ES2267584T3 - Formulacion en disolucion acuosa de alfa-interferon. - Google Patents
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Abstract
Formulación en disolución acuosa de a-interferón que consiste en a-interferón; polisorbato 80 como estabilizador; un agente de regulación de la presión osmótica; conservantes antimicrobianos seleccionados del grupo que consiste en fenol, m-cresol o una mezcla de los mismos; y un sistema tampón.
Description
Formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón.
La presente invención se refiere a una
formulación en disolución acuosa estable de
\alpha-interferón (\alpha-IFN),
que no contiene albúmina sérica humana.
La mayoría de las proteínas se desnaturalizan
fácilmente o pierden su actividad biológica en disolución acuosa.
Por este motivo, muchas compañías farmacéuticas han desarrollado
formulaciones liofilizadas para mejorar la estabilidad de los
productos farmacológicos proteicos. Sin embargo, la formulación
liofilizada de los fármacos proteicos tiene muchos defectos. Puesto
que el proceso de liofilización es caro y requiere una etapa de
reconstitución adicional antes de administrar el fármaco al
paciente, no es preferible a la formulación líquida en cuanto a la
economía o comodidad. Estos puntos también se han considerado en el
desarrollo de formulaciones de \alpha-IFN.
El interferón (IFN) desempeña un papel en el
crecimiento, diferenciación y función de las células normales o
tumorales y es una de las citocinas proteicas que inhibe la
multiplicación de una variedad de virus. Específicamente, IFN
controla la actividad de los linfocitos citolíticos naturales (NK,
natural killer), potencia la actividad de los linfocitos T
citotóxicos y aumenta la actividad fagocítica de los macrófagos.
Así, IFN media en última instancia la reacción inmunitaria de las
células infectadas por virus, etc. IFN puede clasificarse en
\alpha, \beta y \gamma dependiendo de las clases de las
células secretoras o materiales inductores. Entre ellos, las formas
\alpha y \beta son estables incluso a pH 2, pero la forma
\gamma es inestable en condiciones ácidas.
Entre las tres formas, se ha utilizado
\alpha-interferón como agente antiviral durante un
largo tiempo puesto que es sumamente eficaz en el tratamiento de
enfermedades víricas incluyendo la hepatitis C. Por tanto, muchos
investigadores han realizado esfuerzos continuos para desarrollar
formulaciones que puedan conservar la actividad de
\alpha-interferón durante un periodo de tiempo más
largo.
La patente de los EE.UU. 4496537 se refiere a
una formulación de liofilización de \alpha- interferón que
contiene alanina (o glicina) y albúmina sérica humana como
estabilizador y un sistema tampón para mantener el pH en la
disolución de 6,5 a 8,0. También, la patente de los EE.UU. 4847079
se refiere a una formulación acuosa de
\alpha-interferón que contiene albúmina sérica
humana, glicina, timerosal y un sistema tampón para mantener el pH
en de 6,5 a 8,0. De manera interesante, ambas patentes mencionadas
anteriormente se caracterizan porque las formulaciones pueden
contener albúmina sérica humana que es eficaz en la conservación de
la actividad biológica de \alpha-interferón. Sin
embargo, cuando la formulación contiene albúmina sérica humana, la
posibilidad de que la formulación se contamine potencialmente por
patógenos infecciosos tales como el virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH) y el virus de la hepatitis B (VHB) es alta. Por tanto,
recientemente, no se recomienda utilizar albúmina sérica humana.
Además, se sabe que la albúmina anterior puede inducir reacciones
inmunitarias en algunas personas.
La patente europea 0736303A2 describe una
formulación acuosa de \alpha-interferón que
contiene polisorbato como estabilizador y alcohol bencílico como
conservante antimicrobiano y que tiene un sistema tampón para
mantener el pH en el intervalo de 4,5-5,5. En la
patente anterior, se utiliza polisorbato, que es seguro, en lugar de
la albúmina sérica humana potencialmente nociva. Sin embargo, se
sabe que la actividad antimicrobiana del alcohol bencílico disminuye
cuando se utiliza con un tensioactivo no iónico tal como polisorbato
80. De hecho, se ha descubierto que no es aceptable utilizar
polisorbato 80 con alcohol bencílico. (Handbook of Pharmaceutical
Excipients, American Pharmaceutical Association, 1986, pág.
18). Por tanto, debe utilizarse una cantidad relativamente grande de
alcohol bencílico (0,9, 1,0%) con el fin de mantener la actividad
antimicrobiana. Sin embargo, tal uso en exceso de alcohol bencílico
puede producir la agregación de péptidos (Richard L. Remmele et
al., Pharmaceutical Research, Vol. 15, Nº 2, 1998).
También, según la prueba acelerada de la formulación de
\alpha-interferón a 40ºC observada por los
presentes inventores, la formulación líquida que contiene un 1,0% de
alcohol bencílico y un 0,02% de polisorbato 80 tenía una
actividad
mucho menor de \alpha-interferón que la formulación que contiene fenol (o m-cresol) y un 0,02% de polisorbato 80.
mucho menor de \alpha-interferón que la formulación que contiene fenol (o m-cresol) y un 0,02% de polisorbato 80.
