WO2019123283A1 - Formulación farmacéutica estable de una proteína anti-tnfα - Google Patents

Formulación farmacéutica estable de una proteína anti-tnfα Download PDF

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WO2019123283A1
WO2019123283A1 PCT/IB2018/060293 IB2018060293W WO2019123283A1 WO 2019123283 A1 WO2019123283 A1 WO 2019123283A1 IB 2018060293 W IB2018060293 W IB 2018060293W WO 2019123283 A1 WO2019123283 A1 WO 2019123283A1
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adalimumab
formulation
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liquid formulation
concentration
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PCT/IB2018/060293
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Carlos Eduardo ESPINOSA DE LA GARZA
María de Lourdes MUCIÑO ALCÁNTARA
Germán GONZÁLEZ SANTOYO
Nelly PIÑA LARA
Víctor Raúl CAMPOS GARCÍA
Mariana Patricia MIRANDA HERNÁNDEZ
Mariana BOLIVAR VILCHIDO
Antonio German HERNÁNDEZ GARCÍA
Víctor PÉREZ MEDINA MARTÍNEZ
Maribel JARDÓN CASTILLO
Rodolfo SALAZAR CEBALLOS
Néstor Octavio PÉREZ RAMÍREZ
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Probiomed S.A. De C.V.
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons

Definitions

  • the present invention relates to the Pharmaceutical area, in particular pharmaceutical formulations containing monoclonal antibodies.
  • This invention relates to stable liquid formulations of Adalimumab, which is a recombinant monoclonal antibody directed against tumor necrosis factor alpha (anti-TNFa).
  • formulations described in this application contain physicochemical advantages in relation to the formulations disclosed in the state of the art, more specifically in the reference formulations containing Adalimumab.
  • the intrinsic physical and chemical properties of a therapeutic protein are susceptible to alterations during its biosynthesis, extraction, purification, transport and shelf life (Staub et al., 2011), or during any stage of its life cycle if it is exposed to conditions of deliberate or non-deliberate stress, such as: temperature changes, freezing and thawing processes agitation, pH change, among others (Chang and Hershenson
  • a longer half shelf life translates into a stable medication for a longer time, an advantage that is pursued during the development of formulations to reduce costs and bring the drug to a greater number of patients because the drug preserves its physicochemical characteristics and pharmacological for a longer time.
  • excipients will have the function of maintaining the solubility, stability and biological activity of the protein.
  • a buffer solution for pH whose function is to maintain the pH of the pharmaceutical formulation during the life of the product
  • modifying or stabilizing agents whose function is to maintain the structural integrity of the therapeutic protein including the prevention and control of its aggregation
  • surfactant agents whose function is to prevent the formation of particles and protein adsorption on the surface of their container;
  • excipients mentioned above must be compatible with the physical and chemical properties of the protein or active ingredient, so that it can preserve its biological activity according to its therapeutic indication. Additionally, said excipients should not be toxic (Frokjaer and Otzen, 2005), that is, harmless to the patient and should not have a pharmacological effect per se.
  • the above constitutes the vehicle-protein system or liquid formulation.
  • liquid pharmaceutical formulations has obvious advantages over formulations lyophilized since the liquid formulation does not require rehydration (reconstitution of lyophilisate with its diluent) and is ready to be used (Bye et al., 2014), so that dosing accuracy is increased and clinical use in patients is improved ( Harris et al., 2004).
  • Said therapeutic formulations are suitable for parenteral administration, either subcutaneously, intravenously, intramuscularly or intraperitoneally, provided that their physical and chemical stability, as well as their biological activity, can be demonstrated.
  • TNFa tumor necrosis factor alpha
  • the formulation should be appropriate to maintain the expected pharmacological and safety properties according to its therapeutic use.
  • Adalimumab is a human monoclonal antibody generated by recombinant DNA technology. Specifically, it is a human immunoglobulin G subclass 1 (IgGl) which has an approximate molecular mass of 148 kDa. Adalimumab acts as a biological inhibitor of TNFa and is used as a biotherapeutic agent to treat autoimmune diseases in which there is a pathological elevation of TNFa, for example: rheumatoid arthritis, polyarticular juvenile idiopathic arthritis, psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis, Crohn's disease, ulcerative colitis, plaque psoriasis, hidradenitis suppurativa, panuveitis (Humira®, Full prescribing information, 2017), among others.
  • IgGl human immunoglobulin G subclass 1
  • liquid pharmaceutical formulations containing Adalimumab There are several liquid pharmaceutical formulations containing Adalimumab.
  • said formulations can have a shelf life and a reduced physical-chemical stability due to the fact that they contain excipients that do not allow them to prolong the stability thereof nor do they allow to increase the time in which the therapeutic molecules maintain their optimal functional properties.
  • Adalimumab described in the present invention have evident advantages over the formulations disclosed in the state of the art such as that which is on the market under the name of Humira® (US Patent US 8,216,583 and Mexican Patent MX 272842) , and that contains Adalimumab in a buffer solution of pH (citrates and phosphates), mannitol, polysorbate and sodium chloride.
  • the present application describes, among others, a liquid formulation containing Adalimumab, a recombinant anti-TNFa protein, in high concentration (20 to 100 mg / mL), in the presence of a simplified pH buffer solution with only citrates at a concentration of 10 mM, which maintains a pH of 5.2.
  • This formulation also contains 12 mg / mL of mannitol, 1 mg / mL of polysorbate, and sodium chloride used as toning agent (cbp 250 to 350 mOsm / kg).
  • a clear difference of the present invention is the absence of phosphates as a buffering agent.
  • This formulation is used for the treatment of diseases such as: rheumatoid arthritis, polyarticular juvenile idiopathic arthritis, psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis, Crohn's disease, hidradenitis suppurativa, ulcerative colitis, plaque psoriasis and panuveitis, among others.
  • the liquid formulation representative of the present application contains differences and advantages in relation to the formulations described in the state of the art since it makes use of a smaller number of components while maintaining the physicochemical biological pharmacological and safety properties of Adali or ab.
  • the present formulation is supported by the experimental evidence provided from various studies of physicochemical stability, biological activity, pharmacological and safety parameters where properties such as generation of aggregates and degradation, load alterations, modifications of the tertiary structure, presence were evaluated. of visible and subvisible particles, thermal stability, biological potency (before and after the exposure of the formulations to different stress conditions), as well as pharmacokinetics, toxicity and irritability tests, among others.
  • liquid formulation of the present application consist in the use of a smaller number of components (excipients) than the formulations described in the state of the art, so that the complexity and manufacturing cost is reduced while maintaining the properties physicochemical, biological, pharmacological and safety of Adalimumab.
  • this formulation is useful in the treatment of autoimmune diseases in which a pathological elevation of TNFa occurs.
  • the present invention describes new liquid formulations containing Adali or ab, an anti-TNFa onoclonal antibody.
  • this invention comprises a liquid formulation for Adalimumab, a monoclonal antibody directed against TNFa in high concentration (20 to 100 mg / mL), in the presence of a buffer solution of 10 mM citrate, which maintains a pH of 5.2, added with mannitol 12 mg / ml, polysorbate 1 mg / ml and sodium chloride used as toning agent (cbp 250 to 350 mOsm / kg).
  • This formulation makes use of a smaller number of excipients than the formulations described in the state of the art, while maintaining the physicochemical, biological, pharmacological and safety properties of Adalimumab.
  • This formulation is stable for at least 12 months at a temperature of 5 ⁇ 3 ° C.
  • this formulation is useful for containing Adalimumab in its commercial use as a biotherapeutic agent of parenteral administration to treat autoimmune diseases in which a pathological elevation of TNFa occurs.
  • Adalimumab refers to a recombinant human anti-TNF ⁇ monoclonal antibody, specifically, it is a human immunoglobulin G subclass 1 (IgGl). This protein is obtained from a system of expression of recombinant proteins in mammalian cells, specifically, through a culture of Chinese hamster ovary cells (CHO, for its acronym in English). Adalimumab has a CAS registration number (Chemical Abstracts Service) 331731-18-1. Adalimumab was marketed for the first time as a medicine under the name of Humira®.
