KR20040004414A - 에리트로포이에틴 용액 제제 - Google Patents

Abstract

장기간의 우수한 저장 안정성을 가지고 안정화제로 아미노산을 포함하는 에리트로포이에틴 용액 제제. 이 제제는 아미노산 외에도, 계면 활성제, 염 또는 완충 용액을 더 포함할 수 있다.

Description

에리트로포이에틴 용액 제제{ERYTHROPOIETIN SOLUTION PREPARATION}

본 발명은 에리트로포이에틴 용액 제제에 관한 것이다.

에리트로포이에틴 (이하 EPO로 칭함)은 산성 당단백질 호르몬으로 에리트로이드 전구세포의 분화와 증식을 촉진한다. 이 호르몬은 주로 신장에서 분비된다. 적혈구는 특정 기간 중 혈액 내에 풍부히 존재하다가, 지라 등에서 분해된다 (인간에서 평균 수명은 약 120 일). 그러나, 적혈구 세포는 골수로부터 일정하게 공급되고, 따라서 정상 상태에서 말초의 총 적혈구 수는 일정하게 유지된다. EPO는 살아있는 생물체 내에서 적혈구의 항상성을 유지하는데 주요한 역할을 담당한다.

고순도 인간 뇨의(urinary) EPO는 재생 불량성 빈혈 환자의 다량의 뇨로부터 정제 수득한다. 이에 의해 인간 EPO 유전자의 클로닝이 가능해졌다. 현재는, 유전 공학 기술에 의해서 동물 세포에서 재조합 인간 EPO를 다량 생산하는 것이 가능하다. 본 발명의 출원인은 정제된 EPO의 제제 (동결 건조 제제)를 생산하는데 성공하였고, 신장 빈혈 경감제등의 제형으로 시장에 공급하고있다.

안정한 EPO 제제를 시장에 공급하기 위한 약 디자인은 EPO가 억제됐을 때 관측되는 화학적 변화 (가수분해, 디설파이드 교환 반응 등) 또는 물리적 변화 (변성, 응집, 흡착 등)를 필요로 한다. 현재 시판되는 제품은 인간 혈청 알부민 또는 정제된 젤라틴을 일반적인 안정화제로 포함한다. 이러한 물질은 화학적 또는 물리적 변화를 억제하기 위해 이들 제품에 첨가된다. 인간 혈청 알부민은 그 공급을 헌혈에 의존하는 혈액 산물이기 때문에 이것의 첨가 필요성은 논란이 되어왔다. 안정화제로 알부민 또는 젤라틴 외의 단백질을 가하는 경우, 바이러스성 감염의 위험을 완벽히 제거하는데 어려움이 있다.

펩티드 약은 안정화를 위해 통상 동결 건조된다. 그러나, 동결 건조는 생산비용을 증가시키고, 기계적 고장에 따른 증가된 위험성을 내포한다.

이러한 이유로, 동결 건조의 대안으로써, EPO 제제가 안정화제로 쓰이는 단백질의 포함 없이도 장기간의 저장 동안 안정한 EPO 제제가 요구되어왔다.

위의 요구를 충족시키기 위해, 본 발명자들은 광범위한 연구를 실시하였다. 그 결과로, 인간 혈청 알부민 및 정제된 젤라틴 없이도 특정 아미노산을 안정화제로 첨가함으로써, EPO를 안정한 EPO 용액 제제로 전환할 수 있음을 발견하였다. 이 발견에 따라 본 발명의 완성을 이루었다.

즉, 본 발명은 안정화 시약 또는 안정화제로 아미노산을 포함하는 에리트로포이에틴 용액 제제에 관한 것이다.

본 상세한 설명 중의 "안정화시키기 위하여; 안정화하는"은, 일례로, 10℃에서 2 년 이상, 또는 25℃에서 6개월 이상, 또는 40℃에서 2 주 이상에서 에리트로포이에틴의 잔존율을 90% 이상으로, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상으로 유지하는 에리트로포이에틴 용액 제제 또는 저장을 의미한다.