El documento WO 96/11018 se refiere a una
formulación en disolución acuosa que contiene polisorbato y un
agente quelante tal como EDTA disódico, y un conservante. Sin
embargo, la formulación líquida anterior es potencialmente nociva
porque comprende EDTA disódico que se sabe que es citotóxico (Paula
Saarien-Savolainen et al., Pharmaceutical
Research, Vol. 15, Nº 2, 1998) y tiene otro problema porque
puede formar un complejo quelato con iones calcio dentro del cuerpo
humano. También, se sabe que el citrato, que se menciona como otro
agente quelante en la patente anterior, produce un dolor intenso
cuando se administra al organismo.
Para solucionar los problemas mencionados
anteriormente, los presentes inventores han estudiado cómo
desarrollar una formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón, que conserva la actividad
biológica de \alpha-interferón durante un largo
periodo y es muy estable, y que no contiene albúmina sérica humana
potencialmente nociva ni agente quelante. Los presentes inventores
han logrado la presente invención desarrollando una formulación en
disolución acuosa de \alpha-interferón, que puede
conservar la actividad biológica de
\alpha-interferón durante un largo periodo y
minimiza la cantidad de conservante por medio del uso de polisorbato
como estabilizador y fenol, m-cresol o mezcla de los
mismos como conservante antimicrobiano.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar una formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón, que puede conservar la
actividad biológica y la estabilidad fisicoquímica durante un largo
periodo y puede satisfacer los criterios de aceptación en la prueba
de eficacia antimicrobiana de conservación antimicrobiana requeridos
por la Farmacopea Europea incluso aunque contenga sólo una cantidad
muy pequeña de conservantes.
Además, es un objeto de la presente invención
proporcionar una formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón segura, que conserva las
actividades antimicrobianas sin materiales potencialmente nocivos
para el cuerpo humano tales como albúmina sérica humana o agentes
quelantes.
La presente invención proporciona una
formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón que consiste en
\alpha-interferón; polisorbato 80 como
estabilizador; un agente de regulación de la presión osmótica;
conservantes antimicrobianos seleccionados del grupo que consiste en
fenol, m-cresol o una mezcla de los mismos; y un
sistema tampón.
Según la presente invención, se proporciona una
formulación en disolución acuosa estable de
\alpha-interferón. Además, se proporciona una
formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón más segura. Estas y otras
características, aspectos y ventajas de la presente invención se
llegarán a entender mejor con referencia a la siguiente descripción
y reivindicaciones adjuntas.
La figura 1 es un gráfico que muestra el efecto
del estabilizador sobre la actividad biológica de
\alpha-interferón (\alpha-IFN)
cuando la formulación en disolución acuosa de la presente invención
se almacena durante 4 meses a 4ºC.
La figura 2a es un gráfico que muestra el efecto
de los conservantes antimicrobianos sobre la estabilidad de la
formulación en disolución acuosa de \alpha-IFN (6
x 10^{6} UI/ml) midiendo la actividad biológica de
\alpha-IFN cuando la formulación en disolución
acuosa de la presente invención se almacena durante 36 semanas a
4ºC.
La figura 2b es un gráfico que muestra el efecto
del conservante antimicrobiano sobre la estabilidad de la
formulación en disolución acuosa de \alpha-IFN (6
x 10^{6} UI/ml) midiendo la actividad biológica de
\alpha-IFN cuando la formulación en disolución
acuosa de la presente invención se almacena durante 16 semanas a
40ºC.
La figura 3a es un gráfico que muestra el efecto
del pH sobre la estabilidad de la formulación en disolución acuosa
de \alpha-IFN (6 x 10^{6} UI/ml) midiendo la
actividad biológica de \alpha-IFN cuando la
formulación en disolución acuosa de la presente invención se
almacena durante 12 semanas a 40ºC.
La figura 3b es una fotografía que muestra el
efecto del pH sobre la dimerización de \alpha-IFN
determinado mediante tinción con plata del gel sometido a
electroforesis en gel de dodecilsulfato de
sodio-poliacrilamida después de un almacenamiento de
12 semanas a 40ºC.
Las figuras 4a, 4b y 4c son gráficos que
muestran las diferencias en las actividades biológicas entre
formulaciones que comprenden una mezcla de un 0,15% de fenol y un
0,1% de m-cresol, y formulaciones que comprenden un
0,3% de fenol solamente como conservante antimicrobiano cuando las
formulaciones en disolución acuosa de \alpha-IFN
(6 x 10^{6} UI/ML) se almacenan durante 12 semanas a 4ºC, 25ºC y
40ºC, respectivamente.
Las figuras 4d, 4e y 4f son gráficos que
muestran las diferencias en la pureza determinada mediante
cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa
(RP-HPLC) entre formulaciones que comprenden una
mezcla de un 0,15% de fenol y un 0,1% de m-cresol, y
formulaciones que comprenden un 0,3% de fenol solamente como
conservante antimicrobiano cuando las formulaciones en disolución
acuosa de \alpha-IFN (6 x 10^{6} UI/ML) se
almacenan durante 12 semanas a 4ºC, 25ºC y 40ºC,
respectivamente.
Para lograr los objetos anteriores, la presente
invención proporciona una formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón que consiste en
\alpha-interferón; polisorbato 80 como
estabilizador; un agente de regulación de la presión osmótica;
conservantes antimicrobianos seleccionados del grupo que consiste en
fenol, m-cresol o una mezcla de los mismos; y un
sistema tampón.
