KR20010047312A - α-인터페론의 용액제형 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 α-인터페론의 생리활성과 물리화학적 특성을 오랫동안 보존할 수 있는 용액제형에 관한 것으로, 보다 상세하게는 α-인터페론; 안정화제; 삼투압 조절제; 페놀, m-크레졸, 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 항미생물 보존제; 및 완충 시스템을 포함하는 α-인터페론의 용액제형에 관한 것이다. 본 발명의 제형은 α-인터페론의 활성을 장기간 유지하며, 보존제의 첨가량을 최소화 함으로써 인체에 대한 잠재적인 위험성을 나타내지 않고, 수용액상에서 매우 안정한 장점이 있다.

Description

α-인터페론의 용액제형{Liquid Formulation of α-Interferon}
본 발명은 인간 혈청 알부민을 포함하지 않는 안정적인 α-인터페론(α-interferon, α-IFN) 수용액 제형에 관한 것이다.
대부분의 단백질은 수용액상에서 쉽게 변성되거나 생리활성을 상실하기 때문에, 단백질 약물의 안정성을 향상시키기 위해 많은 제약회사들은 동결건조법을 이용하여 왔다. 그러나, 이러한 단백질 제약의 동결건조 제형은 단점을 갖고 있다. 즉 동결건조 과정은 비용이 많이 들고, 환자에게 단백질 약물을 주입하기 전에 단백질 약물의 용해 과정(reconstitution step)이 요구되기 때문에 용액제형에 비해 경제성 또는 편리성 면에서 바람직하지 않다. 이와 같은 점은 α-IFN의 제형개발에 있어서도 마찬가지로 고려되어 왔다.
인터페론(interferon, IFN)은 정상 또는 종양세포의 성장, 분화, 기능에 영향을 미치며, 다양한 종류의 바이러스 증식을 억제하는 단백질 면역증강제(cytokine)의 일종이다. 구체적으로 IFN은 자연살상세포(natural killer cell, NK)의 활성을 조절하고 세포독성 T 세포(cytotoxic T lymphocyte)의 활성을 증진시키며, 대식세포(macrophage)에 의한 식세포작용을 증진시킴으로써 궁극적으로 바이러스 등에 감염된 세포의 면역반응을 매개하는 역할을 한다. IFN은 분비세포나 유도물질의 종류에 따라 α,β,γ의 세 종류로 나뉘는데, 이 중 α와 β는 pH 2에서도 안정한 반면 γ의 경우 산성에서 불안정하다.
이 중 특히 α-IFN은 C형 간염 등 바이러스성 질환의 치료에 특히 효과가 탁월하여 일찍부터 이러한 항바이러스제의 목적으로 사용되어 왔으며, 그 활성을 오랫동안 보존할 수 있는 제형을 개발하기 위한 노력이 지속되어 왔다.
미국 특허 4496537호(US Pat. 4496537)에는 안정화제로서 인간 혈청 알부민과 알라닌(또는 글리신)을 함유하고, 또한 pH 6.5∼8.0이 되도록 완충제를 포함한 α-IFN 용액제형이 언급되어 있다. 또한 미국 특허 4847079호(US Pat. 4847079)는 인간 혈청 알부민, 글리신, 치메로살(thimerosal) 및 완충제를 함유한 pH 6.5∼8.0의 α-IFN 수용액제형에 대해 언급하고 있다. 흥미롭게도 상기 두 개의 특허는 모두 그들의 제형내에 α-IFN의 생리활성을 유지하는데 효과적인 인간 혈청 알부민을 함유한다는 특징을 갖는다. 그러나, 인간 혈청 알부민을 사용할 경우 HIV, HBV 와 같은 전염성 병원체에 의한 잠재적인 오염 가능성이 높기 때문에 최근에는 그 사용이 권장되지 않고 있다. 또한 일부 사람들에게는 상기 알부민이 면역반응을 유발하기도 하는 것으로 알려져 있다.
유럽특허 0736303A2(EP 0736303A2)는 안정화제로 폴리소르베이트를, 항미생물 보존제로 벤질 알콜을 함유하며 pH 4.5∼5.5에서 완충 시스템을 갖는 α-IFN 수용액 제형에 대해 밝히고 있다. 상기 특허에서는 잠재적으로 유해성을 갖는 인간 혈청 알부민 대신 안전한 폴리소르베이트를 사용하고 있다. 그러나, 벤질 알콜은 폴리소르베이트 80과 같은 비이온성 계면활성제와 함께 사용될 경우 미생물에 대한 항균 능력을 감소시키는 것으로 알려져 있으며, 실제로 폴리소르베이트 80은 벤질 알콜과 함께 사용하기에 적합하지 않음이 밝혀져 있다(Handbook of Pharmaceutical Excipients, American pharmaceutical Association, 1986, p18). 따라서, 항미생물 작용을 유지하기 위해서는 상대적으로 많은 양의 벤질 알콜(0.9, 1.0)이 사용되어야 하며, 이러한 벤질 알콜의 과다한 사용은 펩타이드의 응집을 유발할 수도 있다(Richard L. Remmele et al., Pharmaceutical Research, Vol. 15, No. 2, 1998). 또한, 본 발명자들이 α-IFN 제형의 40℃ 가속 시험(40℃ accelerated test)을 통해 관찰한 바에 따르면, 1.0의 벤질 알콜과 0.02의 폴리소르베이트 80을 함유한 용액제형이 페놀(또는 m-크레졸)과 0.02의 폴리소르베이트 80을 함유한 제형에 비해 α-IFN 의 활성을 현저하게 감소시키는 것으로 나타났다.
한편, 폴리소르베이트와 디소듐 EDTA와 같은 킬레이트화제, 그리고 보존제를 함유한 용액제형이 국제공개 96/11018(WO 96/11018)에 언급되어 있다. 그러나 상기 용액제형의 경우 세포독성을 나타내는 것으로 알려져 있는 디소듐 EDTA를 사용하므로 잠재적인 위험성을 가지고 있으며(Paula Saarien-Savolainen et al., Pharmaceutical Research, Vol. 15, No. 2, 1998), 인간 생체내에서 칼슘이온과 함께 킬레이트 화합물을 형성할 수 있는 문제점이 지적되어 왔다. 또한 상기 특허에서 언급되고 있는 또다른 킬레이트화제인 구연산(citrate)의 경우, 생체에 투여하였을 때 심각한 고통을 유발하는 것으로 알려져 있다.