  • a “liquid formulation” refers to an aqueous solution containing a therapeutic agent that allows the biological activity of an IFA, such as Adalimumab, to be effective.
  • the “liquid formulation of Humira®” refers to the liquid reference formulation for Adalimumab, which contains: 40 mg of Adalimumab 1.04 mg citric acid monohydrate, 0.24 mg sodium citrate, 1.22 mg phosphate Dibasic sodium dihydrate, 0.69 mg monobasic sodium phosphate dihydrate, 9.6 mg mannitol, 0.8 mg polysorbate 80 and 4.93 mg sodium chloride in 0.8 ml water grade injectable, at pH 5.2.
  • excipients refer to inert and non-toxic compounds that can be administered to the subject to provide an effective dose of IFA. These compounds are added to the aqueous preparation to maintain the physical, chemical and biological stability of the IFA, as well as to provide the isotonicity suitable for parenteral administration.
  • pH buffer refers to a solution that is capable of tolerating pH changes by keeping it in an acceptable range through the action of its acid-base components.
  • a “stable" liquid formulation is one that, when containing an IFA, has the capacity to remain within the established quality specifications, in terms of physicochemical stability and biological potency, during its expiration period or during its exposure to conditions of stress, for example: thermal stress, mechanical stress, stress by freeze-thaw cycles, among others.
  • Said stability can be demonstrated by analytical methods indicative of stability found in the state of the art, for example: gel permeation chromatography in an ultra high performance liquid chromatography instrument (SE-UHPLC or SEC); cation exchange chromatography in a UHPLC instrument (CEX-UHPLC or CEX), reverse phase chromatography in a UHPLC instrument (RP-UHPLC), counting of individual photons correlated in time or life time (TCSPC), differential scanning calorimetry (DSC), apoptosis inhibition bioassay, capillary isoelectric focusing (cIEF), capillary gel electrophoresis in reducing and nonreducing conditions (CGE-R, CGE-NR, for its acronym in English, respectively), among others.
  • SE-UHPLC or SEC ultra high performance liquid chromatography instrument
  • CEX-UHPLC or CEX reverse phase chromatography in a UHPLC instrument
  • RP-UHPLC reverse phase chromatography in a UHPLC instrument
  • TCSPC differential scanning ca
  • the IFA maintains its "physical stability" in a liquid formulation if it does not show substantially signs of precipitation determined by visual inspection or aggregation or degradation determined by SEC, or changes in the time of life of the fluorescence (i) determined by TCSPC or changes in the transition temperature (Tm) determined by DSC, or of impurities of high and low molecular weight determined by CGE-R and CGE-NR.
  • the IFA maintains its "physico-chemical stability" in a liquid formulation if it does not show substantially any signs of load alteration determined by CEX, or differences in the isoelectric point (pl) determined by cIEF, or changes in the peptide profile determined by RP-UHPLC .
  • the IFA maintains its "biological potency" in a liquid formulation if it does not show substantially signs of alteration of its biological activity determined by bioassay of inhibition of the apoptotic activity of TNFa in mammalian cells.
  • the IFA maintains its "pharmacological properties" in a liquid formulation if it shows no difference in single dose pharmacokinetics and repeated dose pharmacokinetics when compared to the liquid formulation of
  • Humira® The IFA maintains its "safety properties" in a liquid formulation if it shows no difference in acute toxicity, repeated dose toxicity and irritability when compared to the liquid formulation of Humira®.
  • a “surfactant” agent refers to a compound that is capable of lowering the surface tension of a liquid formulation in a manner that prevents the formation of particles and the adsorption of an IFA on the surface of its container.
  • a “stabilizer” or “modifier” agent refers to compounds, such as sugars or amino acids, that are capable of preventing or controlling the aggregation of an IFA.
  • a “tonicity agent” is an inert compound that is isotonic to the liquid formulation and a formulation is isotonic if it has essentially the same osmotic pressure as human blood. Isotonic formulations usually have an approximate osmotic pressure of 250 to 350 mOsm.
  • Figure 1 shows the atograms obtained by SEC of the effect of thermal stress on the aggregation and degradation of Adalimumab contained in the liquid formulation based on the citrate system with respect to the liquid formulation of Humira®, at time 0 (T0) and at the end of 21 days (ET21), where the increase in aggregates and truncated forms can be observed at a comparable level.
  • Figure 2 shows a graph with the relative potency of the liquid formula selected for Adalimumab obtained by bioassay of inhibition of the apoptotic activity of TNFa in the cell line WEHI 164.
  • This bioassay is based on the adjustment of the dose-response curves to the model of four parameters (lower asymptote, slope, inflection point and upper asymptote) from which the average effective concentration and biological power are derived.
  • the bar in dark gray corresponds to the liquid formulation of Humira®, and the bar in light gray corresponds to the liquid formula selected for Adalimumab.
  • the error bars correspond to the standard deviation.
  • Figure 3 shows the characteristic profile of the AgNPs solution with a maximum plasmonic absorption value at 400 nm and the characteristic profile of the AgNPs-protein solution with a maximum plasmonic absorption value at 410 nm.
  • the compatibility evaluation of Adalimumab in the selected liquid formula with three models (model A, B and C) of containers using AgNPs as sensors is also shown.
  • the black region of the pie charts corresponds to protein adsorption in the container (maximum plasmonic absorption value different from 400 nm) and the gray region corresponds to no protein adsorption in the container (maximum plasmonic absorption value at 400 nm ).
  • n corresponds to the number of containers tested.
  • excipients used have proved to be suitable for liquid formulations of recombinant proteins, especially onoclonal antibodies, and in particular useful for stabilizing therapeutic proteins of parenteral application.
  • mM citric acid monohydrate 1.31 mg / ml and sodium citrate dihydrate 0.31 mg / ml
  • phosphates 14.11 mM sodium phosphate dibasic dihydrate 1.53 mg / ml and sodium phosphate monobasic dihydrate 0.86 mg / ml
  • mannitol 12 mg / ml polysorbate 80 1 mg / ml and sodium chloride 6.17 mg / ml, pH 5.2 and cbp of water grade for injection.
  • Adalimumab was used at a concentration of 50 mg / ml, obtained through a CHO cell culture.
  • the liquid formulations after being subjected to stress, were evaluated by several analytical methodologies, including: SEC, CEX, TCSPC, DSC.
  • SEC and CEX were carried out in a UHPLC (model Acquity class H, Waters Corp.), TCSPC was carried out in a fluorometer (model Fluorolog FL3-22, Horiba Scientific), DSC was carried out in a scanning calorimeter Differential (Nano DSC model, TA Instruments).
  • Tables 2, 3 and 4 show the concentrated results of the exploratory study and the optimization of excipients for liquid formulations containing Adalimumab under the conditions of thermal stress, mechanical and freeze-thaw cycles described above.
  • Adalimumab Because the concentration of Adalimumab is high, there is a possibility of protein aggregation. This phenomenon can generate loss of activity and immunogenic reactions. As a general trend of the results obtained by SEC, an increase in the percentage of aggregates was observed as the days of thermal stress increased, with the consequent percentage decrease of the main form of Adalimumab ( Figure 1) . This effect was similar but less evident for the other types of stress.
  • the CEX technique allows to reveal the negatively charged isoforms (acid variants) and positively charged isoforms (basic variants) of a protein. This determination was relevant since it allowed to establish the identity and load heterogeneity of Adalimumab.
  • the results obtained by CEX showed a greater impact of thermal stress on the generation of acidic and basic isoforms as the days of thermal stress increased compared to the other types of stress.
  • the TCSPC technique allows to reveal the fluorescence process that takes place in a certain time (i) due to the exposure of the fluorescent amino acids in the three-dimensional structure of the protein, so that the greater the exposure of the fluorescent amino acids, the greater will be i.
  • the DSC technique allows to reveal the Tm of a protein, as a measure of the changes in the conformation of the protein induced by heat. This determination was relevant since
  • Table 5 shows the summary of the analytical results of the exploratory study and the optimization of excipients for liquid formulation for Adalimumab under thermal stress, mechanical and freeze-thaw cycles. As can be seen, formulation 11 was the one that had the highest number of favorable results, according to the acceptance criteria described above.
