DE60029614T2

DE60029614T2 - Formulierung einer wässrigen interferon-alpha lösung

Info

Publication number: DE60029614T2
Application number: DE60029614T
Authority: DE
Inventors: Young Cheol Daedeok-gu KANG; Sang-Heon Chung-ku LEE; Kyuboem Yusong-ku HAN
Original assignee: LG Chem Investment Co Ltd
Current assignee: LG Corp
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 2000-11-17
Publication date: 2007-07-12
Anticipated expiration: 2020-11-18
Also published as: RU2002116364A; ZA200204096B; CN1391478A; JP2003514027A; KR100399156B1; HUP0203706A2; AU1421601A; DE60029614D1; ATE333891T1; EP1231933A1; ES2267584T3; EP1231933B1; DK1231933T3; TWI223596B; WO2001035987A1; TR200201310T2; PT1231933E; CA2391889A1; MXPA02005105A; AR026507A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabile wäßrige Lösungsformulierung von α-Interferon (α-IFN), die kein menschliches Serumalbumin enthält.
Beschreibung des Standes der Technik
Die meisten Proteine denaturieren oder verlieren ihre biologische Aktivität in wäßriger Lösung leicht. Aus diesem Grund haben viele pharmazeutische Firmen gefriergetrocknete Formulierungen entwickelt, um die Stabilität der Proteinarzneimittelprodukte zu verbessern. Die gefriergetrocknete Formulierung der Proteinarzneimittel hat jedoch viele Nachteile. Das das Gefriertrocknungsverfahren teuer ist und zusätzlich einen Rekonstitutionsschritt des Proteinarzneimittels vor der Verabreichung des Arzneimittels an den Patienten verlangt, ist es gegenüber flüssigen Formulierungen in Bezug auf die Wirtschaftlichkeit und Bequemlichkeit nicht bevorzugt. Diese Punkte wurden auch bei der Entwicklung von Formulierungen von α-IFN berücksichtigt.
Interferon (IFN) spielt eine Rolle beim Wachstum, der Differenzierung und der Funktion von normalen und Tumorzellen und ist eines der Proteincytokine, die die Multiplikation einer Vielzahl an Viren hemmen. Spezifisch steuert IFN die Aktivität von natürlichen Killerzellen (NK), steigert die Aktivität des cytotoxischen T-Lymphozyten und erhöht die phagozytische Aktivität der Makrophagen. Dadurch mediiert IFN letztlich die Immunreaktion von durch Virus usw. infizierten Zellen. IFN kann abhängig von der Art der sekretierenden Zellen oder der induzierenden Materialien in α, β und γ kategorisiert werden. Unter ihnen sind die α- und β-Formen sogar bei pH 2 stabil, aber die γ-Form ist unter sauren Bedingungen instabil.
Unter den drei Formen wurde α-Interferon seit langer Zeit als antivirales Mittel verwendet, da es bei der Behandlung von viralen Krankheiten, einschließlich Hepatitis C, hocheffektiv ist. Daher haben viele Forscher kontinuierliche Anstrengungen unternommen, um Formulierungen zu entwickeln, die die Aktivität von α-Interferon über eine längere Zeitspanne beibehalten können.
Das US-Patent 4,496,537 betrifft eine lyophilisierte Formulierung von α-Interferon enthaltend Alanin (oder Glycin) und menschlich Serumalbumin als Stabilisator und ein Puffersystem, um den pH in der Lösung bei 6,5 bis 8,0 zu halten. Ebenso betrifft das US-Patent 4,847,079 eine wäßrige Formulierung von α-Interferon enthaltend menschliches Serumalbumin, Glycin, Thimerosal und ein Puffersystem, um den pH bei 6,5 bis 8,0 zu halten. Interessanterweise sind beide der oben erwähnten Patente dadurch gekennzeichnet, daß die Formulierungen menschliches Serumalbumin enthalten, das zur Aufrechterhaltung der biologischen Aktivität von α-Interferon wirksam ist. Wenn die Formulierung menschliches Serumalbumin enthält, ist jedoch die Wahrscheinlichkeit hoch, daß die Formulierung potentiell durch infektiöse Pathogene, wie menschliches Immundefizienzvirus (HIV) und Hepatitis B-Virus (HBV) kontaminiert ist, hoch. Daher wird es derzeit nicht empfohlen, menschliches Serumalbumin zu verwenden. Außerdem ist bekannt, daß das obige Albumin bei einigen Menschen Immunreaktionen auslösen kann.
Das europäische Patent 0 736 303 A2 offenbart eine wäßrige α-Interferonformulierung, enthaltend Polysorbat als Stabilisator und Benzylalkohol als antimikrobielles Konservierungsmittel und mit einem Puffersystem, um den pH im Bereich von 4,5–5,5 zu halten. In dem obigen Patent wird Polysorbat, das sicher ist, anstelle von möglicherweise schädlichem menschlichem Serumalbumin verwendet. Es ist jedoch bekannt, daß die antimikrobielle Aktivität von Benzylalkohol abnimmt, wenn er mit nichtionischen Tensiden, wie Polysorbat 80, verwendet wird. Tatsächlich, wurde entdeckt, daß nicht zulässig ist, Polysorbat 80 mit Benzylalkohol zu verwenden (Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association, 1986, 5.18). Daher sollte eine relativ große Menge an Benzylalkohol (0,9, 1,0%) verwendet werden, um die antimikrobielle Aktivität aufrechtzuerhalten. Eine solche übermäßige Verwendung von Benzylalkohol kann jedoch die Aggregation von Peptiden verursachen (Richard L. Remmele et al., Pharmaceutical Research, Bd. 15, Nr. 2, 1998). Gemäß den durch die hiesigen Erfinder beobachteten beschleunigten Tests der α-Interferonformulierung bei 40°C hatte die flüssige 1,0% Benzylalkohol und 0,02% Polysorbat 80 enthaltende Formulierung auch eine viel niedrigere Aktivität von α-Interferon als die Phenol (oder m-Cresol) und 0,02% Polysorbat 80 enthaltende Formulierung.