도 1 은 L-아르기닌 염산염의 농도와 에리트로포이에틴 잔존율의 관계를 나타내는 그래프이다;

도 2 는 L-리신 염산염의 농도와 에리트로포이에틴 잔존율의 관계를 나타내는 그래프이다;

도 3 은 L-히스티딘 염산염의 농도와 에리트로포이에틴 잔존율의 관계를 나타내는 그래프이다; 그리고

도 4 는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 패턴으로 다양한 아미노산이 첨가된 제제에서 분해 생성물 억제 효과를 나타내며 (전기영동도; electrophoretogram), 레인 1: 분자량 표시물, 레인 2: 아미노산 미포함 제제, 레인 3: L-류신 포함 제제, 레인 4: L-페닐알라닌 포함 제제, 레인 5: L-트립토판 포함 제제, 레인 6: L-세린 포함 제제, 레인 7: L-시스테인 포함 제제, 레인 8: 모노나트륨 L-글루탐산 일수화물 포함 제제, 레인 9: L-아르기닌 염산염 포함 제제, 그리고 레인 10: L-히스티딘 염산염 포함 제제이다.

본 발명의 용액제제에 사용되는 EPO는 포유류, 특히 인간 EPO 와 실질적으로 동일한 생활성을 가지고, 자연 발생 EPO와 유전자 재조합으로 수득한 EPO를 포함한다. 유전자 재조합으로 수득한 EPO는 자연 발생 EPO와 동일한 아미노산 배열을가지는 EPO, 또는 상기 아미노산 배열에서 한 개 또는 그 이상의 아미노산이 제거된 EPO, 한 개 또는 그 이상의 아미노산이 치환된 EPO, 또는 한 개 또는 그 이상의 아미노산이 첨가되었으나 상기한 생물학적 활성을 유지한 EPO 를 포함한다. 본 발명의 EPO는 다양한 방법의 추출, 분리와 정제를 수반하여 인간 뇨로부터 추출되는 것; 다양한 방법의 분리와 정제를 수반하여 대장균(E.coli), 효모, 또는 중국 햄스터 난소 세포에서 생성하는 방법과 같은 어떠한 방법에 의해서도 생산되어질 수 있다.

본 발명에서 안정화제로 첨가되는 아미노산은 유리 아미노산 자체와 그들의 나트륨염, 칼륨염과 염산 염 등의 염을 포함한다. 본 발명의 용액 제제는 조합으로 이러한 아미노산의 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 바람직한 아미노산은 D-, L-, 및 DL-형의 류신, 트립토판, 세린, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘 및 리신과 그들의 염들이다. 보다 바람직한 것은 L-류신, L-트립토판, L-글루탐산, L-아르기닌, L-히스티딘 및 L-리신과 그들의 염들이다. 특히 바람직한 것은 L-아르기닌, L-히스티딘 및 L-리신과 그들의 염들이다. 가장 바람직한 것은 L-히스티딘과 그의 염들이다.

본 발명의 용액 제제는, 바람직하게는, 안정화제로서의 단백질을 실질적으로 포함하지 않는다.

본 발명의 용액 제제에 첨가하는 아미노산의 양은, 사용하는 아미노산의 종류에 따른 시험 방법(이후 기술됨)에 의해 바람직한 범위가 정해진다. 일반적으로, 첨가하는 아미노산의 양은 0.001 내지 50 mg/ml, 아르기닌에 대해서 바람직하게는 0.1 내지 40 mg/ml, 보다 바람직하게는 1 내지 10 mg/ml, 리신에 대해서 바람직하게는 0.5 내지 10 mg/ml, 보다 바람직하게는 1 내지 10 mg/ml, 히스티딘에 대해서 바람직하게는 0.5 내지 10 mg/ml, 보다 바람직하게는 1.0 내지 4.0 mg/ml, 가장 바람직하게는 1.0 내지 2.0 mg/ml이다. 이후에 기술된 바대로, EPO의 최고 잔존율은 L-아르기닌 염산염과 L-리신 염산염 각각을 약 1 내지 5 mg/ml의 양으로 유리 아미노산 형태로 가했을 때, 또는 L-히스티딘 염산염을 약 1 내지 10 mg/ml의 양으로 40℃에서 2 주간의 가속 시험, 또는 0.5 내지 5 mg/ml 25℃에서 6 개월간의 가속 시험에서 유리 아미노산 형태로 가했을 때 얻어진다.