  • the liquid formula of Adalimumab which has the best stability characteristics is the one selected from the group consisting of: Adalimumab (20 to 100 mg / ml), in the presence of a 10 mM citrate buffer solution, which maintains a pH of 5.2, added with mannitol 12 mg / ml, polysorbate 1 mg / ml and sodium chloride used as toning agent (cbp 250 to 350 mOsm / kg).
  • Biological potency of the liquid formulation selected for Adalimumab In order to confirm the maintenance of the biological potency of Adalimumab in the selected liquid formula, a bioassay was carried out to inhibit the apoptotic activity of TNFa in mammalian cells ( Figure 2).
  • the bioassay is based on the ability of Adalimumab to prevent the interaction of TNFa with TNF receptors present on the surface of a mouse fibroblast cell line (WEHI 164), allowing us to know the ability of Adalimumab to exert its main mechanism of action in the recognition of its therapeutic target.
  • the selected liquid formulation had a relative potency in the range of 80-125% with respect to the liquid formulation of Humira®. In conclusion, it was confirmed that Adalimumab retains its activity and biological identity in the representative liquid formula.
  • the Hsd ICR mouse evaluation of the representative liquid formulation for Adalimumab provided information on the impact of IFA on a species in which it does not interact with the human therapeutic homologue, mouse TNFa.
  • the administration of the formulations in young male Hsd ICR mice was subcutaneously. 32 mg / kg of IFA were administered in a volume of 10 ml / kg of the liquid formulation selected for Adalimumab or the liquid formulation of Humira®. Concentrations of IFA reached in serum with each of the formulations were evaluated for 56 days by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA, for its acronym in English). The pharmacokinetic parameters evaluated were: time to reach the maximum concentration (T m ax), maximum concentration (Cmax), area under the curve (AUC, for its acronym in English) and average time of residence (MRT, for its acronym in English ). To determine if there were statistically differences Significant among the effects of the two formulations on the IFA, the pharmacokinetic parameters were analyzed using the Student's t-test. Table 6 shows the results of the pharmacokinetic parameters evaluated
  • Cynomolgus monkey is considered a relevant species to perform experimental tests with Adalimumab, since it has interaction with monkey TNFa, the human therapeutic homolog.
  • the administration of the formulations in Cynomolgus monkey was subcutaneously. 32 mg / kg / week were administered for four weeks of IFA in the selected liquid formulation of Adalimumab or in the liquid formulation of Humira®. The concentrations of the IFA levels were evaluated by an MSD (Meso Scale Discovery) ELISA method. The pharmacokinetic parameters AUC (0 - 168 h) and C max were evaluated in the first and fifth administration. Table 7 shows the results of the evaluated pharmacokinetic parameters and Table 8 shows the ratio of liquid formula selected for Adalimumab: Humira® liquid formula.
  • Table 7 Values of the pharmacokinetic parameters evaluated in Cynomolgus monkey. Average ⁇ standard deviation is presented.
  • the toxicological profile of repeated doses of the two formulations was evaluated in the species relevant to the IFA, the Cynomolgus monkey.
  • a single dose level of IFA 32 mg / kg / week
  • the Liquid formulation selected for Adali or ab of the liquid formulation of Humira® was administered subcutaneously for four weeks in a similar volume of the Liquid formulation selected for Adali or ab of the liquid formulation of Humira®.
  • the animals were observed for eight weeks.
  • the groups treated with the two formulations did not show differences in clinical signs, blood pressure, ophthalmoscopy, food consumption, body weight, laboratory parameters of blood chemistry, hematology and urinalysis.
  • necropsy and histopathology showed similar effects.
  • the site where the subcutaneous administration of both formulations was carried out showed similar effects, indicating an identical local tolerability.
  • the immunogenicity produced by the two formulations and IFA was also monitored during the study.
  • the antibodies against the IFA produced by the groups treated with the two formulations were similar, indicating that the liquid formulation selected for Adalimumab does not increase the immunogenicity of the IFA.
  • the irritability of the formulations was evaluated in a comparative way by means of two in vitro tests: irritability in red blood cells and irritability in chick embryo chorioallantoic membrane.
  • the tissues were exposed to different concentrations of IFA in similar volumes of the liquid formulation selected for Adalimumab or the liquid formulation of Humira®, and the index of irritability was determined depending on the percentage of hemolysis and protein denaturation generated. In both trials the formulas behaved in a comparable way and were not irritating.
  • compositions must have a verifiable shelf life and physicochemical stability. For this, it was necessary to confirm that the excipients of the selected liquid formulation allow to prolong the stability and increase the time in which Adalimumab maintains its optimal functional properties.
  • Table 9 shows the results of the long-term stability study (12 months at 5 ⁇ 3 ° C) of the liquid formula selected for Adalimumab. As can be seen, the formulation has the ability to remain within the established quality specifications, in terms of qualitative tests, identity, purity, potency, content and biological load for a period of up to 12 months in conditions of refrigeration. Said stability could be demonstrated by analytical methods indicative of stability found in the state of the art.
  • Biotherapeutic agents such as Adalimumab, demand container-closure systems that allow safe and efficient dosing (US Food and Drug Administration, 1999).
  • Adalimumab demand container-closure systems that allow safe and efficient dosing
  • Adalimumab in the containers using silver nanoparticles (AgNPs) as sensors
  • AgNPs silver nanoparticles
  • a compatibility study of the liquid formulation selected for Adalimumab was carried out.
  • three different models of primary packaging specifically, three models (model A, B and C) of pre-filled syringes of siliconized glass (container or PFS, for its acronym in English).
  • the containers were exposed to the formulation, this was followed by a rinse with water to remove the non-adsorbed protein.
  • Adalimumab As criteria to differentiate the adsorption of Adalimumab, the following was considered:
  • Non-protein adsorption was determined in the container if the characteristic profile of the AgNPs solution with a maximum plasmonic absorption value of 400 nm was obtained.
  • Protein adsorption was determined in the container if the characteristic profile of the AgNPs solution with a maximum plasmonic absorption value different from 400 nm was not obtained.
  • Figure 3 shows the compatibility results of the liquid formulation selected for Adalimumab with the containers. It was determined that 71, 77 and 74% of the tests were positive for protein adsorption in models A, B and C, respectively. This was revealed by a shift to the right of the plasmonic absorption band that showed a maximum value at 410 or 420 nm and by the appearance of additional bands up to 600 nm. While the experimental results showed that container A was the most suitable,> 70% of cases were positive for protein adsorption in all models evaluated. It is important to mention that because the sensitivity of the method allows to detect protein adsorption in the order of ng to pg, for all the evaluated models the protein loss was ⁇ 0.01% of the total content, which was determined as practically insignificant.
  • Humira® (adalimumab) injection, for subcutaneous use. 2017. Full prescribing Information.

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Abstract

.La presente invención describe una nueva formulación liquida para Adalimumab, un anticuerpo monoclonal recombinante dirigido contra el TNFα en alta concentración (20 a 100 mg/mL), en presencia de una solución amortiguadora de pH de citratos, que mantiene un pH de 5.2, adicionada con polisorbato, manitol y cloruro de sodio utilizado como agente tonificante. Esta formulación hace uso de un menor número de excipientes que la formulación descrita en el estado de la técnica, mientras que mantiene las propiedades fisicoquímicas, biológicas, farmacológicas y de seguridad de Adalimumab. Por último, esta formulación es útil para contener Adalimumab en su uso comercial como agente bioterapéutico de administración parenteral para tratar enfermedades autoinmunes en las cuales se presenta una elevación patológica del TNFα.

Description

FORMULACIÓN FARMACÉUTICA ESTABLE DE UNA PROTE ÍNA ANTI -TNFoc
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con el área Farmacéutica, de manera particular con formulaciones farmacéuticas que contienen anticuerpos monoclonales .