El término
"\alpha-interferón" en la presente invención
incluye todos los tipos de \alpha-interferones que
se expresan y purifican en bacterias, levaduras y células animales
recombinantes. Es decir, el término
"\alpha-interferón" tal como se utiliza en el
presente documento, incluye \alpha-interferón
natural y recombinante. Además, pueden incluirse análogos o
variantes de \alpha-interferón, en los que los
aminoácidos del \alpha-interferón humano natural
están parcialmente sustituidos mientras que se conserva más del 50%
de la actividad del \alpha-interferón humano
natural, en la formulación en disolución acuosa de la presente
invención. La cantidad de \alpha-interferón
añadido en la formulación en disolución acuosa de la presente
invención está preferiblemente en el intervalo de 1 x 10^{6}
UI/ml-1 x 10^{8} UI/ml.
El estabilizador que ayuda a mantener la
estabilidad del \alpha-interferón en la
formulación en disolución acuosa de la presente invención es
polisorbato 80 y la concentración de polisorbato 80 está
preferiblemente en el intervalo del 0,01-0,05%
p/v.
Además, la formulación en disolución acuosa de
la presente invención comprende conservantes que incluyen fenol y/o
m-cresol para inhibir el crecimiento de
microorganismos. La concentración preferible de fenol está en el
intervalo del 0,1-0,3% p/v, la concentración
preferible de m-cresol está en el intervalo del
0,1-0,2% p/v, y la mezcla apropiada de fenol y
m-cresol puede incluirse también en las
formulaciones en disolución acuosa de la presente invención.
El sistema tampón en la formulación en
disolución acuosa de la presente invención incluye disolución de
tampón acetato o disolución de tampón fosfato. Más particularmente,
es preferible un sistema tampón que consiste en acetato de amonio y
ácido acético, o un sistema tampón que consiste en
monohidrogenofosfato de sodio (Na_{2}HPO_{4}) y
dihidrogenofosfato de sodio (NaH_{2}PO_{4}). Además, la
concentración del sistema tampón anterior en la formulación en
disolución acuosa de la presente invención está preferiblemente en
el intervalo de 5 \sim 20 mM. El pH de la formulación en
disolución acuosa de la presente invención depende de los sistemas
tampón anteriores. El pH de la formulación en disolución acuosa de
la presente invención está en el intervalo de 4,0 \sim 8,0 en la
mayoría de los casos y preferiblemente en el intervalo de
4,5-6,0.
La formulación en disolución acuosa de la
presente invención también puede incluir un agente de regulación de
la presión osmótica tal como cloruro de sodio. La cantidad del
agente de regulación de la presión osmótica depende de los demás
componentes en la formulación. Finalmente, la formulación en
disolución acuosa de la presente invención se prepara en condiciones
asépticas.
En la presente invención, con el fin de buscar
estabilizadores preferibles, se han preparado formulaciones en
disolución acuosa que comprenden varios excipientes útiles para las
formulaciones inyectables en diversas concentraciones, y se ha
estudiado el efecto del estabilizador sobre la actividad biológica
del \alpha-interferón. Los resultados tras el
almacenamiento durante 4 meses a 4ºC mostraron que las actividades
de las formulaciones en disolución acuosa que comprenden albúmina
sérica humana, polisorbato 80, polietilenglicol o gelatina, como
estabilizante fueron superiores al 90% de la actividad biológica
completa inicial antes del almacenamiento, mientras que la actividad
de la formulación en disolución acuosa que comprendía solamente
\alpha-interferón y un sistema tampón fue de
aproximadamente el 80% de la actividad biológica completa inicial
antes del almacenamiento. Esto es debido probablemente a que los
estabilizadores anteriores evitan la adsorción de
\alpha-interferón sobre la superficie interna de
un vial. Sin embargo, el uso de albúmina sérica humana y gelatina no
se recomienda recientemente debido a las preocupaciones crecientes
sobre la posible contaminación de virus adventicios como VIH, VHB,
etc. Además, puede ser inmunogénico para ciertas personas. Por
tanto, se selecciona polisorbato 80 como el estabilizador más
adecuado en la presente invención.
Además, los inventores han estudiado el efecto
de las concentraciones de polisorbato 80 y conservantes
antimicrobianos sobre el aspecto de las formulaciones en disolución
acuosa. Como resultado, polisorbato en el intervalo del 0,01 \sim
0,02% no afectó al aclaramiento de las formulaciones en disolución
acuosa. Sin embargo, las formulaciones en disolución acuosa se
volvieron turbias si se utilizaba más del 0,15% de
m-cresol y el grado de turbidez era proporcional a
la concentración de m-cresol. Cuando se utilizó
fenol como conservante antimicrobiano, fenol en el intervalo del 0,1
\sim 0,3% no afectó al aclaramiento de las formulaciones en
disolución acuosa, pero las formulaciones en disolución acuosa se
volvieron turbias si se utilizaba más del 0,3% de fenol.
Aunque la formulación en disolución acuosa que
contiene fenol tiene una capacidad algo mayor para conservar la
actividad biológica que la que tiene la formulación en disolución
acuosa que contiene m-cresol o alcohol bencílico, la
diferencia no es grande. Sin embargo, en el caso en que la
formulación en disolución acuosa se almacenó a una alta temperatura
de 40ºC, la actividad biológica de la formulación en disolución
acuosa que comprendía alcohol bencílico disminuyó enormemente.
La actividad biológica así como la dimerización
de \alpha-interferón está influenciada por el pH.
La actividad biológica de \alpha-interferón es
relativamente estable a un pH de aproximadamente 5,8 y la
dimerización fue más frecuente a un pH superior. Por tanto, no es
preferible tener un pH elevado durante un almacenamiento en un largo
periodo de la formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón.