WO 96/11018 betrifft eine wäßrige Lösungsformulierung enthaltend Polysorbat und einen Chelator, wie Dinatrium-EDTA, und ein Konservierungsmittel. Die obige flüssige Formulierung ist jedoch möglicherweise gesundheitsgefährdend, da sie Dinatrium-EDTA umfaßt, von dem bekannt ist, daß es cytotoxisch ist (Paula Saarien-Savolainen et al., Pharmaceutical Research, Bd. 15, Nr. 2, 1998), und sie hat einen anderen Nachteil, da sie Chelatkomplexe mit Calciumionen innerhalb des menschlichen Körpers bilden kann. Außerdem ist von Citrat, das in dem obigen Patent als ein anderer Chelator erwähnt ist, ist auch bekannt, daß es starke Schmerzen hervorruft, wenn es an den Körper verabreicht wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Um die oben erwähnten Probleme zu lösen, haben die hiesigen Erfinder Untersuchungen durchgeführt, um eine wäßrige Lösungsformulierung von α-Interferon zu entwickeln, bei der die biologische Aktivität von α-Interferon über eine lange Zeitspanne erhalten bleibt und die sehr stabil ist, und die weder möglicherweise gesundheitsgefährdendes menschliches Serumalbumin noch einen Chelator enthält. Die hiesigen Erfinder haben die vorliegende Erfindung durch Entwicklung einer wäßrigen Lösungsformulierung von α-Interferon bewerkstelligt, die die biologische Aktivität von α-Interferon über eine lange Zeitspanne beibehalten kann und die Menge an Konservierungsmittel mittels Verwendung von Polysorbat als Stabilisator und Phenol, m-Cresol oder Mischungen davon als antimikrobielles Konservierungsmittel minimiert.
Es ist ein erfindungsgemäßes Ziel, eine stabile wäßrige Lösungsformulierung von α-Interferon bereitzustellen, bei der die biologische Aktivität und die physikochemische Stabilität über eine lange Zeitspanne aufrechterhalten bleiben können und die die in dem von der Europäischen Pharmacopeia verlangten antimikrobiellen Effizienztest für antimikrobielle Konservierungsmittel beschriebenen Zulässigkeitskriterien erfüllen kann, obwohl sie nur eine sehr kleine Menge an Konservierungsmitteln enthält.
Es ist auch ein anderes erfindungsgemäßen Ziel, eine sichere wäßrige Lösungsformulierung von α-Interferon bereitzustellen, bei der die antimikrobiellen Aktivitäten ohne möglicherweise für den menschlichen Körper schädlichen Materialien, wie menschliches Serumalbumin oder Chelatoren, aufrechterhalten bleiben.
Die vorliegende Erfindung stellt eine wäßrige Lösungsformulierung von α-Interferon bereit, die aus α-Interferon; Polysorbat 80 als Stabilisator; einem den osmotischen Druck kontrollierenden Mittel; antimikrobiellen Konservierungsstoffen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phenol, m-Cresol oder einer Mischung davon; und einem Puffersystem besteht.
Erfindungsgemäß wird eine stabile Lösungsformulierung von α-Interferon bereitgestellt. Es wird auch eine sicherere wäßrige Lösungsformulierung von α-Interferon bereitgestellt. Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden mit Bezug auf die folgende Beschreibung und die anhängenden Ansprüche besser verstanden werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das den Effekt des Stabilisators auf die biologische Aktivität von α-Interferon (α-IFN) zeigt, wenn die erfindungsgemäße wäßrige Lösungsformulierung 4 Monate bei 4°C gelagert wird.
2a ist ein Diagramm, das den Effekt der antimikrobiellen Konservierungsstoffe auf die Stabilität der wäßrigen Lösungsformulierung von α-IFN (6 × 10⁶ IU/ml) durch Messung der biologischen Aktivität von α-IFN zeigt, wenn die erfindungsgemäße wäßrige Lösungsformulierung 36 Wochen bei 4°C gelagert wird.
2b ist ein Diagramm, das den Effekt der antimikrobiellen Konservierungsstoffe auf die Stabilität der wäßrigen Lösungsformulierung von α-IFN (6 × 10⁶ IU/ml) durch Messung der biologischen Aktivität von α-IFN zeigt, wenn die erfindungsgemäße wäßrige Lösungsformulierung 16 Wochen bei 40°C gelagert wird.
3a ist ein Diagramm, das den Effekt des pH auf die Stabilität der wäßrigen Lösungsformulierung von α-IFN (6 × 10⁶ IU/ml) durch Messung der biologischen Aktivität von α-IFN zeigt, wenn die erfindungsgemäße wäßrige Lösungsformulierung 12 Wochen bei 40°C gelagert wird.
3b ist eine Photographie, die den Effekt des pH auf die Dimerisierung von α-IFN zeigt, die durch Silberfärbung des Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophoresegels nach 12-wöchiger Lagerung bei 40°C bestimmt wird.
Die 4a, 4b und 4c sind Diagramme, die die Unterschiede der biologischen Aktivitäten zwischen Formulierungen zeigen, die eine Mischung von 0,15% Phenol und 0,1% m-Cresol umfassen, und Formulierungen, die 0,3% Phenol allein als einen antimikrobiellen Konservierungsstoff umfassen, wenn die wäßrigen Lösungsformulierungen von α-IFN (6 × 10⁶ IU/ml) 12 Wochen bei 4°C, 25°C bzw. 40°C gelagert werden.
Die 4d, 4e und 4f sind Diagramme, die die Unterschiede der Reinheit zeigen, die durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeits chromatographie (reverse phase-high performance liquid chromatography, RP-HPLC) bestimmt werden, zwischen Formulierungen umfassend eine Mischung von 0,15% Phenol und 0,1% m-Cresol und Formulierungen umfassend 0,3% Phenol allein als antimikrobiellen Konservierungsstoff, wenn die wäßrigen Lösungsformulierungen von α-IFM (6 × 10⁶ IU/ml) 12 Wochen bei 4°C, 25°C bzw. 40°C gelagert werden.
Detaillierte Beschreibung
Um die obigen Ziele zu erreichen, stellt die vorliegende Erfindung eine wäßrige Lösungsformulierung von α-Interferon bereit, die aus α-Interferon; Polysorbat 80 als Stabilisator; einen den osmotischen Druck regulierenden Mittel; antimikrobiellen Konservierungsstoffen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phenol, m-Cresol oder Mischungen davon; und einem Puffersystem besteht.
