AT402259B - Verfahren zur herstellung eines stabilen pharmazeutischen präparats mit einem gehalt an granulozytkolonie stimulierendem faktor - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines stabilen pharmazeutischen präparats mit einem gehalt an granulozytkolonie stimulierendem faktor Download PDF

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Description

AT 402 259 B
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen pharmazeutischen Präparats mit einem Gehalt an Granulozytenkolonie stimulierendem Faktor (G-CSF), das gegen einen Verlust oder eine Inaktivierung der aktiven Komponente (d.h. des die Granulozytenkolonie stimulierenden Faktors) durch Absorption an der Wand eines Behälters, in welchen das Präparat eingebracht wird, oder 5 durch Assoziation, Polymerisation oder Oxidation der genannten Komponente, geschützt ist. Die Chemotherapie wurde als eine Methode zur Behandlung verschiedenartiger Infektionskrankheiten angewendet, in letzter Zeit wurde jedoch gefunden, daß die Chemotherapie ernste klinische Probleme verursacht, wie beispielsweise die Bildung von arzneimittelbeständigen Organismen, Veränderung der Veruracherorganis-men und starke Nebenwirkungen. Um diese Probleme der Chemotherapie, welche therapeutische Mittel, io wie Antibiotika und Bakterizide, verwendet, zu vermeiden, werden Versuche unternommen, eine Substanz zu verwenden, welche die prophylaktischen Fähigäkeiten des Wirtes eines infektionsverursachenden Organismus aktiviert, um dadurch eine vollständige Lösung der vorgenannten Chemotherapie-Probleme zu erreichen. Es wird angenommen, daß unter den verschiedenen prophylaktischen Fähigkeiten des Wirtes die phagozytische bakterizide Wirkung von Leukozyten den stärksten Einfluß in der Anfangsperiode der 15 bakteriellen Infektion hat, weshalb es anscheinend wichtig ist, die Infektionsschutzfähigkeiten des Wirtes zu erhöhen, indem das Wachstum von Neutrophilen und ihre Differenzierung in das Reifestadium gefördert wird. Ein die Granulozytenkoionie stimulierender Faktor (G-CSF) ist eine sehr brauchbare Substanz, die solche Wirkungen entwickelt, und die Anmelderin hat bereits eine Patentanmeldung betreffend ein Infektionsschutzmittel, bei dem G-CSF verwendet wird, getätigt (Japanische Patentanmeldung Nr. 23777/1985). 20 Wie bereits oben erwähnt wurde, sind mit der Chemotherapie, in der Form, wie sie derzeit angewendet wird, unvermeidbare Probleme verbunden und es werden intensive Anstrengungen unternommen, um eine Arzneisubstanz zur Verwendung aufzufinden, die befähigt ist, die prophylaktischen Funktionen des Wirtes oder der Person, die infiziert wurde, zu aktivieren.
Es ist überflüssig zu sagen, daß G-CSF selbst die Fähigkeit hat, die prophylaktischen Funktionen des 25 Wirtes zu aktivieren, und es wurde auch gefunden, daß G-CSF eine größere therapeutische Wirksamkeit bei der klinischen Anwendung besitzt, wenn es in Kombination mit einer Substanz verwendet wird, die die prophylaktischen Fähigkeiten des Wirtes aktiviert. G-CSF wird in einer sehr kleinen Menge verwendet und gewöhnlich wird ein pharmazeutisches Präparat enthaltend 0,1 - 500 u.g in einer Dosierungsrate von 1 - 7 Mal pro Woche für Erwachsene 30 verabreicht. Beim G-CSF besteht jedoch die Tendenz, daß es an der Wand des es enthaltenden Behälters, wie z.B. einer Inkjektionsampulle, absorbiert wird. Dies führt dazu, daß G-CSF entweder versagt, seine Wirkung als pharmazeutisches Präparat voll zu entwickeln, oder der Zusatz von G-CSF in einer großem Menge als erforderlich notwendig wird, um dem möglichen Verlust durch Absorption zu begegnen. Überdies ist G-CSF labil und gegenüber Umwelteinflüssen, wie Temperatur, Feuchtigkeit, Sauerstoff 35 und ultraviolette Strahlen, äußerst empfindlich. Durch die Einwirkung solcher Faktoren erleidet der G-CSF physikalische oder chemische Veränderungen, wie Assoziation, Polymerisation und Oxidation, und verliert einen Großteil seiner Wirksamkeit. Durch dieses Phänomen ist es schwierig, eine Therapie durch Verabreichung einer sehr genauen und sehr geringen Menge an G-CSF durchzuführen.