본 발명의 용액 제제내 포함된 EPO의 양은 치료할 질병의 형태, 질병의 정도, 환자의 연령, 등등에 따라 결정된다. 일반적으로, 그의 양은 100 내지 500,000 IU/ml, 바람직하게는 200 내지 100,000 IU/ml, 보다 바람직하게는 750 내지 72,000 IU/ml이다. 본 발명의 용액 제제는 예를 들어 주사(피하 또는 정맥), 또는 피부 통과, 점막 통과 또는 비강 통과의 비경구 (parenteral)경로로 투여하나, 경구 투여 역시 가능하다.

본 발명의 용액 제제는 아미노산과 EPO 외에도 용액 형태 제제에 통상 첨가되는 성분들로 폴리에틸렌글리콜: 덱스트란, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 글루코스, 프룩토스, 락토스, 자일로스, 만노스, 말토스, 수크로스 및 라피노스와 같은 당류; 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 인산나트륨, 인산칼륨 및 탄산수소나트륨과 같은 무기 염; 시트르산 나트륨, 시트르산 칼륨 및 아세트산 나트륨과 같은 유기 염; 그리고 필요한 경우, 글루타치온, 티옥트 산, 티오글리콜산 나트륨, 티오글리세롤,알파-모노티오글리세롤, 및 티로황산 나트륨과 같은 황 포함 환원제를 포함할 수 있다. 바람직한 염은 염화나트륨이다. 본 발명의 용액 제제에 폴리옥시에틸렌 소르비탄 알킬 에스테르와 같은 흡착 방지제를 가하는 것도 바람직하다. 특히 바람직한 폴리옥시에틸렌 소르비탄 알킬 에스테르는 폴리소르베이트 20, 21, 40, 60, 65, 80, 81 및 85 이고, 가장 바람직한 것은 폴리소르베이트 20 및/또는 80 이다. 바람직한 폴리소르베이트 20 및/또는 80 의 첨가량은 0.01 내지 1 mg/ml, 보다 바람직하게는 0.05 내지 0.1 mg/ml 이다.

본 발명의 용액 제제는 인산 및/또는 시트르산 완충용액과 같은 용액 제제 분야에서 공지된 수성 완충용액에 상기한 성분들을 용해시켜만들 수 있다. 바람직한 인산 완충용액은 인산수소나트륨-인산이수소나트륨 완충용액이고, 바람직한 시트르산 완충용액은 시트르산 나트륨 완충용액이다. 본 발명의 용액 제제의 pH는 5.0 내지 8.0 이며, 바람직하게는 6.0 내지 7.0 이다.

일본 특허 공개 공보 제 64-71818 호는 요소, 아미노산 및 비이온성 습윤제를 포함함을 특징으로 하는 인간 단백질 제제를 기술하고 있다. 그러나 본 발명의 용액 제제는 바람직하게는 요소를 포함하지 않는데, 그 이유는 요소가 에리트로포이에틴과 같은 당단백질의 장기간 안정화에 기여하는 여부가 불분명하기 때문이다. 요소 분해 생성물과 단백질간의 반응이 또한 일어나고 있음이 알려져 있고 (Protein Chemistry 3, Kyoritsu Shuppan, Chapter 12), 이는 제제에 악영향을 줄 수 있다. 또한, 제제에 적은 성분을 가할수록, 보다 나은 결과가 기대된다.

본 발명의 용액 제제는 밀폐되고, 살균된 플라스틱 또는 유리 용기에 통상 저장한다. 용액 제제는 앰퓰, 바이알 또는 일회용 주사기 내의 일회 조제 양으로, 또는 주사를 위한 봉지 혹은 병과 같은 다회량 형태로 공급될 수 있다.