이상과 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 인체에 잠재적인 위험성을 나타내는 인간 혈청 알부민이나 킬레이트화제를 포함하지 않고 α-IFN의 생리활성이 장기간 유지되며 수용액상에서 안정성이 높은 α-IFN 용액제형을 개발하기 위해 연구하던 중, 안정화제로서 폴리소르베이트를 사용하고 항미생물 보존제로서 페놀, m-크레졸, 또는 이들의 혼합물을 사용하면 보존제의 함유량을 최소화하면서도 α-IFN의 생리활성을 장기간 유지할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 포함하는 보존제의 양이 매우 적음에도 불구하고 유럽약전에서 요구하는 항미생물 보존제의 효율성 테스트의 요건을 만족시킬 뿐 아니라, 장기간 생리활성 및 물리화학적 안정성을 유지할 수 있는 안정적인 α-IFN 용액제형을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 인간 혈청 알부민 또는 킬레이트화제와 같이 인체에 대한 잠재적인 위험성을 갖는 물질을 첨가하지 않고도 항미생물 활성을 유지하는 안전한 α-IFN 용액제형을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1 은 본 발명의 용액제형을 4℃에서 4개월간 저장하였을 때, 안정화제가 α-인터페론(α-IFN)의 생리활성에 미치는 영향을 나타낸 것이고,
도 2a 는 4℃에서 36주간 저장하였을 때의 생리활성을 측정함으로써 항미생물 보존제가 α-IFN 용액제형(6×106IU/ml)의 안정성에 미치는 영향을 나타낸 것이고,
도 2b 는 40℃에서 16주간 저장하였을 때의 생리활성을 측정함으로써 항미생물 보존제가 α-IFN 용액제형(6×106IU/ml)의 안정성에 미치는 영향을 나타낸 것이고,
도 3a 는 40℃에서 12주간 저장하였을 때의 생리활성을 측정함으로써 pH가 α-IFN 용액제형(6×106IU/ml)의 안정성에 미치는 영향을 나타낸 것이고,
도 3b 는 40℃에서 12주간 저장한 후 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)한 젤을 은으로 염색한 사진을 통해 pH가 α-IFN의 이중체 형성에 미치는 영향을 나타낸 것이고,
도 4a, 4b, 4c 는 항미생물 보존제로 0.15페놀과 0.1m-크레졸의 혼합물을 사용한 α-IFN 용액제형과 0.3페놀만을 항미생물 보존제로 사용한 α-IFN 용액제형(6×106IU/ml)을 4℃, 25℃ 및 40℃에서 12주간 보관한 후, 각각의 생리활성을 비교하여 나타낸 것이고,
도 4d, 4e, 4f 는 항미생물 보존제로 0.15페놀과 0.1m-크레졸의 혼합물을 사용한 α-IFN 용액제형과 0.3페놀만을 항미생물 보존제로 사용한 α-IFN 용액제형(6×106IU/ml)을 4℃, 25℃ 및 40℃에서 12주간 보관한 후, 역상-고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 측정한 순도를 비교하여 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 α-IFN; 안정화제; 삼투압 조절제; 페놀, m-크레졸, 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 항미생물 보존제; 및 완충 시스템을 포함하는 α-IFN 용액제형을 제공한다.
본 발명에서 "α-IFN"은 재조합 세균, 효모 및 동물세포에서 발현되고 정제된 모든 형태의 α-IFN을 포함한다. 또한 천연형의 인간 α-IFN 의 일부 아미노산이 치환되고 그 활성이 50이상 유지되는 α-IFN 유사체 또는 변이형도 본 발명의 용액제형내에 포함될 수 있다.
상기 제형에서 α-IFN의 안정성을 유지시키는 안정화제로는 폴리소르베이트 80을 사용하는 것이 바람직하며, 폴리소르베이트의 농도는 0.01∼0.05인 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 용액제형은 미생물의 성장을 억제하기 위하여 페놀 및/또는 m-크레졸을 포함하는 보존제를 포함한다. 바람직한 페놀의 농도는 0.1∼0.3이고, m-크레졸의 바람직한 농도는 0.1∼0.2이며, 페놀과 m-크레졸의 적당한 혼합물이 본 발명의 제형에 포함될 수 있다.
완충 시스템은 초산 완충액 또는 인산 완충액을 포함하며, 구체적으로는 초산 암모늄과 초산 완충액이거나 인산일수소나트륨(Na2HPO4)과 인산이수소나트륨( NaH2PO4)완충액이 바람직하다. 또한, 상기 완충 시스템의 농도는 5∼20mM인 것이 바람직하다. 본 발명의 용액제형의 pH는 상기 완충 시스템에 의존적이나 대부분 pH 4.0∼8.0이며, 바람직하게는 pH 4.5∼6.0이다.
한편, 본 발명의 제형은 염화 나트륨과 같은 삼투압 조절제를 함유할 수 있으며, 그 양은 제형내에 포함되는 성분에 의존적이다. 마지막으로 본 발명의 용액제형은 무균적으로 제조된다.
본 발명에서는 바람직한 안정화제를 탐색하기 위하여 주사제로서 유용한 몇가지 부형제를 다양한 농도로 포함하는 용액제형을 제조하여 α-IFN의 생리활성에 안정화제가 미치는 영향을 조사한 결과, 4℃에서 4달간 보관한 경우 α-IFN과 완충 시스템만을 포함한 용액제형은 최초 충전활성의 80정도의 활성만을 보인 반면, 인간 혈청 알부민, 폴리소르베이트 80, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 젤라틴을 안정제로서 함유한 경우에는 최초 충전활성의 90이상의 활성을 보였다. 이는 상기와 같은 안정화제가 α-IFN이 바이알 표면에 부착하는 것을 방지하기 때문인 것으로 여겨진다. 그러나, 주사용 제형에 있어서 인간 혈청 알부민과 젤라틴의 사용은 바이러스 또는 프레온에 의한 오염의 위험성이 있기 때문에 그 사용이 제한되며, 따라서 폴리소르베이트 80이 가장 적합한 안정제임을 알 수 있다.