Además, los presentes inventores han investigado
los efectos de conservación antimicrobiana de las formulaciones en
disolución acuosa que comprenden una variedad de composiciones y
concentraciones de conservantes según el protocolo para probar la
eficacia de una preparación antimicrobiana en la Farmacopea Europea
(Farmacopea Europea, 1997, 5.1.3. Efficacy of Antimicrobial
Preparation (Eficacia de una preparación antimicrobiana)). El
protocolo concreto para probar la eficacia de una preparación
antimicrobiana en la farmacopea Europea se describió en el ejemplo
de referencia 3, y es tal como sigue brevemente.
Se inocularon artificialmente cinco especies de
cepas habituales que se describen para utilizarse en esta prueba
(cepas habituales de bacterias gram-positivas y
negativas y género de los hongos) a la concentración de 10^{5} a
10^{6} células por 1 ml de la formulación en disolución acuosa. A
intervalos de tiempo determinados, se tomó muestras de una parte de
las formulaciones y se transformó logarítmicamente el grado de
cambios en el número de células viables. Los valores anteriores
transformados logarítmicamente (valores de reducción Log) se
compararon con los valores en la tabla 5.1.3-1 de la
Farmacopea Europea para estimar el nivel de la actividad
antimicrobiana. La clasificación entre las categorías A y B
descritas en la Farmacopea Europea puede obtenerse a partir de la
diferencia en los valores de reducción log de los microorganismos de
interés en el transcurso del tiempo. En el caso de las bacterias, la
categoría A recomienda que deben producirse reducciones de 2 log en
un plazo de 6 horas y reducciones de 3 log en el número de
microorganismos viables frente al valor obtenido para el inóculo en
un plazo de 24 horas y la categoría B recomienda que debe producirse
una reducción de 1 log en un plazo de 24 horas y reducciones de 3
log en un plazo de 7 días desde la inoculación. De manera similar,
en el caso de los hongos, la categoría A recomienda que deben
producirse reducciones de 2 log en un plazo de 7 días y la categoría
B recomienda que debe producirse una reducción de 1 log en un plazo
de 14 días. También, tras el tiempo recomendado anteriormente, no
debe observarse una recuperación o aumento en el número de
microorganismos viables. Los valores de reducción log descritos
anteriormente para cada categoría se aplican a formulaciones
inyectables y colirios, y la formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón de la presente invención se
clasifica en esta recomendación. Por tanto, preparando varias
formulaciones en disolución acuosa de
\alpha-interferón que comprenden diferentes
conservantes y estimando la actividad antimicrobiana relativa
mediante la realización de la prueba de eficacia antimicrobiana
frente a 5 especies de cepas habituales, los presentes inventores
han tratado de determinar la mejor formulación.
Como resultado, tanto la formulación que
comprende un 0,2% de fenol y un 0,1% de m-cresol
como la formulación que comprende un 0,15% de fenol y un 0,1% de
m-cresol satisficieron las categorías A y B en la
Farmacopea Europea frente a Aspergillus niger, Candida albicans,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Escherichia
coli. Sin embargo, en el caso de la formulación que comprende un
0,15% de fenol y un 0,1% de m-cresol, las cantidades
totales de conservantes son el 0,25% de la formulación. Por tanto,
la formulación que comprende un 0,15% de fenol y un 0,1% de
m-cresol es una formulación más preferible en cuanto
a la seguridad, puesto que tiene la cantidad mínima de los
conservantes.
Las versiones descritas previamente de la
presente invención tienen muchas ventajas, incluyendo proporcionar
una formulación en disolución acuosa estable de
\alpha-interferón que puede conservar la actividad
biológica de \alpha-interferón durante un periodo
más largo evitando la adsorción del
\alpha-interferón sobre la superficie de un
vial;
proporcionar una formulación en disolución
acuosa de \alpha-interferón en la que pueden
conservarse la actividad biológica así como la actividad
antimicrobiana de \alpha-interferón minimizando la
cantidad de los conservantes;
proporcionar una formulación en disolución
acuosa de \alpha-interferón más segura con una
cantidad mínima de los conservantes porque se sabe que el uso de una
cantidad grande de los conservantes es nocivo para el cuerpo
humano;
proporcionar una formulación en disolución
acuosa de \alpha-interferón que no contiene
materiales potencialmente nocivos para el cuerpo humano tales como
albúmina sérica humana o agentes quelantes; y
proporcionar una formulación en disolución
acuosa de \alpha-interferón que es muy
estable.
La invención se ilustrará adicionalmente
mediante los siguientes ejemplos. Será evidente para los expertos en
la técnica que estos ejemplos se facilitan solamente para ilustrar
la presente invención en más detalle, pero la invención no se limita
a los ejemplos facilitados.
Ejemplo de referencia
1
Se preparó \alpha-interferón
purificado para el estudio de formulación mediante el proceso de
producción del principio activo de
Intermax-\alpha^{TM}
(interferón-\alpha 2a, LG Chemical LTD).
Tras fermentar Saccharomyces cerevisiae
recombinante que contiene una inserción del gen de
\alpha-interferón humano (Saccharomyces
cerevisiae pYLBC A/G \alphaf \alpha-IFN; nº
de depósito KCTC 0051BP en la Colección Coreana de Cultivos Tipo del
Instituto Coreano de Investigación en Biociencia y Biotecnología
depositado el 2 de julio de 1992), se obtuvo
alfa-interferón de una pureza superior al 95%
mediante cromatografía en fase inversa a través de varias etapas de
purificación incluyendo cromatografía de intercambio iónico y
cromatografía de filtración en gel. Para más detalles, véase la
solicitud de patente coreana número 1992-25912,
presentada el 28 de diciembre de 1992, titulada "Purification
process of \alpha-interferon expressed in
recombinant yeast" ahora la patente coreana número 111251, que se
incorpora al presente documento como referencia.
