 펩타이드들이 마이크로스피어내에서 PLGA와 아실화 반응하는 것을 LC-MS로 확인하였으며, Na et al .은 모세관 전기영동과 MALDI-TOF 질량분석기를 이용하여 펩타이드의 N-말단과 라이신(lysine)의 일차 아민(primary amine)들이 주요 반응 부위임을 확인하였다 (Lucke et al ., 2002a; Na et al ., 2003a). Murty et al .은 현재 시판중인 산도스타틴(Sandostatin) LAR의 활성성분인 옥트레오타이드(octreotide)를 함유한 PLGA 마이크로스피어를 쥐에 투여한 후 투여조직으로부터 아실화된 펩타이드의 생성여부를 확인하였다 (Murty et al ., 2005a). Lucke et al .은 아실화를 방지하기 위한 방법으로 PEG-PLA 다이블록 공중합체(diblock copolymer) 고분자를 사용해 아실화가 완벽하지는 않지만 뚜렷하게 감소함을 확인하였다 (Lucke et al ., 2002b). Na et al .은 옥트레오타이드(octreotide)의 N-말단부위에서 아실화 반응이 더 잘 일어남을 확인하고, N-말단에 PEG를 특이적으로 결합시켰을 때 옥트레오타이드(octreotide)의 활성을 유지하면서도 아실화 반응을 방지할 수 있음을 확인한 바 있다 (Na et al ., 2005a and b).

본 발명은 지속성 펩타이드 약물 방출 제제인 마이크로스피어 (microsphere)의 제조 및 약물방출과정에서 생성되는 불순물로 확인된 아실화된 펩타이드의 생성을 제어하기 위한 것으로서, 즉, 마이크로스피어 제제에 봉입되어 인체내 투여시 매트릭스에서 서서히 방출되는 활성 펩타이드 약물의 안정화를 위한 제제에 관한 것이다.

본 연구에서는 현재 의약품으로 사용되고 있는 산도스타틴(Sandostatin LAR,Novartis)의 주성분인 옥트레오타이드(octreotide, somatostatin analogue)를 모델로 하여 마이크로스피어에서의 아실화 반응 기전을 규명하고, 이를 바탕으로 아실화된 옥트레오타이드의 생성을 억제할 수 있는 마이크로스피어 제조법을 개발하고자 한다.

아실화된 펩타이드는 마이크로스피어 제제의 제조에 사용하는 생체분해성 고분자인 폴리(D,L-락타이드) (PLA)나 폴리(D,L-락타이드-코-글라이코라이드) (PLGA)와 반응하여 생성되는 불순물로 최근 그 존재가 밝혀졌다(Lucke et al., 2002a; Na et al ., 2003a). 현재 FDA의 허가를 받아 인체에 안전하게 사용할 수 있는 생체분해성 합성고분자는 PLA나 PLGA 밖에 없는 실정이다. 현재 사용되고 있는 마이크로스피어 제제의 의약품에서도 아실화된 펩타이드의 존재가 발견되며, ICH 가이드라인에 따라 불순물로서 제제의 유효성과 안전성에 미치는 영향이 조사되어야할 필요성이 제기되고 있다. 따라서 차세대 마이크로스피어 제제 개발을 위해서 아실화된 펩타이드의 생성을 제어할 수 있는 기술의 개발이 요구되고 있다.

현재 인체에 안전하게 사용할 수 있는 생체분해성 고분자가 PLA 또는 PLGA로 제한되기 때문에 이들 고분자들을 이용하여 만드는 마이크로스피어 제제에서 펩타이드 아실화는 피할 수 없는 문제로 여겨진다. 따라서 마이크로스피어의 제조 조건 등을 개선하여 이 문제를 최소화 하는 것이 가장 현실적인 해결책이 된다. 이를 위한 방법의 연구들로써 앞서 언급한 바와 같이 블록 코폴리머(block copolymer)를 사용한다든가 펩타이드에 PEG를 접합한다든가 하는 연구들이 소개되었으나 (Lucke et al ., 2002b; Na et al ., 2005a and b), 이들 방법들은 고분자의 안전성 문제와 펩타이드를 변형한다는 점에서 현실적으로 적용되기 어려운 점이 있다. 따라서 고분자와 펩타이드에 변형을 주지 않으면서 펩타이드 아실화를 최소화하거나 방지할 수 있는 방법의 개발이 요구된다.

이를 위해 먼저 마이크로스피어내에서 아실화 펩타이드의 생성 기전을 규명할 필요가 있는데, 아실화된 펩타이드의 생성 기전에 대하여는 명확히 규명이 안 된 상황이다.