또한, 폴리소르베이트 80과 항미생물 보존제의 농도가 용액제형의 성상에 미치는 영향을 조사한 결과, 폴리소르베이트는 0.01내지 0.02에서 탁도에 영향을 미치지 않았으나, m-크레졸의 경우 0.15이상 사용하면 용액이 탁해졌으며 그 정도는 m-크레졸의 농도에 비례하였다. 한편 항미생물 보존제로 페놀을 사용한 경우에는 0.1 내지 0.3의 농도범위에서는 탁도에 영향을 미치지 않았으나, 0.3이상을 사용하면 용액제형이 탁해졌다.
한편, 페놀을 포함한 제형은 m-크레졸이나 벤질 알콜을 포함한 다른 제형에 비해 생리활성의 유지도가 다소 높지만, 그 정도는 크지 않았다. 그러나, 40℃의 고온에서 저장한 경우에는 벤질 알콜을 포함한 제형의 생리활성이 크게 감소하였다.
pH의 경우 α-IFN의 생리활성은 물론 이중체(dimer) 형성에도 영향을 미치는데, α-IFN의 생리활성은 pH 5.8 근처에서 상대적으로 안정하며, pH가 높을 경우 이중체의 형성 정도가 심하였다. 따라서 α-IFN 용액제형의 장기간 보존을 위해서는 높은 pH가 바람직하지 않음을 알 수 있다.
또한 본 발명에서는 다양한 조성 및 농도의 보존제를 포함한 제형의 항미생물 보존 효과를 유럽 약전의 항미생물 효과실험 방법(European Pharmacopoeia 1997, 5.1.3 Efficacy of Antimicrobial Preparation)에 기준하여 조사하였다. 유럽 약전의 구체적인 항미생물 효과실험은 참조예 3에 정리하였으며 간단히 기술하면 다음과 같다.
용액제형에 이 실험에 사용되도록 기술된 표준균주 -그람 양성, 음성 박테리아와 곰팡이 속 중 표준이 되는 균주- 5종을 제형 1 ml 당 105내지 106세포수의 농도로 인위적으로 접종한 후 정해진 시간 간격으로 샘플링하여 생존 세포수의 변화도를 로그화(로그감소분; Log reduction)한 값을 E.P 5.1.3-1의 값들과 비교하여 항균력이 어느 정도 수준으로 유지되는지를 판별하였다. 한편 유럽 약전에 언급된 A 및 B 범주의 구분은 대상 미생물의 로그 감소분이 시간에 따라 달라지는 수준의 차이로 해석되는데 박테리아의 경우, A 범주는 6시간 내에 2 로그분이 감소하고 24시간 내에 3 로그분이 더 감소하여야 함을 규정한 것이고, B 범주는 24시간 내에 1 로그분이 감소하고 7일 내에 3 로그분이 감소해야 함을 규정한 것이다. 마찬가지로 곰팡이의 경우에는, A 범주는 7일 내에 2 로그분이 감소하여야 하며 B 범주는 14일 내에 1 로그분이 감소해야 함을 규정한 것이다. 그리고 각 감소한 로그분은 이후 시간동안 변화가 없거나 계속 감소해야 함을 규정한 것이다. 각 범주에 따른 로그 감소폭은 주사제, 안약제, 국부 마취제 및 경구제 등 목적하는 제형에 따라 다르게 규정되며 앞에서 언급한 각 범주에 대한 로그 감소분은 주사제와 안약제에 적용되는 값들로서, 본 발명의 α-IFN 용액제형이 이 규정에 해당한다. 따라서 각 보존제가 함유된 몇 가지 α-IFN 용액제형들을 제조하여 표준 균주 5종에 대한 항미생물 효과 실험을 통해 상대적인 항균력을 비교 평가하여 가장 우수한 제형을 결정하고자 하였다.
그 결과, 0.2페놀과 0.1m-크레졸을 포함한 제형, 그리고 0.15페놀과 0.1m-크레졸을 포함한 제형이 아스퍼질러스 니거(A. niger), 칸디다 알비칸스(C. albicans), 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa), 스트렙토코커스 아루레우스(S. aureus) 및 대장균(E. coli)에 대하여 모두 유럽 약전의 범주 A 및 B를 만족시켰다. 그러나, 0.15페놀과 0.1m-크레졸을 포함한 경우가 보존제 전체량이 0.25로서 가장 적은 양의 보존제를 포함하고 있으므로, 안전성 면에서 보다 바람직함을 알 수 있다.
이하 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<참조예 1> 정제된 재조합 α-IFN의 활성성분 용액의 제조
제형연구에 사용되는 정제된 α-IFN 용액은 인터맥스-알파TM(α-IFN, LG 화학) 공정에 의해 제조된다.
인간 α-IFN 유전자가 삽입된 재조합 효모(기탁번호 : KCTP 0051BP)를 발효시킨 후, 이온 교환 크로마토그래피와 젤 여과 크로마토그래피 등의 정제 단계를 거쳐 역상 크로마토그래피에 의해 순도 95이상의 α-IFN을 얻었다.(대한민국특허 공고 111251, "재조합 효모에서 발현된 알파 인터페론의 정제방법" 참조).
<참조예 2> α-IFN 용액제형의 제조 및 생리활성 측정
하기와 같은 조성을 갖는 α-IFN 용액제형을 제조하였다.