Der Begriff "α-Interferon" schließt erfindungsgemäß alle Arte von α-Interferonen ein, die in rekombinanten Bakterien, Hefen und Tierzellen exprimiert und gereinigt werden. Das heißt, der Begriff "α-Interferon", wie hierin verwendet, schließt natürliches und rekombinantes α-Interferon ein. Außerdem können α-Interferon-Analoga oder Varianten, wo die Aminosäuren von natürlichem menschlichen α-Interferon teilweise ersetzt sind, während mehr als 50% der Aktivität von natürlichem menschlichen α-Interferon erhalten bleiben, in die erfindungsgemäße wäßrige Lösungsformulierung eingeschlossen werden. Die zu der erfindungsgemäßen wäßrigen Lösungsformulierung zugegebene Menge an α-Interferon liegt bevorzugt im Bereich von 1 × 10⁶ IU/ml~1 × 10⁸ IU/ml.
Der Stabilisator, der dabei hilft, die Stabilität von α-Interferon in der erfindungsgemäßen wäßrigen Lösungsformulierung aufrechtzuerhalten, ist Polysorbat 80, und die Konzentration von Polysorbat 80 liegt bevorzugt im Bereich von 0,01~0,05 G/V%.
Die erfindungsgemäße wäßrige Lösungsformulierung umfaßt außerdem Konservierungsstoffe, einschließlich Phenol und/oder m-Cresol, um das Wachstum von Mikroorganismen zu hemmen. Bevorzugt liegt die Phenolkonzentration im Bereich von 0,1~0,3 G/V%, bevorzugt liegt die m-Cresol-Konzentration im Bereich von 0,1~0,2 G/V%, und eine geeignete Mischung von Phenol und m-Cresol kann auch in den erfindungsgemäßen wäßrigen Lösungsformulierungen eingeschlossen sein.
Das Puffersystem in der erfindungsgemäßen wäßrigen Lösungsformulierung schließt Acetatpufferlösung oder Phosphatpufferlösung ein. Insbesondere ist ein Puffersystem bestehend aus Ammoniumacetat und Essigsäure oder ein Puffersystem bestehend aus Natriummonohydrogenphosphat (Na₂HPO₄) und Natriumdihydrogenphosphat (NaH₂PO₄) bevorzugt. Außerdem liegt die Konzentration des obigen Puffersystems in der erfindungsgemäßen wäßrigen Lösungsformulierung bevorzugt im Bereich von 5~20 mM. Der pH der erfindungsgemäßen wäßrigen Lösungsformulierung hängt von den obigen Puffersystemen ab. Der pH der erfindungsgemäßen wäßrigen Lösungsformulierung liegt in den meisten Fällen im Bereich von 4,0~8,0 und bevorzugt im Bereich von 4,5~6,0.
Die erfindungsgemäße wäßrige Lösungsformulierung kann auch ein den osmotischen Druck regulierendes Mittel, wie Natriumchlorid, einschließen. Die Menge des den osmotischen Druck regulierenden Mittels hängt von den anderen Komponenten in der Formulierung ab. Letztlich wird die erfindungsgemäße wäßrige Lösungsformulierung unter sterilen Bedingungen hergestellt.
Um bevorzugte Stabilisatoren zu suchen, wurden bei der vorliegenden Erfindung wäßrige Lösungsformulierung, umfassend mehrere für injizierbare Formulierungen nützliche Exzipienten in verschiedenen Konzentrationen hergestellt, und der Effekt des Stabilisators auf die biologische Aktivität von α-Interferon wurde untersucht. Die Ergebnisse nach 4-monatiger Lagerung bei 4°C zeigten, daß die Aktivitäten der wäßrigen Lösungsformulierungen, die menschliches Serumalbumin, Polysorbat 80, Polyethylenglykol bzw. Gelatine als Stabilisatoren umfassen, mehr als 90% der anfangs eingefüllten biologischen Aktivität vor Lagerung betrugen, während die Aktivität der wäßrigen Lösungsformulierung, die nur α-Interferon und ein Puffersystem umfaßt, ungefähr 80% der anfänglich eingefüllten biologischen Aktivität vor Lagerung betrug. Dies ist wahrscheinlich so, weil die obigen Stabilisatoren die Adsorption von α-Interferon an der Innenoberfläche der Ampulle verhindern. Die Verwendung von menschlichem Serumalbumin und Gelatine wird jedoch in letzter Zeit aufgrund der wachsenden Bedenken in Bezug auf eine mögliche Kontaminierung mit infektiösen Viren, wie HIV, HBV usw., nicht empfohlen. Außerdem kann sie für bestimmte Menschen immunogen sein. Daher wird Polysorbat 80 erfindungsgemäß als der am besten geeignete Stabilisator ausgewählt.
Die hiesigen Erfinder haben auch den Effekt der Konzentrationen von Polysorbat 80 und den antimikrobiellen Konservierungsstoffen auf das Aussehen der wäßrigen Lösungsformulierungen untersucht. Im Ergebnis beeinflußte Polysorbat im Bereich von 0,01~0,02% die Klarheit der wäßrigen Lösungsformulierungen nicht. Die wäßrigen Lösungsformulierungen wurden jedoch trüb, wenn mehr als 0,15% m-Cresol verwendet wurde, und der Grad der Trübung war proportional zu der Konzentration von m-Cresol. Wenn Phenol als antimikrobieller Konservierungsstoff verwendet wurde, beeinflußte Phenol im Bereich von 0,1~0,3% die Klarheit der wäßrigen Lösungsformulierungen nicht, aber die wäßrige Lösungsformulierung wurde trüb, wenn mehr als 0,3% Phenol verwendet wurde.
Obwohl die wäßrige Lösungsformulierung umfassend Phenol eine etwas größere Fähigkeit besitzt, die biologische Aktivität zu bewahren, als es die wäßrige Lösungsformulierung umfassend m-Cresol oder Benzylalkohol tut, ist der Unterschied nicht groß. In dem Fall, daß die wäßrige Lösungsformulierung bei der hohen Temperatur von 40°C gelagert wurde, nahm die biologische Aktivität der Benzylalkohol umfassenden wäßrigen Lösungsformulierung jedoch stark ab.
Die biologische Aktivität sowie die Dimerisierung von α-Interferon werden durch den pH beeinflußt. Die biologische Aktivität von α-Interferon ist bei ca. pH 5,8 relativ stabil, und eine Dimerisierung war bei höherem pH häufiger. Daher ist es für eine Langzeitlagerung der wäßrigen Lösungsformulierung von α-Interferon nicht bevorzugt, einen hohen pH zu haben.