본 발명에서는 펩타이드-이온 컴플렉스 (peptide-ion complex)를 이용함으로써, 생체 분해성 합성 폴리머인 PLA 또는 PLGA를 이용하여 제조되는 서방성 약물 제제에 함유되는 펩타이드 약물이 제제 내에서 PLA 또는 PLGA와의 아실화 반응 (acylation)에 의해 아실화 펩타이드 (acylated peptide)를 생성하는 문제점을 해결하였다. 보다 구체적으로, PLA 또는 PLGA와의 아실화 반응의 주요 부위인 펩타이드 약물내 아민기 (-NH₂)를 음이온으로 컴플렉스화하여 보호함으로써 PLA 또는 PLGA 제제에서의 아실화 반응을 억제할 수 있다.

본 발명과 같이 이온 컴플렉스를 이용함으로써, 기존의 펩타이드 제제가 다량의 아실화 펩타이드를 방출하는 것과 달리 고유의 활성과 구조를 지닌 펩타이드가 제제로부터 지속적으로 방출되는 효과를 가져온다.

도 1은 비교예 1, 2 및 실시예 1에서의 아실화된 옥트레오타이드의 방출량 측정 결과를 도시한 것이다.
도 2는 옥트레오타이드 표준품 (A)과 비교예 1의 옥트레오타이드 필름을 0.1 M 포스페이트 완충액 (pH 7.4)에 넣어 37^oC에서 28일 동안 약물 방출 실험후 취한 상등액 (B)을 HPLC로 분석한 결과를 도시한 것이다. 도 2 (B)의 asterisk (*)은 아실화 옥트레오타이드에 해당하는 피크를 의미한다.
도 3은 마이크로스피어에서 펩타이드와 PLGA간의 반응에 의한 아실화된 펩타이드의 생성 기전을 나타낸 것이다.

본 발명은 폴리락타이드 또는 폴리락타이드-코-글라이코라이드를 이용하여 제조되는 펩타이드 약물의 안정화를 위한 펩타이드와 음이온 화합물의 이온 컴플렉스를 포함하는 펩타이드 제제에 관한 것이다.

본 발명에서, 펩타이드 및 음이온 화합물의 이온 컴플렉스를 이용함으로써 펩타이드 약물과 폴리락타이드 또는 폴리락타이드-코-글라이코라이드간 아실화 반응에 의해 생성된 아실화된 펩타이드(acylated peptide)의 생성률을 낮춤으로써, 펩타이드 약물을 안정화시킬 수 있다.

본 발명에서, 아실화된 펩타이드 생성률은 총 방출 펩타이드 중량에 대하여 30w/v% 이하, 보다 구체적으로 20w/v%이하, 보다 더 구체적으로 10w/v% 이하이다.

본 발명에서. 펩타이드 약물의 활성성분인 펩타이드로는 옥트레오타이드(octreotide), 바프레오타이드(vapreotide), 란레오타이드(lanreotide), 살몬 칼시토닌(salmon calcitonin), 휴먼 칼시토닌(human calcitonin), 휴먼 파라타이로이드 호르몬(human parathyroid hormone), 성장호르몬-방출 팩터(growth hormone-releasing factors), 성장호르몬-방출 펩타이드(growth hormone-releasing peptides), 글루카곤 유사 펩타이드-1(glucagon-like peptide-1), 엑센딘-4(exendin-4) 또는 펩타이드 YY(peptide YY) 등이 사용될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며 양이온을 띄는 펩타이드라면 어느 것이든지 사용될 수 있다.

본 발명에서 또한 사용될 수 있는 음이온 화합물로는 펜타소디움 트리폴리포스페이트 또는 콘드로이친 설페이트 등을 예로 들 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 양이온성 펩타이드와 음이온 컴플렉스를 형성할 수 있는 화합물이라면 어느 것이든지 사용될 수 있다.

본 발명의 펩타이드 제제는 필름, 미립구, 마이크로실린더 또는 임플란트 형태의 제형으로 제조될 수 있다.

비교예 및 실시예

옥트레오타이드(Octreotide)만을 함유한 PLGA 필름(비교예 1)의 제조과정

옥트레오타이드 2 mg과 PLGA 20 mg (10% w/w)을 각각 정밀하게 달아 에펜도르프 튜브에 가하고 아세톤 100 μL를 가한 뒤 15분 간 초음파 처리하였다. 옥트레오타이드와 PLGA가 완전히 녹은 것을 확인한 뒤 튜브의 캡을 열고 데시케이터에서 충분히 건조하여 아세톤을 휘발시켜 옥트레오타이드만을 함유한 PLGA 필름을 제조하였다.