α-IFN : 1×106IU/ml ∼ 100×106IU/ml
폴리소르베이트 80 : 1∼5 mg/ml
페놀 : 1.5 mg/ml
m-크레졸 : 1.0 mg/ml
10mM 의 초산 완충액 또는 10mM 인산 완충액을 포함하는 완충 시스템
상기와 같이 제조된 α-IFN 용액제형의 생물학적 활성은 다음과 같은 방법을 변형하여 측정하였다(Armstrong, Method in Enzymology 78, 381-387(1981)). 즉, α-IFN 용액제형이 바이러스에 의한 세포감염에 대해 나타내는 세포 보호효과를 측정하고, 이들의 항바이러스 효과를 재조합 인간 인터페론 α-2(IFN α-2) 또는 표준 물질(reference preparation)의 국제 단위로 계측된 국제 표준의 항바이러스 효과와 비교하여 측정하였다.
37℃, 5CO2배양조건에서 마이크로타이터 플레이트에 MDBK세포(ATCC No. CCL22)를 배양하여 세포의 단일층이 형성된 다음, 세 가지 이상으로 농도를 달리하여 시험용 α-인터페론과 α-인터페론 표준품(재조합 인간 α-인터페론 국제 표준품 : NIH Gxa01-901-535, USA)을 마이크로타이터 플레이트에 첨가하여 배양하였다. 일련의 마이크로타이터 플레이트는 각각 α-인터페론 무처리세포를 포함하고 있으며, 이는 음성 대조군으로 사용되었다. 18-24시간 동안 37℃, 5CO2조건에서 배양한 후, 처리한 α-인터페론을 따라 버리고, 대조군을 제외한 플레이트의 모든 웰에 세포감염 수포성 구내염 바이러스(cytopathic vesicular stromatitis virus, ATCC No. VR-158)를 첨가하였다. 24∼48시간 동안 배양한 후, 마이크로타이터 플레이트를 크리스탈 바이올렛으로 염색한 다음 공기중에서 건조시켰다. 그 다음, 에틸렌 글리콜을 각 웰에 가하여 염색시약을 용출시키고 마이크로플레이트 분광광도계를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하였다.
측정된 표준액과 검액의 흡광도 값을 α-인터페론 용량에 대한 직선식으로 나타낸 후 평행선 분석방법(Parallel line analysis)을 통해 비교하여 검액의 역가를 계산하였다.
<참조예 3> α-IFN 용액제형의 항미생물 효과 실험
실험에 사용한 표준 균주 5종은 다음과 같다. 곰팡이 균주 2종으로서 아스퍼질러스 니거 (Aspergillus niger, ATCC 16404), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans, ATCC 10231)를 사용하였고, 박테리아 균주 3종으로서 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa, ATCC 9027), 스테필로코커스 오리우스 (Staphylococcus aureus, ATCC 6538) 및 대장균 (Escherichia coli, ATCC 8739)을 사용하였다.
박테리아의 고체 배양을 위해 아가-B (Agar-B ; 15 g/L Casitone, 5 g/L Soytone, 5 g/L NaCl, 18 g/L agar, pH 7.3±0.2)를 사용하였고 곰팡이의 고체 배양을 위해 아가-C (Agar-C ; 10 g/L Peptone, 40 g/L Glucose, 15 g/L agar, pH 5.6±0.2)를 사용하였다. 박테리아의 배양은 30 내지 35℃에서 18-24 시간 실시하였고 곰팡이 중 칸디다 알비칸스는 20 내지 25℃에서 24-48 시간 실시하였고 아스퍼질러스 니거는 2내지 7일간 실시하였다.
한편 아스퍼질러스의 경우에는 균체 대신 약 5일간 배양한 이후 형성된 검은 색 포자(spore)를 수집하여 실험에 사용하였다.
시험검체인 α-IFN 용액제형이 담긴 용기에 직접 표준균주를 1 ml 당 105내지 106세포수(아스퍼질러스의 경우, 포자수)가 되도록 접종하기 위해 희석용액을 이용하여 접종전의 세포 농도를 1 ml 당 107내지 108세포수(또는 포자수)로 희석한 후 희석된 세포 현탁액을 용액제형 부피의 1부피비가 되도록 첨가하였다. 희석 용액은 박테리아와 칸디다의 경우 희석용액-A (Dilution buffer-A ; 9 g/L NaCl, 1 g/L Peptone)를 사용하였고 아스퍼질러스의 경우에는 희석용액-B (Dilution buffer-B ; 9g/L NaCl, 0.5 g/L Polysorbate 80)를 사용하였다.
시험검체에 표준균주 현탁액을 접종한 후 0시간, 6시간, 24시간, 7일, 14일, 28일째에 각각 0.1 내지 0.5 ml 씩을 샘플링하고 희석용액을 이용하여 1내지 103배 희석한 다음, 아가 고체배지에 도말하여 앞에서 기술한 배양온도에서 각각 배양하였다. 고체배양에 의해 형성된 콜로니 수를 측정하여 샘플 1 ml 당 생존 세포수 (viable cell number)를 계산하였다. 한편 시험검체들은 샘플링 직후 20 내지 25℃ 인큐베이터(incubator)에서 계속 보존하였다. 생존세포수 측정방법과 이에 사용된 배지들은 유럽 약전 (E.P 1997, 2.6.12)에 기술된 것을 이용하였다.
<실시예 1> 바람직한 안정화제의 탐색
α-IFN이 바이알 벽면에 흡착하는 것을 방지함으로써 α-IFN의 생리활성을 유지시키는 바람직한 안정화제를 탐색하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
우선 주사제에 유용한 몇가지 부형제를 다양한 농도로 포함하는 용액제형을 하기 표 1에 기재된 바와 같이 제조하고, 여기에 0.8염화 나트륨을 가하여 전해질 농도를 등장조건이 되도록 맞추었다. 각각의 용액을 4℃에서 4달간 보존하면서 각 제형의 α-IFN 의 생리활성을 참조예 2의 방법에 따라 조사하였으며, 그 결과를 도 1 및 표 1에 나타내었다. 도 1은 9×106IU/ml의 α-IFN을 포함한 용액에서의 충전활성(filled biological activity)에 대한 α-IFN의 상대적인 생리활성도()를 나타낸다.