Esta invención se refiere a formulaciones liquidas estables de Adalimumab, el cual es un anticuerpo monoclonal recombinante dirigido contra el factor de necrosis tumoral alfa (anti-TNFa) .
Las formulaciones descritas en esta solicitud contienen ventajas fisicoquímicas en relación con las formulaciones divulgadas en el estado de la técnica, más concretamente en las formulaciones de referencia que contienen Adalimumab.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las propiedades físicas y químicas intrínsecas de una proteína terapéutica son susceptibles de sufrir alteraciones durante su biosíntesis, extracción, purificación, transporte y vida de anaquel (Staub et al., 2011), o durante cualquier etapa de su ciclo de vida si ésta es expuesta a condiciones de estrés deliberado o no deliberado, como: cambios de temperatura, procesos de congelamiento y descongelamiento agitación, cambio de pH, entre otras (Chang y Hershenson
2002) . Un mayor tiempo de vida media en anaquel se traduce en un medicamento estable durante un mayor tiempo, ventaja que se persigue durante el desarrollo de formulaciones para disminuir costos y llevar el medicamento a un mayor número de pacientes debido a que el medicamento preserva sus características fisicoquímicas y farmacológicas durante un mayor tiempo.
Debido a esto, una práctica para incrementar la tolerancia de una proteína que es utilizada como ingrediente farmacéutico activo (IFA) en un medicamento, consiste en adicionar excipientes a la formulación farmacéutica. Específicamente, estos excipientes tendrán como función mantener la solubilidad, estabilidad y actividad biológica de la proteína.
Los excipientes o agentes más importantes por considerar durante el desarrollo de una formulación farmacéutica líquida de acuerdo con Chang y Hershenson, (2002), son:
• una solución amortiguadora de pH, cuya función es mantener el pH de la formulación farmacéutica durante la vigencia del producto; agentes modificadores o estabilizadores, cuya función es mantener la integridad estructural de la proteína terapéutica incluyendo la prevención y control de su agregación;
• agentes surfactantes , cuya función es prevenir la formación de partículas y adsorción de proteína en la superficie de su contenedor;
• agentes tonificantes, cuya función es otorgar la isotonicidad a la formulación de manera que sea apropiada para su administración en humanos.
Los excipientes antes mencionados deben ser compatibles con las propiedades físicas y químicas de la proteína o principio activo, de manera tal que pueda preservar su actividad biológica de acuerdo con su indicación terapéutica. Adicionalmente, dichos excipientes no deben ser tóxicos (Frokjaer y Otzen, 2005), es decir, inocuos para el paciente y no deben tener un efecto farmacológico per se. Lo anterior constituye el sistema vehículo-proteína o formulación líquida .
A este respecto el uso de formulaciones farmacéuticas líquidas tiene ventajas evidentes sobre formulaciones liofilizadas ya que la formulación líquida no requiere de rehidratación (reconstitución del liofilizado con su diluyente) y está lista para utilizarse (Bye et al., 2014), de manera que se incrementa la exactitud de dosificación y se mejora el uso clínico en pacientes (Harris et al., 2004) . Dichas formulaciones terapéuticas son adecuadas para administración parenteral, ya sea por vía subcutánea, intravenosa, intramuscular o intraperitoneal , siempre que su estabilidad física y química, así como su actividad biológica pueda ser demostrada. Ello incluye la inhibición de mecanismos de agregación y degradación, modificaciones químicas, modificaciones de la estructura terciaria, presencia de partículas visibles y subvisibles, disminución de la energía libre de desnaturalización, y, particularmente, en preparaciones terapéuticas que contengan alta concentración de proteína, como Adalimumab, alteraciones en la neutralización de su blanco terapéutico, el factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) . Además, la formulación deberá ser apropiada para mantener las propiedades farmacológicas y de seguridad esperadas según su uso terapéutico.
Adalimumab es un anticuerpo monoclonal humano generado por tecnología del ADN recombinante . Específicamente es una inmunoglobulina G humana subclase 1 (IgGl) que cuenta con una masa molecular aproximada de 148 kDa . Adalimumab actúa como un inhibidor biológico del TNFa y es utilizado como agente bioterapéutico para tratar enfermedades autoinmunes en las cuales se presenta una elevación patológica del TNFa, por ejemplo: artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil poliarticular, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, psoriasis en placa, hidradenitis supurativa, panuveítis (Humira®, Full prescribing information, 2017), entre otras.
Existen varias formulaciones farmacéuticas líquidas que contienen Adalimumab. Sin embargo, dichas formulaciones pueden tener una vida de anaquel y una estabilidad fisicoquímica reducida debido a que contienen excipientes que no les permiten prolongar la estabilidad de las mismas ni permiten aumentar el tiempo en el que las moléculas terapéuticas mantienen sus propiedades funcionales óptimas.
Existe entonces la necesidad de formulaciones líquidas nuevas que contengan Adalimumab como IFA en alta concentración que haga uso de un menor número de componentes, mientras que mantenga las propiedades fisicoquí icas biológicas farmacológicas y de seguridad de Adali u ab, y que sea útil para administración parenteral.
Para cumplir este objetivo es necesario un profundo conocimiento de las propiedades fisicoquímicas de la proteína en estudio y excipientes, así como de los potenciales efectos de su interacción. Además, se requiere de la disponibilidad y pericia en el uso de infraestructura analítica especializada para la ejecución de los estudios correspondientes .
Las nuevas formulaciones líquidas de Adalimumab descritas en la presente invención tiene ventajas evidentes frente a las formulaciones divulgadas en el estado de la técnica como la que se encuentra en el mercado bajo el nombre de Humira® (Patente Estadounidense US 8,216,583 y Patente Mexicana MX 272842), y que contiene Adalimumab en una solución amortiguadora de pH (citratos y fosfatos), manitol, polisorbato y cloruro de sodio.
Entre las ventajas de las formulaciones descritas en la presente solicitud se encuentran: 1. Uso de un menor número de excipientes que las formulaciones descritas en el estado de la técnica con resultados inesperados y ventajosos que nunca habían sido obtenidos ni reportados.
2. Mantener la identidad y propiedades fisicoquímicas de Adalimumab .
3. Mantener la potencia biológica de Adalimumab.
4. Mantener las características de seguridad y eficacia en relación con Humira®.
Las anteriores ventajas serán evidentes a la luz de las pruebas experimentales y los resultados mostrados a lo largo de la presente solicitud.
En relación con el estado de la técnica que divulga formulaciones líquidas acuosas que contienen proteínas relacionadas a Adalimumab tenemos que, como se mencionó anteriormente, la patente Estadounidense US 8,216,583 se refiere a una formulación farmacéutica líquida que contiene Adalimumab. Esta formulación tiene como componentes una solución amortiguadora de pH de citratos y fosfatos, polisorbato 80, manitol y que en conjunto mantienen un pH en el intervalo de 4.5 a 6.0. Por el contrario, la presente solicitud describe, entre otras, una formulación líquida que contiene Adalimumab, una proteína recombinante anti-TNFa, en alta concentración (20 a 100 mg/mL), en presencia de una solución amortiguadora de pH simplificada con solamente citratos en una concentración de 10 mM, que mantiene un pH de 5.2. Esta formulación contiene también 12 mg/mL de manitol, 1 mg/mL de polisorbato, y cloruro de sodio utilizado como agente tonificante (cbp 250 a 350 mOsm/kg) . Una clara diferencia de la presente invención es la ausencia de fosfatos como agente amortiguador. Esta formulación es utilizada para el tratamiento de enfermedades como: artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil poliarticular, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad de Crohn, hidradenitis supurativa, colitis ulcerativa, psoriasis en placa y panuveítis, entre otras .
La formulación líquida representativa de la presente solicitud contiene diferencias y ventajas en relación con las formulaciones descritas en el estado de la técnica ya que hace uso de un menor número de componentes mientras que mantiene las propiedades fisicoquímicas biológicas farmacológicas y de seguridad de Adali u ab. La presente formulación se encuentra soportada en la evidencia experimental proporcionada a partir de diversos estudios de estabilidad fisicoquímica, actividad biológica, parámetros farmacológicos y de seguridad donde se evaluaron propiedades como generación de agregados y degradación, alteraciones de carga, modificaciones de la estructura terciaria, presencia de partículas visibles y subvisibles, estabilidad térmica, potencia biológica (antes y después de la exposición de las formulaciones a diferentes condiciones de estrés), así como farmacocinética, toxicidad y ensayos de irritabilidad, entre otras.