Ejemplo de referencia
2
Se prepararon formulaciones en disolución acuosa
de \alpha-interferón que tenían la siguiente
composición:
\alpha-interferón: 1 x
10^{6} UI/ml \sim 100 x 10^{6} UI/ml;
Polisorbato 80: 0,1 \sim 0,5 mg/ml;
Fenol: 1,5 mg/ml;
m-cresol: 1,0 mg/ml; y
un sistema tampón que comprende 10 mM de
disolución de tampón acetato o 10 mM de disolución de tampón
fosfato.
Se sometió a ensayo la actividad biológica de la
formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón tal como se preparó
anteriormente según los procedimientos recomendados en la monografía
1997:1110 "Interferón alfa-2 concentrated
solution" (disolución concentrada de interferón
alfa-2) de la Farmacopea Europea. En otras palabras,
se midió el efecto protector celular de la formulación en disolución
acuosa de \alpha-interferón frente a la infección
celular por virus para calcular las unidades internacionales (U.I.)
comparándolo con el del patrón internacional del interferón
\alpha-2 humano recombinante (IFN
\alpha-2) o un patrón interno de trabajo.
En la condición de cultivo de 37ºC y un 5% de
CO_{2}, se cultivaron células MDKB (células renales bovinas
Madin-Darby: ATCC nº CCL22) en placas de
microtitulación para formar una monocapa celular. Y luego, se
añadieron a las placas de microtitulación y se cultivaron más de 3
concentraciones diferentes de la muestra de prueba de
\alpha-interferón y patrón de trabajo de
\alpha-interferón que se calibró con el patrón
internacional de \alpha-interferón humano
recombinante de NIH (número de catálogo: Gxa
01-901-535, EE.UU.). Una serie de
placas de microtitulación contenían células que no se trataron con
\alpha-interferón, respectivamente, y se
utilizaron como controles negativos. Tras cultivar durante 18 \sim
24 horas en la condición de cultivo de 37ºC y un 5% de CO_{2}, se
desechó la disolución tratada con
\alpha-interferón y se añadió el virus citopático
de la estomatitis vesicular (ATCC nº VR-158) a los
pocillos de todas las placas excepto a los controles. Tras cultivar
durante 24 \sim 48 horas, se tiñeron las placas de microtitulación
mediante cristal violeta y se secaron al aire. Tras añadirse
etilenglicol a cada pocillo para extraer los colorantes de tinción,
se midió la absorbancia a 600 nm utilizando un espectrofotómetro
para microplacas.
Los valores de absorbancia de las disoluciones
patrón y de prueba se representaron con respecto a la dosis de
\alpha-interferón para hacer una relación lineal.
Entonces, se calcularon los títulos de las disoluciones de prueba
mediante comparación utilizando el método de análisis de líneas
paralelas.
Ejemplo de referencia
3
Las cinco especies de cepas habituales
utilizadas para la prueba fueron tal como sigue. Se utilizaron dos
especies de cepas de hongos, Aspergillus niger (ATCC 16404) y
Candida albicans (ATCC 10231) y tres especies de cepas de
bacterias, Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027),
Staphylococcus aureus (ATCC 6538) y Escherichia coli
(ATCC 8739).
Se utilizó agar B (casitona 15 g/l, soytona 5
g/l, NaCl 5 g/l, agar 18 g/l, pH 7,3 \pm 0,2) para el cultivo
sólido de bacterias y agar C (peptona 10 g/l, glucosa 40 g/l, agar
15 g/l, pH 5,6 \pm 0,2) para el cultivo sólido de hongos. Las
bacterias se cultivaron a 30 \sim 35ºC durante 18 \sim 24 horas
y los hogos se cultivaron a 20 \sim 25ºC durante 24 \sim 48
horas en el caso de Candida albicans y durante 2 \sim 7
días en el caso de Aspergillus niger.
En el caso de Aspergillus, se recogieron
esporas negras formadas tras el cultivo durante aproximadamente 5
días y se utilizaron para la prueba en lugar de los hongos.
Con el fin de inocular directamente cepas
habituales en un recipiente que contiene la formulación en
disolución acuosa de \alpha-interferón de prueba
con la concentración de 10^{5} a 10^{6} células (esporas en el
caso de Aspergillus)/ml de cepas habituales, la concentración
celular antes de la inoculación se diluyó hasta de 10^{7} a
10^{8} células (o esporas)/ml de tampón de dilución, y luego se
añadió la suspensión celular diluida a la formulación en disolución
acuosa de tal manera que la cantidad de la suspensión celular
añadida es del 1% (v/v) de la formulación en disolución acuosa.
Como tampón de dilución, se utilizó tampón de dilución A (NaCl 9
g/l, peptona 1 g/l) para las bacterias y Candida, y tampón de
dilución B (NaCl 9 g/l, polisorbato 80 0,5 g/l) para
Aspergillus.