4℃에서의 실시간 저장 테스트
용액시료 조성 대조군 2달후 4달후
활성 활성도 활성 활성도 활성 활성도
1-1 안정화제 없이 완충제만 7.24 80.4 7.03 78.1 5.15 57.2
1-2 인간 혈청 알부민 0.01w/v 10.5 116.7 9.85 109.4 7.64 84.9
1-3 인간 혈청 알부민 0.5w/v 9.75 108.3 8.41 93.4 8.08 89.8
1-4 폴리소르베이트 80 0.01w/v 9.21 102.3 8.65 96.1 8.00 88.9
1-5 폴리소르베이트 80 0.1w/v 10.4 115.6 9.63 107.0 9.55 106.0
1-6 폴리에틸렌글리콜40000.5w/v 8.07 89.7 6.60 73.3 5.79 64.3
1-7 폴리에틸렌글리콜60000.5w/v 8.06 89.6 8.39 93.2 7.95 88.3
1-8 젤라틴 0.05w/v 8.35 92.8 8.83 98.1 9.24 102.7
1-9 젤라틴 0.2w/v 9.33 103.7 8.04 89.3 8.96 99.6
1-10 덱스트란 40T 0.5w/v 7.31 81.2 6.72 74.7 7.39 82.1
* α-IFN의 충전 활성 : 9×106IU/ml (단위 : ×106IU/ml)
α-IFN과 완충 시스템만을 포함한 음성 대조군 제형의 경우 최초 충전활성의 약 80정도의 활성을 보인 반면, 인간 혈청 알부민, 폴리소르베이트 80, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 젤라틴을 함유한 용액제형의 경우에는 최초 충전활성의 90이상의 생리활성을 나타내었다. 이는 상기의 첨가물들에 의해 α-IFN이 바이알 표면에 부착하는 것이 억제되기 때문으로 여겨진다.
이상과 같은 부형제들이 α-IFN의 생리활성을 유지시키는데 기여하기는 하지만, 주사용 제형에 있어서 인간 혈청 알부민과 젤라틴의 사용은 바이러스 또는 프레온에 의한 오염의 위험성 때문에 그 사용이 제한된다. 따라서 폴리소르베이트 80이 가장 적합한 안정화제임을 알 수 있다.
<실시예 2> 폴리소르베이트 80과 항미생물 보존제의 농도가 용액제형의 성상에 미치는 영향
α-IFN 용액제형의 최초 선별을 위한 예비 실험으로서, 폴리소르베이트 80과 항미생물 보존제의 농도가 용액제형의 성상에 미치는 영향을 조사하였다. 폴리소르베이트 80과 항미생물 보존제로서 페놀, M-크레졸, 또는 이들의 혼합용액을 서로 다른 농도로 포함한 각각의 α-IFN 용액제형을 100ml 부피로 제조하고 0.8염화 나트륨과 10mM 초산 암모늄 완충용액을 이용하여 각각 전해질 농도와 pH를 조절하였으며, pH는 5.3으로 하였다.
상기와 같이 제조된 폴리소르베이트 80과 항미생물 보존제의 농도가 다른 용액제형의 색깔과 탁도를 육안으로 관찰하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
폴리소르베이트 80과 항미생물 보존제의 농도에 따른 α-IFN 용액제형의 성상변화
용액시료 조성 성상
폴리소르베이트 80 페놀 m-크레졸
2-12-22-3 0.010.010.01 --- 0.150.200.30 맑고 투명함희고 탁함희고 탁함
2-42-52-62-7 0.010.010.010.01 0.200.300.400.50 ---- 맑고 투명함맑고 투명함희고 탁함희고 탁함
3-13-23-3 0.020.020.02 --- 0.150.200.30 맑고 투명함희고 탁함희고 탁함
3-43-53-63-7 0.020.020.020.02 0.200.300.400.50 ---- 맑고 투명함맑고 투명함희고 탁함희고 탁함
3-83-9 0.020.02 0.150.20 0.100.10 맑고 투명함희고 탁함
m-크레졸이 0.15이상 사용된 경우 용액은 탁해졌으며, 탁함의 정도는 m-크레졸의 농도에 비례하였다. 페놀을 사용한 경우 영향을 미치지 않는 농도범위는 0.1∼0.3였으며, 0.3이상 사용하면 탁해졌다. 반면 이상의 실험에서 폴리소르베이트의 농도는 0.01나 0.02에서 차이가 없었다.
<실시예 3> 항미생물 보존제가 α-IFN의 생리활성에 미치는 영향
초산 암모늄 완충제를 사용하여 용액의 pH를 4.5∼5.5로 맞추는 한편, 용액제형의 전해질 농도는 염화 나트륨을 첨가하여 조절하였다. 모든 용액은 α-IFN의 농도를 6×106IU/ml로 맞추고 4℃와 40℃로 유지시켰다. 저장기간 동안 참조예 2의 방법에 따라 α-IFN의 생리활성의 변화를 측정하였다. 표 3 과 도 2a는 4℃에서 저장된 용액의 생리활성 실험결과를 나타내고 있으며, 표 4와 도 2b는 40℃에서의 결과를 보여주고 있다.