Las ventajas de la formulación líquida de la presente solicitud consisten en el uso de un menor número de componentes (excipientes) que las formulaciones descritas en el estado de la técnica, de manera que se reduce la complejidad y costo de fabricación mientras que mantiene las propiedades fisicoquímicas, biológicas, farmacológicas y de seguridad de Adalimumab. Asimismo, esta formulación es útil en el tratamiento de enfermedades autoinmunes en las cuales se presenta una elevación patológica del TNFa. Breve descripción de la invención
La presente invención describe nuevas formulaciones líquidas que contienen Adali u ab, un anticuerpo onoclonal anti- TNFa . Específicamente, esta invención comprende una formulación líquida para Adalimumab, un anticuerpo monoclonal dirigido contra el TNFa en alta concentración (20 a 100 mg/mL) , en presencia de una solución amortiguadora de pH de citratos 10 mM, que mantiene un pH de 5.2, adicionada con manitol 12 mg/ml, polisorbato 1 mg/ml y cloruro de sodio utilizado como agente tonificante (cbp 250 a 350 mOsm/kg) . Esta formulación hace uso de un menor número de excipientes que las formulaciones descritas en el estado de la técnica, mientras que mantiene las propiedades fisicoquímicas, biológicas, farmacológicas y de seguridad de Adalimumab. Esta formulación es estable por al menos 12 meses a una temperatura de 5 ± 3 °C.
Por último, esta formulación es útil para contener Adalimumab en su uso comercial como agente bioterapéutico de administración parenteral para tratar enfermedades autoinmunes en las cuales se presenta una elevación patológica del TNFa. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
A fin de que se pueda entender más fácilmente la presente invención, se definen algunos términos.
"Adalimumab" se refiere a un anticuerpo monoclonal humano recombinante anti-TNFa, específicamente, se trata de una inmunoglobulina G humana subclase 1 (IgGl) . Esta proteína se obtiene de un sistema de expresión de proteínas recombinantes en células de mamífero, específicamente, a través de un cultivo de células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en ingles) . Adalimumab tiene un número de registro CAS (Chemical Abstracts Service, por sus siglas en inglés) 331731-18-1. Adalimumab se comercializó por primera vez como medicamento bajo el nombre de Humira®.
Una "formulación líquida" se refiere a una solución acuosa que contiene un agente terapéutico que permite que la actividad biológica de un IFA, como Adalimumab, sea efectiva.
La "formulación líquida de Humira®" se refiere a la formulación líquida de referencia para Adalimumab, la cual contiene: 40 mg de Adalimumab 1.04 mg ácido cítrico monohidratado, 0.24 mg citrato de sodio, 1.22 mg fosfato dibásico de sodio dihidratado, 0.69 mg fosfato monobásico de sodio dihidratado, 9.6 mg de manitol, 0.8 mg de polisorbato 80 y 4.93 mg de cloruro de sodio en 0.8 mi de agua grado inyectable, a pH 5.2.
Los "excipientes" se refieren a compuestos inertes y no tóxicos que pueden ser administrados al sujeto para proporcionar una dosis efectiva del IFA. Estos compuestos son adicionados a la preparación acuosa para mantener la estabilidad física, química y actividad biológica del IFA, así como para otorgar la isotonicidad adecuada para administración parenteral .
Una "solución amortiguadora de pH" se refiere a una solución que es capaz de tolerar los cambios de pH manteniéndole en un intervalo aceptable a través de la acción de sus componentes ácido-base.
Una formulación líquida "estable" es aquella que al contener un IFA tiene la capacidad de permanecer dentro de las especificaciones de calidad establecidas, en términos de estabilidad fisicoquímica y potencia biológica, durante su período de caducidad o durante su exposición a condiciones de estrés, por ejemplo: estrés térmico, estrés mecánico, estrés por ciclos de congelación-descongelación, entre otros. Dicha estabilidad puede ser demostrada por métodos analíticos indicativos de estabilidad encontrados en el estado del arte, por ejemplo: cromatografía de exclusión molecular en un instrumento de cromatografía de líquidos de ultra alto desempeño (SE-UHPLC o SEC, por sus siglas en inglés), cromatografía de intercambio catiónico en un instrumento UHPLC (CEX-UHPLC o CEX, por sus siglas en inglés), cromatografía de fase reversa en un instrumento UHPLC (RP-UHPLC, por sus siglas en inglés), conteo de fotones individuales correlacionados en tiempo o tiempo de vida (TCSPC, por sus siglas en inglés), calorimetría diferencial de barrido (DSC, por sus siglas en inglés), bioensayo de inhibición de apoptosis, isoelectroenfoque capilar (cIEF, por sus siglas en inglés), electroforesis capilar en gel en condiciones reductoras y no reductoras (CGE-R, CGE-NR, por sus siglas en inglés, respectivamente), entre otros.
El IFA mantiene su "estabilidad física" en una formulación líquida si no muestra sustancialmente signos de precipitación determinados por inspección visual o de agregación o degradación determinados por SEC, o cambios en el tiempo de vida de la fluorescencia (i) determinados por TCSPC o cambios en la temperatura de transición (Tm) determinados por DSC, o de impurezas de alto y bajo peso molecular determinadas por CGE-R y CGE-NR.
El IFA mantiene su "estabilidad fisicoquimica" en una formulación liquida si no muestra sustancialmente signos de alteración de carga determinados por CEX, o diferencias en el punto isoeléctrico (pl) determinados por cIEF, o cambios en el perfil de péptidos determinados por RP-UHPLC.
El IFA mantiene su "potencia biológica" en una formulación liquida si no muestra sustancialmente signos de alteración de su actividad biológica determinada por bioensayo de inhibición de la actividad apoptótica del TNFa en células de mamífero .
El IFA mantiene sus "propiedades farmacológicas" en una formulación líquida si no muestra diferencia en la farmacocinética de dosis única y farmacocinética de dosis repetidas cuando se compara con la formulación líquida de
Humira® . El IFA mantiene sus "propiedades de seguridad" en una formulación líquida si no muestra diferencia en la toxicidad aguda, toxicidad de dosis repetidas e irritabilidad cuando se compara con la formulación líquida de Humira®.
Un agente "surfactante" se refiere a un compuesto que es capaz de disminuir la tensión superficial de una formulación líquida de manera que previene la formación de partículas y la adsorción de un IFA en la superficie de su contenedor.
Un agente "estabilizador" o "modificador" se refiere a compuestos, como azúcares o aminoácidos, que son capaces de prevenir o controlar la agregación de un IFA.
Un "agente de tonicidad" es un compuesto inerte que hace isotónica a la formulación líquida y una formulación es isotónica si tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas por lo general tienen una presión osmótica aproximada de 250 a 350 mOsm. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La figura 1 muestra los cro atogra as obtenidos por SEC del efecto del estrés térmico sobre la agregación y degradación de Adalimumab contenido en la formulación liquida basada en el sistema de citratos con respecto a la formulación liquida de Humira®, al tiempo 0 (T0) y al término de 21 dias (ET21), donde se puede observar el incremento de los agregados y formas truncas a un nivel comparable.