Es ist daher notwendig, ein stabiles pharmazeutisches G-CSF-Präparat zu entwickeln, das vollständig 40 gegen einen Aktivitätsabfall seiner Wirkkomponente geschützt ist. Dies ist das hauptsächliche Ziel des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die Erfinder haben intensive Studien durchgeführt, um die Stabilität eines G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparats zu verbessern und haben gefunden, daß dieses Ziel durch Zusatz eines pharmazeutisch annehmbaren Tensids, Saccharids, Proteins oder einer Verbindung mit hohem Molekulargewicht 45 erreicht werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist demnach dadurch gekennzeichnet, daß man G-CSF mit dem nachstehend unter (1) angegebenen Molekulargewicht mit wenigtens einem der Ingredienzien ausgewählt aus den nachstehend unter (2) angegebenen Tensiden, den nachstehend unter (3) angegebenen Sacchari-den, den nachstehend unter (4) angegebenen Proteinen und den nachstehend unter (5) angegebenen so Verbindungen mit hohem Molekulargewicht in einer nachstehend unter (6) angegebenen Menge vermischt, das resultierende Gemisch in dem nachstehend unter (7) angegebenen Puffer löst, die Lösung sterilisiert und einen Behälter mit der sterilisierten Lösung beschickt, welches pharmazeutische Präparat in einem der nachstehend unter (8) angegebenen Zustände stabil gelagert wird: (1) Molekulargewicht: 55 etwa 19.000 - 1000, durch elektrophorese durch ein Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel gemes sen; (2) das Tensid ist wenigstens ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem nichtionischen Tensid, einem anionischen Tensid und einem natürlichen Tensid, wobei das nichtionische Tensid 2
AT 402 259 B ein aliphatischer Sorbitan-Säureester, ein aliphatischer Glycerin-Säureester, ein aliphatischer Polyglycerin-Säureester, ein aliphatischer Polyoxyethylensorbitan-Säureester, ein aliphatischer Polyoxyethylensor-bitol-Säureester, ein aliphatischer Polyoxyethylenglycerin-Säureester, ein aliphatischer Polyethylenglykol-Säureester, ein Polyoxyethylenalkylether, ein Polyoxyethylenpolyoxypropylenalkylether, ein Polyoxyeth-ylenalkylphenylether, ein polyoxyethyliertes gehärtetes Rizinusöl, ein polyoxyethyliertes Bienenwachsderivat, ein Polyoxyethylenlanolinderivat oder ein aliphatisches Polyoxyethylen-Säureamid ist, das anionische Tensid ein Alkylsulfatsalz, ein Polyoxyethylenalkylethersulfatsalz oder ein Sulfobernsteinsäureester-salz ist, und das natürliche Tensid Lecithin, Glycerophospholipid, Sphingophospholipid oder ein aliphatischer Saccharose-Säureester ist; (3) das Saccharid ist wenigstens ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycerin, Erythritol, Arabitol, Xylitol, Sorbitol, Mannitol, Glucuronsäure, Iduronsäure, Galacturonsäure, Neuramin-säure, Glyconsäure, Mannuronsäure, Ketoglykolsäure, Ketogalactonsäure, Ketogluconsäure, Hyaluronsäure und Salze hiervon, Chondroitinsulfat und Salze hiervon, Heparin, Inulin, Chitin und Derivate hiervon, Chitosan und Derivate hiervon, Dextrin, Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5.000 - 150.000 und Alginsäure und Salze hiervon; (4) das Protein ist wenigstens ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Humanserumalbumin, Humanserumglobulin, Gelatine, säure- oder alkalibehandelte Gelatine mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 7.000 - 100.000 und Collagen; (5) die Verbindung mit hohem Molekulargewicht ist wenigestens ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxypropylcellulose, Hydroxymethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Hy-droxyethylcellulose, Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von 300 - 6.000, Polyvinylalkohol mit einem Molekulargewicht von 20.000 bis 100.000 und Polyvinylpyrrolidon mit einem Molekulargewicht von 20.000 - 100.000; (6) Mengen der Bestandteile in Gewichtsteilen: G-CSF 1 Tensid 1-10.000 Saccharid 1-10.000 Protein 1-20.000 Substanz mit hohem Molekulargewicht 1-20.000 (7) Puffer:
Phosphatpuffer; und ' (8) Lagerungszustand: Lösungspräparat und gefriergetrocknetes Präparat.
Der G-CSF kann nach irgendeiner bekannten Methode erhalten werden, wie beispielsweise nach denen, die in den japanischen Patentanmeldungen Nr. 153273/1984, 269455/1985, 269456/1985, 270838/1985 und 270839/11985 beschrieben sind. Beispielsweise kann ein menschlicher G-CSF entweder durch Züchtung einer Zellinie (CNCM-Zugriffsnummer 1-315 oder I-483), gewonnen aus Tumorzellen von Patienten mit Mundhöhlenkrebs, oder durch Ausdruck einer rekombinanten DNA (welche durch die Wirkung eines menschlichen G-CSF-Codierungsgens erzeugt wurde) in einer geeigneten Wirtszelle (z.B. E. Coli, C 127-Zelle oder Ovarzellen eines chinesischen Hamsters) hergestellt werden.
Es kann jeder menschliche G-CSF, der bis zu einem hohen Ausmaß gereinigt worden war als der G-CSF verwendet werden, der im erfindungsgemäß herstellbaren pharmazeutischen Präparat enthalten sein soll. Vorzugsweise werden solche menschliche G-CSFen verwendet, die durch Isolierung aus dem Überstand der Kultur einer menschlichen G-CSF-produzierenden Zelle, und aus einem Polypeptid oder Glyco-protein mit der von menschlichem G-CSF, das durch Transformation eines Wirtes mit einem rekombinanten Vektor, in den eine Gencodierung für ein Polypeptid mit der menschlichen G-CsF-Aktivität inkorporiert worden war, erhalten wurde.
Zwei besonders bevorzugte Beispiele von menschlichem G-CSF sind nachstehend gezeigt: (1) menschlicher G-CSF mit folgenden physikochemischen Eigenschaften: i) Molekulargewicht: etwa 19.000 £ 1.000, gemessen durch Elektrophorese durch ein Natriumdodecyl-sulfat - Polyacrylamidgel; ii) isoelektrischer Punkt: mit wenigstens einen der drei isoelektrischen Punkte, pl = 5,5 ± 0,1, pl = 5,8 ± 0,1 und pl = 6,1 ± 0,1. iii) Ultraviolettabsorption: mit einer Maximumabsorption bei 280 nm und einer Minimumabsorption bei 260 nm; 3
AT 402 259 B iv) Aminosäuresequenz der 21 Reste vom N-Terminus: H2N-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro*Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-Cys-Leu-Glu-Gln-Val-(2) menschlicher G-CSF enthaltend entweder ein Polypeptid mit die menschlichen Granulocyten stimulierender Faktor-Aktivität, repräsentiert durch die ganze oder einen Teil der nachstehend gezeigten s Aminosäuresequenz, oder ein Glycoprotein, welches sowohl den genannten Polypeptid- als auch einen Zuckerkettenteil besitzt: (Met) Thr n Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gin Val Arg Lys Ile Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin Glu Lys Leu (Val Ser Glu) Cys m 1 Ala Thr Tyr Lys Leu Cys Bis Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu Bis Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser Bis Leu Gin Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala
Gin Pro (vorausgesetzt daß m 0 oder 1 und n 0 oder 1 ist) 45 Wegen Einzelheiten betreffend die Methode zur Herstellung dieser beiden Arten von G-CSF siehe die Beschreibung der japanischen Patentanmeldungen Nr. 153273/1984, 269455/1985, 269456/1985, 270838/1985 und 270839/1985, die alle von der Anmelderin getätigt wurden.