Tras inocularse las suspensiones de cepas
habituales a las formulaciones en disolución acuosa de prueba, se
tomaron muestras cada una de 0,1 \sim 0,5 ml de las formulaciones
de prueba a 0 horas, 6 horas, 24 horas, 7 días, 14 días y 28 días,
respectivamente, y las disoluciones de las que se tomaron muestras
se diluyeron en 1 a 10^{3} veces utilizando los tampones de
dilución. Luego, las muestras diluidas se untaron sobre medio sólido
de agar y se cultivaron a las temperaturas de cultivo según se
describió anteriormente. Se calculó el número de células viables por
1 ml de la muestra contando el número de colonias formadas a partir
del cultivo sólido. Mientras tanto, se almacenaron las
formulaciones en disolución acuosa de prueba en una incubadora a 20
\sim 25ºC tras la toma de muestras. Como método para estimar el
número de células viables y medios para la prueba, se utilizaron los
descritos en la Farmacopea Europea (F.E. 1997, 2.6.12).
Se realizó el experimento a continuación para
buscar los estabilizadores preferibles que conservan la actividad
biológica de \alpha-interferón evitando la
adsorción de \alpha-interferón sobre la superficie
de un vial.
En primer lugar, se prepararon formulaciones en
disolución acuosa que comprendían varios excipientes útiles para
formulaciones inyectables a diversas concentraciones, tal como se
describe en la tabla 1, y se añadió cloruro de sodio para ajustar la
tonicidad. Cada formulación en disolución acuosa se almacenó durante
4 meses a 4ºC para estimar la actividad biológica de
\alpha-interferón en cada formulación según el
método descrito en el ejemplo de referencia 2. Los resultados se
muestran en la figura 1 y la tabla 1 a continuación. La figura 1 es
un gráfico que muestra la actividad biológica relativa (%) de
\alpha-interferón con respecto a la actividad
biológica completa de la formulación en disolución acuosa que
contiene 9 x 10^{6} UI/ml de
\alpha-interferón.
| *Actividad biolígica completa de \alpha-interferón: 9 x 10^{6} UI/ml (unidad: x 10 ^{6} UI/ml) |
Las formulaciones de control negativo que
comprenden sólo \alpha-interferón y sistema
tampón, conservaron aproximadamente el 80% de la actividad biológica
completa inicial. Por otro lado, la formulación en disolución acuosa
que comprende albúmina sérica humana, polisorbato 80,
polietilenglicol o gelatina conservaron más del 90% de la actividad
biológica completa inicial. Esto se debe probablemente a que se
evita la adsorción de \alpha-interferón sobre la
superficie de un vial por los aditivos anteriores.
Aunque los aditivos anteriores contribuyen a
conservar la actividad biológica de
\alpha-interferón, el uso de albúmina sérica
humana y gelatina está restringido para las formulaciones
inyectables debido a los posibles problemas de contaminación por los
virus adventicios. Por tanto, polisorbato 80 es el estabilizador más
adecuado.
Como experimento preliminar para la selección
inicial de la formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón, se investigó el efecto de las
concentraciones de polisorbato 80 y los conservantes antimicrobianos
sobre el aspecto de las formulaciones en disolución acuosa. Se
prepararon 100 mililitros de las formulaciones en disolución acuosa
de \alpha-interferón que comprenden polisorbato 80
y conservantes antimicrobianos que incluyen fenol,
m-cresol o una mezcla de los mismos a diversas
concentraciones. Luego, se ajustaron la tonicidad y el pH de cada
formulación utilizando cloruro de sodio al 0,8% y tampón acetato de
amonio 10 mM, respectivamente. El pH de cada formulación se ajustó a
5,3.
Se observaron a ojo el color y la turbidez de
las formulaciones en disolución acuosa anteriores que comprenden
polisorbato 80 y conservantes antimicrobianos. Los resultados se
muestran en la tabla 2 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Cuando se utilizó más del 0,15% de
m-cresol, las formulaciones en disolución acuosa se
volvieron turbias y el grado de turbidez fue proporcional a la
concentración de m-cresol. En el caso de fenol, el
intervalo de concentración que no hizo que las formulaciones en
disolución acuosa fueran turbias fue del 0,1 \sim 0,3% y las
formulación en disolución acuosa se volvieron turbias cuando se
añadió más del 0,3% de fenol. Los resultados de las pruebas
anteriores son similares tanto a la concentración del 0,01% como a
la concentración del 0,02% de polisorbato 80.
Se controló el pH de la formulación en
disolución acuosa hasta 4,5 \sim 5,5 utilizando tampón acetato de
amonio, y se ajustó la tonicidad de la formulación en disolución
acuosa añadiendo cloruro de sodio. Se ajustó la concentración de
\alpha-interferón a 6 x 10^{6} UI/ml para todas
las formulaciones en disolución acuosa. La temperatura de
almacenamiento fue o bien a 4ºc o bien a 40ºC. Durante el periodo de
almacenamiento, se midieron los cambios en la actividad biológica de
\alpha-interferón utilizando el método descrito en
el ejemplo de referencia 2. La tabla 3 y la figura 2a a continuación
muestran el resultado de la prueba de actividad biológica de la
formulación en disolución acuosa almacenada a 4ºC y la tabla 4 y la
figura 2b a continuación muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
* En las tablas 3 y 4, el valor superior es la
actividad biológica absoluta de \alpha-interferón
y el valor inferior es la actividad biológica relativa (%) de
\alpha-interferón con respecto a la actividad
biológica de \alpha-interferón a tiempo 0.