La figura 2 muestra una gráfica con la potencia relativa de la formula liquida seleccionada para Adalimumab obtenida por bioensayo de inhibición de la actividad apoptótica del TNFa en la linea celular WEHI 164. Este bioensayo se basa en el ajuste de las curvas dosis-respuesta al modelo de cuatro parámetros (asíntota inferior, pendiente, punto de inflexión y asíntota superior) del cual se deriva la concentración efectiva media y potencia biológica. La barra en gris obscuro corresponde a la formulación líquida de Humira®, y la barra en gris claro corresponde a la formula líquida seleccionada para Adalimumab. Las barras de error corresponden a la desviación estándar. La figura 3 muestra el perfil característico de la solución de AgNPs con un valor máximo de absorción plasmónica en 400 nm y el perfil característico de la solución de AgNPs- proteína con un valor máximo de absorción plasmónica en 410 nm. También se muestra la evaluación de compatibilidad de Adalimumab en la formula líquida seleccionada con tres modelos (modelo A, B y C) de contenedores utilizando AgNPs como sensores. La región en negro de las gráficas circulares corresponde a adsorción de proteína en el contenedor (valor máximo de absorción plasmónica diferente de 400 nm) y la región en gris corresponde a no adsorción de proteína en el contenedor (valor máximo de absorción plasmónica en 400 nm) . n corresponde al número de contenedores probados.
EJEMPLOS
Ejemplos prácticos de las incorporaciones de la presente invención se ilustran a continuación, en el entendimiento de que cualquier persona hábil en el campo de formulaciones farmacéuticas puede hacer modificaciones o adiciones a lo que se ilustra dentro del alcance de la presente invención.
De manera independiente los excipientes utilizados han demostrado ser adecuados para formulaciones líquidas de proteínas recombinantes, en especial anticuerpos onoclonales , y en particular útiles para estabilizar proteínas terapéuticas de aplicación parenteral.
Con el fin de identificar las propiedades de estabilidad de una proteina en una determinada formulación liquida y en un periodo de tiempo corto, ésta es expuesta a condiciones de estrés acelerado. Dichas condiciones son más agresivas de las que se podría exponer a la proteína en condiciones normales de almacenamiento (Chang y Hershenson, 2002) . También, permite anticipar los efectos de condiciones no esperadas durante el manejo, distribución y almacenaje. Las condiciones de estrés acelerado incluyen (pero no se limitan) la exposición de la proteína a: temperaturas fuera del intervalo recomendado, agitación y múltiples ciclos de congelación-descongelación. Tomando en cuenta lo antes mencionado y con el objetivo de identificar aquella nueva formulación que haga uso de un menor número de componentes mientras que mantiene las propiedades fisicoquímicas, biológicas, farmacológicas y de seguridad de Adalimumab se llevó a cabo un estudio exploratorio y de optimización para su uso en un proceso de manufactura de las formulaciones candidato detalladas en la tabla 1: Tabla 1 . Concentración y características de excipientes utilizados en el estudio exploratorio y de optimización para formulación líquida para Adalimumab.
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Las formulaciones líquidas indicadas en la tabla 1 fueron sometidas a estrés térmico durante dos etapas: a 40 °C con toma de muestras a 0 y 14 días, y a 50 °C con toma de muestras a 21 días, respectivamente. De manera similar, las pruebas de estrés mecánico se llevaron a cabo en dos etapas: a 450 rpm con toma de muestras a 0 y 14 días, y a 600 rpm con toma de muestras a 21 días, respectivamente. El estrés por ciclos de congelación-descongelación se llevó a cabo con toma de muestras a los ciclos 5 y 10. Como control (muestra con clave "C" en la tabla 3) se utilizó la formulación líquida de Humira® que contiene: citratos 7.29 mM (ácido cítrico monohidratado 1.31 mg/ml y citrato de sodio dihidratado 0.31 mg/ml), fosfatos 14.11 mM (fosfato de sodio dibásico dihidratado 1.53 mg/ml y fosfato de sodio monobásico dihidratado 0.86 mg/ml), manitol 12 mg/ml, polisorbato 80 1 mg/ml y cloruro de sodio 6.17 mg/ml, a pH 5.2 y cbp de agua grado inyectable. Para todos los casos se utilizó Adalimumab en una concentración de 50 mg/ml, obtenido a través de un cultivo de células CHO.
Las formulaciones líquidas, luego de ser sometidos al estrés, fueron evaluadas por varias metodologías analíticas, incluyendo: SEC, CEX, TCSPC, DSC. SEC y CEX fueron llevados a cabo en un UHPLC (modelo Acquity clase H; Waters Corp.), TCSPC fue llevado a cabo en un fluorómetro (modelo Fluorolog FL3-22, Horiba Scientific) , DSC fue llevado a cabo en un calorímetro de escaneo diferencial (modelo Nano DSC; TA Instruments ) .
Como criterios de aceptación, se consideró lo siguiente:
• Una diferencia no mayor a 0.2 unidades de pH con respecto al valor objetivo.
• Una diferencia no mayor a 1 % en la pureza determinada por SEC respecto al IFA de Adalimumab.
• Una diferencia no mayor a 5 % en la pureza determinada por CEX respecto al IFA de Adalimumab. • Una diferencia no mayor a 2
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en el tiempo de vida de la fluorescencia determinada por TCSPC respecto al tiempo inicial y una diferencia no mayor a tres desviaciones estándar respecto al IFA de Adalimumab.
• Una diferencia no mayor a 1 °C en la Tm determinada por DSC respecto al tiempo inicial o a la fórmula control.
• Un valor de absorbancia a 320 nm localizado entre el valor mínimo al tiempo inicial y valor máximo a cada condición de estrés de la formula control .
• Menor número de excipientes.
En las tablas 2, 3 y 4 se muestran los resultados concentrados del estudio exploratorio y de optimización de excipientes para formulaciones líquidas que contienen Adalimumab bajo las condiciones de estrés térmico, mecánico y ciclos de congelación-descongelación descritas anteriormente.
Debido a que la concentración de Adalimumab es alta, existe posibilidad de agregación proteica. Éste fenómeno puede generar pérdida de actividad y reacciones inmunogénicas . Como tendencia general de los resultados obtenidos por SEC, se observó un incremento en el porcenta e de agregados conforme aumentaron los días de estrés térmico, con la consecuente disminución porcentual de la forma principal de Adalimumab (figura 1) . Este efecto fue similar pero menos evidente para los otros tipos de estrés.
Por otro lado, la técnica CEX permite revelar las isoformas de carga negativa (variantes ácidas) e isoformas de carga positiva (variantes básicas) de una proteína. Esta determinación fue relevante ya que permitió establecer la identidad y heterogeneidad de carga de Adalimumab. De manera análoga a SEC, los resultados obtenidos por CEX mostraron un mayor impacto del estrés térmico sobre la generación de isoformas ácidas y básicas conforme aumentaron los días de estrés térmico en comparación con los otros tipos de estrés. La técnica TCSPC permite revelar el proceso de fluorescencia que se lleva a cabo en un tiempo determinado (i) debido a la exposición de los aminoácidos fluorescentes en la estructura tridimensional de la proteína, de manera que mientras mayor sea la exposición de los aminoácidos fluorescentes, mayor será i . Esta determinación fue relevante ya que brindó información de la estructura y dinámica de una proteína, así como de la interacción proteína-solvente . Los resultados obtenidos por TCSPC mostraron que, bajo un tratamiento térmico, i conservó una relación directamente proporcional a los días de estrés. Sin embargo, bajo tratamientos mecánicos 5 o de_ congelación-descongelación, i mantuvo una relación inversa, es decir, a mayor número de ciclos, menor i.
La técnica DSC permite revelar la Tm de una proteína, como una medida de los cambios en la conformación de la proteína inducidos por calor. Esta determinación fue relevante ya que
10 permitió conocer la estabilidad estructural en solución de Adalimumab. A mayor Tm una mayor temperatura será requerida para desestabilizar la estructura nativa de la proteína y viceversa. Los resultados obtenidos por DSC no mostraron cambios en las Tm de Adalimumab después de 10 ciclos de
15 congelación-descongelación .
Tabla 2. Resultados del estudio exploratorio y de optimización de excipientes para formulación líquida para Adalimumab. Estrés térmico.
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Tabla 3. Resultados del estudio exploratorio y de optimización de excipientes para formulación líquida para Adalimumab. Estrés mecánico. SEC TCSPC CEX
Clave Día Agregados t Acidas Básicas
Truncas (%)
(%) (ns) (%) (%)
1-3 055 0.66 150 1.61 227 2.30 1509 17.42 3000 32.23
4-8 024 0.67 173 3.31 228 2.32 1558 37.47 2402 29.56
9-12 21 055 0.59 160 1.64 227 2.31 1556 18.55 27.41 28.91
13-15 057 0.62 164 1.69 228 2.31 1746 18.87 2424 25.95
C 023 0.35 137 1.61 230 2.32 1008 14.30 22.65 23.55
5
Tabla 4. Resultados del estudio exploratorio y de optimización de excipientes para formulación líquida para Adalimumab. Estrés por ciclos de congelación- descongelación .