다양한 아미노산을 포함하는 EPO 용액 제제를 준비하여, 40℃에서 2 주간의 가속 시험을 실시한다. 시험후의 각 제제의 EPO 함량을 RP-HPLC (역상 HPLC)로 측정하여, 내용물에 아미노산을 첨가한 효과를 조사한다. 그 결과로, 아미노산을 포함하지 않은 용액제제에 비해, L-류신, L-트립토판, 모노나트륨 L-글루탐산 일수화물, L-아르기닌 염산염, L-히스티딘 염산염 및 L-리신 염산염을 포함하는 용액제제에서 EPO의 잔존율이 높았다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동의 결과는 L-아르기닌 염산염, L-히스티딘 염산염이 가속 시험 후에 제제 내에서 생기는 EPO 분해 생성물의 형성을 억제하는데 효과적임을 나타낸다.

첨가시에 효과적인 아미노산들 중에서, 제제의 안정성에 대한 L-아르기닌 염산염, L-리신 염산염 및 L-히스티딘 염산염의 농도 효과를 측정한다. 즉, L-아르기닌 염산염, L-리신 염산염 또는 L-히스티딘 염산염이 다양한 농도로 존재하는 EPO 제제를 준비하여, 40℃에서 2 주간의 가속 시험을 준비한 제제에 대하여 실시한다. 시험이 종료되었을 때, 제제 내의 EPO 잔존율이 L-아르기닌 염산염과 L-리신 염산염의 경우 약 1 내지 5 mg/ml의 농도에서 최고치를 나타낸다. L-히스티딘 염산염의 경우 최고 EPO 잔존율은 1 내지 10 mg/ml의 농도에서 나타난다. L-히스티딘 염산염이 다양한 농도로 포함되어있는 EPO 제제의 경우에도 25℃에서 6 개월간의 가속 시험을 역시 실시하였다. 최고 EPO 잔존율은 0.5 내지 5 mg/ml의 농도에서 나타난다. 이러한 결과는 L-아르기닌 염산염, L-리신 염산염 및 L-히스티딘 염산염이 첨가 최적 농도를 가지고 있음을 나타낸다.

본 발명의 EPO 용액 제제는 인간 혈청 알부민이나 정제된 젤라틴과 같은 외래 단백질이나 바이러스성 감염의 위험으로부터 자유로운 안전한 제제이다. 여기에 포함된 아미노산은 전통적인 안정화제에 비하여 저렴하고, 동결 건조 생산물에 비해 제조 비용 역시 저렴하다. 따라서, 본 발명의 제제는 경제적으로도 유용하다. 더 나아가, 본 발명의 용액 제제는 완충용액에 용해시킬 필요 없이 그냥 그대로 사용하면 된다. 이는 동결건조에 비해 사용시의 수고를 경감시킨다. 이러한 다양한 장점들 덕분에, 본 발명의 산업상 이용성은 막대하다.

본 발명은 이제 이하의 실시예를 참고로 좀더 자세히 설명될 것이나, 이는 그 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.

시험 방법

5 ml의 유리 바이알을 아래의 성분/ml을 포함하는 1 ml의 분배 용액으로 채우고 10 mM 인산 완충용액 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)을 이용하여 pH 6.0으로 맞춘다.

EPO1,500 IU

비이온성 계면 활성제0.05 mg

(폴리소르베이트 80, Nikko Chemical Co., LTD.)

염화나트륨8.5 mg

아미노산 (Sigma Chemical Co.)0 내지 40 mg

채워진 바이알을 막아서 밀폐하고, 용액제제로 사용한다. 가속 시험을 위해서, 제제를 40℃ 항온 용기 내에서 2 주간 정치시킨다. 이후 제제를 RP-HPLC 분석 (WATERS)과 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석으로 평가한다.

실시예 1: 다양한 아미노산 첨가의 EPO 잔존율에 대한 효과

앞서의 시험 방법에 따른, 아래의 표에 기재된 다양한 아미노산을 포함하는 용액 제제를 준비하여, 40℃ - 2 주간 가속 시험을 실시한다. 이후, 그들의 EPO 잔존율을 RP-HPLC 방법으로 측정한다. 결과는 표 1에 나타내었다.