다양한 종류의 항미생물 보존제를 함유하고 있는 용액제형을 4℃에서 보관하였을 때 α-IFN 생리활성의 변화
용액시료 보존제(w/v) 저장기간
0 4주 8주 12주 16주 20주 36주
4-1 벤질 알콜(1.0) 6.79 6.14 6.72 6.61 6.20 5.98 5.77
100 90.4 99.0 97.4 91.3 88.1 85.0
4-2 m-크레졸(0.15) 6.51 5.58 7.35 6.46 5.96 - 5.67
100 85.7 112.9 99.2 91.6 - 87.1
4-3 페놀(0.3) 6.69 5.42 6.87 6.48 6.34 5.92 6.53
100 81.0 102.7 96.9 94.8 88.5 97.6
충전 활성 : 6×106IU/ml 단위 : 106IU/ml
다양한 종류의 항미생물 보존제를 함유하고 있는 용액제형을 40℃에서 보관하였을 때 α-IFN 생리활성의 변화
용액시료 보존제(w/v) 저장 기간
0 2주 4주 6주 8주 10주 12주 16주
4-1 벤질 알콜(1.0) 6.79 5.81 5.18 5.44 4.50 3.18 3.57 2.26
100 85.6 76.3 80.1 66.3 46.8 52.6 33.3
4-2 m-크레졸(0.15) 6.51 6.12 5.78 5.41 5.09 4.52 4.79 3.81
100 94.0 88.8 83.1 78.2 69.4 73.6 58.5
4-3 페놀(0.3) 6.69 6.27 5.94 5.14 5.41 3.97 4.19 2.9
100 93.7 88.8 76.8 80.9 59.3 62.6 43.3
충전 활성 : 6×106IU/ml 단위 : 106IU/ml
*표 3과 4에서 상단은 α-IFN 생리활성의 절대치를, 하단은 시간 0에서의 활성에 대한 상대적인 활성도를 나타냄
표 3과 도 2a에서 보여지듯이 페놀을 포함하는 제형은 다른 제형에 비해 생리활성의 유지도가 약간 우수하였으나, 그 정도는 크지 않았다. 그러나, 40℃에서 저장한 경우에는 벤질 알콜 제형의 생리활성이 α-IFN의 다른 용액제형에 비해 훨씬 크게 감소하였다(표 4 및 도 2b 참조).
<실시예 4> pH가 α-IFN의 생리활성과 이중체 형성에 미치는 영향
α-IFN 6×106IU/ml, 0.15m-크레졸, 10mM 초산 암모늄 완충액을 함유하는 용액제형을 제조하였다. 용액의 pH는 각각 5.3, 5.8 및 6.3으로 맞추었다. 제조된 용액제형은 40℃에서 12주간 보존하였으며, 각 용액의 생리활성을 적당한 시간간격을 두고 측정하였다. 상기 결과를 표 5 및 도 3a에 나타내었다.
pH가 40℃에서 저장한 용액제형의 생리활성에 미치는 영향
용액시료 용액의 pH 저장 기간
0 2주 4주 6주 8주 10주 12주
5-1 5.3 6.51 6.12 5.78 5.41 5.09 4.52 4.79
100 94.0 88.8 83.1 78.2 69.4 73.6
5-2 5.8 6.58 6.54 7.33 6.66 6.54 5.83 5.83
100 99.4 111.4 101.2 99.4 88.6 88.6
5-3 6.3 7.21 6.60 6.62 6.76 6.79 5.27 5.68
100 91.5 91.8 93.8 94.2 73.1 78.8
충전 활성 : 6×106IU/ml 단위 : 106IU/ml
12주 후, 이중체의 형성여부 및 정도는 비환원성 조건하에서 14SDS-PAGE(discontinuous buffer system, separating gel; 14, 0.375M Tris-HCl, pH 8.8, stacking gel; 5, 0.125M Tris-HCl, pH 6.8)한 다음 은으로 염색하여 측정하였다.
우선, 14분리젤을 제조한 후 2 장의 유리판 사이에 채워 넣어 굳히고, 다시 5압축젤을 제조하여 분리젤 위에 붓고 콤(comb)을 끼워넣어 굳혔다. 압축젤이 완전히 굳은 후 콤(comb)을 제거하고 생성된 각 웰을 이동완충액(running buffer, Tris-glycine buffer, pH 8.3)으로 세척하였다. 상기 용액 제형 100 ㎕에 3배 농축 샘플 완충액(0.186M Tris, 3SDS, 30v/vglycerol, 0.009bromophenol blue, pH 6.8) 50 ㎕를 넣고 잘 혼합한 후 끓는 수욕상에서 2분간 끓이고 냉욕조에서 식힌 후 이 시료 50 ㎕와 분자량 표지 물질(Bio-Rad, Low range MW marker) 10 ㎕를 서로 다른 웰에 주입하였다. 시료와 분자량 표지 물질을 주입한 후 젤을 전기영동장치(Hoeffer Scientific Instruments, SE 600)에 장착하고 이동 완충액을 채운 후 전원공급장치(Hoeffer Scientific Instruments, PS 2500)에 연결하여 젤 한 장당 10 mA의 전류를 흘려 브로모페놀 블루의 띠가 압축젤과 분리젤의 경계면에 이를 때까지 전개하고, 브로모페놀 블루의 띠가 경계면에 이르면 전류를 20 mA로 높여 브로모페놀 블루의 띠가 유리판의 하단에 이를 때까지 전개하였다. 전개가 끝나면 전원을 끄고 젤을 꺼낸 다음 메탄올 : 아세트산 : 물(50:10:40) 혼합용액을 가하여 실온에서 12-16시간 동안 단밸질을 고정하였다. 계속하여 10글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액에서 30분간 교반한 후 탈이온수로 20분씩 3회에 걸쳐 세척하였다. 질산은 용액(0.8silver nitrate, 0.08NaOH, 4암모니아수)을 제조한 후, 이 용액에 젤을 넣고 5분간 암소에서 교반하고 탈이온수로 1분씩 3회 세척한 다음, 사용 직전에 제조한 발색액(developer, 0.005구연산, 0.14포름알데히드, 0.005메탄올)을 가하여 부드럽게 흔들어 주면서 은으로 염색된 단백질 밴드가 나타나는 것을 관찰하였다. 그 결과를 표 6 및 도 3b에 나타내었다.
pH가 α-IFN의 이중체 형성에 미치는 영향
용액시료 용액의 pH 저장 기간
0 2주 4주 6주 8주 10주 12주
5-1 5.3 - - - - - - -
5-2 5.8 - + + + + ++ ++
5-3 6.3 - + + + ++ ++ ++
* - : 이중체(dimer) 미검출+ : 1이하의 이중체 검출++ : 1또는 그 이상의 이중체 검출
표 5 및 도 3a에서 보여지듯이, α-IFN의 생리활성은 pH 5.8 근처에서 상대적으로 안정적인 경향성을 나타내었다. 한편, 이중체의 생성은 높은 pH에서 보다 심각하게 나타났다(표 6 및 도 3b 참조). 결과적으로, 높은 pH의 제형은 α-IFN 용액제형의 장기간 보존을 위해서는 바람직하지 않음을 알 수 있다.