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0
En la tabla 5 se muestra el resumen de los resultados analíticos del estudio exploratorio y de optimización de excipientes para formulación líquida para Adalimumab bajo estrés térmico, mecánico y ciclos de congelación- 5 descongelación. Como se puede notar, la formulación 11 fue aquella que tuvo el mayor número de resultados favorables, de acuerdo con los criterios de aceptación descritos anteriormente. Con base en lo anterior y teniendo en cuenta el uso de un menor número de excipientes como criterio de selección, la formula líquida de Adalimumab que reúne las mejores características de estabilidad es la seleccionada del grupo que consiste de: Adalimumab (20 a 100 mg/ml), en presencia de una solución amortiguadora de pH de citratos 10 mM, que mantiene un pH de 5.2, adicionada con manitol 12 mg/ml, polisorbato 1 mg/ml y cloruro de sodio utilizado como agente tonificante (cbp 250 a 350 mOsm/kg) .
Tabla 5. Resumen del estudio exploratorio y de optimización de excipientes para formulación líquida para Adalimumab bajo estrés térmico, mecánico y ciclos de congelación- descongelación .
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Formulación favorable
Formulación no favorable
Potencia biológica de la formulación liquida seleccionada para Adalimumab Con el objetivo de confirmar el mantenimiento de la potencia biológica de Adalimumab en la formula liquida seleccionada, se llevó a cabo un bioensayo de inhibición de la actividad apoptótica del TNFa en células de mamífero (figura 2) . El bioensayo se basa en la capacidad de Adalimumab para evitar la interacción del TNFa con los receptores TNF presentes en la superficie de una línea celular de fibroblastos de ratón (WEHI 164), permitiendo conocer la capacidad de Adalimumab para ejercer su mecanismo principal de acción en el reconocimiento de su blanco terapéutico. La formulación líquida seleccionada presentó una potencia relativa en el intervalo de 80 - 125 % respecto a la formulación líquida de Humira®. En conclusión, se confirmó que Adalimumab conserva su actividad e identidad biológica en la formula líquida representativa .
Farmacocinética de la formulación líquida seleccionada para Adalimumab .
Con el objetivo de confirmar el mantenimiento de las propiedades farmacológicas de Adalimumab en la formula líquida seleccionada, se evaluó el impacto que tiene esta formulación sobre los parámetros farmacocinéticos de forma comparativa con la formulación liquida de Humira®. Para esto se realizaron estudios de farmacocinética en dos especies: ratón Hsd:ICR y mono Cyno olgus.
Farmacocinética de dosis única
La evaluación en ratón Hsd:ICR de la formulación líquida representativa para Adalimumab brindó información del impacto del IFA en una especie en la que no presenta interacción con el homólogo terapéutico humano, el TNFa de ratón .
La administración de las formulaciones en ratones machos jóvenes Hsd:ICR fue por vía subcutánea. Se administraron 32 mg/kg de IFA en un volumen de 10 ml/kg de la formulación líquida seleccionada para Adalimumab o de la formulación líquida de Humira®. Las concentraciones de IFA alcanzadas en suero con cada una de las formulaciones fueron evaluadas durante 56 dias mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) . Los parámetros farmacocinéticos evaluados fueron: tiempo para alcanzar la concentración máxima (Tmax) , concentración máxima (Cmax) , área bajo la curva (AUC, por sus siglas en inglés) y tiempo medio de residencia (MRT, por sus siglas en inglés) . Para determinar si existieron diferencias estadísticamente significativas entre los efectos de las dos formulaciones sobre el IFA, los parámetros farmacocinéticos se analizaron empleando la prueba t de Student. En la tabla 6 se muestran los resultados de los parámetros farmacocinéticos evaluados
Tabla 6. Resultados de los parámetros farmacocinéticos evaluados en ratón Hsd:ICR. Se presenta promedio ± desviación estándar .
Formulación líquida
Parámetro Formulación líquida de Humira®
seleccionada
102.4 ± 107.39 73.6 ± 72.08 429.77 + 77.11 349.82 + 119.80 108469.61 +63327.11 77704.33 ± 34760.73
Figure imgf000030_0001
172.94 ± 101.57 136.82 + 38.84
El análisis estadístico reveló que los parámetros farmacocinéticos Tmax , Cmax , AUC y MRT no presentaron diferencias estadísticamente significativas (p > 0.05) . Esto confirmó que la formulación líquida seleccionada permite un comportamiento farmacocinético del I FA idéntico al producido por la formulación líquida de Humira®.
Farmacocinética de dosis repetidas
La especie de mono Cynomolgus es considerada como una especie relevante para realizar pruebas experimentales con Adalimumab, ya que presenta interacción con el TNFa de mono el homólogo terapéutico humano.
La administración de las formulaciones en mono Cynomolgus fue por via subcutánea. Se administraron 32 mg/kg/semana durante cuatro semanas de IFA en la formulación liquida seleccionada de Adalimumab o en la formulación liquida de Humira®. Las concentraciones de los niveles del IFA se evaluaron mediante un método MSD (Meso Scale Discovery, por sus siglas en inglés) ELISA. Se evaluaron los parámetros farmacocinéticos AUC(0 - 168 h) y Cmax en la primera y en la quinta administración. En la tabla 7 se muestran los resultados de los parámetros farmacocinéticos evaluados y en la tabla 8 se muestra la relación de formula liquida seleccionada para Adalimumab : formula liquida de Humira®.
Tabla 7 . Valores de los parámetros farmacocinéticos evaluados en mono Cynomolgus. Se presenta promedio ± desviación estándar .
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5
Tabla 8 . Relación de formula líquida seleccionada para Adalimumab : formula líquida de Humira® de los parámetros evaluados .
Figure imgf000032_0002
Los resultados mostraron que la absorción subcutánea, 10 concentración ( Cmax ) y extensión (AUC ) de la exposición sistémica del I FA en el mono Cynomolgus producida por las dos fórmulas es idéntica. De igual forma, la acumulación del I FA que permiten las dos formulaciones al ser administradas de forma repetida es idéntica.
15
Seguridad de la formulación liquida seleccionada para Adalimumab .
Con el objetivo de confirmar el mantenimiento de las propiedades de seguridad de Adalimumab en la formula líquida 20 seleccionada, se llevaron a cabo estudios de toxicidad aguda en ratón Hsd:ICR y de toxicidad de dosis repetidas en mono Cynomolgus de forma comparativa con la formulación líquida de Humira®. Además de estas pruebas se evaluó la irritabilidad de las formulaciones en pruebas ín vitro.
Toxicidad aguda
El perfil toxicológico agudo de las dos formulaciones se evaluó en ratón Hsd:ICR. En este estudio se administraron por vía subcutánea cinco niveles de dosis del IFA (1.6, 16, 32, 560 y 786 mg/kg) en un volumen semejante (10 ml/kg) de la formulación líquida seleccionada para Adalimumab o de la formulación líquida de Humira®. Las administraciones agudas de las dos formulaciones produjeron efectos comparables sobre los signos clínicos, el incremento de peso y en la necropsia e histopatología de los animales tratados. Estos resultados mostraron que las dos fórmulas son bien toleradas y que presentan un perfil toxicológico agudo idéntico.