Außerdem haben die hiesigen Erfinder die Effekte von antimikrobieller Konservierung auf die wäßrigen Lösungsformulierungen, die eine Vielzahl an Zusammensetzungen und Konzentrationen von Konservierungsstoffen umfassen, gemäß dem Protokoll zum Test der Wirksamkeit von antimikrobieller Konservierung in der Europäischen Pharmakopoeia (European Pharmacopoeia 1997, 5.1.3 Efficacy of Antimicrobial Preparation) untersucht. Das konkrete Protokoll zum Test der Wirksamkeit von antimikrobieller Konservierung in der Europäischen Pharmakopoeia wird in Referenzbeispiel 3 und im folgenden kurz beschrieben.
Fünf Spezien von Standardstämmen, von denen beschrieben ist, daß sie in diesem Test verwendet werden (Standardstämme von Gram-positiven und -negativen Bakterien und Fungi Genus), wurden künstlich bei einer Konzentration von 10⁵ bis 10⁶ Zellen pro 1 ml der wäßrigen Lösungsformulierung inkubiert. Zu bestimmten Zeitintervallen wurde von einem Teil einer Formulierung eine Probe entnommen, und der Grad der Veränderung in der Anzahl der lebenden Zellen wurde logarithmisch transformiert. Die obigen logarithmisch transformierten Werte (Log-Reduktionswerte) wurden mit den Werten in der Europäischen Phamakopoeia, Tabelle 5.1.3-1 verglichen, um das Ausmaß der antimikrobiellen Aktivität zu schätzen. Eine Klassifikation zwischen dem in der Europäischen Pharmakopoeia beschriebenen Kategorien A und B kann aus dem Unterschied der Log-Reduktionswerte der interessierenden Mikroorganismen über den Verlauf der Zeit erhalten werden. Im Fall von Bakterien schreibt die Kategorie A vor, daß zwei Log-Reduktionen innerhalb 6 Stunden und 3 Log-Reduktionen innerhalb von 24 Stunden in der Anzahl von lebenden Mikroorganismen gegen den für das Inkubat erhaltenen Wert auftreten sollten, und die Kategorie B schreibt vor, daß eine Log-Reduktion innerhalb von 24 Stunden und 3 Log-Reduktionen innerhalb von 7 Tagen von der Inkubierung auftreten sollten. Ähnlich schreibt die Kategorie A im Fall von Pilzen vor, daß 2 Log-Reduktionen innerhalb von 7 Tagen auftreten sollten, und die Kategorie B schreibt vor, daß eine Log-Reduktion innerhalb 14 Tagen auftreten sollte. Nach der oben vorgeschriebenen Zeit sollte außerdem keine Erholung oder kein Anstieg der Anzahl an lebenden Mikroorganismen beobachtet werden. Die oben für jede Kategorie beschriebenen Log-Reduktionswerte werden auf injizierbare Formulierungen und Augentropfen angewandt, und die erfindungsgemäße wäßrige Lösungsformulierung von α-Interferon fällt unter diese Vorschrift. Daher haben die hiesigen Erfinder durch Herstellung von mehreren wäßrigen Lösungsformulierungen von α-Interferon, die verschiedene Konservierungsstoffe umfassen, und Schätzen der relativen antimikrobiellen Aktivität durch Durchführung des antimikrobiellen Wirksamkeitstests gegen fünf Spezien von Standardstämmen versucht, die beste Formulierung zu bestimmen.
Im Ergebnis erfüllten sowohl die 0,2% Phenol und 0,1% m-Cresol umfassende Formulierung als auch die 0,15% Phenol und 0,1% m-Cresol umfassende Formulierung die Kategorien A und B aus der Europäischenen Pharmakopoeia gegen Aspergillus niger, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Escherichia coli. Im Falle der 0,15% Phenol und 0,1% m-Cresol umfassenden Formulierung ist die Gesamtmenge der Konservierungsstoffe jedoch 0,25% der Formulierung. Deshalb ist die 0,15% Phenol und 0,1% m-Cresol umfassende Formulierung im Hinblick auf die Sicherheit bevorzugter, da sie die geringste Menge an Konservierungsstoffen hat.
Die zuvor beschriebenen Versionen der vorliegenden Erfindung haben viele Vorteile, einschließlich des Bereitstellens einer stabilen wäßrigen Lösungsformulierung von α-Interferon, bei der die biologische Aktivität von α-Interferon über eine längere Zeitspanne aufrechterhalten werden kann, indem die Adsorption von α-Interferon an der Oberfläche der Ampulle verhindert wird;
des Bereitstellens einer wäßrigen Lösungsformulierung von α-Interferon, in der die biologische Aktivität sowie die antimikrobielle Aktivität von α-Interferon aufrechterhalten werden können, indem die Menge an Konservierungsstoffen minimiert wird;
des Bereitstellens einer sichereren wäßrigen Lösungsformulierung von α-Interferon mit einer minimalen Menge an Konservierungsstoffen, da es bekannt ist, daß die Verwendung einer großen Menge der Konservierungsstoffe für den menschlichen Körper schädlich ist;
des Bereitstellens einer wäßrigen Lösungsformulierung von α-Interferon, die keine möglicherweise für den menschlichen Körper schädlichen Materialien, wie menschliches Serumalbumin oder Chelatoren enthält; und
des Bereitstellens einer wäßrigen Lösungsformulierung von α-Interferon, die sehr stabil ist.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Es wird für den Fachmann offensichtlich sein, daß diese Beispiele nur angegeben sind, um die vorliegende Erfindung detaillierter zu veranschaulichen, aber die Erfindung nicht auf die angegebenen Beispiele beschränkt ist.
Referenzbeispiel 1: Herstellung von gereinigtem rekombinantem α-IFN
Gereinigtes α-Interferon für die Formulierungsstudie wurde durch das Wirkstoffherstellungsverfahren von Intermax-α^TM (Interferon-α 2a, LG Chemical LTD) hergestellt.
Nachdem rekombinanter Saccharomyces cerevisiae, enthaltend eine Geninsertion für menschliches α-Interferon (Saccharomyces cerevisiae pYLBC A/G αf α-IFN; Hinterlegungs-Nr. KCTC 0051BP bei der Korean Collection for Type Cultures des Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, hinterlegt am 2. Juli 1992) fermentiert wurde, wurde alpha-Interferon mit einer umkehrphasenchromatographischen Reinheit höher als 95% durch mehrere Reinigungsschritte einschließlich Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltrationschromatographie erhalten. Für genauere Details wird auf die koreanische Patentanmeldung Nr. 1992-25912, eingereicht am 28. Dezember 1992, mit dem Titel "Purification process of α-Interferon expressed in recombinant yeast", jetzt koreanisches Patent Nr. 111251, die hierin durch das Zitat einbezogen wird, verwiesen.