<실시예 5> 두 종류의 보존제에 대한 항미생물 효과 실험
페놀 및/또는 m-크레졸을 보존제로서 함유하고 있는 α-IFN 용액제형들에 대해 항미생물 효과 실험을 수행하되, 유럽약전(E.P 1997, 5.1.3)에 나와 있는 항미생물 효과 실험방법에 기준하여 실험하였다. 우선, α-IFN 6×106IU/ml, 0.02폴리소르베이트 80, 10mM 초산 암모늄 완충액을 함유한 각각의 제형을 제조하였다. 여기에 하기 표 7과 같이 보존제의 농도를 달리하여 첨가하고, 염화 나트륨을 첨가하여 전해질 농도를 조절하였다. 각각의 제형의 항미생물 효과실험의 결과를 표 7에 나타내었으며, 참조예 3에 기술된 것과 같은 실험방법을 이용하여 제형 1 ml 당 생존 세포수를 측정하였다. 각 샘플링 시간별로 측정한 생존 세포수를 로그화한 후 각 시간 간격마다 로그감소분(Log reduction)을 구하여 그 값이 유럽 약전에 규정된 A 및 B 범주를 만족하는지 여부를 비교 판단하였다.
* A : 유럽 약전(EP)의 A 범주를 만족시키는 것을 의미
B : 유럽 약전(EP)의 B 범주를 만족시키는 것을 의미
- : 실험하지 않음
표 7의 결과로부터 알 수 있듯이, 0.15페놀과 0.1m-크레졸을 모두 포함하고 있는 용액제형은 가장 적은 양의 보존제를 포함하고 있지만(보존제 전체량 : 0.25), 유럽 약전의 항미생물 효과 실험에서 범주 A 및 B를 모두 만족시켰다.
<실시예 6> 0.15페놀과 0.1m-크레졸을 혼합 사용한 제형과 0.3페놀만을 사용한 제형의 안정성 비교 실험
α-IFN 6×106IU/ml, 0.02폴리소르베이트 80, 0.3페놀 및 10mM 초산 암모늄 완충액을 포함하는 제형(용액시료 #7-1)과, 상기에서 0.3페놀 대신 0.15페놀과 0.1m-크레을 포함하는 제형(용액시료 #7-2)의 두 종류 제형을 제조하였다. 용액의 pH는 5.3으로 맞추고, 염화 나트륨을 첨가하여 전해질 농도를 등장액이 되도록 조절하였다. 각 제형을 1군마다 3개 롯트씩, 3개 군으로 나누어 각각 4℃, 25℃, 40℃에서 12주간 저장하였다. 일정한 시간 간격을 두고 α-IFN의 생리활성의 변화를 측정하였으며, 순도는 역상-고성능 액체 크로마토그래피(reverse phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC, Waters Alliance System, UV detector, Jupiter C18 column)로 결정하였다. 그 결과를 표 8에서 13까지 그리고 도 4a에서 4f까지에 나타내었다.
(6-1) α-IFN의 생리활성 변화 측정
4℃에서 보관한 경우의 α-IFN 생리활성
용액시료 보존제(w/v) 저장기간
0 4주 8주 12주
7-1a 페놀 0.3 6.11 6.05 6.58 5.98
100.0 99.0 107.7 97.9
7-1b 페놀 0.3 6.53 6.57 6.54 5.43
100.0 100.6 100.2 83.2
7-1c 페놀 0.3 7.94 7.48 7.94 7.18
100.0 94.2 100.0 90.4
7-2a 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 6.68 6.69 6.29 6.18
100.0 100.1 94.2 92.5
7-2b 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 7.77 6.89 7.67 8.06
100.0 88.7 98.7 103.7
7-2c 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 6.39 6.02 6.24 6.72
100.0 94.2 97.7 105.2
25℃에서 보관한 경우의 α-IFN 생리활성
용액시료 보존제(w/v) 저장 기간
0 2주 4주 8주 12주
7-1a 페놀 0.3 6.11 6.94 5.85 - 6.72
100.0 113.6 95.7 - 110.0
7-1b 페놀 0.3 6.53 7.18 7.20 - 8.26
100.0 110.0 110.3 - 126.5
7-1c 페놀 0.3 7.94 7.33 6.87 7.66 7.34
100.0 92.3 86.5 96.5 92.4
7-2a 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 6.68 6.63 6.60 - 6.49
100.0 99.3 98.8 - 97.2
7-2b 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 7.77 7.59 7.07 - 7.67
100.0 97.7 91.0 - 98.7
7-2c 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 6.39 - - 6.14 6.45
100.0 - - 96.1 100.9
40℃에서 보관한 경우의 α-IFN 생리활성
용액시료 보존제 저장 기간
0 1주 2주 3주 4주 8주 12주
7-1a 페놀 0.3 6.11 5.28 5.89 5.68 5.56 5.02 4.39
100.0 86.4 96.4 93.0 91.0 82.2 71.8
7-1b 페놀 0.3 6.53 6.24 6.56 6.47 6.06 4.84 4.88
100.0 95.6 100.5 99.1 92.8 74.1 74.7
7-1c 페놀 0.3 7.94 7.55 6.69 6.61 - 5.49 4.49
100.0 95.1 84.3 83.2 - 69.1 56.5
7-2a 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 6.68 6.02 6.34 6.71 6.46 5.59 6.27
100.0 90.1 94.9 89.5 85.3 68.1 72.2
7-2b 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 7.77 7.23 6.34 6.71 6.46 5.59 6.27
100.0 93.1 81.6 86.4 83.1 71.9 80.7
7-2c 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 6.39 5.40 5.94 5.20 5.22 4.75 4.02
100.0 84.5 93.0 81.4 81.7 74.3 62.9
* 이상 표 8 내지 10에서 상단은 생리활성의 절대치를, 하단은 시간 0일때의 생리활성에 대한 상대적인 생리활성도를 나타낸다. 상기 표에서 6×106IU/ml의 α-IFN을 포함한 제형의 활성을 충전활성으로 하여 상대적 활성도를 계산하였으며, 각 수치의 단위는 106IU/ml이다.