Toxicidad de dosis repetidas
El perfil toxicológico de dosis repetidas de las dos formulaciones se evaluó en la especie relevante para el IFA, el mono Cynomolgus. En este estudio se administró por vía subcutánea un solo nivel de dosis de IFA (32 mg/kg/semana) durante cuatro semanas en un volumen semejante de la formulación liquida seleccionada para Adali u ab o de la formulación liquida de Humira®. Posterior a esto los animales se observaron durante ocho semanas. Durante este tiempo los grupos tratados con las dos formulaciones no presentaron diferencias en signos clínicos, presión sanguínea, oftalmoscopia, consumo de alimento, peso corporal, parámetros de laboratorio de bioquímica sanguínea, hematología y urianálisis. De igual forma los hallazgos de necropsia e histopatología mostraron efectos semejantes. El sitio donde se realizó la administración subcutánea de ambas formulaciones presentó efectos semejantes, indicando una tolerabilidad local idéntica.
Durante el estudio también se monitoreó la inmunogenicidad producida por las dos formulaciones y el IFA. Los anticuerpos contra el IFA producidos por los grupos tratados con las dos formulaciones fueron semejantes, indicando que la formulación líquida seleccionada para Adalimumab no aumenta la inmunogenicidad del IFA. En general, los resultados indicaron que las dos formulaciones presentan un perfil de toxicidad de dosis repetidas idénticos y no modifican la seguridad del IFA en una especie relevante. Ensayos de irritabilidad
Se evaluó de forma comparativa la irritabilidad de las formulaciones mediante dos ensayos ín vitro : irritabilidad en células rojas sanguíneas e irritabilidad en la membrana corioalantoidea de embrión de pollo. En ambos ensayos se expusieron los tejidos a distintas concentraciones del IFA en volúmenes semejantes de la formulación líquida seleccionada para Adalimumab o de la formulación líquida de Humira®, y se determinó el índice de irritabilidad dependiendo del porcentaje de hemolisis y desnaturalización de proteínas generado. En los dos ensayos las formulas se comportaron de forma comparable y no fueron irritantes.
Estabilidad de la formulación líquida seleccionada para Adalimumab
Las formulaciones farmacéuticas deben tener una vida de anaquel y una estabilidad fisicoquímica comprobables. Para esto, fue necesario confirmar que los excipientes de la formulación líquida seleccionada permiten prolongar la estabilidad y aumentar el tiempo en el que Adalimumab mantiene sus propiedades funcionales óptimas. En la tabla 9 se muestran los resultados del estudio de estabilidad a largo plazo (12 meses a 5 ± 3 °C) de la fórmula líquida seleccionada para Adalimumab. Como se puede observar, la formulación tiene la capacidad de permanecer dentro de las especificaciones de calidad establecidas, en términos de pruebas cualitativas, de identidad, de pureza, de potencia, de contenido y de carga biológica durante un periodo de hasta 12 meses en condiciones de refrigeración. Dicha estabilidad pudo ser demostrada por métodos analíticos indicativos de estabilidad encontrados en el estado del arte.
Tabla 9 . Estudio de estabilidad a largo plazo 5 ± 3 °C de la formula líquida seleccionada para Adalimumab.
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a Resula resultados correspondientes a tres lotes independientes.
Selección de si stema con tenedor-cierre de la formulación liquida seleccionada para Adalimumab
Los agentes bioterapéuticos , como Adalimumab, demandan sistemas contenedor-cierre que permitan una dosificación segura y eficiente (US Food and Drug Administration, 1999) . Sin embargo, dependiendo de la naturaleza fisicoquimica del
IFA, interacciones hacia una superficie en particular siempre existirán en un mayor o menor grado, cuyo efecto potencial es la formación de agregados. Este fenómeno ha sido relacionado con la ocurrencia de eventos adversos (Gerhardt et al., 2014) . Por lo tanto, es necesario llevar a cabo una evaluación de compatibilidad proteina-contenedor que proporcione evidencia de la adecuabilidad de uso.
Tomando en cuenta lo antes mencionado y con el objetivo de determinar la adsorción de Adalimumab en los contenedores utilizando nanoparticulas de plata (AgNPs, por sus siglas en inglés) como sensores se llevó a cabo un estudio de compatibilidad de la formulación liquida seleccionada para Adalimumab hacia tres modelos diferentes de empaque primario, específicamente, tres modelos (modelo A, B y C) de jeringas prellenadas de vidrio siliconizadas (contenedor o PFS, por sus siglas en inglés) . Para este propósito, los contenedores fueron expuestos a la formulación, esto fue seguido de un enjuague con agua para remover la proteína no adsorbida.
Finalmente una solución de AgNPs fue adicionada y posteriormente recuperada, y analizada por absorción UV-vis (300 a 750 nm) para determinar la absorción plas ónica de la solución de AgNPs .
Como criterios para diferenciar la adsorción de Adalimumab, se consideró lo siguiente:
Se dictaminó no adsorción de proteina en el contenedor si se obtenía el perfil característico de la solución de AgNPs con un valor máximo de absorción plasmónica en 400 nm.
Se dictaminó adsorción de proteína en el contenedor si no se obtenía el perfil característico de la solución de AgNPs con un valor máximo de absorción plasmónica diferente de 400 nm.
En la figura 3 se muestran los resultados de compatibilidad de la formulación líquida seleccionada para Adalimumab con los contenedores. Se determinó que un 71, 77 y 74 % de los ensayos fueron positivos para adsorción de proteína en los modelos A, B y C, respectivamente. Esto fue revelado por un desplazamiento hacia la derecha de la banda de absorción plasmónica que mostró un valor máximo a 410 o 420 nm y por la aparición de bandas adicionales hasta 600 nm. Si bien los resultados experimentales mostraron que el contenedor A fue el más adecuado, > 70 % de los casos fueron positivos para adsorción de proteína en todos los modelos evaluados. Es importante mencionar que debido a que la sensibilidad del método permite detectar adsorción de proteína en el orden de ng a pg, para todos los modelos evaluados la pérdida de proteína fue < 0.01 % del contenido total, lo cual se determinó como prácticamente insignificante.
En conclusión, los resultados experimentales mostraron que la formulación líquida seleccionada para Adalimumab, que esta basada en el sistema de citratos, adicionada con polisorbato y manitol con un pH de 5.2, es capaz de mantener las propiedades fisicoquímicas, biológicas, farmacológicas y de seguridad de Adalimumab. Además, se comprobó su estabilidad a largo plazo y su compatibilidad con el sistema contenedor- cierre. Todo lo anterior con la ventaja de hacer uso de un menor número de excipientes que la formulación líquida de
Humira® y de otras formulaciones con Adalimumab descritas en el estado de la técnica. REFERENCIAS
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Claims

RE IVINDICACIONES
1. Una formulación farmacéutica liquida estable para un anticuerpo monoclonal anti-TNFa caracterizada porque comprende :
a) un anticuerpo monoclonal anti-TNFa.
b) una solución amortiguadora de pH que se selecciona del grupo de citratos.
c) un agente surfactante que se selecciona del grupo de polisorbato .
d) un agente estabilizante que se selecciona del grupo de manitol .
e) un agente tonificante que se selecciona del grupo de cloruro de sodio.
f) agua estéril.
2. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque el anticuerpo monoclonal anti-TNFa es preferentemente Adalimumab.
3. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque la concentración de Adalimumab es de 20 a 100 mg/ml .
4. La formulación de conformidad con la reivindicación 3 caracterizada porque la concentración de Adalimumab es preferentemente 50 mg/ml .
5. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque la concentración de la solución amortiguadora de pH de citratos es preferentemente 10 mM.
6. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque el agente surfactante es preferentemente polisorbato 80.
7. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque la concentración de polisorbato es preferentemente 1 mg/ml.
8. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque la concentración de manitol es preferentemente 12 mg/ml.
9. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque cloruro de sodio es adicionado para obtener una osmolalidad de 250 a 350 mOsm/kg
10. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque el pH es preferentemente 5.2.
11. El uso de la formulación de las reivindicaciones 1 a 10 caracterizado porque la formulación está adaptada para ser administrable a un sujeto en una cantidad suficiente para tratar una o más enfermedades autoinmunes en las cuales se presenta una elevación patológica del TNFa.
12. El uso de conformidad con la reivindicación 11 caracterizado porque las enfermedades autoinmunes se seleccionan del grupo que comprende: artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil poliarticular, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad de Crohn, hidradenitis supurativa, colitis ulcerativa, psoriasis en placa y panuveitis.
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