Referenzbeispiel 2: Herstellung der wäßrigen Lösungsformulierung von α-Interferon und Abschätzung ihrer biologischen Aktivität
Wäßrige Lösungsformulierungen von α-Interferon mit der folgenden Zusammensetzung wurden hergestellt:
α-Interferon: 1 × 10⁶ IU/ml~100 × 10⁶ IU/ml;
Polysorbat 80: 0,1~0,5 mg/ml;
Phenol: 1,5 mg/ml;
m-Cresol: 1,0 mg/ml; und
ein Puffersystem umfassend 10 mM Acetatpufferlösung oder 10 mM Phosphatpufferlösung
Die biologische Aktivität der wie oben hergestellten wäßrigen Lösungsformulierung von α-Interferon wurde gemäß den in der Monographie 1997: 1110 "Interferon alfa-2 concentrated solution" der Europäischen Pharmakopoeia beschriebenen Vorgehensweisen getestet. Mit anderen Worten wurde der zellprotektive Effekt der wäßrigen Lösungsformulierung von α-Interferon gegenüber einer Infektion der Zelle durch Viren gemessen, um die internationalen Einheiten (IU) durch Vergleich mit denen des internationalen Standards für rekombinantes menschliches Interferon α-2 (IFN α-2) oder einem Laborarbeitsstandard zu berechnen.
Unter den Kulturbedingungen von 37°C und 5% CO₂ wurden MDBK-Zellen (Madin-Derby Bovine Kidney cells: ATCC Nr. CCL22) in Mikrotiterplatten kultiviert, um eine Zellmonolage zu bilden. Und dann wurden mehr als drei unterschiedliche Konzentrationen von α-Interferon-Testprobe und α-Interferon-Arbeitsstandard, der mit dem internationalen Standard für rekombinantes menschliches α-Interferon von NIH (Katalog-Nr.: Gxa01-901-535, USA) kalibriert war, zu den Mikrotiterplatten gegeben und kultiviert. Eine Serie von Mikrotiterplatten enthielt Zellen, die nicht mit α-Interferon behandelt waren, und diese wurden als negative Kontrollen verwendet. Nach 18 bis 24 Stunden Kultivieren unter den Kulturbedingungen von 37°C und 5% CO₂ wurde die behandelte α-Interferonlösung verworfen, und cytopathischer Vesikularstomatitis-Virus (ATCC Nr. VR-158) wurde in die Vertiefungen aller Platten außer den Kontrollen gegeben. Nach 24–48 Stunden Kultivieren wurden die Mikrotiterplatten durch Kristallviolett gefärbt und an der Luft getrocknet. Nachdem Ethylenglykol zu jeder Vertiefung zugegeben wurde, um die Färbefarbstoffe zu extrahieren, wurde die Absorption bei 600 nm unter Verwendung eines Mikroplattenspektrophotometers gemessen. Die Absorptionswerte der Standard- und Testlösungen wurden in bezug auf die Dosis von α-Interferon aufgetragen, so dass sich eine lineare Beziehung ergibt. Dann wurden die Titer der Testlösungen durch Vergleich unter Verwendung des Analyseverfahrens der parallelen Linien berechnet.
Referenzbeispiel 3 – Test der antimikrobiellen Wirksamkeit der wäßrigen Lösungsformulierung von α-Interferon
Die für den Test verwendeten fünf Spezien von Standardstämmen waren wie folgt: Zwei Spezien von Pilzstämmen, Aspergillus niger (ATCC 16404) und Candida albicans (ATCC 10231), und drei Spezies von Bakterienstämmen, Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Staphylococcus aureus (ATCC 6538) und Escherichia coli (ATCC 8739) wurden verwendet.
Agar B (15 g/l Casitone, 5 g/l Soytone, 5 g/l NaCl, 18 g/l Agar, pH 7,3 ± 0,2) wurde für die feste Kultur der Bakterien verwendet, und Agar C (10 g/l Pepton, 40 g/l Glucose, 15 g/l Agar, pH 5,6 ± 0,2) wurde für die feste Kultur der Pilze verwendet. Die Bakterien wurden bei 30~35°C 18~24 Stunden kultiviert, und die Pilze wurden bei 20~25°C 24~48 Stunden im Falle von Candida albicans und 2~7 Tage im Falle von Aspergillus niger kultiviert.
Im Fall von Aspergillus wurden die nach Kultur über etwa 5 Tage gebildeten schwarzen Sporen gesammelt und anstelle der Pilze für den Test verwendet.
Um Standardstämme in einem Gefäß, enthaltend die wäßrigen Lösungstestformulierungen von α-Interferon in einer Konzentration von 10⁵ bis 10⁶ Zellen (Sporen im Falle von Aspergillus)/ml der Standardstämme direkt zu inkubieren, wurde die Zellkonzentration vor der Inkubation auf 10⁷ bis 10⁸ Zellen (oder Sporen)/ml mit Verdünnungspuffer verdünnt, und dann wurde die verdünnte Zellsuspension zu der wäßrigen Lösungsformulierung gegeben, so daß die Menge der zugegebenen Zellsuspension 1 (V/V)% der wäßrigen Lösungsformulierung betrug. Als Verdünnungspuffer wurde der Verdünnungspuffer A (9 g/l NaCl, 1 g/l Pepton) für Bakterien und Candida verwendet, und der Verdünnungspuffer B (9 g/l NaCl, 0,5 g/l Polysorbat 80) wurde für Aspergillus verwendet.
Nachdem die Suspensionen der Standardstämme mit den wäßrigen Lösungstestformulierungen inkubiert worden waren, wurden jeweils 0,1~0,5 ml der Testformulierungen bei 0 Stunden, 6 Stunden, 24 Stunden, 7 Tagen, 14 Tagen bzw. 28 Tagen als Probe genommen, und die Lösungsproben wurden 1- bis 10³-fach unter Verwendung der Verdünnungspuffer verdünnt. Dann wurden die verdünnten Proben auf festes Agarmedium geschmiert und bei den oben beschriebenen Kulturtemperaturen kultiviert. Die Anzahl lebender Zellen pro 1 ml der Probe wurde durch Zählen der aus der festen Kultur gebildeten Kolonienzahl berechnet. In der Zwischenzeit wurden die wäßrigen Lösungstestformulierungen in einem Inkubator bei 20~25°C unmittelbar nach der Probenahme gelagert. Als Verfahren zur Schätzung der Anzahl lebender Zellen und Testmedien wurden die in der Europäischen Pharmakopoeia (EP 1997, 2.6.12) beschriebenen verwendet.