다양한 아미노산을 포함하는 용액 제제에 대한 가속 시험 후의 EPO 잔존율

아미노산	첨가량 (mg/ml)	40℃ - 2 주간 가속시험 이후의 EPO 잔존율(초기 농도의 %)
미첨가	0	83.9
L-류신	10	91.6
L-페닐알라닌	10	57.8
L-트립토판	5	97.0
L-세린	10	85.2
L-시스테인	10	47.1
모노나트륨 L-글루탐산 일수화물	10	93.9
L-아르기닌 염산염	10	93.6
L-히스티딘 염산염	10	99.7
L-리신 염산염	10	95.8

이상에서 보는 바와 같이, L-류신, L-트립토판, 모노나트륨 L-글루탐산 일수화물, L-아르기닌 염산염, L-히스티딘 염산염, 및 L-리신 염산염이 특히 현저한 EPO 잔존율을 유도하였다.

실시예 2: 다양한 농도의 아미노산 첨가의 EPO 잔존율에 대한 효과

앞서의 시험 방법에 따라, 아래에 기재된 다양한 농도의 L-아르기닌 염산염을 포함하는 EPO 용액 제제를 준비하여, 동일하게 40℃ - 2 주간 가속 시험을 실시한다. 이후, 그들의 EPO 잔존율을 RP-HPLC 방법으로 측정한다. 결과는 표 2에나타내었다.

L-아르기닌 염산염을 포함하는 제제에 대한 가속 시험 후의 EPO 잔존율

아미노산	첨가량 (mg/ml)	40℃ - 2 주간 가속시험 이후의 EPO 잔존율 (초기농도의 %)
미첨가	0	89.6
L-아르기닌 염산염	0.1	92.7
	1	96.7
	5	96.1
	10	93.6
	20	92.0
	40	91.6

위의 결과는 도 1의 그래프로 도시하였다. 상기된 것과 같이, L-아르기닌 염산염은 약 1 내지 5 mg/ml 의 농도 범위에서 최고의 EPO 잔존율을 유도하였다.

이후, L-리신 염산염에 대하여도 동일 시험을 실시하였다. 첨가한 L-리신 염산염의 양과 가속 시험후 EPO 잔존율을 표 3에 기재하였다.

L-리신 염산염을 포함하는 제제에 대한 가속 시험후의 EPO 잔존율

아미노산	첨가량 (mg/ml)	40℃ - 2 주간 가속시험 이후의 EPO 잔존율 (초기농도의 %)
미첨가	0	88.7
L-리신 염산염	0.5	93.1
	1	95.8
	5	96.3
	10	90.2

위의 결과는 도 2의 그래프로 도시하였다. 상기된 것과 같이, L-리신 염산염은 약 1 내지 5 mg/ml 의 농도 범위에서 최고의 EPO 잔존율을 유도하였다.

이후, L-히스티딘 염산염에 대하여도 동일 시험을 실시하였다. 첨가한 L-히스티딘 염산염의 양과 가속 시험후 EPO 잔존율을 표 4에 기재하였다.

L-히스티딘 염산염을 포함하는 제제에 대한 가속 시험후의 EPO 잔존율

아미노산	첨가량 (mg/ml)	40℃ - 2 주간 가속시험 이후의 EPO 잔존율 (초기농도의 %)
미첨가	0	91.5
L-히스티딘 염산염	0.5	95.5
	1	97.3
	5	98.1
	10	99.7

위의 결과는 도 3의 그래프로 도시하였다. 상기된 것과 같이, L-히스티딘 염산염은 약 1 내지 10 mg/ml 의 농도 범위에서 최고의 EPO 잔존율을 유도하였다.

앞서의 시험 방법에 따라, 아래에 기재된 다양한 농도의 L-히스티딘 염산염을 포함하는 EPO 용액 제제를 준비하여, 25℃ - 6 개월 가속 시험을 실시한다. 이후, 그들의 EPO 잔존율을 RP-HPLC 방법으로 측정한다. 결과는 표 5에 나타내었다.

L-히스티딘 염산염을 포함하는 제제에 대한 가속 시험후의 EPO 잔존율

아미노산	첨가량 (mg/ml)	25℃ - 6 개월간 가속시험 이후의 EPO 잔존율 (초기농도의 %)
미첨가	0	93.2
L-히스티딘 염산염	0.5	99.3
	1	99.9
	5	97.9
	10	94.1

상기된 것과 같이, L-히스티딘 염산염은 0.5 내지 5 mg/ml 의 농도 범위, 특히 1 mg/ml 에서 최고의 EPO 잔존율을 유도하였다.