옥트레오타이드와 펜타소디움 트리폴리포스페이트(pentasodium tripolyphosphate, TPP)가 혼합되어 함유된 PLGA 필름(비교예 2)의 제조과정

옥트레오타이드와 TPP를 각각 2 mg씩 정밀하게 달아 에펜도르프 튜브에 취하고 PLGA 20 mg과 아세톤 100 μL를 가한 뒤 15분 간 초음파 처리하였다. 옥트레오타이드, TPP, 및 PLGA가 완전히 녹은 것을 확인한 뒤 튜브의 캡을 열고 데시케이터에서 충분히 건조하여 아세톤을 휘발시켜 옥트레오타이드와 TPP가 혼합되어 함유된 PLGA 필름을 제조하였다.

옥트레오타이드와 TPP의 이온컴플렉스를 함유한 PLGA 필름(실시예 1)의 제조과정

옥트레오타이드 용액 (50 mg/mL)과 TPP 용액 (18 mg/mL)을 각각 동일한 부피 (몰비 옥트레오타이드:TPP=1:1)를 취해 섞어 이온컴플렉스를 형성시킨 후, 8000 rpm에서 10 분 간 원심분리하여 이온컴플렉스를 침전시켰다. 이온컴플렉스 표면에 반응하지 않고 남아있는 옥트레오타이드를 제거하기 위하여 정제수 1 mL을 가지고 2회 세척한 후, 동결건조하여 디스크 형태의 고형 이온컴플렉스를 제조하였다. 이 이온컴플렉스에 PLGA 20 mg과 아세톤 100 μL를 가한 뒤 15분 간 초음파 처리하였다. 이온컴플렉스와 PLGA가 완전히 녹은 것을 확인한 뒤, 튜브의 캡을 열고 데시케이터에서 충분히 건조하여 옥트레오타이드와 TPP의 이온컴플렉스를 함유한 PLGA 필름을 제조하였다.

실험예

옥트레오타이드(Octreotide)만을 함유한 PLGA 필름(비교예 1)과 옥트레오타이드와 펜타소디움 트리폴리포스페이트(pentasodium tripolyphosphate, TPP)가 혼합되어 함유된 PLGA 필름(비교예 2) 및 옥트레오타이드와 TPP의 이온컴플렉스를 함유한 PLGA 필름(실시예 1)을 동일한 조건에서 제조한 후 0.1 M 포스페이트 완충액 (pH 7.4)에 넣어 37^oC에서 28일 동안 약물 방출 실험을 하였다.

옥트레오타이드만을 함유한 PLGA 필름과 옥트레오타이드와 TPP 혼합물을 함유한 PLGA 필름에서는 아실화 옥트레오타이드가 각각 36.9%와 39.7% 생성됨에 비해 본 발명 실시예 1의 옥트레오타이드-TPP 이온컴플렉스를 함유한 PLGA 필름에서는 아실화된 옥트레오타이드가 7.4%만이 생성되었고 나머지 92.6%에 해당하는 고유의 옥트레오타이드가 방출됨을 확인하였다 (도 1 참조).

Claims

폴리락타이드 또는 폴리락타이드-코-글라이코라이드를 이용하여 제조되는 펩타이드 약물의 안정화를 위한 펩타이드와 음이온 화합물의 이온 컴플렉스를 포함하는 펩타이드 제제.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드 약물의 안정화는 펩타이드 약물과 폴리락타이드 또는 폴리락타이드-코-글라이코라이드간 아실화 반응에 의해 생성된 아실화된 펩타이드(acylated peptide)의 생성률을 낮춤으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 펩타이드 제제.
제2항에 있어서,
상기 아실화된 펩타이드 생성률이 총 방출 펩타이드 중량에 대하여 30w/v% 이하인 것을 특징으로 하는 펩타이드 제제.
제2항에 있어서,
상기 아실화된 펩타이드 생성률이 총 방출 펩타이드 중량에 대하여 20w/v% 이하인 것을 특징으로 하는 펩타이드 제제.
제2항에 있어서,
상기 아실화된 펩타이드 생성률이 총 방출 펩타이드 중량에 대하여 10w/v% 이하인 것을 특징으로 하는 펩타이드 제제.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드가 옥트레오타이드(octreotide), 바프레오타이드(vapreotide), 란레오타이드(lanreotide), 살몬 칼시토닌(salmon calcitonin), 휴먼 칼시토닌(human calcitonin), 휴먼 파라타이로이드 호르몬(human parathyroid hormone), 성장호르몬-방출 팩터(growth hormone-releasing factors), 성장호르몬-방출 펩타이드(growth hormone-releasing peptides), 글루카곤 유사 펩타이드-1(glucagon-like peptide-1), 엑센딘-4(exendin-4) 및 펩타이드 YY(peptide YY)로 이루어진 그룹으로 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 펩타이드 제제.
제1항에 있어서,
상기 음이온 화합물은 펜타소디움 트리폴리포스페이트 또는 콘드로이친 설페이트인 것을 특징으로 하는 펩타이드 제제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩타이드 제제가 필름, 미립구, 마이크로실린더 및 임플란트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 펩타이드 제제.