Eine weitere anwendbare Methode besteht in der Fusion einer G-CSF produzierenden Zelle mit einer sich selbst fortpflanzenden bösartigen Tumorzelle und Züchten der resultierenden Hybridoma in Gegenwart so oder in Abwesenheit von Mytogen.
Die menschlichen G-CSF enthaltende Lösung kann in gefrorenem Zustand gelagert werden, nachdem sie gegebenenfalls im Zuge bekannter Techniken weiter gereinigt und eingeengt worden war. Alternativ kann die Lösung gelagert werden, nachdem sie durch Maßnahmen wie Gefriertrocknen entwässert worden war. 55 Alle auf diese Weise hergestellten menschlichen G-CSFen können wie durch vorliegende Erfindung angebenen aufgearbeitet werden, um pharmazeutische Präparate mit einem Gehalt an stabilem G-CSF zu erhalten. 4
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Typische Beispiele von Tensiden, die zur Erzeugung des pharmazeutischen Präparats mit einem Gehalt an stabilem G-CSF erfindungsgemäß verwendet werden können, werden in der Folge aufgezählt: nichtionische Tenside mit HLB-Werten von 6 - 18, wie aliphatische Sorbitan-Säureester (z.B. Sorbitanmonocaprylat, Sorbitanmonolaurat und Sorbitanmonopalmitat), aliphatische Glycerin-Säureester (z.B. Glycerinmonocapry-lat, Glycerinmonomyristat und Glycerinmonostearat), aliphatische Polyglycerin-Säureester (z.B. Decaglycer-ylmonostearat, Decaglyceryldistearat und Decaglycerylmonolinoleat), aliphatische Polyoxyethylensorbitan-Säureester (z.B. Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, Polyoxyethylensorbitanmonooleat, Polyoxyethylensor-bitanmonostearat, Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat, Polyoxyethylensorbitantrioleat und Polyoxyethylen-sorbitantristearat), aliphatische Polyoxyethylensorbitol-Säureester (z.B. Polyoxyethylensorbitoltetrastearat und Polyoxyethylensorbitoltetraoleat), aliphatische Polyethylenglycerin-Säureester (z.B. Polyoxyethylengly-cerylmonostearat) aliphatische Polyethylenglycol-Säureester (z.B. Polyethylenglykoldistearat) Polyoxyeth-ylenalkylether (z.B. Polyoxyethylenlaurylether), Polyoxyethylenpolyoxypropylenalkylether (z.B. Polyoxyeth-ylenpolyoxypropylenglykolether, Polyoxyethylenpolyoxypropylenpropylether und Polyoxyethylenpolyoxypro-pylencetylether), Polyoxyethylenalkylphenylether (z.B. Polyoxyethylennonylphenylether), polyoxyethyliertes Rizinusöl, gehärtetes polyoxyethyliertes Rizinusöl (hydriertes polyoxyethyliertes Rizinusöl), polyoxyethylier-te Bienenwachsderivate (z.B. polyoxyethyliertes Sorbitol-Bienenwachs, Polyoxyethylenlanolinderivate (z.B. Polyoxyethylenlanolin), und aliphatische Polyoxyethylen-Säureamide (z.B. Poiyethylenstearinsäureamid); anionische Tenside, wie Alkylschwefelsäuresalze mit C10 - Ci 8 - Alkylgruppen (z.B. Natriumcetylsulfat, Natriumlaurylsulfat und Natriumoleylsulfat), Polyoxyethylenalkylether-Schwefelsäuresalze, worin die durchschnittliche Molzahl der Ethylenoxidaddition 2-4 beträgt und die Alkylgruppe 10-18 Kohlenstoffatome aufweist (z.B. Polyoxyethylennatriumlaurylsulfat), Salze von Alkylsulfobemsteinsäureestern, worin die Alkylgruppe 8-18 Kohlenstoffatome aufweist (z.B. Natriumlaurylsulfobernsteinsäureester) und natürliche Tenside, wie Lecithin, Glycerophospholipid, Sphingophospholipid (z:b Sphingomyelin) und aliphatische Saccharoseester, worin die aliphatische Säure 12 bis 18 Kohlenstoffatome besitzt. Diese Tenside können natürlich entweder einzeln oder im Gemisch verwendet werden.
Doe oben aufgezählten Tenside werden vorzugsweise in Mengen von 1 - 10.000 Gew.-Teilen pro Gew.-Teil G-CSF verwendet.
Die Saccharide, die bei der Herstellung des pharmazeutischen Präparats mit einem Gehalt an stabilem G-CSF verwendet wereden können, können aus Monosacchariden, Oligosacchariden und Polysacchariden, sowie Phosphatestern und Nucleotidderivaten hiervon ausgewählt werden, solange sie pharmazeutisch annhembar sind. Typische Beispiele sind in der Folge angegeben: dreiwertige oder höhere Zuckeralkohole, wie Glycerin, Erythritol, Arabitol, Xylitol, Sorbitol und Mannitol; saure Zucker, wie Glucuronsäure, Iduronsäu-re, Neuraminsäure, Galacturonsäure, Gluconsäure, Mannuronsäure, Ketoglykolsäure, Ketogalaktonsäure und Ketogulonsäure; Hyaluronsäure und Salze hierevon, Chondroitinsulfat und Salze hiervon, Heparin, Inulin, Chitin und Derivate hiervon, Chitosan und Derivate hiervon, Dextrin, Dextran mit durchschnittlichen Molekulargewichten von 5.000 - 150.000, und Alginsäure und Salze hiervon. Alle diese Saccharide können mit Vorteil entweder allein oder im Gemisch verwendet werden.