Beispiel 1: Suche nach bevorzugten Stabilisatoren
Das nachfolgende Experiment wurde durchgeführt, um nach bevorzugten Stabilisatoren zu suchen, die die biologische Aktivität von α-Interferon durch Verhinderung der Absorption von α-Interferon an der Oberfläche einer Ampulle aufrechterhalten.
Zuerst wurden wäßrige Lösungsformulierungen umfassend mehrere für injizierbare Formulierungen nützliche Exzipienten in verschiedenen Konzentrationen wie in Tabelle 1 beschrieben hergestellt, und Natriumchlorid wurde zugegeben, um die Tonizität einzustellen. Jede wäßrige Lösungsformulierung wurde 4 Monate bei 4°C gelagert, um die biologische Aktivität von α-Interferon in jeder der Formulierung gemäß dem in Referenzbeispiel 2 beschriebenen Verfahren abzuschätzen. Die Ergebnisse sind in 1 und Tabelle 1 unten gezeigt. 1 ist ein Diagramm, das die relative biologische Aktivität (%) von α-Interferon in Bezug auf die eingefüllte biologische Aktivität der wäßrigen Lösungsformulierung, enthaltend 9 × 10⁶ IU/ml α-Interferon zeigt.
Die Formulierungen der negativen Kontrollen, die nur α-Interferon und Puffersystem umfassen, behielten etwa 80% der anfangs eingefüllten biologischen Aktivität bei. Andererseits behielt die wäßrige Lösungsformulierung, umfassend menschliches Serumalbumin, Polysorbat 80, Polyethylenglykol oder Gelatine mehr als 90% der anfangs eingefüllten biologischen Aktivität bei. Dies ist wahrscheinlich so, da die Absorption von α-Interferon an der Oberfläche der Ampulle durch die obigen Zusätze verhindert wird.
Obwohl die obigen Zusätze dazu beitragen, die biologische Aktivität von α-Interferon aufrechtzuerhalten, ist die Verwendung von menschlichem Serumalbumin und Gelatine für injizierbare Formulierungen aufgrund der potentiellen Verunreinigungsprobleme durch schädliche Viren beschränkt. Daher ist Polysorbat 80 der geeignetste Stabilisator.
Beispiel 2: Effekt der Konzentrationen von Polysorbat 80 und der antimikrobiellen Konservierungsstoffe auf das Aussehen der wäßrigen Lösungsformulierungen
Als vorbereitendes Experiment zur anfänglichen Auswahl der wäßrigen Lösungsformulierung von α-Interferon wurde der Effekt der Konzentration von Polysorbat 80 und der antimikrobielle Konservierungsstoffe auf das Aussehen der wäßrigen Lösungsformulierungen untersucht. 100 ml der wäßrigen Lösungsformulierungen von α-Interferon umfassend Polysorbat 80 und antimikrobielle Konservierungsmittel einschließlich Phenol, m-Cresol oder Mischungen davon in verschiedenen Konzentrationen wurden hergestellt. Dann wurde die Tonizität und der pH jeder Formulierung unter Verwendung von 0,8% Natriumchlorid bzw. 10 mM Ammoniumacetatpuffer eingestellt. Der pH jeder Formulierung wurde auf 5,3 eingestellt.
Die Farbe und die Trübung der obigen wäßrigen Lösungsformulierungen, umfassend Polysorbat 80 und antimikrobielle Konservierungsstoffe in verschiedenen Konzentrationen wurden mit dem Auge beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten gezeigt.
Tabelle 2: Veränderungen des Aussehens der wäßrigen Lösungsformulierungen von α-Interferon in Abhängigkeit von den Konzentrationen von Polysorbat 80 und den antimikrobiellen Konservierungsstoffen
Wenn mehr als 0,15% m-Cresol verwendet wurden, wurden die wäßrigen Lösungsformulierungen trüb, und der Trübungsgrad war proportional zu der Konzentration an m-Cresol. Im Fall von Phenol war der Konzentrationsbereich, der die wäßrigen Lösungsformulierungen nicht trüb machte, 0,1~0,3%, und die wäßrigen Lösungsformulierungen wurden trüb, wenn mehr als 0,3% Phenol zugegeben wurde. Die obigen Testergebnisse sind sowohl bei der Konzentration von 0,01% als auch der Konzentration von 0,02% Polysorbat 80 ähnlich.
Beispiel 3: Effekt der antimikrobiellen Konservierungsstoffe auf die biologische Aktivität von α-Interferon
Der pH der wäßrigen Lösungsformulierung wurde durch Verwendung von Ammoniumacetatpuffer auf 4,5–5,5 eingestellt, und die Tonizität der wäßrigen Lösungsformulierung wurde durch Zugabe von Natriumchlorid eingestellt. Die Konzentration von α-Interferon wurde bei allen wäßrigen Lösungsformulierungen auf 6 × 10⁶ IU/ml eingestellt. Die Lagerungstemperatur war entweder 4°C oder 40°C. Während der Lagerungszeit wurden die Veränderungen der biologischen Aktivität von α-Interferon unter Verwendung des in Referenzbeispiel 2 beschriebenen Verfahrens gemessen. Die Tabelle 3 und die 2a unten zeigen die Ergebnisse der Tests der biologischen Aktivität der wäßrigen Lösungsformulierung gelagert bei 4°C, und die Tabelle 4 und die 2b unten zeigen die Ergebnisse bei 40°C.
Wie in Tabelle 3 und 2a gezeigt, war der Unterschied nicht groß, obwohl die wäßrige Lösungsformulierung umfassend Phenol geringfügig besser in der Lage war, die biologische Aktivität aufrechtzuerhalten als andere wäßrige Lösungsformulierungen. Im Falle der Lagerung bei 40°C nahm die biologische Aktivität der wäßrigen Lösungsformulierung umfassend Benzylalkohol im Vergleich zu anderen wäßrigen Lösungsformulierungen stark ab (siehe Tabelle 4 und 2b).