실시예 3: 다양한 아미노산 첨가의 EPO 분해 생성물에 대한 효과

앞서의 시험 방법에 따라, 다양한 농도의 아미노산을 포함하는 EPO 용액 제제를 준비하여, 40℃ - 2 주 가속 시험을 실시한다. 이후, 그들의 EPO 분해 생성물의 형성을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 분석법으로 측정한다.

1) 샘플의 준비

가속 시험 후, SDS, 글리세린, 및 브로모페놀 블루를 포함하는 1M 트리스-염산염 완충용액 (pH 6.8)을 실시예 1의 표 1에 기재된 다양한 아미노산을 포함하는 각각의 EPO 용액 제제에 가한다. 혼합물을 60℃에서 15 분간 가열하여 샘플 용액을 준비한다.

2) 전기 영동

샘플 용액 (10 ㎕)을 이하의 실시 조건하에서 전기 영동한다:

a) 장치: 판 (slab) 겔 전기 영동 장치 (Bio-Rad Laboratories)

b) 전기 영동 겔: SDS-PAGEmini8-16 (폴리아크릴아미드 8 내지 16%의 농도 구배 겔, Tefco)

c) 전기 영동 온도: 25℃

d) 전기 영동 조건: 25 mA 일정 전류/겔

3) 발색 방법 (western blotting)

전기 영동 겔을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막에 옮긴다. 이후, 항-EPO 토끼 혈청, 비오틴 표지화된 항-토끼 IgG 염소 항체, 및 비오틴화된 호스래디시 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase)를 이용하여 3,3'-디아미노벤지딘-과산화수소를 기질로한 발색 반응을 실시한다.

4) 결과

결과는 도 4에 도시되었다. 아미노산 미포함 제제 (레인 2)와 비교하여, 모노나트륨 L-글루탐산 일수화물 포함 제제 (레인 8), L-아르기닌 염산염 포함 제제 (레인 9), 및 L-히스티딘 염산염 포함 제제 (레인 10)는 EPO 분해 생성물의 형성을 억제하는 현저한 효과를 나타내었다.

본 발명의 EPO 용액 제제는 인간 혈청 알부민이나 정제된 젤라틴과 같은 외래 단백질이나 바이러스성 감염의 위험으로부터 자유로운 안전한 제제이다. 여기에 포함된 아미노산은 전통적인 안정화제에 비하여 저렴하고, 동결 건조 생산물에 비해 제조 비용 역시 저렴하다. 따라서, 본 발명의 제제는 경제적으로도 유용하다. 더 나아가, 본 발명의 용액 제제는 완충용액에 용해시킬 필요 없이 그냥 그대로 사용하면 된다. 이는 동결건조에 비해 사용시의 수고를 경감시킨다. 이러한 다양한 장점들 덕분에, 본 발명의 산업상 이용성은 막대하다.

Claims (10)

1. 안정화제로 아르기닌 또는 그의 염을 함유하는 에리트로포이에틴 용액 제제.
2. 제 1 항에 있어서, 아르기닌이 L-아르기닌인 용액 제제.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 아르기닌의 농도가 0.1 내지 40 mg/ml 인 용액 제제.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 안정화제로 단백질을 함유하지 않는 용액 제제.
5. 제 4 항에 있어서, 계면활성제, 염, 완충액 또는 이것들의 조합을 추가로 함유하는 용액 제제.
6. 제 5 항에 있어서, 계면 활성제가 폴리옥시에틸렌 소르비탄 알킬 에스테르인 용액 제제.
7. 제 6 항에 있어서, 계면 활성제가 폴리소르베이트 20 및/또는 80 인 용액 제제.
8. 제 5 항에 있어서, 염이 염화나트륨인 용액 제제.
9. 제 5 항에 있어서, 완충 용액이 인산 및/또는 시트르산 완충 용액인 용액 제제.
10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 요소를 함유하지 않는 용액 제제.