Die oben aufgezählten Saccharide werden vorzugsweise in Mengen von 1 - 10.000 Gew.-Teilen pro Gew.-Teil G-CSF verwendet.
Typische Beispiele von Proteinen zur Verwendung bei der Herstellung des pharmazeutischen Präparats mit einem Gehalt an stabilem G-CSF umfassen menschliches Serumalbumin, menschliches Serumglobulin, Gelatine, säurebehandelte Gelatine (durchschnittl. Molgew. = 7.000 - 100.000), alkalibehandelte Gelatine (durchschnittl. Molgew. = 7.000 - 100.000) und Collagen. Es ist überflüssig zu sagen, daß diese Proteine entweder für sich allein oder im Gemisch verwendet werden können.
Die oben aufgezählten Proteine werden vorzugsweise in Mengen von 1 - 20.000 Gew.-Teilen pro Gew.-Teil G-CSF verwendet.
Typische Beispiele von Verbindungen mit hohem Molekulargewicht zur Verwendung bei der Herstellung des pharmazeutischen Präparats mit einem Gehalt an stabilem G-CSF umfassen: natürliche Polymere, wie Hydroxypropylcellulose, Hydroxymethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und Hydroxyethylcellulo-se; und synthetische Polymere, wie Polyethylenglykol (Molgew. = 300 - 6.000), Polyvinylalkohol (Molgew. = 20.000 - 100.000) und Polyvinylpyrrolidon (Molgew. = 20.000 - 100.000). Es ist unnötig zu sagen, daß diese Verbindungen mit hohem Molekulargewicht entweder alleine oder in Kombination angewendet werden können.
Die oben aufgezählten Verbindungen mit hohem Molekulargewicht werden vorteilhaft in Mengen von 1 -20.000 Gew.-Teilen pro Gew.-Teil G-CSF verwendet.
Zusätzlich zum Tensid, zum Saccharid, zum Protein oder zur Verbindung mit hohem Molekulargewicht der oben beschriebenen Art kann bei der Herstellung der pharmazeutischen Verbindung mit einem Gehalt an stabilem G-CSF wenigstens ein Mitglied der Gruppe bestehend aus einer Aminosäure, einem schwefel- 5
AT 402 259 B haltigen Reduktionsmittel und einem Antioxidationsmittel ebenfalls inkorporiert werden. Beispiele von Aminosäuren sind Glycin, Threonin, Tryptophan, Lysin, Hydroxylysin, Histidin, Arginin, Cystein, Cystin und Methionin. Beispiele schwefelhaltiger Reduktionsmittel sind: N-Acetylcystein, N-Acetylhomocystein, Thioct-säure, Thiodiglykol, Thioethanolamin, Thioglycerin, Thiosorbitol, Thioglycolsäure und Salze hiervon, Natri-5 umthiosulfat, Natriumhydrogensulfit, Natriumpyrosulfit, Natriumsulfit, Thiomilchsäure, Dithiothreitol, Glutathion und ein mildes schwefelhaltiges Reduktionsmittel mit einer Sulfhydrylgruppe, wie eine Ci - C7 -Thioalkansäure. Beispiele von Antioxidationsmitteln sind Erythorbinsäure, Dibutylhydroxytoluol, Butylh-ydroxyanisol, dl-alpha-Tocopherol, Tocopherolacetat, L-Ascorbinsäure und deren Salze, L-Ascorbinsäurepal-mitat, L-Ascorbinsäurestearat, Triamylgallat, Propylgallat und Chelatbildner, wie Dinatriumethylendiaminte-10 traacetat (EDTA), Natriumpyrophosphat und Natriummetaphosphat.
Die oben aufgezählten Aminosäuren, schwefelhaltigen Reduktionsmittel und Antioxidationsmittel oder Gemische hiervor werden vorzugsweise in Mengen von 1 - 10.000 Gew.-Teilen pro Gew.-Teil G-CSF verwendet.
Zum Zwecke der Formulierung des erfindungsgemäß herstellbaren Präparats mit einem Gehalt an 75 stabilem G-CSF in einer geeigneten Dosierungsform können eines oder mehrere der folgenden Mittel inkorporiert werden: ein Verdünnungsmittel, ein Solubilisiereungsmittel, ein isotonisches Mittel, ein Arzneimittelträger, ein pH-Modifizierungsmittel, ein reizlinderndes Mittel und ein Puffer.
Das stabilisierte pharmazeutische Präparat mit einem Gehalt an stabilisiertem G-CSF kann entweder für die orale Verabreichung oder für die parenterale Verabreichung , beispielsweise durch verschiedenartig 20 angewendete Injektion, verabreicht werden, und es können verschiedenartige Dosierungsformen, je nach der speziellen Verabreichungsmethode, verwendet werden. Typische Dosierungsformen sind: solche für die orale Verabreichung, wie Tabletten, Pillen, Kapseln, Granulate und Suspensionen; Lösungen, Suspensionen und gefriergetrocknete Präparate, insbesondere für intravenöse, intramuskuläre, subcutane und intracutane Injektionen; und solche für die transmucosale Verabreichnung, wie Rectalsuppositorien, Nasenmedikamente 25 und Vaginalsuppositorien.
Erfindungsgemäß wird wenigstens eine Substanz, ausgewählt aus der Gruppe umfassend ein Tensid, ein Saccharid, ein Protein oder eine Verbindung mit hohem Molekulargewicht, dem pharmazeutischen Präparat mit einem Gehalt an stabilem G-CSF zugesetzt, so daß es vor einer Adsorption durch die Wand seines Behälters oder einer Injektionsspritze geschützt ist, während es gleichzeitig über lange Zeit stabil 30 bleibt.