Tal como se muestra en la tabla 3 y la figura
2a, aunque la formulación en disolución acuosa que contiene fenol
tenía una capacidad ligeramente mayor para conservar la actividad
biológica que las demás formulaciones en disolución acuosa, la
diferencia no era grande. Sin embargo, en el caso de almacenamiento
a 40ºC, la actividad biológica de la formulación en disolución
acuosa que comprende alcohol bencílico disminuyó enormemente en
comparación con las demás formulaciones en disolución acuosa (véase
la tabla 4 y la figura 2b).
Se prepararon formulaciones en disolución acuosa
que contenían 6 x 10^{6} UI/ml de
\alpha-interferón, 0,15% de
m-cresol y tampón acetato de amonio 10 mM. El pH se
cada formulación en disolución acuosa se controló en 5,3, 5,8 y 6,3,
respectivamente. Las formulaciones en disolución acuosa preparadas
se almacenaron a 40ºC durante 12 semanas, y se midió la actividad
biológica de cada formulación en disolución acuosa en los intervalos
de tiempo apropiados. Los resultados se muestran en la tabla 5 y la
figura 3a a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Tras 12 semanas, se midió la aparición y el
grado de dimerización mediante SDS-PAGE al 14%
(electroforesis en gel de dodecilsulfato de
sodio-poliacrilamida) (sistema tampón discontinuo,
gel separador; al 14%, Tris-HCl 0,375 M, pH 8,8, gel
concentrador; al 5%; Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8) en
condiciones no reductoras seguido por tinción con plata.
En primer lugar, tras preparar el gel de
separación al 14% solidificado entre dos piezas de placas de vidrio,
se preparó la disolución de gel concentrador al 5% y se vertió sobre
el gel separador, y luego se insertó un peine. Tras solidificar
completamente el gel concentrador, se retira el peine, y cada
pocillo formado se lavó con tampón de electroforesis (tampón
Tris-glicina, pH 8,3). A 100 \mul de la
formulación en disolución acuosa anterior, se le añadió 50 \mul de
tampón de muestra concentrada 3 veces (Tris 0,186 M, 3% de SDS, 30%
v/v de glicerol, 0,009% de azul de bromofenol, pH 6,8) y se mezcló
bien. Luego, se llevó a ebullición la mezcla en un baño de agua en
ebullición durante 2 minutos y se enfrió en un baño frío. Se
cargaron 50 \mul de esta muestra y 10 \mul de marcador de peso
molecular (Bio-Rad, marcador de PM de intervalo
bajo) en diferentes pocillos. Tras cargar la muestra y el marcador
de peso molecular, el gel se colocó en el sistema de electroforesis
(Hoeffer Scientific Instruments, SE 600) y luego se vertió el tampón
de electroforesis en el sistema. Aplicando 10 mA de corriente por
lámina de gel, conectando el sistema a un dispositivo de suministro
de energía (Hoeffer Scientific Instruments, PS 2500), se llevó a
cabo la electroforesis hasta que la banda de azul de bromofenol
alcanzó el borde entre el gel separador y el gel concentrador.
Cuando la banda de azul de bromofenol alcanzó el borde, se elevó la
corriente hasta 20 mA y entonces se llevó a cabo la electroforesis
hasta que la banda de azul de bromofenol alcanzó el extremo inferior
de la placa de vidrio. Tras completarse la electroforesis, se
desconectó la potencia, se retiró el gel del sistema y se fijó el
gel que contenía las proteínas en la mezcla de metanol : ácido
acético : agua (50:10:40) a temperatura ambiente durante
12-16 horas. Entonces, el gel se transfirió a una
disolución de glutaraldehído al 10% durante 30 minutos con agitación
y se lavó 3 veces con agua desionizada cada vez durante 20 min.
Tras preparar la disolución de nitrato de plata (0,8% de nitrato de
plata, 0,08% de NaOH y 4% de agua amoniacal), el gel se transfirió a
esta disolución y se agitó en un lugar oscuro durante 5 minutos.
Luego, el gel se lavó 3 veces con agua desionizada, cada vez durante
1 min. Se añadió al gel disolución de revelado (0,005% de ácido
cítrico, 0,14% de formaldehído y 0,005% de metanol) preparada
inmediatamente antes de su uso y el gel se agitó suavemente para
revelar las bandas de proteína teñidas con plata. Los resultados se
muestran en la tabla 6 y la figura 3b a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se muestra en la tabla 5 y la figura
3a, la actividad biológica de \alpha-interferón
fue relativamente estable a un pH de aproximadamente 5,8. Mientras
tanto, la dimerización de \alpha-interferón fue
más frecuente a pH superior (véase la tabla 6 y la figura 3b). En
consecuencia, no es preferible un pH elevado para el almacenamiento
durante un periodo largo de la formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón.