Beispiel 4: Effekt das pH auf die biologische Aktivität und die Dimerisierung von α-Interferon
Wäßrige Lösungsformulierungen, umfassend 6 × 10⁶ IU/ml α-Interferon, 0,15% m-Cresol und 10 mM Ammoniumacetatpuffer wurden hergestellt. Der pH jeder wäßrigen Lösungsformulierung wurde auf 5,3, 5,8 bzw. 6,3 eingestellt. Die hergestellten wäßrigen Lösungsformulierungen wurden bei 40°C 12 Wochen gelagert, und die biologische Aktivität jeder wäßrigen Lösungsformulierung wurde zu geeigneten Zeitintervallen gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 und 3a unten gezeigt.
Nach 12 Wochen wurden das Auftreten und der Grad der Dimerisierung bei 14% SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) (diskontinuierliches Puffersystem, Trenngel: 14%, 0,375 M Tris-HCl, pH 8,8, Auflaufgel: 5%; 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8) unter nichtreduzierenden Bedingungen gefolgt von Silberfärbung gemessen.
Nach dem Herstellen eines 14%igen Trenngels verfestigt zwischen zwei Teilen aus Glasplatten wurde zuerst eine 5%ige Auflaufgellösung hergestellt und auf das Trenngel gegossen, und dann wurde ein Kamm eingeführt. Nachdem das Auflaufgel vollständig verfestigt war, wurde der Kamm entfernt, und jede der gebildeten Vertiefungen wurde mit Laufpuffer (Tris-Glycin-Puffer, pH 8,3) gewaschen. Zu 100 μl der obigen wäßrigen Lösungsformulierung wurden 50 μl 3-fach konzentrierter Probenpuffer (0,186 M, Tris, 3% SDS, 30% V/V% Glycerin, 0,009% Bromphenolblau, pH 6,8) zugegeben und gut gemischt. Dann wurde die Mischung in einem kochenden Wasserbad 2 Minuten gekocht und in einem Kühlbad gekühlt. 50 μl dieser Probe und 10 μl Molekulargewichtsmarker (Bio-Rad, MW-Marker mit niedrigem Bereich) wurden in verschiedene Vertiefungen gefüllt. Nach Befüllen mit der Probe und dem Molekulargewichtsmarker wurde das Gel in das Elektrophoresesystem (Hoeffer Scientific Instruments, SE 600) gestellt, und dann wurde Laufpuffer in das System gegossen. Durch Anlegen von 10 mA Strom pro Blatt des Gels durch Verbinden des Systems mit dem Energiezufuhrgerät (Hoeffer Scientific Instruments, PS 2500) wurde die Elektrophorese durchgeführt, bis das Bromphenolblauband die Grenze zwischen dem Trenngel und dem Auflaufgel erreichte. Wenn das Bromphenolblauband die Grenze erreichte, wurde der Strom auf 20 mA erhöht, und dann wurde die Elektrophorese durchgeführt, bis das Bromphenolblauband das untere Ende der Glasplatte erreichte. Nachdem die Elektrophorese vollständig war, wurde der Strom abgestellt, das Gel aus dem System genommen, und das die Proteine enthaltende Gel wurde in einer Mischung von Methanol:Essigsäure:Wasser (50:10:40) bei Raumtemperatur 12~16 Stunden fixiert. Dann wurde das Gel unter Rühren für 30 Minuten in eine 10%ige Glutaraldehyd-Lösung überführt und 3-mal für jeweils 20 Minuten mit entionisiertem Wasser gewaschen. Nach Herstellung der Silbernitratlösung (0,8% Silbernitrat, 0,08% NaOH und 4% Ammoniakwasser) wurde das Gel in diese Lösung überführt und an einem dunklen Platz 5 Minuten bewegt. Dann wurde das Gel 3-mal jeweils eine Minute mit entionisiertem Wasser gewaschen. Die unmittelbar vor Verwendung hergestellte Entwicklungslösung (0,005% Zitronensäure, 0,14% Formaldehyd und 0,005% Methanol) wurde zu dem Gel gegeben, und das Gel wurde sanft geschüttelt, um die silbergefärbten Proteinbanden zu entwickeln. Die Ergebnisse werden in Tabelle 6 und 3b unten gezeigt. Tabelle 6: Effekt des pHs auf die Dimerisierung von α-Interferon

* -: Dimer wurde nicht gefunden
+: Weniger als 1% Dimer wurde gefunden
++: 1% oder mehr als 1% des Dimers wurde gefunden

Wie in Tabelle 5 und 3a gezeigt, war die biologische Aktivität von α-Interferon bei ca. pH 5,8 relativ stabil. Währenddessen war die Dimerisierung von α-Interferon bei höheren pH häufiger (siehe Tabelle 6 und 3b). Folglich ist ein hoher pH für die Langzeitlagerung der wäßrigen Lösungsformulierung von α-Interferon nicht bevorzugt.
Beispiel 5: Effekt von zwei Konservierungsmitteln auf die antimikrobielle Aktivität
Tests der antimikrobiellen Wirksamkeit wurden für die wäßrigen Lösungsformulierungen von α-Interferon umfassend Phenol und/oder m-Cresol als Konservierungsstoffe gemäß den in der Europäischen Pharmakopoeia (E. P. 1997, 5.1.3) beschriebenen Vorgehensweisen durchgeführt. Zuerst wurde jede wäßrige Lösungsformulierung umfassend 6 × 10⁶ IU/ml α-Interferon, 0,02% Polysorbat 80 und 10 mM Ammoniumacetatpuffer hergestellt. Zu der Formulierung wurden die Konservierungsmittel in verschiedenen Konzentrationen, wie in Tabelle 7 unten gezeigt, zugegeben, und Natriumchlorid wurde zugegeben, um die Tonizität jeder Formulierung einzustellen. Die Ergebnisse der Tests der antimikrobiellen Wirksamkeit der wäßrigen Lösungsformulierungen sind in Tabelle 7 unten gezeigt. Die Anzahl lebender Zellen pro 1 ml der wäßrigen Lösungsformulierung wurde unter Verwendung der in Referenzbeispiel 3 beschriebenen Vorgehensweise gemessen. Die zu jeder Aufnahmezeit gemessene Anzahl lebender Zellen wurde logarithmisch transformiert, und die Log-Reduktion wurde für jedes Zeitintervall berechnet. Die erhaltenen Log-Reduktionen wurden mit den Werten für die in der Europäischen Pharmakopoeia beschriebenen Kriterien A und B verglichen, um abzuschätzen, ob sie die Kriterien A oder B erfüllen. Tabelle 7: Test der antimikrobiellen Wirksamkeit der wäßrigen Lösungsformulierungen umfassend Konservierungsmittel in verschiedenen Konzentrationen

* A: bedeutet daß die wäßrige Lösungsformulierung das Kriterium A in der Europäischen Pharmakopoeia erfüllt.