Der detaillierte Mechanismus, nach welchem die oben genannnten Substanzen G-CSF stabilisieren oder vor Adsorption schützen, ist noch zu klären. In Gegenwart eines Tensids wird die Oberfläche von G-CSF, der ein hydrophobes Protein ist, mit dem Tensid abgedeckt, um solubilisiert zu werden, so daß der in einer Spurenmenge vorhandene G-CSF wirksam davor geschützt wird, an der Wand seines Behälters Oder einer 35 Spritze adsorbiert zu werden. Ein Saccharid oder eine hydrophile Verbindung mit hohem Molekulargewicht bildet eine hydratisierte Schicht zwischen dem G-CSF und der adsorptionsfähigen Wandfläche seines Behälters oder einer Spritze, wodurch die Adsorption von G-CSF in wirksamer Weise verhindert wird. Ein Protein konkurriert mit dem G-CSF bei der Adsorption an der Wand des Behälters oder der Spitze und behindert dadurch wirksam die Adsorption von G-CSF. 40 Neben dem Schutz des G-CSF vor Adsorption tragen die vorgenannten Substanzen auch dazu bei, eine Assoziation oder Polymerisation der G-CSF-Moleküle zu verhindern. In Gegenwart eines Tensids, Saccha-rids, Proteins oder einer Verbindung mit hohem Moleklulargewicht werden die einzelnen G-CSF-Moleküle in diesen Substanzen dispergiert, und die Wechselwirkung zwischen den G-CSF-Molekülen wird so weit reduziert, daß die Möglichkeit einer Assoziation oder Polymerisation derselben weitgehend ausgeschaltet 45 wird. Überdies verzögern diese Substanzen die Selbstoxidation von G-CSF, die unter hohen Temperaturen oder bei Feuchtigkeit beschleunigt wird, oder sie verhindern, daß G-CSF als Ergebnis seiner Selbstoxidation assozoiiert oder polymerisiert. Diese Effekte der Verzögerung der Selbstoxidation von G-CSF oder der Verhinderung der Assoziation oder Polymerisation desselben werden durch den Zusatz einer Aminosäure, eines schwefelhaltigen Reduktionsmittels oder eines Antioxidationsmittels weiter verstärkt. 50 Die oben beschriebenen Probleme machen sich insbesondere bei Injektionslösungen und bei Suspensionen bemerkbar, sie treten jedoch auch während des Vorganges der Formulierung von G-CSF zu anderen Dosierungsformen, wie Tabletten, auf. Der Zusatz von Tensiden, Sacchariden, Proteinen oder Verbindungen mit hohem Molekulargewicht ist auch im letzgenannten Fall wirksam.
Durch den Zusatz wenigstens einer Substanz der Gruppe umfassend ein Tensid, Saccharid, Protein und 55 eine Verbindung mit hohem Molekulargewicht wird G-CSF stark stabilisiert und hält, wie durch die folgenden Beispiele bewiesen wird, seine Aktivität über lange Zeitperioden bei. Um diese Ergebnisse zu erzielen, ist die Menge einer jeden dieser Substanzen, insbesondere die untere Grenze derselben, kritisch und es sind die folgenden Bereiche bevorzugt: 1 - 10.000 Gew.-Teile Tensid, 1 - 10.000 Gew.-Teile 6
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Saccharid, 1 - 20.000 Gew.-Teile Protein und 1 - 20.000 Gew.-Teile Verbindung mit hohem Molekulargewicht pro 1 Gew.-Teil G-CSF.
Erfindungsgemäß wird ein Tensid, ein Saccharid, ein Protein und/oder eine Verbindung mit hohem Molekulargewicht in einer speziellen Konzentration verwendet, die nicht nur bei der Verhinderung einer Adsorption von G-CSF an den Wänden seines Behälters oder einer Spritze wirksam sind, sondern auch bei der Erhöhung der Stabilität eines G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparats. Als Ergebnis hiervon ist es möglich, die Verabreichung einer kleinen, jedoch hochgenauen Dosis von G-CSF an Patienten zu gewährleisten; da G-CSF teuer ist, führt seine wirksame Verwendung zu einer Verringerung der Herstellungskostgen von G-CSF enthaltenden pharmazeutischen Präparaten.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung und sind in keiner Weise als einschränkend zu betrachten. In diesen Beispielen wurde die Restaktivität von G-CSF nach einer der folgenden Methoden bestimmt: (a) Weichagar-Methode unter Verwendung von Mausknochenmarkzellen:
Ein Pferdeserum (0,4 ml), 0,1 ml der Probe, 0,1 ml Knochenmarkzellensuspension von C3H/HE-Mäusen (weiblich) und 0,4 ml einer modifizierten McCoy's 5A Nährlösung enthaltend 0,75% Agar wurden miteinander vermischt, in eine Plastikschale für Gewebekulturen (D = 35 mm) geschüttet, koaguliert und 5 Tage lang bei 37” in 5% C02/95% Luft und bei 100% Luftfeuchtigkeit gezüchtet. Die Anzahl der gebldeten Kolonien wurde gezählt (eine Kolonie bestand aus wenigstens 50 Zellen) und die Aktivität wurde bestimmt, wobei eine Einheit die Aktivität für die Bildung einer Kolonie ist. Mit "CH3/HE wird ein Mäusestamm bezeichnet, der aus dem Charles River, Japan, verfügbar ist und folgende Eigenschaften besitzt: Frei von Brusttumorfaktor; hohe Komplementaktivität; starke Anfälligkeit der männlichen Mäuse gegen Lebertumor; erbbedingte abnorme Retina; niedrige Werte an roten Blutzellen und Leukozyten; und hohe Mortalität der männlichen Mäuse bei Einwirkung flüchtiger Öle und von Chloroform.