Se llevaron a cabo pruebas de eficacia
antimicrobiana para las formulaciones en disolución acuosa que
comprenden fenol y/o m-cresol como conservantes,
según los procedimientos descritos en la Farmacopea Europea (F.E
1997, 5.1.3). En primer lugar, se preparó cada formulación en
disolución acuosa que comprende 6 x 10^{6} UI/ml de
\alpha-interferón, un 0,02% de polisorbato 80 y
tampón acetato de amonio 10 mM. A la formulación, se añadieron los
conservantes a diversas concentraciones tal como se muestra en la
tabla 7 a continuación, y se añadió cloruro de sodio para ajustar la
tonicidad de cada formulación. Los resultados de la prueba de
eficacia antimicrobiana de las formulaciones en disolución acuosa
se muestran en la tabla 7 a continuación. Se midió el número de
células viables por 1 ml de formulación en disolución acuosa
utilizando los procedimientos descritos en el ejemplo de referencia
3. Los números de células viables medidos en cada tiempo de toma de
muestras se transformaron logarítmicamente y se calculó la reducción
Log en cada intervalo de tiempo. Se compararon las reducciones log
obtenidas con los valores de los criterios A o B recomendados en la
Farmacopea Europea para estimar si satisfacen los criterios A o
B.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
| * A: \begin{minipage}[t]{130mm}significa que la formulación en disolución acuosa satisface los criterios A en la Farmacopea Europea.\end{minipage} | |
| \hskip0.2cm B: \begin{minipage}[t]{130mm}significa que la formulación en disolución acuosa satisface los criterios B en la Farmacopea Europea.\end{minipage} | |
| \hskip0.2cm -: significa que la prueba no se realizó. |
Tal como puede observarse a partir de los
resultados en la tabla 7, la formulación en disolución acuosa que
comprende tanto el 0,15% de fenol y el 0,1% de
m-cresol satisfizo los criterios A y B de la prueba
de eficacia antimicrobiana en la Farmacopea Europea incluso cuando
contenía la cantidad mínima de los conservantes (cantidad total de
conservantes: 0,25%).
Se prepararon una formulación en disolución
acuosa que comprendía 6 x 10^{6} UI/ml de
\alpha-interferón, un 0,02% de polisorbato 80, un
0,3% de fenol y tampón acetato de amonio 10 mM (formulación en
disolución acuosa de prueba nº 7-1) y la misma
formulación descrita anteriormente excepto en que se utilizó una
mezcla del 0,15% de fenol y el 0,1% de m-cresol en
lugar del 0,3% de fenol (formulación en disolución acuosa de prueba
nº 7-2). Se ajustó a 5,3 el pH de cada formulación
en disolución acuosa y se añadió cloruro de sodio a la formulación
en disolución acuosa para ajustar la tonicidad. Las dos clases de
formulaciones se dividieron en 3 grupos y los 3 grupos se
almacenaron a 4ºC, 25ºC y 40ºC, respectivamente, durante 12 semanas.
Cada grupo tiene 3 lotes. A intervalos de tiempo regulares, se
midieron los cambios en la actividad biológica del
\alpha-interferón. Se determinó la pureza
utilizando cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa
(RP-HPLC, Waters Alliance System, detector UV,
columna Júpiter C18). Los resultados se muestran en las tablas
8-13 y las figuras 4a-4f a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\bullet \begin{minipage}[t]{145mm} En las tablas
8-10, el valor superior es la actividad biológica
absoluta de \alpha -interferón y el valor inferior
es la actividad biológica relativa (%) de
\alpha -interferón con respecto a la actividad
biológica de \alpha -interferón a tiempo 0. La
unidad de cada valor en las tablas es de 10 ^{6}
UI/ml.\end{minipage} \cr}
\vskip1.000000\baselineskip
Las figuras 4a, 4b y 4c son gráficos que
muestran los cambios en la actividad biológica relativa con respecto
a la actividad biológica de \alpha-interferón a
tiempo 0. Tal como se muestra en la tabla 8-13 y las
figuras 4a-4f, las formulaciones en disolución
acuosa que comprenden una mezcla del 0,15% de fenol y el 0,1% de
m-cresol mostraron una tendencia similar a aquellas
que comprenden un 0,3% de fenol solo en cuanto a la actividad así
como la pureza durante el periodo de prueba completo. Además, las
dos clases de formulaciones satisficieron los requisitos
antimicrobianos recomendados en la prueba de eficacia antimicrobiana
en la Farmacopea Europea. Sin embargo, la formulación en disolución
acuosa que comprende una mezcla del 0,15% de fenol y el 0,1% de
m-cresol es más segura para el cuerpo humano que la
que comprende un 0,3% de fenol solo porque la primera contiene una
cantidad menor de los conservantes.
Claims (8)
1. Formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón que consiste en
\alpha-interferón; polisorbato 80 como
estabilizador; un agente de regulación de la presión osmótica;
conservantes antimicrobianos seleccionados del grupo que consiste en
fenol, m-cresol o una mezcla de los mismos; y un
sistema tampón.
2. Formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón según la reivindicación 1, en la
que la cantidad de \alpha-interferón añadida está
en el intervalo de 1 x 10^{6} UI/ml-1 x 10^{8}
UI/ml.
3. Formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón según la reivindicación 1, en la
que la concentración de polisorbato 80 está en el intervalo del
0,01-0,05% p/v.
4. Formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón según la reivindicación 1, en la
que el agente de regulación de la presión osmótica es cloruro de
sodio.
5. Formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón según la reivindicación 1, en la
que el conservante se selecciona del grupo que consiste en el
0,1-0,3% p/v de fenol, 0,1-0,2% p/v
de m-cresol o una mezcla de los mismos.
6. Formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón según la reivindicación 1, en la
que el sistema tampón es un sistema tampón que consiste en acetato
de amonio y ácido acético; o un sistema tampón que consiste en
monohidrogenofosfato de sodio (Na_{2}HPO_{4}) y
dihidrogenofosfato de sodio (NaH_{2}PO_{4}).
7. Formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón según la reivindicación 6, en la
que la concentración del sistema tampón en la formulación en
disolución acuosa está en el intervalo de 5-20
mM.
8. Formulación en disolución acuosa de
\alpha-interferón según la reivindicación 1, en la
que el pH de la formulación está en el intervalo de
4,5-6,0.
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