(6-2) α-IFN의 순도
4℃에서 보관한 용액 시료들의 순도를 RP-HPLC로 측정한 결과
용액시료 보존제 저장 기간
0 4주 8주 12주
7-1a 페놀 0.3 100.0 98.3 96.9 99.6
7-1b 페놀 0.3 100.0 98.3 95.9 98.5
7-1c 페놀 0.3 100.0 98.3 98.3 97.7
7-2a 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 100.0 100.0 97.7 98.1
7-2b 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 99.0 100.0 98.2 98.7
7-2c 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 100.0 100.0 98.6 98.0
25℃에서 보관한 용액 시료들의 순도를 RP-HPLC로 측정한 결과
용액시료 보존제(w/v) 저장 기간
0 2주 4주 8주 12주
7-1a 페놀 0.3 100.0 99.1 99.0 94.6 94.8
7-1b 페놀 0.3 100.0 97.6 97.9 94.8 95.3
7-1c 페놀 0.3 100.0 97.8 97.8 95.3 93.4
7-2a 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 100.0 99.2 96.9 96.1 94.8
7-2b 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 99.0 99.2 97.2 96.5 93.9
7-2c 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 100.0 98.0 97.8 97.2 94.9
40℃에서 보관한 용액 시료들의 순도를 RP-HPLC로 측정한 결과
용액시료 보존제(w/v) 저장 기간
0 1주 2주 3주 4주 8주 12주
7-1a 페놀 0.3 100.0 100.0 98.4 94.4 95.8 89.7 86.3
7-1b 페놀 0.3 100.0 100.0 98.1 94.9 94.3 89.4 86.4
7-1c 페놀 0.3 100.0 97.6 96.0 94.7 95.0 84.2 78.6
7-2a 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 100.0 100.0 98.3 97.3 96.4 88.5 82.9
7-2b 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 99.0 99.4 98.2 96.3 95.7 88.4 83.8
7-2c 페놀 0.15+m-크레졸 0.1 100.0 98.7 100.0 96.8 95.4 85.9 78.9
도 4a, 4b 및 4c는 시간 0에서의 생리활성에 대한 상대적인 생리활성의 변화의 경향성을 보여준다. 표 8 내지 13과 도 4a 내지 4f에서 보여지듯이, 0.15페놀과 0.1m-크레졸을 혼합 사용한 제형은 전체 실험기간 동안 활성이나 순도 면에서 0.3의 페놀만을 포함한 제형과 비슷한 양상을 보였다. 또한 두 종류의 제형 모두 유럽약전에서 규정한 항미생물 효과 실험의 요건을 충족시켰다. 그러나, 0.15페놀과 0.1m-크레졸을 모두 포함한 제형의 경우 사용하는 전체 보존제의 양이 0.3페놀만을 사용한 제형에 비해 적기 때문에 인체에 대해 보다 안전함을 알 수 있다.
본 발명은 α-IFN, 폴리소르베이트 80, 보존제 및 적절한 완충 시스템을 포함하는 α-IFN 용액제형에 관련된 것이다. 본 발명의 α-IFN 용액제형은 α-IFN이 바이알의 표면에 부착하는 것을 방지함으로써 활성을 유지할 수 있으며, 따라서 활성유지 기간이 보다 긴 안정적인 α-IFN을 얻을 수 있다. 또한 본 발명의 용액제형은 보존제의 양을 최소화함으로써 항미생물 활성을 유지함과 동시에 용액제형 내의 α-IFN 생리활성도 유지할 수 있는 장점이 있다. 상기 보존제를 다량으로 사용하는 것은 인체에 해롭다고 알려져 있으므로, 보존제의 사용을 최소화함으로써 본 발명은 보다 안전한 제형을 제공하게 된다.
즉, 본 발명은 보존제의 양을 최소화한 α-IFN의 용액제형을 제공하며, 상기 제형은 인간 혈청 알부민 또는 킬레이트화제를 첨가한 경우와 같은 인체에 대한 잠재적인 위험성을 나타내지 않고, 수용액상에서 매우 안정한 장점이 있다.

Claims (9)

  1. α-IFN; 안정화제; 삼투압 조절제; 페놀, m-크레졸, 또는 이들의 혼합물 중에서 선택되는 항미생물 보존제; 및 완충 시스템을 포함하는 α-IFN 용액제형.
  2. 제 1항에 있어서, α-IFN을 1×106IU/ml∼1×107IU/ml의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 α-IFN 용액제형.
  3. 제 1항에 있어서, 안정화제는 폴리소르베이트 80인 것을 특징으로 하는 α-IFN 용액제형.
  4. 제 3항에 있어서, 폴리소르베이트의 농도는 0.01∼0.05 w/v인 것을 특징으로 하는 α-IFN 용액제형.
  5. 제 1항에 있어서, 삼투압 조절제는 염화나트륨인 것을 특징으로 하는 α-IFN 용액제형.
  6. 제 1항에 있어서, 보존제는 0.10∼0.30 w/v의 페놀, 0.1∼0.2 w/v의 m-크레졸, 또는 이들의 혼합물중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 α-IFN 용액제형.
  7. 제 1항에 있어서, 완충 시스템은 초산 암모늄과 초산 완충액이거나 또는 인산일수소나트륨(Na2HPO4)과 인산이수소나트륨(NaH2PO4)완충액인 것을 특징으로 하는 α-IFN 용액제형.
  8. 제 7항에 있어서, 전체 용액제형에 대한 완충 시스템의 농도는 2∼50mM인 것을 특징으로 하는 α-IFN 용액제형.
  9. 제 1항에 있어서, 제형의 pH는 4.5∼6.0인 것을 특징으로 하는 α-IFN 용액제형.
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