Die in Methode (a) verwendete McCoy's 5A Nährlösung wurde nach folgender Methode hergestellt.·
Zusammensetzung der McCoy's 5A Nährlösung in mg/l:
Anorganische Salze: CaCh (anh.) 100,00 KCl 400,00 MgS04 (anh.) 97,67 NaCI 6.460,00 NaH2P0«.H20 580,00 7
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Andere Komponenten: Bactopepton 600,00 D-Giucose 3.000,00 Glutathion (reduziert) 0,50 Phenolrot 10,00 L-Alanin 13,90 L-Arginin.HCI 42,10 L-Asparagin 45,00 L-Asparaginsäure 19,97 L-Cystein 31,50 L-Glutaminsäure 22,10 L-Glutamin 219,20 Glycin 7,50 L-Histidin.HCI.H2O 30,96 L-Hydroxyprolin 19,70 L-Isoleucin 39,36 L-Leucin 39,36 L-Lysin.HCI 36,50 L-Methionin 14,90 L-Phenylalanin 16,50 L-Prolin 17,30 L-Serin 26,30 L-Threonin 17,90 L-Triprophan 3,10 L-T yrosin-Na.2H2 O 26,10 L-Valin 17,60
Vitamine: Ascorbinsäure 0,50 Biotin 0,20 Cholinchlorid 5,00 D-Ca-pantothenat 0,20 Folsäure 10,00 i-lnositol 36,00 Niacinamid 0,50 Nicotinamid 0,50 p-Aminobenzoesäure 1,00 Pyridoxal.HCI 0,50 Pyridoxin.HCI 0,50 Riboflavin 0,20 Thiamin.HCI 0,20 Vitamin Bl 2 2,00
Zwölf Gramm der obigen Zusammensetzung, 2,55 g Aminosäure-Vitaminmedium, 2,18 g Natriumbicar-bonat und 50.000 Einheiten Kaliumpenicillin G wurden zwei Mal in 500 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wurde aseptisch durch ein feinporiges Membranfilter (0,22 um), bestehend im wesentlichen aus Celluloseacetatnitrat, filtriert.
Das Aminosäure-Vitaminmedium hatte folgende Zusammensetzung: 8
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Komponente Menge (mg/0,88 g) L-Argin.HCI 126,00 L-Cystin.2HCI 15,66 L-Cystein.HCI(H20 ) 17,66 L-Histidin.HCI(H20) 42,00 L-Isoleucin 52,00 L-Lysin.HCI 73,00 L-Methionin 15,00 L-Phenylalanin 32,00 L-Threonin 48,00 L-Tryptophan 10,00 L-Tyrosin.2Na 44,45 L-Valin 46,00 L-Glutamin 292,00 Tiamin.HCI 1,00 Riboflavin 0,10 Pyridoxal.HCI 1,00 Nicotinylamid 1,00 Ca-Pantothenat 1,00 Folsäure 1,00 i-lnositol 2,00 Cholinbitartrat 1,80 (Das Gemisch (0,88 g) wird verwendet, indem es in destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen der Lösung von 1000 ml gelöst wird). (b) Reverse phase Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatoqraphie:
Unter Verwendung einer Reverse-phase-C8-Säule (4,6 mm x 300 mm; 5 um) und eines n-Propan-ol/Trifluoressigsäure-Gemisches als mobile Phase wurde die Restaktivität von G-CSF (injiziert in einer Menge äquivalent zu 1 ug) unter folgenden Gradientbedingungen bestimmt:
Zeit (sec) Lösungsmittel (A) Lösunqsmittel (B) Gradient O 100% 0% η linear 15 o% 100% ~ linear 25 100% 0% J Lösungsmittel (A) : 30% n-Propanol und 0,1% Trifluoressigsäure Lösungsmittel (B): 60% n-Propanol und 0,1% Trifluoressigsäure
Der Nachweis wurde bei einer Wellenlänge von 210 nm erbracht und der Prozentanteil an G-CSF-Restaktivität wurde nach folgender Formel ermittelt:
Restmenge an G-CSF
G-CSF-Restak- = nach Verstreichen einer gegebenen Zeit x 100 tivität (%) Anfangsmenge an G-CSF
Die Restmenge an G-CSF, bestimmt nach dieser Methode, stand in sehr guter Übereinstimmung mit dem 9
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Ergebnis, das bei der Messung nach der Weichagarmethode (a) unter Verwendung von Mausknochenmarkzellen erhalten wurde.
Beispiel 1 zu 5 ug G-CSF wurde eines der in Tabelle 1 angeführten Stabilisierungsmittel hinzugefügt und das Gemisch wurde aseptisch in einer 20 mM Pufferlösung (enthaltend 100 mM Natriumchlorid; ph 7,4) gelöst, um ein 5 ug G-CSF pro ml enthaltendes pharmazeutisches Präparat zu erhalten, welches sodann gefriergetrocknet wurde. Die zeitabhängige Änderung in der G-CSF-Aktivität wurde nach der Methode (a) gemessen und die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusamengefaßt. Der Ausdruck "Aktivität (%)" in der Tabelle steht für die Restaktivität von G-CSF in bezug auf die Anfangseinheit und wird nach folgender Formel bestimmt:
Aktivitätseinheit O
Aktivität (%) = Ablauf einer gegebenen Zeit x 100 anfängliche Aktivitätseinheit
Die Gefriertrocknung wurde in folgender Weise durchgeführt:
Die ein Stabilisierungsmittel enthaltende G-CSF-Lösung wurde in ein sulfa-behandeltes Glasfläschchen eingebracht, bei -40 ’C oder darunter 4 Stunden lang gefroren, einer Primärtrocknung durch Erwärmen von -40*C auf 0*C während einer Zeitdauer von 48 Stunden bei Erhöhung des Druckes von 0,03 auf 0,1 Torr unterworfen, und dann einer Sekundärtrocknung durch Erwärmen von 0*C auf 20 *C während einer Zeitdauer von 12 Stunden bei Erhöhung des Druckes von 0,03 auf 8 Torr ausgesetzt; hierauf wurde des Innere des Fläschchens mit sterilem trockenem Stickstoffgas bis zum Erlangen von atmosphärischem Druck gefüllt und das Fläschchen mit einem gefriergetrockneten Gummistopfen verschlossen und mit einer Aluminiumkappe versiegelt. 10