B: bedeutet, daß die wäßrige Lösungsformulierung das Kriterium B in der Europäischen Pharmakopoeia erfüllt.
-: bedeutet, daß der Test nicht durchgeführt wurde.

Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 7 ersichtlich ist, erfüllt die wäßrige Lösungsformulierung umfassend sowohl 0,15% Phenol als auch 0,1% m-Cresol die Kriterien A und B des Tests der antimikrobiellen Wirksamkeit der Europäischen Pharmakopoeia, obwohl sie die geringste Menge an Konservierungsmitteln (Gesamtmenge an Konservierungsmitteln: 0,25%) enthielt.
Beispiel 6: Vergleichstest der Stabilität zwischen der wäßrigen Lösungsformulierung umfassend eine Mischung von 0,15% Phenol und 0,1% m-Cresol und dar wäßrigen Lösungsformulierung umfassend nur 0,3% Phenol
Eine wäßrige Lösungsformulierung umfassend 6 × 10⁶ IU/ml α-Interferon, 0,02% Polysorbat 80, 0,3% Phenol und 10 mM Ammoniumacetatpuffer (wäßrige Lösungstestformulierung #7-1) und dieselbe Formulierung wie oben beschrieben, außer daß eine Mischung von 0,15% Phenol und 0,1% m-Cresol anstelle von 0,3% Phenol verwendet wurde (wäßrige Lösungstestformulierung #7-2) wurden hergestellt. Der pH jeder wäßrigen Lösungsformulierung wurde auf 5,3 eingestellt, und Natriumchlorid wurde zu der wäßrigen Lösungsformulierung zugegeben, um die Tonizität einzustellen. Die zwei Arten von Formulierungen wurden in drei Gruppen unterteilt, und die 3 Gruppen wurden 12 Wochen bei 4°C, 25°C bzw. 40°C gelagert. Jede Gruppe hatte drei Chargen. In gleichmäßigen Zeitabständen wurden die Veränderungen der biologischen Aktivität von α-Interferon gemessen. Die Reinheit wurde unter Verwendung von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC, Waters Alliance System, UV-Detektor, Jupiter C18-Säule) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabellen 8~13 und 4a~4f unten gezeigt.
(6-1) Veränderungen der biologischen Aktivität von α-Interferon Tabelle 8: Biologische Aktivität von α-Interferon während der Lagerung bei 4°C
Tabelle 9: Biologische Aktivität von α-Interferon während der Lagerung bei 25°C
(6-2) Reinheit von α-Interferon Tabelle 11: Reinheit der wäßrigen Lösungsformulierungen während Lagerung bei 4°C ermittelt durch PR-HPLC
Tabelle 12: Reinheit der wäßrigen Lösungsformulierungen während einer Lagerung bei 25°C ermittelt durch RP-HPLC
4a, 4b und 4c sind Diagramme, die die Veränderungen der relativen biologischen Aktivität bezogen auf die biologische Aktivität von α-Interferon zur Zeit 0 zeigen. Wie in Tabellen 8~13 und 4a~4f gezeigt, zeigten die wäßrigen Lösungsformulierungen umfassend eine Mischung von 0,15% Phenol und 0,1% m-Cresol im Hinblick auf die Aktivität sowie die Reinheit während der gesamten Testspanne eine ähnliche Tendenz wie diejenigen umfassend nur 0,3% Phenol. Auch erfüllten die zwei Arten der Formulierungen die antimikrobiellen Voraussetzungen, die in dem antimikrobiellen Wirksamkeitstest in der Europäischen Pharmakopoeia beschrieben sind. Die wäßrige Lösungsformulierung umfassend eine Mischung von 0,15% Phenol und 0,1% m-Cresol ist jedoch sicherer für den menschlichen Körper als diejenige umfassend nur 0,3% Phenol, da die erstere die geringere Menge an Konservierungsstoffen enthält.

Claims

Wäßrige Lösungsformulierung von α-Interferon, bestehend aus α-Interferon; Polysorbat 80 als Stabilisator; einem den osmotischen Druck regulierenden Mittel; antimikrobiellen Konservierungsstoffen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phenol, m-Cresol oder einer Mischung davon; und einem Puffersystem.
Wäßrige Lösungsformulierung von α-Interferon gemäß Anspruch 1, worin die zugegebene Menge an α-Interferon im Bereich von 1 × 10⁶ IU/ml bis 1 × 10⁸ IU/ml liegt.
Wäßrige Lösungsformulierung von α-Interferon gemäß Anspruch 1, worin die Konzentration an Polysorbat 80 im Bereich von 0,01 bis 0,05 G/V% liegt.
Wäßrige Lösungsformulierung von α-Interferon gemäß Anspruch 1, worin das den osmotischen Druck regulierende Mittel Natriumchlorid ist.
Wäßrige Lösungsformulierung von α-Interferon gemäß Anspruch 1, worin das Konservierungsmittel aus der Gruppe bestehend aus 0,1 bis 0,3 G/V% Phenol, 0,1 bis 0,2 G/V% m-Cresol oder einer Mischung davon ausgewählt ist.
Wäßrige Lösungsformulierung von α-Interferon gemäß Anspruch 1, worin das Puffersystem ein Puffersystem bestehend aus Ammoniumacetat und Essigsäure oder ein Puffersystem bestehend aus Natriummonohydrogenphosphat (Na₂HPO₄) und Natriumdihydrogenphosphat (NaH₂PO₄) ist.
Wäßrige Lösungsformulierung von α-Interferon gemäß Anspruch 6, worin die Konzentration des Puffersystems in der wäßrigen Lösungsformulierung im Bereich von 5 bis 20 mM liegt.
Wäßrige Lösungsformulierung von α-Interferon gemäß Anspruch 1, worin der pH der Formulierung im Bereich von 4,5 bis 6,0 liegt.