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Tabelle 1
Stabilisierungsmittel Menge (Gew.-Teile) Aktivität (%) Nach 6 Monat Nach 1 Monat Lagerung bei 4 * C Lagerung bei 37 · C Xylitol 10,000 92 86 Mannitol 10,000 91 85 Glucuronsäure 10,000 86 82 Hyaluronsäure 2,000 92 89 Dextran (M 40.000) 2,000 95 90 Heparin 5,000 85 80 Chitosan 2,000 93 91 Alginsäure 2,000 90 90 menschl. Serumalbumin 1,000 98 99 menschl. Serumglobulin 1,000 98 95 säurebehandelte Gelatine 2,000 97 95 alkalibehandelte Gelatine 1,000 99 96 Collagen 2,000 95 90 Polyethylenglycol (M 4.000) 10,000 94 90 Hydroxypropylcellulose 1,000 98 94 Natriumcarboxymethylcellulose 1,000 88 80 Hydroxymethylcellulose 5,000 92 90 Polyvinylalkohol (M 50.000) 2,000 96 95 Polyvinylpyrrolidon (M 50.000) 2,000 95 94 menschl. Serumalbumin 2,000 100 97 Mannitol 2,000 Cystein 100 menschl. Serumalbumin 2,000 99 96 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat 100 Mannitol 2,000 menschl. Serumalbumin 2,000 98 92 Hydroxypropylcellulose 500 Dextran (M 40.000) 2,000 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat 100 98 96 Sorbitol 2,000 polyoxyethyliertes gehärtetes Rizinusöl 100 94 92 Dextran (M 40.000) 2,000 nicht zugesetzt - 74 58 leispiel 2
Zu 10 ug G-CSF wurde eines der in der Tabelle 2 angegebenen Stabilisierungsmittel hinzugefügt und Gemisch wurde aseptisch in 20 mM Phosphatpufferlösung (enthaltend 100 mM Natriumchlorid; pH 7,4) 11
AT 402 259 B um ein pharmazeutisches Präparat enthaltend 10 ug G-CSF pro ml zu erhalten. Das Präparat v ;h in ein sulfa-behandeltes Glasfläschchen eingebracht und versiegelt, um eine G-CSF-Lösui i. Die zeitabhängige Veränderung in der Aktivität des G-CSF in dieser Lösung wurde nach ders e, die in Beispiel 1 angewendet wurde, gemessen, die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben
Tabelle 2 ! Aktivität (^ 3 Menge i Nach Nach Nach Stabilisierungsmittel (Gew.- Teile) 7 Tagen Lagerung bei 4°C 2 Monaten Lagerung bei 4°C 1 1 Monat , Lagerung bei KT Mann!toi 5.000 91 87 82 Hyaluronsäure 2.000 93 87 70 Dextran (M 40.000) 2.000 96 95 85 Glycerin 10.000 90 90 88 Neuraminsäure 5.000 93 91 84 Chitin 2.000 95 92 86 Dextrin 2.000 90 92 87 menschl. Seruna.1 bumin 1.000 99 95 92 irenschl. Serumglobulin M o o o 98 94 90 säurebehandelte Gelatine 2.000 97 96 87 alkalibehandelte Gelatine 500 99 95 92 Collagen-. 2.000 99 94 88 Polyethylenglycol (M 4.000) 10.000 94 89 90 Hydraxyprqpylcellulose 2.000 98 95 92 NatriumraLrbcKymethyl- cellulose 2.000 92 91 80 Hydraxyethylcellulose 4 .000 92 94 90 Polyvinylalkohol <M 50.000) 4.000 97 93 90 Polyvinylpyrrolidcn (M 50.000) 4.000 95 95 92 Sorbitanircnolaurat 400 97 96 95 Polyaxyethylen- sorbitanmonolaurat 400 100 96 94 12
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Tabelle 2 (Fortsetzung)
Aktivität (%) i 1 Stabilisierungsmittel Menge (Gew.- Teile) Nach 7 Tagen Iagerung bei 4°C Nach 2 Monaten Lagerung bei 4°C Nach j 1 Monat 1 Lagerung bei KT I 1 1 1 Polyoxyethylen- sorbitannonostearat 400 98 97 94 Polycscyethylenpolyaxy- prcpylenglykolether 400 100 94 93 polyaxyethyliertes gehärtetes Rizinusöl 4 00 99 98 90 Natriumlaurylsulfat 2.000 97 93 87 Lecithin 2.000 97 94 90 nenschl. Serumalbumin 2.000 Mannitol 2.0.00 100 99 97 Cystein 100 nenschl. Serunalbumin 2.000 Polyaxyethylensorbitan- mgnolaurat 100 99 97 95 Manni.tol 2.000 nenschl. Serumalbumin 1. 000 Hydraxypropylcellulose 500 99 97 95 Dextran (M 40.000) 2.000 PolycKyethylensorbitan-manopa Imitat 100 Sorbitol 2.000 S6 96 93 polyaxyethyliertes gehärtetes Rizinusöl 100 Dextran (M 40.000) 2. 000 95 92 52 nicht zugesetzt - 72 61 47 IO ug G-CSF wurde eines der in der Tabelle 3 angegebenen Stabilisierungsmittel hinzugefügt ur nisch wurde aseptisch in 20 mM Phosphatpufferlösung (enthaltend 100 mM Natriumchlorid; pH 7, 13 3
AT 402 259 B gelöst, um ein 10 ng G-CSF enthaltendes pharmazeutisches Präparat zu erhalten. Ein Milliliter des Präparats wurde in ein sulfa-behandeltes, mit Silicon beschichtetes Glasfläschchen eingebracht und bei 4*C stehen gelassen. Die Wirksankeit eines jeden Stabilisierungsmittels hinsichtlich des Schutzes des G-CSF vor Adsorption wurde durch Messen der Pestaktivität des G-CSF in der Lösung nach 0,5 und 24 Stunden bewertet. Die Messung wurde nach der Methode (b) unter Anwendung der Reverse phase Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. 14
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Tabelle 3
Stabilisierungsmittel Menge (Gew.-Teile) Restaktivität (%) anfangs 0,5 h 2 h 24 h Mannitol 5,000 100 93 90 91 Hyaluronsäure 2,000 100 97 92 92 Dextran (M 40.000) 2,000 100 98 95 96 Glycerin 10,000 100 94 91 90 Heparin 2,000 100 92 90 90 Glucuronsäure 5,000 100 96 90 91 Ketoglycolsäure 5,000 100 92 88 90 menschl.Serumalbumin 1,000 100 100 101 99 menschl. Serumglobulin 1,000 100 98 100 98 alkalibehandelte Gelatine 500 100 99 98 99 säurebehandelte Gelatine 2,000 100 99 97 97 Collagen 2,000 100 100 98 99 Polyethylenglycol (M 4.000) 10,000 100 100 100 99 Hydroxypropylcellulose 2,000 100 100 100 99 Natriumcarboxymethylcellulose 2,000 100 98 96 95 Hydroxyethylcellulose 4,000 100 96 93 92 Polyvinylalkohol (M 50.000) 4,000 100 99 100 98 Polyvinylpyrrolidon (M 50.000) 4,000 100 98 98 96 Sorbitanmonocaprylat 400 100 100 100 98 Polyoxyethylensorbitanmonostearat 400 100 100 98 100 polyoxyethyliertes gehärtetes Rizinusöl 400 100 99 101 99 Natriumlaurylsulfat 2,000 100 100 99 97 Lecithin 2,000 100 99 100 98 menschl. Serumalbumin Mannitol Cystein 2,000 2,000 100 100 100 100 101 menschl. Serumalbumin Polyoxyethylensorbitanmonolaurat Mannitol 2,000 100 2,000 100 100 98 99 menschl. Serumalbumin Hydroxypropylcellulose Dextran (M 40.000) 1,000 500 2,000 100 101 99 100 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat Sorbitol 100 2,000 100 100 99 99 polyoxyethyliertes gehärtetes Rizinusöl Dextran (M 40.000) 100 2,000 100 100 98 97 nicht zugesetzt - 100 91 72 73 15

Claims (1)

  1. AT 402 259 B Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung eines stabilen pharmazeutischen Präparats mit einem Gehalt an Granulocy-tenkolonie stimulierenden Faktor (G-CSF), dadurch gekennzeichnet, daß man G-CSF mit dem nachstehend unter (1) angegebenen Molekulargewicht mit wenigtens einem der Ingredienzien ausgewählt aus den nachstehend unter (2) angegebenen Tensiden, den nachstehend unter (3) angegebenen Sacchariden, den nachstehend unter (4) angegebenen Proteinen und den nachstehend unter (5) angegebenen Verbindungen mit hohem Molekulargewicht in einer nachstehend unter (6) angegebenen Menge vermischt, das resultierende Gemisch in dem nachstehend unter (7) angegebenen Puffer löst, die Lösung sterilisiert und einen Behälter mit der sterilisierten Lösung beschickt, welches pharmazeutische Präparat in einem der nachstehend unter (8) angegebenen Zustände stabil gelagert wird: (1) Molekulargewicht: etwa 19.000 ± 1000, durch Elektrophorese durch ein Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel gemessen; (2) das Tensid ist wenigstens ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem nichtionischen Tensid, einem anionischen Tensid und einem natürlichen Tensid, wobei das nichtionische Tensid ein aliphatischer Sorbitan-Säureester, ein aliphatischer Glycerin-Säureester, ein aliphatischer Polyglycerin-Säureester, ein aliphatischer Polyoxyethylensorbitan-Säureester, ein aliphatischer Polyoxyethylensorbitol-Säureester, ein aliphatischer Polyoxyethylenglycerin-Säureester, ein aliphatischer Polyethylenglykol-Säureester, ein Polyoxyethylenalkylether, ein Polyoxyethylenpolyoxypropy-lenalkylether, ein Polyoxyethylenalkylphenylether, ein polyoxyethyliertes gehärtetes Rizinusöl, ein polyoxyethyliertes Bienenwachsderivat, ein Polyoxyethylenlanolinderivat oder ein aliphatisches Poly-oxyethylen-Säureamid ist, das anionische Tensid ein Alkylsulfatsalz, ein Polyoxyethylenalkylethersul-fatsalz oder ein Sulfobernsteinsäureestersalz ist, und das natürliche Tensid Lecithin, Glycero-phospholipid, Sphingophospholipid oder ein aliphatischer Saccharose-Säureester ist; (3) das Saccharid ist wenigstens ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycerin, Erythritol, Arabitol, Xylitol, Sorbitol, Mannitol, Glucuronsäure, Iduronsäure, Galacturonsäure, Neuram-insäure, Glyconsäure, Mannuronsäure, Ketoglykolsäure, Ketogalactonsäure, Ketogluconsäure, Hyaluronsäure und Salze hiervon, Chondroitinsulfat und Salze hiervon, Heparin, Inulin, Chitin und Derivate hiervon, Chitosan und Derivate hiervon, Dextrin, Dextran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5.000 - 150.000 und Alginsäure und Salze hiervon; (4) das Protein ist wenigstens ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Humanserumalbumin, Humanserumglobulin, Gelatine, säure- oder alkalibehandelte Gelatine mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 7.000 - 100.000 und Collagen; (5) die Verbindung mit hohem Molekulargewicht ist wenigestens ein Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxypropylcellulose, Hydroxymethylcellulose, Natriumcarboxymethylcel-lulose, Hydroxyethylcellulose, Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von 300 - 6.000, Polyvinylalkohol mit einem Molekulargewicht von 20.000 bis 100.000 und Polyvinylpyrrolidon mit einem Molekulargewicht von 20.000 - 100.000; (6) Mengen der Bestandteile in Gewichtsteilen; G-CSF 1 Tensid 1-10.000 Saccharid 1-10.000 Protein 1-20.000 Substanz mit hohem Molekulargewicht 1-20.000 (7) Puffer: Phosphatpuffer; und (8) Lagerungszustand: Lösungspräparat und gefriergetrocknetes Präparat. 16
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